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Regulación del metabolismo

REGULACIÓN DEL METABOLISMOBloque I – Mecanismos de regulación metabólicaBloque I – Mecanismos de regulación metabólica en respuesta a señales extracelularesen respuesta a señales extracelulares

TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO

1. Introducción Las rutas metabólicas han de estar reguladas en función de unas necesidades cambiantes. De

forma general, cada una de estas rutas está compuesta por una serie de etapas, cada una catalizada por una enzima (normalmente distinta); con que una de estas etapas esté regulada es suficiente para que la ruta sea más o menos rápida. A la enzima de la etapa regulada en cuestión se le denomina enzima reguladora.

Existen infinidad de rutas, algunas de las cuales pueden ir en sentidos opuestos, por lo cual el metabolismo ha de estar coordinado a nivel celular (por ejemplo, si está funcionando la síntesis de ácidos grasos es absurdo que funcione su oxidación). En animales, seres pluricelulares, lógicamente también ha de haber una coordinación a nivel tisular. Esta coordinación y regulación depende de:

1. Señales o mensajes extracelulares, donde destaca el papel de las hormonas.

2. Señales metabólicas.

2. Papel de la membrana plasmática en el control del metabolismo La membranas celulares constituyen una barrera hidrofóbica, lo cual, en lo que respecta al

metabolismo supone dos efectos:

1. Determina el lugar de la recepción de la señal. A este respecto las señales se comportan de diferente manera, en función de su naturaleza:

(a) Los mensajeros liposolubles que, por tanto, pueden atravesar la membrana, cuya recepción de la señal será interna (por ejemplo, las hormonas esteroideas)

(b) Los mensajeros hidrosolubles que no pueden atravesar la membrana lipídica, y por tanto su recepción se da a nivel de la misma membrana plasmática; es decir, suponen una transducción de la señal a nivel de la membrana, tras lo cual se genera un mensajero intracelular (cAMP, Ca2+)

En ambos casos se genera una respuesta que lleva a cabo el control del metabolismo.

2. Condiciona el transporte de sustancias polares, tanto sin o con carga (por ejemplo la glucosa no tiene carga, pero presenta muchos grupos OH que impiden el paso a través de la

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membrana). Por tanto se requieren sistemas de transporte (poros proteicos), independientemente de que el sistema sea pasivo o activo.

2.1 Características de las membranasDestacan dos características:

1. Asimetría. Tanto desde un punto de vista estructural como funcional:

(a) Asimetría estructural. Como ejemplo ilustrativo, la membrana ha de estar curvada (definiendo la forma esférica celular típica), lo cual se consigue debido a que la cabeza polar de los fosfolípidos es más voluminosa en la monocapa externa que en la monocapa interna; y de este modo por tanto habrá diferente composición de fosfolípidos en cada monocapa.

Un fosfolípido es un glicerol que en posición 1 y 2 presenta dos ácidos grasos, y en 3 tiene un fosfato unido por un enlace ester a un alcohol (que en conjunto definen la cabeza polar) (Ilustración 1). Destacan 4 tipos diferentes de alcoholes: Inositol, Serina, Colina y etanolamina. Siguiendo el ejemplo ilustrativo anterior comparemos dos de estos alcoholes diferentes en lo que respecta al tamaño que atribuyen a la cabeza del fosofolípido del que forman parte: la etanolamina y la colina (Ilustración 2); de esta forma, la fosfatidil colina presenta una cabeza polar observa mucho más voluminosa, por lo cual está principalmente en la monocapa externa; mientras que la etanolamina, con una cabeza menor, en la interna.

(b) Asimetría funcional. En el caso de los mensajeros extracelulares hidrosolubles en la membrana ha de darse tanto la recepción de la señal como la generación de una señal intracelular. Así, la señal es recibida en la parte orientada hacia el medio exterior, debido a lo cual otra proteína (o la misma) genera la señal intracelular (por tanto, en cualquier caso ha de haber una región catalítica orientada hacia el citosol).

2. Fluidez. La fluidez depende el componente lipídico y condiciona el desplazamiento lateral de las proteínas en el plano de la bicapa. La fluidez depende de:

(a) El número de dobles enlaces o insaturaciones de los ácidos grasos de los fosfolípidos, de forma que a mayor número de insaturaciones, más fluidez.

(b) La longitud de las cadenas de los ácidos grasos (número de carbonos), de forma que a menor longitud, más fluidez.

(c) En la fluidez de membrana también juega un papel importante el colesterol.

La fluidez es muy importante para las funciones de la membrana, como ejemplo ilustrativo, la adenil ciclasa sintetiza cAMP en respuesta a la unión de un mensajero a su receptor, sistema en el que además hay que añadir, al receptor y a la enzima adenil ciclasa, un tercer

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Ilustración 2: Dos alcoholes de fosfolípidos

Ilustración 1: Estructura de un fosfolípido


componente, la proteína G (intermediaria entre los dos anteriores). Y estos 3 componentes no están continuamente interaccionando; de esta forma, con la activación del receptor debido al mensajero, se da un cambio conformacional en el mismo receptor tal que activa la proteína G, que a su vez activa a la adenil ciclasa. Y obviamente, estas interacciones necesitan de desplazamiento de los componentes, de ahí la importancia de la fluidez en la transducción de la señal.

3. Mecanismos de control del metabolismo El control de la actividad del metabolismo se lleva a cabo de dos maneras:

1. Controlando la actividad enzimática.

2. Controlando los niveles enzimáticos.

Normalmente se controla en cada ruta una o dos enzimas (denominadas por tanto, enzimas reguladoras, como vimos anteriormente), tanto para su actividad como para su cantidad. Una enzima reguladora puede estar sometida a control de su actividad, de sus niveles o ambos.

3.1 Control de la actividad enzimáticaA su vez, el control de la actividad enzimática se lleva a cabo de tres formas diferentes:

1. Regulando la concentración de sustratos (y de productos). Esta forma de control afecta a todas las enzimas. Se debe a que la velocidad de la acción de las enzimas aumenta con la concentración de su sustrato de forma lineal. Como conceptos generales (Ilustración 3), en el punto en el que V0 se hace independiente del sustrato, la velocidad V0 es máxima (Vmax); y la concentración de sustrato donde V0 vale ½ de Vmax se denomina Km (constante de Michaelis – menten). De esta forma, si yo tengo una ruta con varios eslabones, esta forma de control explica porqué una enzima reguladora es suficiente para que la ruta entera quede regulada:

Si en esta ruta yo controlo E1, controlo los niveles de P1, que a su vez es S2. Y por tanto con los niveles de S2 también ser regula la actividad de E2 de forma indirecta, y así sucesivamente; en última instancia, de esta fomr se controla el producto final, P3, con una sola enzima reguladora. En este sistema de regulación se pueden destacar además dos particularidades:

(a) El primero es el caso de que sustrato y enzima se encuentren en compartimentos diferentes (como por ejemplo sucede con la glucosa que entra a las células). En este caso, como se comentaba en el apartado anterior de la membrana, por lo general ha de haber un transportador que pase el sustrato al compartimento donde se encuentra la enzima. Por tanto, una forma de regulación constituye incidir sobre el transportador

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S1 P1/S 2 P2/S3 P3

E3E2E1

Ilustración 3: Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima.


(T); es decir, si yo facilito el transporte de S1, aumento la concentración de S1 en presencia de la enzima E1, y por tanto favorezco la ruta.

(b) El segundo caso específico se da en aquellas enzimas que resultan inhibidas por sus propios productos (de la misma enzima en cuestión). La acción de las enzimas se basa en que su centro activo presenta gran afinidad por el producto y poca por el producto, pero en el caso de las enzimas que resultan inhibidas por sus productos, tienen gran afinidad por el sustrato, y algo menos de afinidad por el producto. Por tanto, en el caso de que aumente la concentración del producto (por ejemplo, en el caso que se esté acumulando), se inhibe la acción de la enzima.

De esta forma, si en el ejemplo anterior yo inhibo E2, no tengo inhibida E1 y está entrando sustrato al compartimento en cuestión, P1/S2 se acumula, por lo cual E1 se inhibe, lo que determina que S1 también se acumule; en última instancia, el aumento de la concentración de S1 condiciona el transporte, o bien se revierte o entra tanto como sale, y por tanto S1 se destina otro compartimento.

2. Regulación alostérica. En este caso, el modulador se une a un centro diferente del centro activo denominado centro alostérico, lo cual puede activar o inhibir la enzima. Como ejemplo ilustrativo, si tengo una ruta diferente además de la anterior mencionada, podría resultar que uno de sus productos, como puede ser Pa, regule a E1. Obviamente Pa no se parece ni de coña a P1, por tanto se une a un centro diferente del centro activo.

Esto pone de manifiesto la coordinación del metabolismo: si cuando se da la ruta de los números a de darse la ruta de las letras ha de haber entre ellas una control positivo; si se da un control recíproco (es decir, cuando se da una no se da la otra) habrá una inhibición o control negativo. Destacan dos particularidades también en este caso:

(a) En primer lugar, tan diferente es P3, de la misma ruta de los números, como Pa de P1, por tanto la retroinhibición que pueda realizar P3 sobre E1 es también una regulación alostérica.

(b) En segundo lugar, si Pa incide sobre el transportador de S1 del ejemplo anterior, en vez de E2 se regula la presencia de S1 en presencia de la enzima E1, y por tanto la ruta.

En lo referente a la implicación de la regulación alostérica, hay que tener en cuenta que la

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S1 S1 P1/S 2 P2/S3 P3

E3E2E1T

Sa Pa/Sb Pb/Sc Pc

S1 P1/S2 P2/S3 P3

EcEbEa

E1 E2+/

S1 P1/S 2 P2/S3 P3E3E2E1


modificación alostérica es un mecanismo de control del metabolismo en respuesta a señales metabólicas. Como ya vimos, las señales extracelulares informan de las necesidades del organismo en su conjunto, mientras que las metabólicas informan de las necesidades de una célula. Es decir, si por ejemplo las dos rutas anteriores son opuestas (como podrían ser glicólisis y gluconeogénesis) cuando se de uno no ha de darse la otra; así, por una señal metabólica (Pa, en el caso anterior) se coordinan alostéricamente las rutas.

3. Modificación covalente de una enzima. Esta modificación covalente puede ser de dos tipos:

(a) Irreversible. Mas rara, como ejemplo ilustrativo destaca la proteolísis limitada; si mediante una proteasa se corta un trozo de una enzima que previamente se unía al centro activo y lo inhibía (ilustración 4), la enzima quedará permanentemente activa. Esto es irreversible debido a que no hay ninguna enzima que cosa peptidos. Por tanto, a nivel de esta enzima sólo queda degradarla y volverla a sintetizar.

Esto introduce un nuevo concepto, el plazo: una modificación irreversible para ser revertida supone la síntesis de la enzima, y por tanto es a más largo plazo; por contra, una modificación reversible la enzima se puede revertir a muy corto plazo.

Un ejemplo destacable de proteasa limitada es la calpaina, que se activa ante un aumento en los niveles de Ca2+ (mensajero intracelular), y por tanto en un mecanismo de control en respuesta a señales extracelulares. Concluimos por tanto que de forma general, en lo referente al control del metabolismo, la proteolisis limitada depende de señales extracelulares.NOTA: En la proteolisis ilimitada, la proteasa reconoce y corta sólo el enlace peptídico, por tanto empieza por un extremo de una proteína y termina por el otro, liberando aminoácidos. En el caso de la proteolisis limitada se reconoce el enlace peptídico y también una secuencia de aminoácidos a cada lado. Esto constituye un caso análogo a las nucleasas, donde se tienen tanto nucleasas que sólo reconocen el enlace nucleotídico, y liberan por tanto nucleótidos; y endonucleasas de restricción, que reconocen una el enlace nucleotídico y una secuencia de nucleótidos a cada lado.

(b) Reversible. La más usual es la fosforilación/ desfosforilación. La fosforilación se realiza sobre los grupos OH, que en una proteína pueden aparecer en 3 de sus residuos, Serina, treonina y tirosina. En la fosforilación el ácido fosfórico con el grupo OH (alcohol) forman un enlace esterfosfato, obviamente covalente. Por su parte la desfosforilación consiste en la hidrólisis del enlace fosfoester por la acción de una molécula de agua. Implicados en estos procesos tenemos dos grupos de pares de enzimas:

i. Las enzimas fosforilan residuos de Serina y treonina se denominan proteínas kinasas (PK); mientras que las enzimas que desfosforilan los enlaces fosfoester de estas proteínas kinasas se conocen como proteínas fosfatasas (Ppasas).

ii. Las enzimas que desfosforilan residuos de tirosina se denominan proteínas tirosina kinasa; las enzimas que revierten la acción de estas se llaman tirosina fosfatasas.

El control mediante fosforilación/ desfosforilación de las enzimas reguladoras del

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Ilustración 4: Proteolísis limitada


metabolismo intermediario (parte central del metabolismo, de orientación energética) está llevado a cabo por proteínas kinasas y proteínas fosfatasas; y por otro lado, en relación con el metabolismo la fosforilación de tirosinas aparece en las vías de transducción relacionadas.

El esquema principal del proceso es el siguiente:

Como se observa, para la fosforilación, el grupo fosfato viene del ATP (más concretamente desoxiATP). Estas enzimas liberan el fostato en ganma (ilustración 5) y, como se ha menocionado, establecen con el un enlace fosfodiester con el OH.

En lo referente a la coordinación del metabolismo, en cuanto a los dos grupos:

A. Exiten PK dependientes de mensajeros intracelulares (lo que implica la existencia de señales extracelulares), como por ejemplo sucede en el caso de la PKA (dependiente de cAMP); así como también encontramos PK dependientes de señales metabólicas, como son el caso de la AMPK (PK activada por AMP) o la PDK (piruvato deshidrogenasa kinasa).

B. De igual manera tenemos proteínas fosfatasas dependientes de señales intracelulares, y también pueden haber dependientes de señales metabólicas.

Cabe destacar una particularidad, la concertación entre la modulación alostérica y la fosforilación/ desfosforilación, de forma que en algunos casos la unión de un modulador alostérico a una enzima facilita su fosforilación por una PK, o la impide; o viceversa, es decir, la unión de un modulador alostérico a una enzima, en este caso, fosforilada puede favorecer o inhibier su desfosforilación por una proteina fosfatasa. Si incluimos este concepto en el esquema anterior quedaría así:

4. Interacción proteínaenzima. Obviamente no se trata de una interacción covalente; un ejemplo típico es la interacción de la calmodulina (CaM) con muchas enzimas. La calmodulina es la proteína que media la mayoría de los efectos del Ca2+, de forma que, en

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ENZIMA (Ser/ Thr) ENZIMA (Ser/ Thr – P)

Activada/ Inhibida Inhibida /Activada

ATP ADP

Pi H2O

PK

PPasa

Ilustración 5: ATP, y liberación del fosfato en ganma.

Adenina

Desoxiribosa Pα– P β– Pγ

ENZIMA (Ser/ Thr) ENZIMA (Ser/ Thr – P)

H2O

PPasaPi

Inhibida /ActivadaActivada/ Inhibida

Modulador alostérico PK ADPATP Modulador

alostérico


general, la calmodulina libre de Ca2+ se encuentra disociada de sus enzimas diana, que a su vez se encuentran inactivas. Si en respuesta a una señal intracelular aumentan los niveles de Ca2+, el catión se une a la calmodulina que cambia de conformación y se une a sus enzimas diana, que normalmente se van a activar; si tras esto disminuyen los niveles de Ca2+, el catión se libera de la enzima, con lo cual la enzima se inhibe.

De forma general, y como ocurre con el ejemplo mencionado (dado que el Ca2+ es un mensajero secundario), se trata de un sistema de control en respuesta a señales extracelulares.

3.2 Control de los niveles enzimáticosEste control se basa en una proteína (la enzima) cuya concentración aumenta y disminuye.

Lógicamente, como proteína viene de un mRNA, que a su vez viene del DNA; por tanto sus niveles dependen de cuatro procesos:

i. Transcripción de DNA.

ii. Traducción de mRNA.

iii. Degradación de mRNA

iv. Degradación proteica.

Pero la forma más generalizada, o al menos más conocida, de forma de control de los niveles de una proteína es el control trancripcional, que a su vez se ejerce de 3 maneras:

1. Por unión de mensajeros o señales extracelulares (que por tanto han de ser hidrofóbicas) a factores de transcripcción.

2. Por fosforilación de factores de transcripcción en respuesta a señales extracelulares

3. Por la unión de señales metabólicas a factores de transcripción.

NOTA: En eucariotas, la RNA polimerasa no se une directamente al DNA, como es el caso de procariotas, si no que lo hace a factores de transcripción, los cuales sí están unidos al DNA, formando en conjunto (DNA, factores de transcripción y RNA polimerasa) el complejo de transcripción.

Mediante estos tres mecanismos, o bien se favorece la formación del complejo de transcripción (y por tanto la transcripcion), o bien se desfavorece.

Se concluye que el control de los niveles enzimáticos es respuesta a señales extracelulares y metabólicas.

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CaM + ENZIMA Ca2+– CaM – ENZIMA

ActivadaInhibida

[Ca2+ ]↑

[Ca2+↓]

DNA mRNA [Proteína↑] Degradación

Degradación


Características de las proteínas cuyos niveles están sujetos a regulación

El requisito principal que han de cumplir estas proteínas es tener una vida media corta, dado que su degradación es la única vía que baja sus niveles.

Además, en comparación con los mecanismos de control con los referentes a la actividad, este se trata de un mecanismo a más largo plazo, más lento, pues implica transcripción, procesado del mRNA, traducción y procesamiento proteico, con la excepción de la modificación covalente de la enzima, caso en el que, eso sí, el efecto es rápido.

3.3 Doble controlUna enzima puede verse también sujeta a un doble control, es decir, debido a control de su

actividad enzimática y de sus niveles.

TEMA 2: MENSAJEROS EXTRACELULARES Y RECEPTORES

1. Comunicación celular La regulación es la integración de las funciones celulares en el organismos pluricelulares

complejos, depende de la transmisión de información entre las células, que es llevada a cabo por mensajeros extracelulares. En la transmisión de información definimos dos tipos celulares (Ilustración 6):

1. La célula emisora, aquella que sintetiza, libera, y a veces almacena, un mensajero extracelular.

2. La célula blanco o diana, aquella que produce la recepción de la información contenida en el mensajero extracelular, y como consecuencia elabora una respuesta.

Hay que tener en cuenta que un mismo mensajero extracelular puede intervenirr en más de un tipo de comunicación celular diferente; el ejemplo típico es la adrenalina, que intervienen en la comunicación sináptica y endocrina.

1.1 Comunicación endocrinaLas características principales de este sistema de comunicación son las siguientes:

1. En este sistema de comunicación, célula emisora y célula blanco están muy distantes.

2. Esto implica la liberación del mensajero extracelular a la sangre, y por tanto su dilución en un gran volumen, debido a lo cual los niveles de mensajeros de comunicación endocrina será muy bajos (1011 o 109 M); esto supone que la afinidad de los repectores por estos mensajeros ha de ser muy alta.

3. La vida media de los mensajeros extracelulares endocrinos va a ser elevada, por tanto cundo cambian los requerimientos puede haber circulación de varios mensajeros opuestos,

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Ilustración 6: Transmisión de información

Medio extracelular

RecepciónRespuesta

Síntesis(Almacenamiento)Liberación

Cel. blancoCel. emisora


que para coordinar sus funciones necesitaran de señales metabólicas.

Los mensajeros extracelulares que median la comunicación endocrina se pueden dividir en tres grupos:

i. Hormonas, si están liberadas por una célula de una glándula endocrina.

ii. Neurohormonas, si están liberados por una neurona, y otra célula nerviosa.

iii. Hormonas de acción trópica, donde la célula blanco es una célula secretora de otra célula endocrina diferente, cuya respuesta será la liberación de otra hormona diferente.

1.2 Comunicación sinápticaDe forma paráloga al caso anterior, caben citar tres características:

1. En la comunicación sináptica la célula emisora siempre es una neurona, y está en estrecho contacto con su célula blanco, que puede ser una neurona u otra célula diferente.

2. El mensajero se libera a la hendidura sináptica (de un espesor de unos 20nm), donde por tanto la concentración del mensajero es elevada (5∙104). Esto determina que la afinidad de los receptores por el mensajero es menor que en la comunicación endocrina.

3. La vida media de los mensajeros va a ser baja, de forma que los mensajeros podrán ser:

(a) Rápidamente degradados extracelularmente, en la hendidura sináptica. Por ejemplo la acetilcolina y la acetilcolirestenasa (una proteína de membrana con el centro catalítico hacia el medio extracelular).

(b) O capturados por diferentes células:

i. Célula presináptica.

ii. Célula postsináptica.

iii. Células gliales que rodean la hendidura sináptica.

Y una vez capturados, los mensajeros extracelulares podrán ser:

i. Reutilizados.

ii. Degradados intracelularmente.

Los mensajeros extracelulares que participan en la comunicación sináptica son:

i. Neurotransmisores, implicados en las vías principales de comunicación.

ii. Neuromoduladores, liberados a sinapsis colaterales que modulan la vía principal de comunicación.

1.3 Comunicación paracrinaSe pueden destacar estas dos características:

1. Célula emisora y blanco están próximas, pero no se tratan de neuronas.

2. No hay liberación del mensajero extracelular a la sangre.

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Los mensajeros extracelulares se conocen como mediadores locales.

Comunicación autocrina

Un caso particular de comunicación paracrina es la autocrina, en la cual la célula emisora y la célula blanco son del mismo tipo, e incluso la misma. Un ejemplo lo constituyen los factores de crecimiento tumorales.

2. Estructura química de los mensajeros extracelulares Las señales que recibe una célula pueden ser químicas o físicas, y pueden proceder o bien

del mismo organismo o del exterior. Así:

1. Físicas como la luz, el sonido, la presión.

2. Químicas, como las moléculas implicadas en el gusto, el olfato, las feromonas, moléculas de la superficie de células contiguas o de la matriz extracelular (es decir, las que participan en la adhesión célulacélula, o célulamatriz); y también los mensajeros extracelulares que intervienen en la comunicación celular.

Estos mensajeros extracelulares pueden ser moléculas inorgánicas o orgánicas, y dentro de las orgánicas van a ser hidrosolubles y liposolubles (que por tanto pueden atravesar las membranas, pero presentan el inconveniente de que si son endocrinas necesitan de proteínas para el transporte en el medio acuoso que es la sangre).

2.1 Tipos de estructura química de los mensajeros extracelulares 1. Sustancias inorgánicas. Como el NO (óxido nítrico, gas) y el Ca2+ (obviamente

extracelular).

A continuación se enumerarán los mensajeros extracelulares orgánicos:

2. Nucleósidos y nucleótidos. (Ilustración 7) Un nucleósido, como puede ser la adenosina, está formado por un azúcar y una base nitrogenada. Un nucleótido, como el ATP (que además de la implicación energética también es un mensajero extracelular) está formado por una base nitrogenada, un azúcar, y uno o varios fosfatos.

3. Aminas. Que a su vez se dividen en dos tipos:

(a) Lineales, como la acetilcolina, el primer mensajero extracelular descubierto.

(b) Cíclicas, como las catecolaminas (como son la adrenalina y la noradrenalina) y la indolalquilaminas (entre las que figura la serotonina, también conocida como 5

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Adenosina ATP


Hidroxitriptamina o 5HT).

4. Aminoácidos. Todo aminoácidos presenta un grupo carboxílico y un grupo amino. Se pueden clasificar en dos grupos:

(a) Aminoácidosα , en los cuales el grupo amino se encuentra en el carbono , es decir, elα siguiente al carboxílico. A su vez dividimos:

i. Aminoácidos proteicosα , como glutámico y glicocola (que se trata del aminoácido más sencillo, con un H de cadena lateral).

ii. Aminoácidos no proteicosα , es decir, con disposición en el carbono del grupoα amino pero que no se encuentra en proteínas. Un ejemplo lo constituye la tiroxina (tetraiodotironina o T4), o su análogo la triiodotironina (T3). Ambos derivan de la tirosina, y se caracterizan de presentar iodo, un elemento escasísimo.

(b) Otros aminoácidos, es decir, no Aminoácidos, y que por tanto presentan el grupoα amino en una posición diferente del carbono ; obviamente no son proteicos. Comoα ejemplo destaca el GABA o ácido aminobutírico, con el grupo amino en .γ γ

5. Péptidos y proteínas. Por convenio un péptido está integrado por entre 3 y 50 aminoácidos, y una proteína tiene más de 50. Tanto péptidos como proteínas proceden siempre de precursores inactivos de mayor tamaño que el mensajero extracelular al que darán parte, debido a modificaciones postraduccionales de dos tipos:

A. Proteolisis limitada en todos los casos.

B. Glicosilación aveces, que es la adición covalente de hidratos de carbono.

De liberarse más de un péptido activo a partir de un precursor, pueden tratarse de dos o más cadenas del mismo mensajero extracelular, como es el caso de la insulina, cuyo precursor

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Glutámico Tiroxina GABA

H3+NCH2CH2CH2COO

Aminoácido tirosina

Precursor inactivo Péptido/s activos

Proteolisis limitada (Glicosilación)

Péptido/s inactivos

Actetilcolina Adrenalina (Catecolamina) Serotonina (Indolalquilamina)

(CH3)3N+CH2CH2O.CO.CH3

Grupo IndolGrupo Catecol


contiene tanto las cadenas A y B, presentes en el mensajero extracelular como tal, además del péptido C, no activo; o bien puede darse el caso de que a partir de un mismo precursor se escindan dos o más peptidos diferentes, como suceden en la propiomelanocortina (en la cual además el punto de corte varía en función de la zona de la adenohipófisis en la que suceda).

(a) Ejemplos de péptidos como mensajeros extracelulares son la TRH o tiroliberina (hormona liberadora de tironina, con sólo 3 aminoácidos) o el glucagón (con 29 aminoácidos).

(b) Ejemplos de proteínas son la insulina (con una cadena A de 21 aminoácidos y una cadena B de 30 aminoácidos, que tras la ruptura del péptido C quedan unidas por puentes disulfuro; y que por tanto suman un conjunto de 51 aminoácidos, y se han utilizado para definir el límite entre péptido y proteína), o proteínas más grandes como la TSH o tirotropina (hormona estimuladora del tiroides, con dos subunidades unidas no covalentemente, la subunidad ,α de 89 aminoácidos; y la subunidad ,β de 112 aminoácidos; y con un alto nivel de carbohidratos).

Cabe mencionar que en algunos casos el precursor inactivo es liberado a la sangre donde sufre el proteolisis limitada extracelular para dar las formas activas. Es el caso del angiotensinógeno, que sufre proteolisis limitada extracelular para dar lugar a la angiotensina.

Hasta este punto se han mencionado los mensajeros extracelulares orgánicos hidrosolubles. A partir de este punto se mencionaran los liposolubles.

6. Esteroides y derivados, como el cortisol (hormona esteroidea) y el 1,25hidroxicolecalciferol o vitamina D [NOTA: las vitaminas tienen dos funciones, o cofactores, como todas las Bs; o mensajeros extracelulares]. Se caracterizan por derivar del colesterol (de ahí

que se denominan esteroides), lo que determina su liposolubilidad.

7. Terpenos. Se caracterizan por presentar enlaces conjugados, como sucede por ejemplo en el ácido 9cisretinoico o vitamina A.

8. Derivados de ácidos grasos. Ejemplos de mensajeros extracelulares derivados de ácidos grasos son las prostaglandinas (concretamente derivados del ácido araquidónico) o los leucotrienos (cabe destacar que el leucotrieno C4 tiene un tripéptido unido covalentemente a la estructura del ácido graso que se sintetiza independientemente de la síntesis ribosomal, el glutatión).

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Cortisol (Hormona esteroídica) 1,25dihidroxicolecalciferol

Ácido 9cisretinoico (Vitamina A)


2.2 Síntesis, almacenamiento y liberación de mensajeros extracelulares hidrosolubles

En general, todos los mensajeros extracelulares hidrosolubles (nucleótidos y nucleósidos, aminas, aminoácidos y péptidos y proteínas) se almacenan en vesículas de secreción y se liberan por exocitosis, proceso regulado por los niveles de Ca2+ citosólico (hay que tener en cuenta que Ca2+

citosólico no es equivalente a Ca2+ intracelular, dado que el catión puede estar almacenado en el retículo endoplásmico), de forma que sí aumentan se produce la fusión de la vesícula con la membrana extracelular, y con ello la liberación por exocitosis del mensajero.

Previo al desglose del punto, será útil hacer un recordatorio de los sistemas de transporte celulares, que mediaran el almacenamiento de algunos mensajeros.

Sistemas de transporte

Diferenciamos transporte pasivo y activo, en función del gradiente de la molécula transportada:

1. Si la molécula se transporta en contra de gradiente se lleva a cabo un transporte activo, que a su vez se diferencia en dos tipos:

(a) Primario, que presenta ATPasas implicadas, y por tanto requiere directamente de hidrólisis de ATP.

(b) Secundario, el denominado cotransporte, es el transporte de una especie en contra de gradiente acoplado al transporte de otra especie a favor de gradiente (proceso espontáneo del cual se obtiene la energía para el primero); a su vez diferenciamos:

i. Simporte, si el transporte de las dos especies tienen el mismo sentido.

ii. Antiporte, si el sentido del transporte de las especies es opuesto.

Cabe mencionar que el gradiente de concentración que posibilita el cotransporte en general está generado por transporte activo primario, y por tanto el transporte secundario necesita de hidrólisis de ATP previa. Además, en ambos casos se necesita del concurso de proteínas.

2. Si la molécula se transporta a favor de gradiente se da transporte pasivo, donde también diferenciamos dos tipos:

(a) Difusión simple, para la cual no se requieren proteínas, si no que se da a través de las membranas. Es el caso del transporte a favor de gradiente de moléculas liposolubles o gases.

(b) Difusión facilitada, que sí requiere de proteínas, y en el que se transportan pasivamente moléculas polares (con o sin carga).

Almacenaje en vesículas de secreción

Se produce de diferentes maneras, en función de la naturaleza del mensajero orgánico hidrosoluble:

1. En el caso de los péptidos y proteínas, se sintetizan siempre como proteínas de secreción,

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es decir en ribosomas asociados al retículo endoplasmático rugoso; de aquí pasan por la vía endocítica al aparato de Golgi, en cuyos extremos se desprenden las vesículas de secreción. Además, en este tránsito hacia las vesículas tendrá lugar el procesamiento proteico. Así se concluye que para los péptidos y proteínas, la síntesis y la incorporación a vesículas se dan en el mismo proceso.

2. El resto de mensajeros de naturaleza orgánica hidrosoluble (nucleótidos y nucleósidos, aminas y aminoácidos) se sintetizan en el citosol, desde donde tendrán que ser transportadosal interior de una vesícula de secreción.

Esto implica la concentración en las vesículas secretoras del mensajero, donde habrá por tanto una concentración superior a la del citosol, desde donde deberá darse un transporte activo (en contra de gradiente), que en este caso se realiza acoplado a la salida a favor de gradiente de H+ en un cotransporte de tipo antiporte (transporte secundario). A su vez, la alta concentración de H+ en la vesícula de secreción que posibilita este cotransporte la genera una ATPasa de H+(transporte primario), que a transportado H+ del exterior al interior de la vesícula utilizando energía procedente de la hidrólisis de ATP (Ilustración 7).

Control de los mensajeros extracelulares orgánicos hidrosolubles

Por último, en estos mensajeros extracelulares orgánicos hidrosolubles el control recae en su liberación.

2.3 Síntesis y liberación de los mensajeros extracelulares orgánicos liposolubles, gaseosos y Ca2+

Los mensajeros extracelulares gaseosos (como el NO) o orgánicos liposolubles se van a sintetizar en la célula emisora, pero debido a que difunden en las membranas celulares, obviamente no estarán sometidos a almacenamiento; es decir, según se sintetizan serán liberados, además mediante difusión simple. En consecuencia, se controla su síntesis.

En cuanto al Ca2+ extracelular, será considerado como mensajero extracelular en tanto en cuanto existan receptores para él, y provoque con la correspondiente unión una respuesta; pero hay que tener en cuenta que ni se almacena ni se libera.

3. Tipos de sistemas receptores para mensajeros extracelulares

3.1 Conceptos previosUn receptor será aquella proteína presente en la célula diana que reconoce la información

contenida en el mensajero extracelular; información que se reconoce con la unión del mensajero

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RER Ap. de Golgi Vesícula secretora Exocitosis

Citosol Vesícula secretora Exocitosis

Ilustración 7: Almacenamiento de mensajeros orgánicos hidrosolubles no peptídicos.


extracelular al mismo recepto, y por tanto de esta misma unión se deduce el concepto ligando. Ligando es la molécula que se puede unir a un receptor, y puede ser tanto los mencionados mensajeros extracelulares como moléculas similares. Así, tenemos dos tipos de ligandos:

(a) Mensajeros extracelulares, denominados ligandos endógenos.

(b) Otros ligandos, conocidos como agentes farmacológicos, que pueden ser naturales o de síntesis.

Por ejemplo, para receptor de acetilcolina (Ach), el ligando endógeno es la acetilcolina, pero algunos receptores pueden unir también nicotina (agente farmacológico con origen en plantas) o muscarina (agente farmacológico con origen en hongos). Distinguimos dos tipos de lingandos en función de su acción:

1. Si la unión del ligando con el receptor provoca una respuesta, ese ligando se conoce como agonista, concretamente provoca un cambio conformacional en la proteína receptora que induce la respuesta.

2. Si la unión del ligando con el receptor no provoca respuesta, debido a que no se ha producido cambio conformacional en el receptor, se denomina antagonista o bloqueantes. La función de estos será impedir que un agonista se una y provoque una respuesta.

Todos los ligandos endógenos son agonistas, los antagonistas son siempre agentes farmacológicos que se utilizan para modular la respuesta inducida por los agonistas. Ahora bien, obviamente hay agentes farmacológicos agonistas, que se pueden utilizar para incrementar una respuesta.

La unión receptorligando presenta tres características generales y principales:

1. Reversibilidad. Es decir, se puede dar un equilibrio asociacióndisociación de la unión, que a su vez estará regulado por la concentración de ligando: R + L ⇄ RL.

2. Elevada afinidad. Desde los neurontransmisores (donde es menor) hasta las hormonas (donde será muy alta).

3. Especificidad estereotípica. De haber esteroisómeros, como en el caso de los aminoácidos (donde hay formas D y L), los receptores reconocen una sola de las formas.

El efector es la proteína que con la unión del mensajero extracelular agonista al receptor experimenta un cambio conformacional, y como consecuencia efectúa una respuesta. De esta forma, un sistema receptor es la suma de un receptor y un efector, que puede estar constituido por una o más proteínas. Cuando el sistema está compuesto por una proteína, una parte de ella actúa como efectora y otra como receptora; si son más de una, el receptor y el efector son proteínas diferentes.

3.2 Clasificación de sistemas receptoresEn primer lugar, en función de donde se encuentren, se diferencian entre sistemas receptores

de la membrana plasmática e intracelulares:

• En cuanto a los sistemas receptores de membrana plasmática, presentan las siguientes características:

a) Son sistemas receptores para mensajeros orgánicos de naturaleza hidrosoluble (que no

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puede atravesar la membrana plasmática). Es decir, sistemas orientados hacia el exterior de la célula.

b) El componente receptor y efector pueden o bien formar una proteína o proteínas diferentes.

c) Tiene que haber transducción de la señal del exterior de la célula al interior, lo que implica la generación de mensajeros intracelulares.

• A continuación, contrastaremos estas características con las de los sistemas receptores intracelulares:

a) Son sistemas receptores para mensajeros orgánicos de naturaleza liposoluble, que por tanto atraviesan libremente la membrana plasmática.

b) Receptor y efector siempre forman parte de la misma proteína.

c) Referente a estos sistemas, no es necesaria la transducción de la señal, por tanto no es necesaria la formación de mensajeros intracelulares.

3.3 Tipos de sistemas receptores de membrana plasmáticaEn primer lugar se diferencian dos grandes grupos, en función de si estén constituidos por

una sola proteína o por varias:

• Sistemas receptores constituidos por una sola proteína:

a) Receptores que constituyen canales iónicos. Permiten el paso de iones a favor de gradiente de concentración y carga (gradiente electroquímico). La unión del mensajero extracelular o cualquier otro agonista, que en general son moléculas de pequeño tamaño, inducirán la apertura del canal.

Como el efector y el receptor forman parte de la misma proteína, el canal se abrirá cuando se asocie y se cerrará cuando se disocie. Estos sistemas receptores tienen una respuesta más rápida que el resto (al no implicar interacción entre varias proteínas), por lo que están relacionados con la comunicación sináptica.

b) Receptores con actividad enzimática. El efector va a ser una enzima y van a unir siempre mensajeros intracelulares de naturaleza peptídica. Como por ejemplo los receptores con actividad tirosin kinasa, como el receptor de insulina (la insulina tiene 59 aminoácidos, y por tanto se encuentra en la frontera entre proteína y péptido, pero es considerado péptido).

• Los constituidos por más de una proteína son los sistemas receptores acoplados a proteínas G. Estos sistemas, como tales, tienen tres componentes proteicos: receptor, efector y proteínas reguladoras ligantes de nucleótidos de guanina. El efector puede ser una enzima o un canal iónico dependiente de voltaje (permite el paso a favor de gradiente de iones). En cuanto a los últimos, los canales iónicos dependientes de voltaje, los sistemas se ocupan de la modulación del tiempo de apertura.

Son los sistemas efectores de respuesta más lenta, y unen mensajeros químicos de estructura muy diversa (concretamente, los que tienen como efectores enzimas unen moléculas pequeñas, y los que modulan canales iónicos dependientes de voltaje, péptidos).

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Un mismo mensajero extracelular puede actuar a través de distintos tipos de sistemas receptores de membrana plasmática. Por ejemplo, los receptores nicotínicos de ACh (acetilcolina) pertenecen al primer tipo citado, receptores que constituyen canales iónicos, y los muscarínicos a los últimos, sistemas receptores acoplados a proteínas G. Sin embargo, obviamente la nicotina sólo activa los receptores canales y la muscarina los acoplados a proteína G.

4. Interacción receptorligando La interacción receptorligando se da en cualquier tipo de receptor, ya sea intracelular,

extracelular... Y además también es independiente del tipo de ligando, pues hablamos de interacción, no de respuesta. En las técnicas clásicas de análisis de la interacción no se emplean receptores purificados, sino células intactas, homogeneizados o preparaciones de membrana plasmática, y los ligandos van a estar marcados radiactivamente.

4.1 Determinación de los parámetros de unión mediante estudios directosLos parámetros de unión son:

1. La afinidad del receptor por el ligando (no del ligando por el receptor), un parámetro que dependerá del ligando. Es decir, un mismo receptor tendrá diferente afinidad por diferentes ligandos.

2. El otro parámetro es la concentración de receptor. Se trata de un parámetro independiente del ligando, pues puede unirse de forma más rápida o lenta, pero a la concentración suficiente se acaba saturando todos los receptores. Este parámetro es importante debido a que esta relacionado con la magnitud de la respuesta (para ligandos agonistas). Es decir, da una idea de los sensibles que son las células en estudio a un ligando concreto.

Primer caso: Existencia de un solo tipo de unión

El caso general es considerar un solo tipo de sitio de unión en el receptor (y en la célula):

– Inicialmente:

Donde CS0 es la concentración total de sitios libres, y CL

0 es la concertación total de ligandos.

– Posteriormente, en equilibrio (en función del tiempo y la temperatura):

Donde CS es la concentración de sitios libres, CL la concentración de ligandos libres, y CSL la

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CS0 + CL

0

+

CS + CL CSL

+


concentración de sitios ocupados o de ligando unido.

Este equilibrio permite utilizar las siguientes constantes (en unidades de concentración 1):

Siendo Ka la constante de asociación, y Kd la constante de disociación.

En los estudios de interacción receptorligando, se pretende determinar la concentración de sitios libres inicial, CS

0 y la constante de disociación, Kd (inversa de la afinidad).

La CS en el equilibrio es igual a la concentración total de sitios menos la concentración de sitios ocupados (CS=CS

0 CSL). Si sustituyo esto en la ecuación de la constante de afinidad llegaré a la siguiente relación:

Esta ecuación es análoga a la de MichaelisMenten, y por tanto podemos hacer la consiguiente representación:

Para alcanzar CS0 hay que trabajar en concentraciones de saturación, es decir, en

concentraciones de ligando muy altas, y eso puede traer problemas de solubilidad. En consecuencia se requiere una representación rectilínea, y para ello, partiendo de la sustitución anterior se puede llegar a esta ecuación:

Esta es la ecuación de Scatchard, que ya es la ecuación de una recta con una pendiente de

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K a=C SL

C S⋅C L

K d=CS⋅CL

CSL

K d=1

afinidad

CSL=C S

0 ∙CL

K dC L

CSL

C L

=C S

0

K d

−CSL

K d


1/Kd (que puede ser sacado factor común), donde el signo negativo, por tanto, sólo indica el sentido de la recta.

NOTA: Extrapolar es alargar la recta, intrapolar es obtener el punto de corte.

En el punto de corte de la recta con el eje de las abscisas (X) se puede obtener el parámetro CS

0:

Por tanto se puede calcular CS0 sin necesidad de condiciones de saturación. Y en el punto

donde la recta corta al eje de las ordenadas (Y) el segundo término de la ecuación de Scatchard es cero, y la relación CSL/CL es igual a b (que no tiene unidades):

De esta manera se puede obtener por tanto Kd, inversa de la afinidad (que tiene unidades de concentración).

Para obtener estos parámetros experimentalmente, tendré una serie de tubos con la misma concentración de células o de membrana, y por tanto con los mismos sitios de unión, y le iré aumentado la concentración de ligando marcado radiactivamente. Tras esto se incuba, y una vez alcanzado el equilibrio habrá una porción de ligando libre y otra unida al receptor. Para hacer la representación de Scatchard se necesita las concentraciones obtenidas tras la incubación. Para obtener estos datos, si se trabaja con membrana o células se suele hacer por filtración, el filtro obtiene las células o membranas , y con ellas el ligando unido, y eluye el ligando no unido. De esta manera, la concentración de ligando libre puede calcularse midiendo la radiactividad del material filtrado, pero como hay que lavar muchos el filtro para impedir la unión inespecífica se genera una gran concentración de filtrado, y dado que hay que utilizar líquido de centelleo (disolventes orgánicos, no hidrosolubles) se hace inabarcable el cálculo de la radiactividad con el filtrado. Por tanto, se hace con la diferencia del utilizado (CL

0) entre el unido:

Por tanto, con este procedimiento tengo CSL y CL, y por tanto su relación CSL/CL, y con los valores de CSL y CSL/CL tengo las coordenadas de la recta de la representación de Scatchard. Una vez

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0=C SL

CL

; 0=C S

0

K d

−CSL

K d

;C S

0

K d

=CSL

K d

CSL=CS0

b=CS

0

K d

K d=CS

0

b

C L=C L0−CSL


representado se extrapola hasta que corte con los ejes, y después interpolando tengo en el eje X CS0,

la concentración total de sitios (denominado también unión máxima); y en el eje Y b, con el cual puedo obtener Kd.

En los trabajos ingleses, todas estos parámetros tienen otras denominaciones:

– CSL, concentración de ligando unido, se denomina B, de bound. En consecuencia, la concentración total de sitios o unión máxima es CS

0 es Bmax.

– CL, concentracion de ligando libre, se conoce como F, de free.

Por tanto, la relación de la representación de Scatchard CSL/CL es B/F.

Segundo caso: Existencia de más de un tipo de unión no interaccionantes

Existen variedades de receptores que pueden unir el mismo ligando, por ejemplo una célula puede expresar receptores adrenérgico y adrα β enérgicos,teniendo los dos como ligandos endógenos tanto adrenalina como noradrenalina.

En el caso de que valorásemos la unión del ligando a estos dos tipos de receptores, al representación de Scatchard saldría compleja, donde cada componente de la línea correspondría a un receptor. Por tanto, la representación se podría descomponer en dos rectas, donde la pendiente de cada recta correspondería a 1/Kd. Como ya sabemos, cuanto mayor es la pendiente menor es la Kd, y mayor es la afinidad. Es decir, en el caso del ejemplo propuesto el sitio 1 es el receptor de mayor afinidad.

Ahora bien, en la representación sale una línea de dos componentes siempre y cuando la afinidad de los receptores sea suficientemente diferente.

Tercer caso: Existencia de más de un tipo e sitios de unión interaccionantes

Se trata de receptores con más de un sitio de unión para el ligando, y que además presentan cooperatividad positiva o negativa. Por ejemplo, el receptor de nicontina de ACh tiene dos sitios de unión para el ligando, y la unión se produce con cooperatividad positiva. En estos receptores hay sitios de alta afinidad (donde se dan primero), y da baja afinidad. En enzimas y receptores este caso no es muy abundante.

En una representación de Scatchard con estos receptores se obtiene curvas. En el caso de cooperatividad negativa es muy difícil saber si estoy tratando con un receptor al cual se le unen varios ligandos con coopertividad negativa, o más de un receptor con diferentes afinidades. Para

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resolver este problema se trata el receptor con agentes de modificación covalente con el fin de bloquear uno de los dos sitios. Si se puede bloquear la unión en uno de los dos sitios (con lo cual desaparece uno de los componentes de la línea), habrá diferentes receptores (caso 2), pero si se abole toda la unión es signo de que estoy tratando con un solo receptor, y por tanto estoy en el caso de varios sitios de unión interaccionantes.

4.2 Estudios indirectos o de desplazamientoEn los estudios directos siempre se deja fija concentración de sitios, aunque no se conozca, y

se va aumentando la concentración de ligando marcado radiactivamente. En este caso, también se deja fija la concentración de sitios, pero se deja fija la concentración de ligando marcado radiactivamente y se añaden concentraciones crecientes de un ligando frío (no marcado) (conocido como agente desplazante o I), de forma que el ligando frío compite con el ligando marcado.

Como muestra la gráfica, se detecta el ligando unido al principio porque está marcado radiactivamente. Es decir, se va filtrando las células o membranas y se va midiendo la radiactividad.

Este sistema va a tener las siguientes aplicaciones:

Aplicación 1: Determinación de la unión inespecífica

En los estudio directos se pueden tener casos de unión inespecífica aunque se trabajen en condiciones no saturables, sobretodo si se trabajo con preparaciones no purificadas. Esto se debe a que mediante estudios directos se obtengo unión total (específica + inespecífica), y por tanto habrá que determinar mediante estudios indirectos que parte de la unión total corresponde a la unión inespecífica.

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En el caso A únicamente el ligando se une específicamente al receptor, pues conforme aumenta la concentración del ligando desplazante [I] es posible desplazar todo el ligando radiactivo unido, porque el número de sitios al que está unido el ligando marcado es finito (por eso al final la línea corta con el eje de abcisas, la concentración de ligando marcado unido es 0).

En el caso B por mucho que aumente la concentración de [I] no se podrá desplazar todo el ligando marcado, porque hay un componente de unión inespecífica. Es decir, es posible desplazar el ligando marcado unido al receptor, pero por mucho que aumente la concentración de ligando frío no se puede desplazar el marcado unidos inespecíficamente a otros sítios.

En consecuencia, mediante estudios indirectos se calcula la unión inespecífica, y mediante la diferencia unión total – unión inespecífica se obtiene la unión específica. Es importante discernir entre las dos uniones en un componente recto de la unión inespecífica, para estar seguro que por mucho que se aumente la concentración.

Por último, estos estudios se hacen para la concentración más alta de ligando, y así es posible ahorrarse realizarlos con los de menos concentración de ligando.

Aplicación 2: Clasificación de subtipos de receptores

Estos estudios se hacen a una concentración fija de ligando marcado, y se basan en comparar el desplazamiento de ese ligando marcado por distintos agonistas o antagonistas fríos (denominados desplazantes: en la ilustración I1, I2 e I3).

Pueden existir más de un tipo de un receptor (tipo A, tipo B... como por ejemplo, el receptor

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muscarínico y nicotínico de ACh). La caracterización de los tipos se hace en función de la activación que hace de ese receptor su ligando u otro agonista, es decir, en función de la respuesta. Siguiendo el ejemplo, el receptor de ACh nicotínico es un receptor que abre un canal, y el muscarínico está acoplado a proteína G. Aveces es algo más complejo, y por ejemplo en el caso de los receptores adrenérgicos, que todos están acoplados a proteína G, los tipos se clasifican en función del efector que resulta regulado (pero siempre en función de su respuesta). En este sentido tendríamos receptores adrenérβ gicos, todos acplados a la activación de la adenilato ciclasa; y α adrenérgicos, que unos inhiben la adenilato ciclasa y otros activan la Plasa C de PIP2.

Pero la clasificación de los subtipos de hace en función de los estudios de desplazamiento, y para ello se utiliza el parámetro IC 50, o concentración inhibidora 50. La IC50 es la concentración de agente desplazante o frío (I) necesaria para desplazar el 50% del ligando unido marcado (L*). El valor de IC 50 depende de la concentración de ligando unido, pero si esto los dejo fijo se puede comparar la potencia de desplazamiento entre varios agentes desplazantes y el unido marcado. Por tanto, esto permite comparar la potencia de desplazamiento de diversos agonistas y antagonistas; en el ejemplo, la mayor potencia de desplazamiento la presenta I3.

Por tanto, se clasifica un subtipo A1 por que presenta esta gráfica característica, y muestra una potencia de desplazamiento decreciente I3 > I2 > I1; y podría diferenciarse de un subtipo A2 por que este mostrara una potencia de desplazamiento diferente, por ejemplo I2>I1>I3.

Como hemos dicho, este se hace con diversos agonitas y antagonistas, y podrían salir caracterizaciones iguales o diferentes con ambos, pero una sola diferencia sería suficiente para caracterizar los subtipos.

La potencia de desplazamiento esta en relación inversa con los valores de IC 50, así en eel primer caso: IC 503 < IC502 < IC501. De esto se deduce que el receptor al que se une el ligando marcado (L*) y al que se une I3, I2 e I1 tendrá más afinidad por el compuesto I3, pues a menor concentración, mientras que I3 desplaza el 50%, los otros han desplazado menos. Pero el parámetro de Kd no lo puedo saber, y para ello requiero una representación de Scatchard.

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TEMA 3: RECEPTORES DE MEMBRANA PLASMÁTICA

1. Receptores canales En los receptores canales, donde la misma proteína será efector y receptor. Son proteínas

homo o heterooligoméricas (es decir, formada por varias subunidades del mismo o diferente tipos), cuyas subunidades presentan siempre al menos dos segmentos transmembrana. Obviamente, estos segmentos transmembrana deben poseer una estructura en héliα ce hidrofóbica, donde las cadenas de sus aminoácidos se dirigen a las colas hidrofóbicas de los fosfolípidos. Ahora bien, todas las subunidades de estos canales contribuyen en la formación del poro, que ha de ser hidrofílico, por lo que al menos uno de sus segmentos transmembrana de cada subunidad ha de ser una héliceα anfipática (con residuos polares y apolares), cuyos residuos polares estarán orientados hacia la luz del poro.

Por último en lo referente a sus estructura general, aunque se trate de proteínas que pueden ser heteroméricas, dentro de cada tipo de receptor las subunidades presentan la misma pauta estructural.

En cuanto a su mecanismo de acción, la activación de los receptores canales conlleva a la apertura del canal, con lo que se posibilita un transporte pasivo por difusión facilitada de iones, Na+/K+, Ca2+ o Cl, según el caso.

Los ligandos asociados a estos receptores son moléculas de pequeño tamaño, en general neurotransmisores, donde la finalización de la respuesta, es decir, el cierre del canal iónico, es rápida y se debe a la disociación del ligando. El ligando no asociado será degradado y/o capturado, con lo que baja su concentración, y se desplaza el equilibrio del complejo receptorligando a su disociación.

1.1 Receptor nicotínico de acetilcolinaEs un heteropentámero constituido por las subunidades 2 , , y α β γ δ, que se encuentran

codificadas por genes diferentes. Constituye un cana del Na+/K+, lo que en el medio fisiológico conlleva a la entrada de Na+ y la salida de K+. En las células este intercambio de iones provoca la despolarización de su membrana.

La pauta estructural de sus subunidades (igual para todas, como se señalo en la introducción al apartado) es cuatro segmentos transmembrana, con los extremo aminoterminal y carboxiloterminal hacia el exterior (ilustración 8). Esto define tres regiones extracelulares (un bucle extracelular entre II y III, y los dominios aminoterminal y carboxiloterminal) y dos intracelulares (los bucles entre I y II, y III y IV).

En todas las subunidades, la hélice anfipática es el paso transmembrana II. Una secciónα transversal del receptor mostraría entonces las cinco subunidades, cada una con cuatro hélices,α

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Ilustración 8: Pauta estructural del receptor nicotínico de acetilcolina.


tres de ellas hidrofóbicas (I, III y IV), y la restante (II), que constituye la luz del poro, anfipática. Teniendo en cuenta que el paso de rosca de una hélice es de cuatro aminoácidos, de cada cuatroα aminoácidos de la secuencia del paso en hélice anfipático, uno a de ser polar, y los otros tresα hidrofóbicos.

El ligando endógeno es la acetilcolina, que se una al domino aminoterminal de cada una de las subunidades α; por lo tanto cada receptor tiene dos dominios de unión el ligando. Son necesarias las dos uniones para la apertura del canal, y su unión presenta cooperatividad positiva.

Este receptor presenta un papel fundamental en la sinapsis neuromuscular, donde la acetilcolina es liberada por el terminal presináptico de una neurona, y los receptores nicotínicos están situados en el sarcolema postsináptico (el sarcolema es lamembrana plasmática de la célula muscular). De esta manera, la activación del receptor provoca la despolarización del sarcolema, y como consecuencia habrá una apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. La entrada a favor de gradiente de Ca2+ provocada no será suficiente, y se verá reforzada por una salida de calcio del retículo endoplásmico. En última instancia, el aumento de la concentración de Ca2+ provoca la contracción muscular.

La despolarización provocada por la apertura del receptor nicotínico de acetilcolina es local y no generalizada (solo afecta donde está el receptor), pero será capaz de abrir canales de Na+ y de K+ dependientes de voltaje (en el caso de que los de Ca2+ no estén cerca), y así propagarse hasta abrir los canales más alejados de Ca2+ dependientes de voltaje. Esta despolarización se transmite como una onda porque va seguida de repolarización, gracias a la acción de la ATPasa de Na+/K+, que permite restaurar las concentraciones iniciales de estos iones.

De forma paralela, la acetilcolina será degradada en la hendidura sináptica por la acción de la acetilcolirestenasa, con lo que disminuye su concentración en la brecha, se desplaza el equilibrio hacia la disociación de ligando del receptor, y los canales nicotínicos se cierran, provocando que en última instancia se cierren los canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Ahora funciona un sistema que restituye los niveles iniciales de Ca2+, provocando la relajación del músculo.

Por último, cabe destacar que el mismo ligando acetilcolina funciona también a través de receptores acoplados a proteína G, concretamente los receptores muscarínicos.

Receptor de GABAA

Este receptor presenta la misma pauta estructural que el receptor nicotínico de acetilcolina, pero a diferencia de este constituye un canal de Cl, de forma que con su apertura entra Cl a favor de gradiente, que a su vez implica una hiperpolarización, o dicho de otra forma, el potencial de membrana se hace más negativo (y por tanto se dificulta o inhibe la despolarización).

En lo referente al ligando, GABA es el acrónimo de ácido γaminobutírico, un γaminoácido.

Se trata de uno de los receptores de canal de regulación más compleja, pero en este curso únicamente cabe destacar el papel de las benzodiacepinas, un grupo de fármacos ansiolíticos y tranquilizantes debido a su acción como agonistas para el receptor de GABAA.

Tal y como sucede para la acetilcolina, el GABA también actúa en receptores acoplados a proteína G, conocidos como receptores de GABAB.

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1.2 Receptores ionotrópicos de glutamatoEn algunos casos, los receptores canales para un ligando concreto se les conoce como

ionotrópico, y los receptores acoplados a proteína G para el mismo ligando como metabotrópicos. Este es el caso por ejemplo de los receptores de glutamato, y concretamente para este apartado, los ionotrópicos.

Su pauta estructural son tres segmentos transmembrana que atraviesan la bicapa, y un bucle P (dominio que atraviesa una sola monocapa, en este caso la interna) entre los pasos transmembrana I y II. Cada una de las subunidades que integran el receptor tienen el aminoterminal hacia el exterior y el carboxiloterminal hacia el interior (ilustración 9). Obviamente, uno de los tres segmentos transmembrana es una hélice anfipática.α

A su vez, distinguimos distintos tipos de receptores ionotrópicos de glutamato según su función y su selectividad iónica, y definidos por sus agonistas específicos:

• Receptores de AMPA (acrónimo de amino, 3OH, 5metil, 4ixoazolpropionato, suα agonista sintético específico) y de Cainato (agonista específico natural). Ambos constituyen un canal de Na+/K+.

• Receptores de NMDA (NmetilDAspartato, agonista específico natural). Constituye un canal de Ca2+.

Receptores de AMPA y de cainatoEl glutamato, actuando actuando a través de los canales de AMPA o de cainato es el

neurotransmisor excitador más importante del sistema nervioso central (al permitir el flujo de Na+/K+ conduce a la despolarización de la membrana, y los neurotransmisores que inducen la despolarización se les denomina activadores o excitadores). Cuando el glutamato se une a estos receptores se abre el canal, y la entrada de Na+ y la salida de K+ conduce a la despolarización, que se propaga hasta la terminal sináptica con objeto de la liberación de neurotransmisor, para lo cual tendrán que suceder varias cosas:

1. La despolarización ha de propagarse, para lo cual son necesarios los canales de Na+ y de K+

dependientes de voltaje.

2. En la terminal ha de haber exocitosis, por lo que debe haber a ese nivel un aumento den los niveles de Ca2+. A este respecto, la despolarización promueve la apertura en el terminal de canales de Ca2+ dependientes de voltaje.

NOTA: Si los receptores que inducen despolarización son excitadores, los que producen hiperpolarización, como el de GABAA se conocen como inhibidores. Podemos pensar en un esquema con componentes excitadores e inhibidores, de forma que a un mismo soma neuronal lleguen aferencias excitadoras (como vías de glutamato ante receptores de AMPA o de cainato) e inhibidoras (como vías de GABA ante receptores de GABAA); aquí los receptores de GABAA frenarán la despolarización, y si yo quiero que continúe la comunicación por la vía excitatoria necesito liberar mayor concentración de glutamato para que la despolarización venza la hiperpolarización. Por el contrario, si el sistema está muy activado porque o bien se está liberando mucho neurotransmisor activador, o bien poco inhibidor, se pueden suministrar benzodiacepinas, que frenan la despolarización.

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Ilustración 9: Pauta estructural del receptor ionotrópico de glutamato.


Receptores de NMDA

Como ya se ha señalado, se trata de canales de Ca2+. El receptor de NMDA (ilustración 10). Presentan un sitio de unión para el glutamato y también otro para la unión de glicina, de forma que el glutamato funciona como ligando agonista y la glicocola como coactivador (o coagonista), y por tanto es necesaria la unión de ambos ligandos para la apertura del canal. Esto implica que en la sinapsis donde se localicen estos receptores han de liberarse al mismo tiempo por la terminal presináptica glutamato y glicina.

NOTA: El papel de la glicina como señal extracelular no se limita al de coactivador del receptor de NMDA, se trata de un neurotransmisor que tendrá también sus propios receptores, que resultan ser estructural y funcionalmente iguales a los de GABAA (por tanto estructuralmente iguales a los nicotínicos de acetilcolina, pero constituyendo canales de Cl).

Sin embargo, la unión de glutamato y glicina, siendo necesaria para al apertura del canal, no es suficiente, dado que el receptor presenta también un sitio de unión para el Mg2+ que bloquea completamente la luz del canal. Únicamente este bloqueo es revertido ante una despolarización de membrana.

Por tanto, el receptor de NMDA es simultáneamente dependiente de ligando y de voltaje. Solo si se da despolarización que haga saltar el Mg2+, y están unidos glutamato y glicina se permite la difusión facilitada hacia el interior celular de Ca2+.

Este canal desempeña un papel fundamental en la potenciación a largo plazo (o LTP, es la potenciación de una sinapsis como consecuencia de sus uso repetido). Teniendo en cuenta que la entrada de Ca2+ no produce ningún cambio a nivel del potenical de membrana (ni se facilita ni se inhibe la despolarización), y que la despolarización que los abre es subsidiaria, por tanto, a la activación de otros receptores canales previos, la entrada de Ca2+ desarrolla la LTP debido a que cerca de estos canales se encuentra un determinado citoesqueleto que promueve el anclaje a proteínas implicadas en el LTP (no sucediendo así con los canales de Ca2+ dependientes de voltaje). Puesto que las concentraciones del catión aumentan de forma local, si la célula en cuestión presenta canales de Ca2+ dependientes de voltaje en otro territorio, ni se activa su vía, ni la apertura de estos promueve LTP (de forma general, a esto se le conoce como concepto de compartimentalización).

1.3 Receptores purinérgicos P2XExisten varios subtipos de estos receptores, los cuales se

caracterizan por unir adenosina y ATP, y generalmente constituyen canales de Na+/K+ y excepcionalmente de Ca2+. Son proteínas oligoméricas, donde cada subunidad presenta la misma pauta estructural (como en los demás tipos de receptores vistos), dos segmentos transmembrana con los extremos aminoterminal y

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Ilustración 10: Receptor de NMDA

Ilustración 11: Pauta estructural del receptor purinérgico P2X


carboxiloterminal hacia el interior, que definen un bucle extracelular (ilustración 11).

Como sucede en los casos anteriores, también existe una versión de receptores purinérgicos, capaces de unir adenosina y ATP, pero acoplados a proteína G; son los receptores purinérgicos P2Y.

2. Tipos de receptores con actividad enzimática Son receptores monoméricos, diméricos o tetraméricos, pero en todo caso las subunidades

que atraviesan la membrana plasmática presentan un solo paso transmembrana. Además, todos unen mensajeros extracelares de naturaleza peptídica.

En principio, en estos sistemas receptores la parte efectora y receptora se encuentran en la misma proteína (salvo excepciones), siendo la parte efectora una enzima. Esto determina que la clasificación de estos receptores atienda a la actividad enzimática de esta parte efectora:

1. Receptores con actividad guanidil cilclasa (GC). Es decir, la producción de cGMC a partir de GTP:

Un ejemplo de receptores con actividad guanidil ciclasa es el receptor de ANF (o ANP, factor o péptido natriurético auricular). Cabe destacar que estas y todas las demás enzimas que utilizan como sustrato GTP o ATP, es condición necesaria para su papel como sustrato que el nucleótido trifosfato esté formando un quelato con Mg2+ (complejo Mg2+ nucleótido trifosfato).

2. Receptores con actividad tirosin kinasa (TK). Son proteínas que fosforilan proteínas en residuos de tirosina.

En este grupo están los receptores de insulina y lo receptores para factores de crecimiento epidérmico. Además la excepción del grupo de receptores con actividad enzimática, en la que receptor y efector son dos proteínas diferentes se trata de receptores con actividad tirosin kinasa, concretamente el caso de elreceptor de citoquinas y el receptor de leptina. Pero, aunque receptor y efector sean entidades proteicas diferentes, están acopladas diferectamente, y no a través de proteína G.

3. Por úlimo, los receptores con actividad fosfotirosina fosfatasa (PTP), que desfosforilan los residuos de tirosina fosforilados, mediante la hidrólisis de su enlace ester.

Un ejemplo de este subtipo es la proteína CD45 leucocitaria.

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Mg2+– GTP cGMP + PP2

GC

Proteína – Tyr – OH Proteína – Tyr – OP TKATP ADP

Proteína – Tyr – OP Proteína – Tyr – OH PTPH2O Pi


TEMA 4: SISTEMAS DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G

1. Receptores acoplados a proteína G Se trata de una familia con más de cien tipos de receptores, que a su vez presentan más de

cien ligandos diferentes, que se pueden englobar en los siguients grupos:

• La mayoría de los ligandos para receptores acoplados a proteína G son mensajeros extracelulares hidrosolubles.

• Algunos son mensajeros lipídicos anfipáticos (es decir, con una porción hidrofílica y otra hidrofóbica), como los eicosanoides o el ácido lisofosfatídico (se trata de un fosfolípido sin el grupo OH).

• También son ligandos las moléculas implicadas en el gusto y el olfato.

• Estos receptores también median estímulos físicos (y por tanto son capaces de transducirlos), como es el caso del detector de fotones.

• Por último, también pueden ser receptores para proteasas, como por ejemplo la trombina.

Todos los receptores acoplados a proteína G son monoméricos y comparten una pauta estructural común de siete αhélices transmembrana, con el extremo aminoterminal hacia el exterior y el carboxiloterminal hacia el interior. Los siete segmentos transmembrana quedan unidos por tres bucles extracelulares y tres bucles intracelulares (ilustración 12), siendo en la mayoría de los casos el tercer bucle intracelular enorme (l3).

En la mayoría de los casos en el dominio aminoterminal hay sitios de Nglicosilación, y el tamaño de este segmento varía en función del tipo de receptor. Por su parte, el dominio Cterminal varía también de tamaño,y en la mayoría de casos presenta una cisteina palmitoilada (o incluso dos, pero cercanas entre sí), que conforma un cuarto bucle intracelular en la hemimembrana interna; es decir, un ácido palmítico forma un enlace tioestier con el S de la cisteina, y a su vez tiene la cola hidrofóbica insertada en la monocapa interna. Normalmente la o las cisteinas palmitoiladas se encuentran cercanas al tercer bucle intraceluar (I3) de forma que el cuarto bucle es corto.

Además puede haber segmentos en hélice que seα proyecten fuera de la membrana, y que por tanto no serán hidrofóbicos.

La unión del ligando se puede producir en varios sitios:

• En el dominio aminoterminal, en cuyo caso esta región será larga. Es el caso de los

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Ilustración 12: Pauta estructural de los receptores acoplados a proteínas G


receptores para hormonas glicoproteicas (LH, FSH...) y para moléculas pequeñas (Ca2+, glutamato, GABA...). El caso de los receptores de trombina (implicada en la coagulación) es algo particular, pues no se une al dominio aminoterminal, sino que actúa como proteasa cortándolo por un punto concreto, y libera un péptido, lo que provoca un cambio conformacional en la proteína restante, y eso conduce a la activacion del receptor.

• Otros ligandos se unen a los tres bucles externos transmembrana, incluida la parte transmembrana de los segmentos transmembrana. Son los receptores de hormonas peptídicas, los receptores de aminas, de eicosanoides...

El caso de los receptores de fotones va a suponer una particularidad dentro del grupo. Aparte de las características generales mencionadas han de poseer un grupo prostético, es decir, un componente no proteíco con dobles enlaces conjugados (que permita absorber luz), que concretamente se trata del 11cysretinol (un derivado de la vitamina A). Además, estos receptores para ser funcionales, y poder unir el ligando han de estar dimerizados (aunque, como todos los del grupo, son monómeros).

1.1 Reconocimiento de la proteína G y transducción de la señalEn el reconocimiento de la proteína G van a participar los bucles intracelulares dos, tres (I2 e

I3) y el dominio carboxiloterminal (incluido el bucle I4), de forma que tras la activación del receptor, estos dominios reconocen y activan la proteína G. Cabe mencionar que en estas tres regiones existen residuos de serina y de treonina suceptibles de fosforilación por dos grupos de kinasas:

• GRKs (kinasas de receptores acoplados a proteínas G), mayoritarias.

• PKs (proteín kinasas) dependientes de mensajeros extracelulares , menos implicadas en esta función.

Estas fosforilaciones están implicadas en la desensibilización de los receptores.

Con la llegada de ligando y el reconocimiento y activación de la proteína G se inicia la transducción de la señal, que tiene cinco características;

1. La transducción va a ser mucho más lenta que en el caso de los receptores canales, pues están implicados tres componentes: el receptor, la proteína G y el efector, de forma que: R → p. G Efector.→

2. La terminación de la señal tiene lugar por desensibilización del receptor, y por tanto es lenta. Recordemos que en los receptores canales la terminación de la señal tiene lugar por disociación debida a la degradación del neurotransmisor in situ o su recaptura, lo que determina que esta terminación de la señal también sea rápida. Pero para el caso de los receptores acoplados a proteína G, no solo la transducción es lenta, también lo es la terminación de la señal, que además tiene lugar a nivel del receptor (y no de la presencia de ligando).

3. Presentan desensibilización del receptor, cuya función será impedir la interacción entre el receptor y la proteína G, debido a la fosforilación de algunos residuos en los dominios de interacción con la proteína G.

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4. Su transducción es compleja. Pues viene determinada por la existencia de múltiples tipos de receptores (más de 100), de múltiples proteínas G y múltiples efectores (tanto enzimas como canales); y además, existe una multiplicidad de interacciones entre el receptor y la proteína G, así como entre la proteína G y el receptor. Es decir, en primer lugar un mismo tipo de receptor puede interaccionar con diversos tipos de proteínas G:

También puede darse el caso contrario, varios tipos de receptor pueden actuar sobre el mismo tipo de proteína G, modulando un mismo tipo de efector.

Por último,varios tipos de proteína G pueden interaccionar con el mismo tipo de efector.

5. En su transducción se da amplificación de la señal. En el caso de los sistemas receptorefector unitarios, si se activa una molécula de receptor, se activada una molécula de efector. Pero en estos casos, si se activa un receptor, es capaz de interaccionar con más de una proteína G antes de que el ligando se disocie (por desensibilización), y por tanto se activan más de una proteína G. Y a su vez, una proteína G es capaz de modular a más de una molécula de efector. En última instancia una molécula de ligando puede dar respuesta por varios efectores.

2. Proteínas G heterotriméricas Son proteínas reguladoras ligantes de nucleotidos de guanina. Están compuestas de tres

subunidades, , , y , y se encuentran ancladas a la monocapa interna de la membrana (ancladas,α β γ no insertadas) por un sistema similar al de la palmitoilación de las cisteinas del dominio carboxilo terminal de los receptores acoplados a proteína G, es decir, por modificaciones lipídicas covalentes.

Las características de las subunidades son:

• En cuanto a la subunidad α, de las tres es la de mayor tamaño (entre 4046 Kda). Se conocen más de 20 tipos de subunidades , que a su vez se pueden agrupar en cuatroα familias en base a sus identidades de secuencia:

◦ αs, en la que se encuntran la αs, la αsXL y la αsolf (implicada en la transducción olfatoria).

◦ αi/O, que integra las αi13, la αT (conocida como transducina, implicada en la fotorecepción), la αz y la αgust (implicada en la transducción gustativa).

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RG1 E1

G2 E2

G ER1

R2

ER2 G2

R1 G1


◦ αq/11, que engloba la αq, la α11, la α14 y la α15/16.

◦ α12, que integra la α12,y la α13.

Las subunidades van a estar ancladas a la monocapa interna por α acilación, es decir, gracias a que uno de sus aminoácido tiene unido un ácido graso, cuya cadena hidrofóbica esta inserta en la membrana. Esta acilación puede ser:

◦ Palmitoilación, es decir, la unión de un ácido palmítico (16,0) NOTA: La primer cifra indica

el número de carbonos y la segunda el número de dobles enlaces.

◦ Miristoilación, la unión de un ácido mirístico (14,0).

Además, la parte del heterotrímero que interacciona con el receptor acoplado a proteína G (cuando este es activado) es precisamente la subunidad , y también es la única de lasα subunidades que tiene actividad GTPasa, y que por tanto une nucleótidos de guanina. Es decir, la actividad GTPasa es la capacidad de hidrolizar una molécula GTP unida al dominio catalítico de la enzima para dar Pi y GDP, con lo que la subunidad , tras su actividad,α pasaría a tener unido GDP (que puede salir del centro catalítico y ser remplazado por GTP).

Por último, no solo interacciona con el receptor y presenta actividad GTPasa, sino que también es capaz de interaccionar con el efector. Estos efectores pueden estar previamente activados, de forma que la acción de la proteína G será su modulación, como sucede en el caso de los canales iónicos dependientes de voltaje (donde la proteínas G modulan el tiempo de apertura); anque en el caso de las enzimas normalmente median su activación. Destaca el ejemplo de la adenilato ciclasa, que es activada por la subunidad de la proteína Gα αs, y a su vez es inhibida por la subunidad de la proteína Gα αi.

• En cuanto a las subunidades y β γ, se encuentran extrechamente unidas (hasta el punto que se les conoce genéricamente como el dímero βγ). La subunidad β tienen un peso molecular de 37 KDa y se le conocen 5 variedades o tipos. La subunidad γ tiene un peso molecular de 78,5 KDa y 14 tipos distintos. Teniendo en cuenta los más de 20 tipos de las subunidad ,α y toda esta variedad dentro de las subunidades , habrá una gran combinatoria deβγ posibilidades de proteínas G diferentes.

Se encuentran unidas a la membrana por una isoprenilación de la subunidad γ (un isopreno es el monómero del terpeno), cuya cola hidrofóbica ancla a la membrana interna la subunidad en cuestión, y mantiene indirectamente asociada a la membrana a la .β

En lo referente a su función, el dímero será capa de interaccionar con diferentes gruposβγ de proteínas:

◦ Con efectores, que pueden ser iguales o diferentes de aquellos que interaccionan con las subunidad .α

◦ Y además son capaces de interaccionar con otras proteínas, entre las que destacan las GRKs (kinasas de receptores acoplados a proteínas G).

En tal caso, no son capaces de interaccionar con el receptor de proteínas acoplado a proteínas G.

En lo referente al trímero completo, es la subunidad la que confiere el nombre a cada tipoα

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de proteína G, y por tanto atribuye la especificidad. Esto implica que cada tipo de proteína G siempre lleva el mismo tipo de subunidad , pero no necesariamente la misma combinación delα dímero .βγ

2.1 Ciclo de activación – inactivaciónEn el estado inactivo, las proteínas G se encuentran en forma heterotrimérica, es decir, con

el dímero asociado a la subunidad , la cual además presenta unido GDP.βγ α

En un momento dado, un receptor se activa por la unión de un agonista e interacciona con la subunidad . Esto produce que el GDP sea remplazado por GTP, lo que a su vez conlleva laα disociación del heterotrímero, y por tanto al estado activo de la proteína G, pues tanto la subunidad

como el dímero pueden interaccionar con otras proteínas y modular su actividad.α βγ

Este estado activo de la proteína G no será permanente debido a la actividad GTPasa de la subunidad , gracias a la cual el GTP unido es hidrolizado, sale una molécula de pirofosfato yα queda unido GDP a la subunidad, lo cual a su vez conduce a la reasociación con el dímero , y porβγ tanto al estado inactivo.

En conclusión, la señal que provoca la activación es el receptor activado por la unión de un agonsita, y la señal que produce la inactivación es la actividad GTPasa intrínseca de la subunidad .α Ahora bien, diferentes factores pueden afectar al ciclo de activación – inactivación, entre los cuales destacan las proteínas RGSs (reguladores de la señalización por proteínas G). Estos RGSs pueden ser:

• Los propios efectores.

• Otras proteínas como las GRKs (kinasas de receptores acoplados a proteínas G), antes mencionadas como proteínas con la que podía interactuar el dímero .βγ

En cuanto a su acción en el ciclo de activación – desactivación, las RGSs actúan o bien promoviendo la activación o la inactivación, según lo cual recibirán diferente denominación:

• GEFs (factores intercambiadores de nucleótidos de guanina), que promueven la activación.

• GAPs (proteínas activadoras de la actividad GTPasa intrínseca de la subunidad )α implicados en la inactivación.

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Ilustración 13: Ciclo de activación inactivación de las proteínas G.

Estado activo

Estado inactivo


Si aplicamos al ciclo de activación – inactivación de estas proteínas el hecho de que un mismo tipo de proteína G pueda tener diferentes dímeros tiene interesantes consecuencias.βγ

Así, el hecho de que el dímero βγ sea intercambiable puede hacer que la activación de una vía conlleve la inactivación de otra vía de proteínas G, dado que el aumento de concentración del dímero desplaza el equilibrio hacia la asociación (pues + – GDP – GDP – es unβγ α → α βγ equilibrio, aunque dependa de la previa hidrólisis).

2.2 La proteína G como sustrato de toxinas bacterianasConcretamente la subunidad puede ser sustrato de toxinas bacterianas, que actúanα

modificándola covalentemente. Estudios in vitro han revelado que algunas subunidades puedenα ser modificadas por la toxina de Vibrio colerae, y otras pueden ser alteradas covalentemente por la toxina de Bordetella pertussis (agente etiológico de la tos ferina). Algunas subunidades tambiénα han revelado ser sensibles a la acción de ambas toxinas, como la transducina. Y por último, algunas subunidades no pueden ser modificadas por ninguna de las dos, como por ejemplo sucede con lasα familias αq y α12.

La modificación covalente producida por estas toxinas varía en su repercusión para la función de las proteínas G (ilustración 13):

• La modificación covalente de la toxina colérica tiene como diana la subunidad en estadoα activo, y produce la inhibición de su actividad GTPasa, con lo que una vez que la subunidad una GTP y por tanto se active, se mantendrá permanentemente activa (independientemente de la presencia de GAPs)

• La modificación covalente de toxina de B. pertussis tiene como diana la subunidad α formando el heterotrímero, y determina que la subunidad sea insensible a la activación porα un receptor, con lo cual la proteína G se mantiene permanentemente inactiva.

En cuanto a la modificación covalente que producen, ambas toxinas presentan actividad enzimática NAD+ hidroxilasa/ ADPribosiltransferasa. Es decir, en primer lugar hidrolizan el enlace hidroxilo del NAD+, dando lugar a nicotinamida y ADPribosilo:

Y después transfieren el ADPribosilo sobre un aminoácido de la subunidad :α

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αs – GDP – β1γ4 αs – GTP + β1γ4

αi – GDP αi – GDP – β1γ4

GTP GDP

Pi H2O

NAD+ hidroxilasa

NAD+

Nicotinamida Adenina

Ribosa – P – P – Ribosa

Adenina

Ribosa – P – P – Ribosa

ADPribosilo

Nicotinamida


In vivo, la subunidad αs del epitelio intestinal resulta ADPribosilada por la toxina colérica, lo que a su vez causa las diarréas que caracterizan el cólera. En este sentido, la toxicidad concerniente a estas bacterias plantea la siguiente pregunta: ¿Porqué un animal tiene una proteína diana de una toxina bacteriana, tal que altera su funcionamiento?, pues bien, la actividad enzimática de estas toxinas hace referencia al efecto de enzimas endógenas con el mismo efecto y actividad, de forma que las toxinas bacterianas únicamente mimetizan estas actividades endógenas.

3. GTPasas Monoméricas Se trata de una familia muy amplia de proteínas, todas ellas constituidas por una sola cadena

polipeptídica de entre 2035 Kda (aproximadamente como la subunidad β de las proteínas G heterotriméricas). Algunas están ancladas a la hemimembrana interna plasmática por isoprenilación, mientras que otras son proteínas solubles.

Funcionalmente son idénticas a la subunidad α de las proteínas G heterotriméricasa, es decir, unen nucleótidos de guanina (GTP o GDP), y van a presentar actividad GTPasa; pero a diferencia de las heterotriméricas, presentan la actividad GTPasa inhibida, en demanda para su activación de una GAP que la active (actividad GTPasa que por tanto inhibirá la enzima).

Como se observa en el esquema, en algunos casos, la GTPasa monomérica inactiva (unida a GDP) puede estar interaccionando con proteínas GDI (proteínas inhibidoras de la disociación de GDP), cuya funciona es mantenerla precisamente inactiva. Por tanto, cumplen el mismo papel que la ADPribosilación de Bordetella pertussis.

Para la salida de GDP y entrada de GTP es necesario que exista una proteína GEF (factor intercambiador de nucleótidos de guanina); en analogía con el caso anterior, en las triméricas los receptores de siete pasos transmemebrana actúan como GEF.

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Sub. α permanentemente activa

Toxina de V. colerae

NAD+ Nicotinamida + H+

Arg = NH2+

Lys – SH Toxina de B. pertussis

Arg = NH – Ribosa – ADP

Enlace Nglicosídico

Lys – S – Ribosa – ADP

Enlace Sglicosídico

Sub. α activa

Sub. α inactiva (heterotrímero)

Sub. α permantemente inactiva

GTPasa – GTP Activa

(GDI –) GTPasa – GDP Inactiva

GEF

GAP

GTP GDP

H2O

GDP

Pi

Cascada de fosforilaciones

Ciclo Celular


A modo de conclusión, en el ciclo de acción de estas enzimas va a ser necesario el concurso de dos proteínas: GEF y GAP.

3.1 Regulación y efecto del ciclo de activación/ inactivaciónHaciendo referencia a la conclusión del apartado anterior, en el ciclo de activación/

inactivación de estas proteínas se puede incidir a dos niveles: o bien sobre las GEF o sobre las GAP, además de ciertos casos de regulación mediante incidencia sobre las GDI.

La vía más conocida de regulación del ciclo es la activación de las GEF, que a su vez se activan como consecuencia de la activación de los TKRs (receptores con actividad tirosin kinasa) principalmente, habiendo otras vías menos importantes, como el aumento de AMPc.

Una diferencia fundamental con las proteínas G heterotriméricas, es que en el caso de las monoméricas es que en su estado activo regulan la actividad de una enzima que sintetiza mensajeros intracelulares, o la de un canal dependiente de voltaje para Na+ y Ca2+ (en definitiva, otro mensajero intracelular). Más aún, en última instancia la activación de la GTPasa conduce a una cascada de fosforilaciones que tiene como resultado final regular el ciclo celular, lo cual determina que los receptores que iniciaron el proceso, los TKR son, además de receptores de insulina, receptores de factores de crecimiento (en general referente a proliferación, salvo para el caso de factor de crecimiento de nervios).

Ahora bien, la misma relación que une a las GTPasas con el ciclo celular, necesariamente lo relaciona con el cancer. De esta manera, la mayoría de estas GTPasas son producto de protooncogenes (están codificadas por genes los cuales una mutación u alteración puede transformarlos en oncogenes). Por ejemplo, la proteína RAS presenta en el centro activo de la actividad GTPasa una glicocola si proviene de su correspondiente protooncogen, que en el producto del oncogen será sustituida por una valina. Aun así, ni en un caso ni en otro la actividad GTPasa es activa sin la presencia de una GAP, pero mientras que esta actividad enzimática si es desatada por una GAP en la proteína con glicocola (quedando por tanto la proteína G inactiva), con valina es insensible a la activación (la actividad GTPasa está abolida). Por tanto, RAS oncogénica está permanentemente activa, y debido a ello, el ciclo celular continuamente promocionado.

4. Desensibilización de receptores La desensibilización es la disminución de la magnitud de respuesta como consecuencia de la

acción sobre un receptor. En el caso que nos ocupa, la desensibilización implica el desacomplamiento entre receptor – proteína G, es decir, el bloqueo de la interacción del receptor con la proteína G. Esto se debe a una fosforilación en alguno de los dominios del receptor relacionado con la interacción con la proteína G, a saber, los bucles intracelulares II y III, y el dominio carboxilo terminal, la cual provoca un cambio conformacional tal que no pueda darse la interacción entre el receptor el la proteína G. Está fosforilación la llevan a cabo dos tipos de proteín kinasas:

1. Las GRKs (kinasas de receptores acoplados a proteínas G), mayoritarias.

2. Las PK dependientes de mensajeros intracelulares, menos comunes.

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4.1 Kinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs)Las GRKs constituyen una familia de 7 miembros, algunos de las cuales están unidos a la

membrana interna por modificación covalente de tipo lipídico (aciladas e isopreniladas), y en otros casos unidos indirectamente a la membrana a través de asociación a los dímeros disociados. Enβγ el segundo caso, necesariamente a la disociación del dímero, la proteína G a de estar activa, y por tanto también el receptor. Esto es importante, dado que las GRKs solo son capaces de fosforilar receptores que estén activos (de hecho, las GRKs siempre están activas), dado que la misma activación del receptor provoca un cambio conformacional que expone los residuos susceptibles de dicha fosforilación; por tanto, al sólo resultar desensibilizados los receptores activos, a este tipo de desensibilización se le denomina desensibilización homóloga.

Sin embargo, la fosforilación per se es necesaria para la desensibilización pero no suficiente. La generación de residuos fosfato en el receptor define sitios de alta afinidad para la unión de arrestinas (una familia de cuatro miembros de proteínas citosólicas), y está unión de las arrestinas impide la interacción del receptor con las proteínas G, teniendo lugar en este punto la desensibilización.

Pero la proteína G puede seguir activa, y por tanto seguir activando receptores, sin embargo parece ser que los GRKs también tienen capacidad de actuar como GAP, con lo cual, por un lado no se activarán más proteínas G por la acción del receptor (aún incluso con la presencia de ligando), y por otro se promueve la inactivación de las proteínas G activas.

Tras esto se asocian al complejo receptor fosforilado – arrestina otras proteínas como clatrina, AP2, dinamina, lo que permitirá la internanización del receptor en un endosoma. Una vez internado, habrá una disociación de todas las proteínas que formaron el endosoma, posteriormente una disociación de la arrestina, y por último una desfosforilación de los residuos fosfato de las GRKs por la fosfoproteína fosfatasa 2A. Por tanto todo esto conduce a la presencia del receptor resensibilizado en el endosoma, que ahora puede tomas dos vías:

a) El endosoma se puede fusionar con la membrana plasmática, con lo que se recicla el receptor.

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Ilustración 14: Desensibilización homóloga


b) El endosoma puede fusionarse con un lisosoma, de forma que el receptor se degradará.

No se sabe como se hace la elección de una u otra vía, pero parece ser que unos tipos de receptores tienen más propensión a seguir una vía u otra, y también, dentro del mismo tipo de receptor, puede estar facilitada una vía en función de la magnitud de la respuesta generada por dicho receptor.

En cualquier caso, cada vía define un tipo diferente de desensibilización:

a) El reciclaje del receptor supone una desensibilización a corto plazo, pues propicia una disminución del número de receptores que se restaurará al cabo de poco tiempo.

b) La degradación define una desensibilización a largo plazo, sólo restaurándose el número inicial de receptores al cabo de su síntesis.

Por último, cabe destacar que en algunos casos, el receptor fosforilado interaccionando con la arrestina (lo que como hemos visto, conlleva la desensibilización de la respuesta mediada por proteína G) es capaz de poner en marcha otras vías de traducción independientes de proteína G, por ejemplo, el complejo receptor fosforilado – arrestina puede interaccionar con proteínas de las vías de las MAPKs (kinasas activasdas por mitógenos), con lo que la formación del mencionado complejo implica la finalización de la respuesta A (mediada por proteína G) y el inicio de la respuesta B (correspondiente a las MAPKs).

4.3 Proteín Kinasas dependientes de mensajeros intracelularesEntre las PK dependientes de mensajeros intracelulares relacionadas con la fosforilación (y

por tanto desensibilización) de receptores para las proteínas G destaca la PKA (PK dependiente de AMPc), aunque también actúan otras. En este caso, la fosforilación depende de que esté el mensajero que active la PK en cuestión, y por tanto, puede tener lugar esté o no el receptor activo. Se trata por tanto de una desensibilización heteróloga.

El acoplamiento de los receptores, proteína G y fosforilación por mensajeros intracelulares va a suponer la autorregulación de la actividad de la vía. De esta manera, una PKA activa debido a la actividad de los correspondientes efectores (activados a su vez vía proteína G) desensibiliza todos los receptores activas, tanto los que han producido la activación de las adenil ciclasas (AC) como las que no, pudiendo considerarse esta desensibilización como un mecanismo de retroalimentación negativa (depende de un mensajero final, producto de la vía de transducción).

En este caso, para darse la desensibilización no es necesaria la participación de las arrestinas, y por tanto es suficiente la fosforilación por las PK.

Además, también cabe destacar una relación entre las dos vías de desensibilización, pues las GRKs (que de partida son activas) pueden ser fosforiladas por PK dependientes de mensajero intracelular, lo que incrementa su capacidad de fosforilación para con los receptores.

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R G E M. intracelularP (Desensibilización)

PK depen. de m. intracelular


Bloque II – Mensajeros intracelularesBloque II – Mensajeros intracelulares

TEMA 5: NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS

1. Nucleótidos cíclicos como mensajeros intracelulares Para que una molécula desempeñe un papel como mensajero intracelular, su concentración a

de estar sometida a un estrecho control, que a su vez se ejecuta a un doble nivel: tanto a nivel de síntesis (aparición) y a nivel de degradación (desaparición). Sin embargo, no se ajusta a este estereotipo el Ca2+, que ni se sintetiza ni se degrada, tan solo se controlan sus flujos.

1.1 Síntesis y degradaciónUn nucleósido cíclico va a ser sintetizado a partir de un nucleósido trifosfato (NTP). En los

nucleósidos trifosfatos los fosfato en y en tienen un Oα β , y el fosfato en γ tiene dos, y el Mg2+, con sus dos cargas positivas forma un enlace de coordinación (un quelato) con los dos O de los fosfatos en y en , lo que curva un poco la cadena de los fosfatos y permite que el nucleósidoα β trifosfato entre en el centro activo de la enzima.

A partir del nucleótido trifosfato y gracias a la acción de una ciclasa se forma un 3',5'NMPc (nucletido cíclico), con lo que un pirofosfato se escinde, y el O libre el fosfato en establece un enlace ester con el OHα de la ribosa en 3' (por tanto, el fosfato queda con dos enlaces ester con la misma ribosa). Hay que tener en cuenta que cualquier reacción catalizada por una ciclasa es reversible, lo cual lentificaría gravemente el proceso; sin embargo, in vivo la hidrólisis del pirofosfato llevada a cabo por una fosfatasa es irreversible, y es esto lo que desplaza el equilibro de la ciclasa hacia la derecha.

Para la posterior degradación del nucleótido cíclico, la fosfodiesterasa de monofosfatos cíclicos hidroliza el enclace ester en 3' (dejando el nucleótido cícico en un nucleósido monofosfato lineal); como veremos, los niveles de estas enzimas van a estar muy regulados. Finalmente, el nucleosido monofosfato se verá degradado a un nucleósido y un fosfato, reacción catalizada por una 5' nucleotidasa.

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(Mg2+)5'NTP 3',5'NMPc + Ppi 2PiCiclasa Pirofosfatasa

Nucleósido monofosfato ciclico (nucleótido cíclico)

Fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos

H2O

H2O

5'NMPNucleósido monofosfato

H2O

Nucleósido + Pi

Ilustración 15: Ejemplo de nucleótido cíclico, AMPC.

5'Nucleotidasa


Los nucleótidos cíclicos que actúan como mensajeros intracelulares son el AMPc y el GMPc, siendo por tanto sus sustratos ATP y GTP respectivamente.

1.2 Efectos de los nucleótidos cíclicosA grandes rasgos tenemos dos tipos de efectos:

• Los más importantes y mayoritarios son los efectos indirectos, es decir, los ejercidos a partir de PK dependientes de nucleótidos cíclicos.

• En algunos casos también ejercen un efecto directo. Concretamente se contemplan estos casos:

◦ Modulación de canales iónicos de membrana plasmática (Recordemos que los canales iónicos se dividen en dependientes de voltaje y operados por ligando, y para el último caso, el ligando puede ser un mensajero extracelular, o, tal y como nos ocupa, un mensajero intracelular como AMPc y GMPc).

◦ El AMPc también puede unirse a algunos GEF, concretamente los denominados Epac (correspondientes al intercambio de nucleótidos difosfato por nucleótido trifosfato de la Rac GDP), activándolos.

2. El AMPc y la Adenilato ciclasa La adenilato ciclasa (AC) es la enzima implicada en la producción de AMPc a partir de ATP.

En mamíferos se ha descrito una adenil ciclasa soluble (en espermatozoide e higado, que es activada por bicarbonato), que obviamente al ser soluble no estará implicada en la transducción de señales extracelulares (además de por su localización restringida) y nueve de membrana o particuladas, de los cuales unos tipos y otros se encuentran en todas las células y todos los tejidos. Es más, el AMPc se encuentra en toda la escala filogenética, y su espectro de acción es mucho mayor que el GMPc.

Cada una de las nueve isoformas serán estudiadas en función de sus efectores de sistemas receptores acoplados a proteína G. Todas ellas comparten la misma estructura, un dominio amino terminal intracelular, seis segmentos transmembranales, un dominio citosólico denominado C1, otros seis segmentos transmembranales y un gran dominio carboxilo terminal, también citosólico, denominado C2. El centro activo (o sitio P) está formado por un trozo del dominio C1 y otro trozo del dominio C2, lo que determina que sean estas regiones las que presenten el mayor grado de conservación de secuencia entre las nueve isoformas (e incluso con la soluble). Además, el centro

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Ilustración 16: Pauta estructural de la adenilato ciclasa


activo de las adenilato ciclasas presenta alto grado de conservación de secuencia con el centro activo de las guadenilato ciclasas, de hecho, con tres mutaciones puntuales en los aminoácidos que forman parte de su centro activo se transforma en una GC.

En estos dominios C1 y C2 también se encuentran los sitios de unión a través de los que interaccionan proteínas y otras moléculas que regulan las adenilato ciclasas, además de residuos susceptibles de ser fosforilados por PK dependientes de mensajeros intracelares.

2.1 Regulación de la adenilato ciclasa

Moduladores generales de todas las isoformas particuladas

1. Activación por Gsα. Todos las isoformas particuladas se van a ver activadas por la interacción con la subunidad α de la proteína Gs, activación que refleja la modulación por mensajeros extracelulares que actúan a través de receptores acoplados a proteína G.

2. Inhibición por adenosina. A través del centro activo (conformado por C1 y C2). El significado de esta regulación parte de que la presencia de adenosina es signo de que ha habido previamente AMPc, y por tanto, ha estado funcionando la AC. Por tanto se trata de una retroalimentación negativa (inhibición por producto final).

3. Activación por diterpeno forskolina, que activa a todas las isoformas salvo la ACIX. Este terpeno proviene de Coleus forskohlii, y refleja la existencia de un modulador endógeno desconocido cuya acción mimetiza.

4. Activación por Mg2+/ inhibición por Ca2+ mM. El Mg2+ siempre está formando parte de un complejo con el sustrato (en forma de Mg2+ATP), por tanto es un cosustrato; pero además la adenilato ciclasa presenta un sitio por el cual este metal ctúa como modulador alostérico. Por su parte el Ca2+, a elevadas concentraciones inhibe la adenilato ciclasa debido a que compite con el Mg2+ en la unión de ese sitio alostérico.

Moduladores específicos

1. Inhibición por Giα. Refleja el efecto de mensajeros extracelulares que actúan a través de receptores acoplados a proteína G.

2. Modulación (activación/ inhibición) por el dímero Gβγ. Dado que las G βγ son intercambiables entre las diferentes proteínas G, pueden reflejar la activación de la proteína Gs, la activación de la proteína Gi, o la activación de otras proteínas G. Con lo cual puede haber una interferencia de otras vías de transducción de señales extracelulares.

3. Inhibición mediada por PKA. La PK dependiente de AMPc es capaz de fosforilar la adenilato ciclasa, inhibiendo su actividad. Por tanto, en cierto modo podemos hablar de una retroinhibición por producto.

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ATP AMPc AMP Adenosina + Pi

AC PDE Nucleotidasa


4. Por último, modulación indirecta por otros mensajeros extracelulares, es decir, la interferencia de otras vías de transducción:

a) Modulación por Ca2+μm a través de CaM, donde a su vez se distingue:

Activación por Ca2+/CaM, donde directamente la CaM interacciona con algunas isoformas de adenilato ciclasa y las activa.

Inhibición por fosforilación catalizada por PK dependiente de Ca2+/CaM, concretamente la Ca2+/CaMK tipo II y III.

Inhibición por desfosforilación catalizada por una fosfoproteína fosfatasa dependiente de Ca2+/CaM, que puede ser o la calcineurina o la PPPasa 2B. Esto implica que en su estado activa la adenilato ciclasa esté fosforilada.

b) Modulación por DAG. El DAG es un mensajero intracelular de origen lipídico, que a través de la PKC promueve la fosforilación de algunas isoformas de adenilato ciclasa desembocando su activación o inhibición.

2.2 Adenilato ciclasas como RGSAlgunas isoformas funcionan como RGS (proteínas reguladoras de la señalización de

proteínas G):

• Concretamente, algunas actúan como GEF de Gs y Gi.

• Otras actúan como GAPs de Gsα.

3. El GMPc y la guanilil ciclasa El papel del GMPc es mucho más

restringido que el del AMPc, no encontrándose en todas las células y tejidos. Existen dos tipos de guanilil ciclasas: particuladas y solubles.

3.1 Guanilil ciclasas particuladasSon homodímeros, cuyos

monómenos idénticos presentan un dominio amino terminal extracelular, un segmento transmembrana, y un dominio carboxilo terminal intracelular. El centro activo se encuentra formado por una región de los dos dominios carboxilo terminal. Existen siete tipos de guanilil ciclasas

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ATP AMPc AMP Adenosina + Pi NucleotidasaPDEAC

Ilustración 17: Guanilil ciclasa particulada (pGC)


particuladas, que se numeran desde la A a la G (la p es de particulada): pGCA, pGCB,..., pGCG.

Los tres primeros tipos, pGCA, pGCB y pGCC, unen mensajeros extracelulares de naturaleza peptídica, y por tanto están ubicados en la membrana plasmática. Por tanto son aunténticos receptores de membrana con capacidad enzimática, en los cuales el mensajero extracelular se unirá a la región amino terminal:

a) pGCA une ANP (péptido natriurético auricular) y BNP (péptido natriurético cerebral).

b) pGCB une CNP (péptido natriurético tipo C).

c) pGCC une guanidina.

De los cuatro restantes, pGCD, pGCE, pGCF y pGCG, no se conoce ligando, y por tanto se conocen como receptores huerfanos. Sin embargo, aunque son similares a los anteriores, es posible que algunos no tengan ligando. En este sentido, las pGCE y p GCF ni se encuentran en la membrana plasmática, sino en las membranas de los discos del segmento externo de conos y bastones, y por tanto el extremo amino terminal lo tendrán hacia la luz del disco y el carboxilo terminal, y por tanto el centro activo, hacia el citosol. En teoría, el sitio receptor está en en la luz del dico, por tanto un hipotético mensajero extracelular tendría que atravesar la membrana plasmática y la del disco, es decir, debería ser lipídico; pero claro, esto implica que el amino terminal del pGC no debería contar con ciertos aminoácidos apolares, para poder unir ligandos lipídos (que no es el caso). Ergo, al menos estas dos enzimas no es esperable que tengan un ligando extracelular.

Sin embargo, si tienen un mecanismo de activación independiente de mensajeros extracelulares. Así, E y F son activados por interacción de unas proteínas denominadas GCAP (proteína de la activación de la GC particulada), que estás unidas a la hemimembrana citosólica de los discos mediante una modificación covalente lipídica (concretamente una miristoilación). Estas GCAP presentan cuatro dominios de unión a Ca2+ denominados dominios EF, tres de los cuales son funcionales. Cuando la proteína se encuentra libre del Ca2+, la proteína está interaccionando con las pGCE/F, que por tanto se encuentra activa. Pero con el aumento de la concentración de Ca2+, tres de estos cationes se unen a la GCAP, que se disocia de la pGCE/F y conduce a su inactivación. Una posterior disminución de la concentración de Ca2+ conduciría a su disociación de la GCAP, y ello permite que la proteína se reasocie a la pGC, y se active.

3.2 Guanilil ciclasas solublesSe trata de heterodímeros, ,αβ cuyo centro activo está formado por una región de la mitad

carboxilo terminal de cada una de las subunidades. En la mitad amino terminal de las dos subunidades nos encontramos con una región que va a estar conservada en las dos subunidades,

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Ilustración 18: Bastón retiniano

pGCE/FInactiva

PGC – E/F – GCAP Activa

↑[Ca2+ ] 3Ca2+ GCAP3Ca2+

GCAP↓[Ca2+ ] 3Ca2+


pero que en la correspondiente a la subunidad β hay una histidina a la que se encuentra unido un grupo hemo. Todas las sGC (s de soluble) son activadas por el radical libre NO a través del grupo hemo.

El NO es un mensajero extracelular inorgánico gaseoso, capaz por tanto de difundir libremente a través de las membranas, y en consecuencia las sGC se consideran receptores intracelulares. Se ha postulado muchas dianas para el NO, pero la única claramente establecida son precisamente las sGC. Este mensajero gaseoso se sintetiza por la NO sintasa en una reacción compleja, como subproducto de la oxidación de la arginina a citrulina (aminoácido no proteíco)

NOTA: X sintetasa es una enzima que sintetiza X, y para ello necesita la hidrólisis acoplada de ATP; X sintasa, por el contrario es una enzima que sintetiza X sin dicha

hidrólisis acoplada.

Existen tres isoformas de NO sintasa:

• Dos de ellas son constitutivas, las denominadas NOS (NO sintetasa), en las que a su vez se diferencia:

◦ nNOS, en la cual n hace referencia al tejido nervioso, aunque también se encuentra en otros tejidos.

◦ eNOS, e de endotelio, pero que como en el caso anterior también se puede encontrar en otros tejidos.

• La tercera isoforma es inducida, se denomina iNOS (i de inducible) y se expresa fundamentalmente en hígado.

Las enzimas constitutivas son aquellas que sus niveles no varían (se regula su actividad), y por contra en las inducibles su expresión se encuentra regulada. Teniendo en cuenta esto, la regulación de estos dos grupos de enzimas se hace de forma diferente:

• La expresión de la iNOS se encuentra promovida por citokinas.

• Mientras que en las constitutivas, nNOS y eNOS, son activadas por Ca2+/CaM.

4. Fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicosComo hemos visto, las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (que por motivos obvios en

adelante se hará referencia a ellas como PDE) son responsables de la disminución de estos mensajeros extracelulares. Existen más de 20 genes que codifican para PDE, muchos de los cuales presentan variantes de splicing, con lo que cada gen podrá codificar más de una proteína.

Las variantes de splicing se pueden generar por dos vías no excluyentes:

1. Pueden usarse diferentes zonas alternativas en la región promotora, que darán productos de transcripción diferentes. Pueden existir diferentes factores de transcripción para una

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Ilustración 19: Guanilil ciclasa particulada


misma región promotora, presentes de forma característica en función del tejido y del momento concreto, que se unan a distintas zonas dento de la región promotora del gen (con lo que varía el punto de iniciación de la transcripción, y por tanto, lo transcrito es diferente).

2. Un único producto puede procesarse de diferentes maneras en diferentes tejidos y momentos, es decir, un mRNA inmaduro puede dar varios mRNA maduros, y por tanto diferentes productos. A este fenómeno se le conoce como splicing alternativo.

En consecuencia, los 20 genes que codifican para PDE, mendiante variantes de splicing son capaces de producir unos 50 tipos de PDE de nucleótidos cíclicos.

A su vez, estos 50 tipos de PDE pueden ser tanto solubles, asociadas a membrana e integrales (entre las que también se cuentan las ancladas a lípidos o que atraviesan parte de la doble membrana) (siendo estas dos últimas proteínas particuladas); y presentan diferentes sustratos:

• Las hay de AMPc.

• Como de GMPc.

• E incluso de AMPc y GMPc, gracias a que ambos nucleótidos son similares.

Con objeto de su estudio, estas 50 enzimas se agrupan en más de 11 familias en función de la afinidad de sustratos y de su regulación. Todo esto va a repercutir en su nomenclatura: se nombran mediante la referencia al tipo de enzima (PDE en nuestro caso), seguido de un número que indica la familia, una letra que hacer referencia al gen en el que se encuentra, y un último número referido a la variante de splicing; por ejemplo, la PDE4D3 se trata de una fosfodienterasa de nucleótidos cíclicos de la familia 4, cuya referencia del nombre del gen es la letra D, y que se trata de la variante de splicing número 3.

4.1 Organización estructural comúnTres dominios son la base de la organización estructural común para la mayoría de las 11

familias de PDE:

1. Dominio catalítico central, situada en el centro de la estructura primaria, y que se trata de la región más conservada.

2. Dominio regulador, situado hacia el extremo amino terminal, y en que encontraremos diferentes segmentos (o residuos) en las distintas familias:

• Sitios de interacción con otras proteínas.

• Sitios de unión de pequeñas moléculas.

• Residuos susceptibles de fosforilación.

3. En algunos casos también presentan dominios reguladores adicionales, que pueden estar situados o bien hacia el carboxilo terminal, o bien hacia el amino terminal, tal y como el dominio regulador general. Estos dominios adicionales pueden estar implicados en diferentes funciones:

• La localización subcelular.

• En la dimerización de las PDE.

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• O bien constituir más residuos susceptibles de fosforilación.

4.2 Regulación de las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicosCabe destacar tres tipos regulación:

1. Regulación por interacción proteínaproteína. Es decir, las PDE pueden interaccionar con otras proteínas, con lo que resultan reguladas. Se ha descrito:

a) Interacción con proteínas G. Es el caso de la PDE6, específico en GMPc e implicada en la fototransducción. Esta PDE se trata de un heterotetrámero (αβγ2), donde las subunidades y son catalíticas (y además se encuentran isopreniladas, y ancladas a laα β hemimembrana de los discos que da al citosol), y las dos γ son inhibidoras (que mantienen la PDE inactiva cuando se encuentra en forma de heterotetrámero). Consecuentemente a su activación por proteína G, esta PDE6 se trata del efector de un sistema de transducción acoplado a proteína G, concretamente la transducina, presente también en la membrana de los dicos, así como su correspondiente receptor de 7 hélices transmembranas, la rodopsina, encargado de activar la proteína G.

El grupo prostético de la rodopsina (como receptor), el 11 cisretinol, es capaz de captar un protón al recibir radicación, con lo cual se activa, y posteriormente activa la proteína Gt. A continuación la subunidad Gtα interacciona con la PDE6, promoviendo la disociación de las subunidades inhibidoras (2γ), y por tanto su activación.

Para la integración de las señales visuales es necesario un cese rápido de la señal, función en la que están implicadas las subunidades γ libres, debido a que son capaces de actutar como GAP de las subunidades libres de Gtα, inactivándolas.

b) Interacción con Ca2+/ CaM. Concretamente la PDE1, capaz de hidrolizar tanto AMPc como GMPc, es activada por la Ca2+/ CaM; por tanto, a través de esta PDE se integran la vía de señalización de los nucleótidos cíclicos con la vía de señalización regulada por Ca2+.

2. Activación alostérica por GMPc. La PDE2 hidroliza tanto AMPc como GMPc (algo más este último), y como versa este apartado, también se encuentra activada por este último. El significado de esta regulación es integrar las vías de señalización mediadas por ambos nucleótidos cíclicos. De esta forma, en células que expresan pGCA (receptor de ANP) se ha visto que los efectos de la activación de este receptor vienen mediados por la disminución de

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GtαGDPβγ GtαGTP + βγ

αβγ2 + 2αβ γ

Rodopsina

hν

GTP GDP

GMPc

PDE activa

5'GMP

PDE inactiva

GAP


los niveles de AMPc, lo cual representaba una aparente paradoja. Pues bien, la activación del receptor conlleva la síntesis de GMPc, que a su vez activará la PDE2, y como consecuencia descenderán los niveles de GMPc y AMPc, ergo, se dará la respuesta.

Este fenómeno es interesante, y permite postular un efecto directo del GMPc, independiente de una PD dependiente de este nucleótido.

3. Regulación por fosforilación. Donde a su vez diferenciamos:

a) Fosforilación catalizada por PK dependientes de mensajeros intracelulares, que podrán ser la PKA, PKG o las CaMK, con lo que vemos anastomósis de más vías de regulación. Destaca el caso de la PDE4, específica de AMPc, que resulta fosforilada y activada por la PKA, y además presenta colocalización ella gracias a las proteínas AKAP (proteínas de anclaje de la PKA). Así, cuando aumentan los niveles de AMPc, el nucleótido cíclico estimula la PKA, que fosforila una serie de sustratos proteicos, entre ellos la PDE4; por tanto, una de las respuestas de esta vía será la propia finalización de todas las respuestas. Se trata de un mecanismo rápido de la terminación de las respuestas vía AMPc.

Ahora bien, la elevación de los niveles de un mensajero intracelular no es homogénea en toda la célula; así, independientemente de la localización de la AC se puede jugar con la ausencia o presencia de colocalización de la PKA y la PDE4 para determinar una duración determinada de su respuesta. Obviamente, si la PKA está libre, sus respuestas duran más tiempo.

b) Fosforilación catalizada por PK depentiente de la activación de TKRs (receptores con actividad tirosin kinasa). Un ejemplo ilustrativo es la lipolísis en tejido adiposo, que es activada por insulina. De esta manera, la activación del receptor de insulina (IR) activa indirectamente a la PKB, que a su vez activa la PDE3, una fosfodiesterasa con la misma afinidad a GMPc y AMPc.

Regulación mediada por Xantinas

La mayoría de las familias de PDE son inhibidas por xantinas natulares o sintéticas:

• Entre las naturales tenemos la cafeina, teofilina (presente en el Té) y teobromina (presente en el chocolate).

• Entre las sintéticas está la IBMx.

Se trata de inhibidores específicos, que en algunos casos se han utilizado con fines terapéuticos, como sería el caso de la teofilina en su papel de broncodilatador. Sin embargo, más actualmente se están diseñando inhibidores específicos para su uso como agentes terapéuticos, un de los cuales es el sildenafilo, el componente activo de la viagra, un inhibidor PDE5 selectivo (fosfodiesterasa específica de GMPc).

En relación con esto, el aumento de GMPc en el músculo liso conduce a una disminución de

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Ilustración 20: Interacción de la PKA con la PDE4


los niveles citosólicos de Ca2+, lo que a su vez provoca relajación del músculo liso.

Si este músculo liso es vascular, se va a producir una vasodilatación, que a nivel general se traduce en una disminución de la presión sanguínea. Y si se dilatan los vasos aferentes al pene, se produce un llenado de los cuerpos cavernosos o esponjosos, y por tanto erección. Ahora bien, existen agentes farmacológicos que pueden elevar estas concentración de GMPc, por si no se consiguieran de forma natural, de diferentes maneras:

• Se puede o promover su síntesis, que está llevada a cabo por GC.

• O impedir su degradación por su PDE correspondiente.

La GC diana de estos agentes farmacológicos es una GC soluble, y la PDE diana es la PDE5, específica de GMPc. La activación de la sGC viene promovida por el NO, y por tanto se usan agentes farmacológicos que liberen NO, esto es, nitroglicerina y nitritos (los cuales se siguen vendiente den los SexShop como poppers). Por su parte, como hemos visto la PDE5 resulta inhibida por el sildenafilo.

TEMA 6: MENSAJEROS DE ORIGEN LIPÍDICO

1. Conceptos previos Estos mensajeros están generados fundamentalmente por la acción de fosfolipasas (que son

abreviadas como Plasas) o esfingomielinasas (que son abreviadas como Smasas), que como consecuencia de la activación de GPCRs (receptores acoplados a proteína G) o TKRs (receptores con actividad tirosin kinasa) van ha hidrolizar lípidos de la hemimembrana interna plasmática, o de otras membranas. Como resultado de la hidrólisis de estos lípidos se generan una serie de productos que actúan como mensajeros intracelulares, e incluso algunos funcionarán como mensajeros extracelulares. Estos lípidos por tanto serán fosfolípicos o esfingolípidos.

1.1 Estructura de los fosfolípidos y fosfolipasasUn fosfolípido es un esqueleto de glicerol (un alcohol),

que en posición uno y dos tiene sendos ácidos grasos, y en tres forma un enlace ester con un fosfato, y a su vez el fosfato forma otro enlace ester con un alcohol (que puede ser colina, etanolamina, serina e inositol). Las diferentes fosfolipasas pueden hidrolizar diferentes enlaces:

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GTP

Fármacos GMPc ↑ Relajación del músculo liso Vasodilatación

5 'GMP

sGL

PDE5

+

[Ca2+ ]↓

Ilustración 21: Lugares de corte de las principales Plasas


• La Plasa A2 hidroliza el ácido graso en posición 2, generando un lisofosfolípido más ácido araquidónico (los fosfolípidos en posición 2 suelen tener ácido araquidónico). Generalmente esta fosfolipasa no tienen interés en la formación de mensajeros.

• Como producto de la Plasa C se forma diacilglicerol (DAG), y se libera un alcohol fosfato.

• Como producto de la acción de la Plasa D se genera ácido fosfatídico (PA) y se liera el alcohol. A continuación el PA puede ser sustrato de la Plasa A2, que rompe en enlace en posición 2 generando acido lisofosfatídico, y liberando un ácido araquidónico.

Ahora bien, sobre los fosfolípidos pueden actuar también kinasas, las denominadas fosfolipasas kinasas (PLKinasas), que fosforilan el fosfolípido. La única posibilidad de fosforilación reside en que el alcohol sea un polialcohol, y que tenga por tanto al menos un OH libre; de esta manera, el único polialcohol presente en los fosfolípidos es el inositol, un polialcohol cíclico de 6 OH. Un ejemplo lo puede constituir el fosfatidil inositol4,5bisfosfato, que tiene tres enlaces ester mediante fosfatos: el que determina la unión al alcohol, más otros dos en posiciones 4 y 5. De aquí que la hidrólisis por Plasa C de esta molécula de inositol trifosfato (IP3).

NOTA: Lo que vulgarmente llamamos fosfolípido, se llama formalmente glicerolípido, haciendo referencia al alcohol que forma el esqueleto, como ocurre en los esfingolípidos.

1.2 Estructura de los esfingolípidos y esfingomielinasasEl alcohol que constituye el esqueleto de los esfingolípidos es la esfingosina, un

aminoalcohol de cadena larga. Precisamente su grupo amino forma un enlace amida (carboxilo más amino da un enlace amida, como por ejemplo los enlaces peptídicos) con el carboxilo de un ácido graso, dando la unión del ácido graso y la esfingosina una ceramida. Y el OH de la esfingosina forma un enlace ester con un fosfato, que a su vez forma otro enlace ester con un alcohol. El alcohol es del mismo tipo que los presentes en los fosfolípidos.

La Smasa hidroliza el enlace ester entre la esfingosina unida al ácido graso y el fosfato, liberando por tanto la ceramida y un alcohol fosfato. Las ceramidas son mensajeros intracelulares, y actúan sobre algún tipo de fosfoproteína fosfatasa (PPasa) y sobre algún tipo de PKC (proteín kinasa C).

2. Fosfolipasas C de PIP2

Como veremos, existen varias isoformas de la Plasa C de PI4,5P2.

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Ilustración 22: Estructura de los esfingolípidos y lugares de corte de las SMasas


2.1 Metabolismo de fosfoinosítidosEs esquema que se va a describir está referido a la membrana plasmática (donde PIP2 está

localizado preferentemente en la cara interna), aunque las Plasas C hidrolizan también fosfoinosítidos de otras membranas, típicamente la nuclear.

Mediante una PK4K (PI4 kinasa) se genera a partir de PI el PI(4)P. Este fosfoinosítido será sustrato de otra fosforilación mediante la PI5K, que dará el PI(4,5)P2 (fosfoinositol4,5bisfosfato). Este será el sutrato de las Plasas C de PIP2, que liberan DAG (que queda en la membrana) y un intermediario inosítido con el fosfato cíclico (I(1:2cíclico,4,5)P3), que tras introducirse una molécula de agua dará el IP3. Tanto el IP3 como el DAG son mensajeros intracelulares, y por supuesto, siguen diferentes vías de metabolismo:

• El DAG puede ser fosforilado por la DAGK para dar ácido fosfatítico (PA), que funciona como mensajero intracelular y también está implicado en la regeneración de PI (que tiene lugar en el retículo endoplásmico).

• El IP3 se va a degradar a través de dos vías:

◦ Puede sufrir fosforilación por la IP3K (inositol fosfato 3 kinasa, donde el 3 está referido a la posición de la fosforilación, no al número de fosfatos del sustrato), dando I(1,3,4,5)P4. El I(1,3,4,5)P4 será posteriormente desfosforilado para dar IP2.

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◦ La otra vía es la desfosforilación directa del IP3 en posición 5, llevada a cabo por la misma fosfatasa que actúa sobre IP4, la IP5Pasa.

Ambas vías convergen en el IP2, que perderá otro fosfato para dar IP (inositol fosfato), que volverá a ser sustrato de otra fosfatasa generando inositol.

La regeneración del fosfoinositol tiene lugar a partir del inositol y el CDPDAG (formado a partir del PA y CTP (citidina trifosfato)). En la formación del CDPDAG se liberan dos fosfatos en forma de PPi (pirofosfato), dado que el CTP tiene tres fosfatos, el PA tiene uno, y el CDPDAG resultante tiene dos; la enzima que cataliza el proceso es la PA citidil transferasa.

NOTA: Respecto a las fosforilaciones, si los tres fosfatos están en posiciones diferentes de una molécula, se hace referencia a ellos como trisfosfato. Pero si están en la misma posición, y por tanto en una cadena de enlaces ester, se denominan trifosfato.

Finalmente, es la PI Sintasa la que genera a partir del CDPDAG y el inositol el PI, que posteriormente migra a la membrana plasmática, liberándose además en su formación CMP.

Este metabolismo está regulado por receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o con receptores con actividad tirosin kinasa (TKR). Concretamente, la hidrólisis de PIP2, llevada a cabo por la Plasa C de PIP2 ha de estar estrechamente regulada debido a que su acción genera dos mensajeros intracelulares.

Por su parte, el IP3 se libera al citosol, y va a actuar sobre los receptores de IP3 (IP3R), presente en la membrana del retículo endoplásmico, donde promueve la apertura de canales de Ca2+, lo que por tanto supone el paso del Ca2+ endoplásmico al citosol, y por tanto el aumento de sus concentraciones a este nivel (de hecho, la única función del IP3 es el aumento del Ca2+ citosólico). El Ca2+ actúa ahora de diversas maneras:

• Regula un tipo de isoformas de Plasas C de PIP2.

• Otro papel del Ca2+, junto con el DAG será la activación directa (y no mediante Ca2+/ CaM) de la PKC.

• Sin embargo, la mayoría de los efectos del Ca2+ se ejercen a través de las proteínas ligantes de Ca2+, conocidas como CaBP (proteínas ligantes de Ca2+), siendo la más importante la CaM (calmodulina).

Pero no sólo la acción de la Plasa C de PIP2 deben estar muy reguladas, sino que también la síntesis de su sustrato, el PIP2 ha de estarlo, pues constituye un mensajero intracelular capaz de regular las Plasas D.

Por último en lo concerniente al PIP2, tiene un último papel, y es el de ser sustrato de la PI3K para formar un el fosfolípido de membrana PI(3,4,5)P3, un mensajero intracelular. Por su parte, el PI(3,4,5)P3 va ha activar la PDK (kinasa dependiente de PIP3).

A modo de resumen tenemos por tanto tres papeles para el PIP2:

• Sirve de sustrato de la Plasa de PIP2 para formar los mensajeros intracelulares IP3 y DAG.

• Por sí mismo el PIP2 es un mensajeo intracelular que regula Plasas D.

• Es sustrato de PI3K para formar PIP3, que a su vez activa las PDK.

En fin, toda esta regulación es muy importante, de hecho la PI4K, PI5K y la PI3K están

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reguladas por receptores acoplados a proteína G, por TKR (concretamente para la PI3K) y por PA (para la PI4K y la PI5K).

Significado de la existencia de las dos vías en el metabolismo del IP3

A nivel celular, el principio de economía predice que si un proceso se puede llevar a cabo sin gasto de ATP, esa será la versión que se seleccionará; sin embargo, aquí vemos que la vía larga de metabolismo del IP3 gasta ATP, y su versión reducida no. Clásicamente, esto se explicaba dándole al IP4 un papel de mensajero intracelular, pero actualmente se está negando esto.

Parece que la explicación de la conservación de las dos vías reside en que tanto el IP4 como el IP3 son sustratos de la misma enzima, la IP5Pasa, y esta tiene una KM 10 veces menor por el IP4

que por el IP3 (es decir, más afinidad por el IP4); pero precisamente cuando el sustrato es el IP4 la VMAX (velocidad máxima) de la fosfatasa es 100 veces menor que cuando el sustrato es el IP3. Por lo tanto el IP4 tiene un efecto inhibidor de la enzima, tardando más en degradarse el IP3.

Así, la vía larga del IP4 presenta un efecto regulador facilitador que sólo se toma cuando la concentración del IP3 es alta,. Por tanto para darse ha de haber una señal sostenida que implique el aumento de los niveles de IP3, la generación de IP4, y la posterior inhibición de la IP5Pasa que hace que los niveles de IP3 estén elevados por más tiempo.

Papel del litio

Algunas de las Pasas de estas vías parece que se encuentran inhibidas por el catión litio, que a sido utilizado durante mucho tiempo como antidepresivo, por impedir el paso de IP3 a inositol. Además el litio inhibe el apetito sexual.

2.2 Isoformas de Plasa C de PIP2 – Dominios funcionales y regulaciónExisten seis familias de isoformas de Plasa C de PIP2, entre las cuales, por lo que respecta a

la estructura, el modelo de familia es la Plasa Cδ.

Dominios funcionales comunes

1. Dominio PH hacia el extremo amino terminal. Este dominio sirve para la unión de la proteína a las moléculas de PIP2 de la membrana, lo que determina que las Plasas C de PIP2

no sean enzimas integrales de membrana (como veremos no tienen ningún paso transmembrana), sino proteínas asociadas; y dado que el dominio PH no es el centro activo, habrá en la molécula al menos dos regiones que unan PIP2, este dominio PH y el centro catalítico. Las enzimas se deberán unir a sitios ricos en PIP2, pues deberá haber una molécula cerca a la que permite el anclaje, que será el sustrato; de hecho, presenta más afinidad por el PIP2 el dominio PH que el centro catalítico.

La isoforma Plasa C ξ (cita) no presenta el dominio PH, están presentes en el espermatozoide, de forma que en el momento de la fecundación pasan al cigoto y son los responsables de la onda de Ca2+.

2. Dominios catalítico. Está formado por dos regiones, una región X y una región Y, separadas por un pequeño péptido de unión denominado linker XY. Obviamente la mayor

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homología de estas proteínas está en el centro activo.

Hay una familia de isoformas, la Plasa Cγ, cuyo péptido de unión es enorme. Y en las isoformas Plasa Cε hay un inserto en la región Y.

3. Dominio C2 hacia el extremo carboxilo terminal. Une Ca2+ a niveles basales (niveles que hay normalmente en la célula) y fosfolípidos. Sirve para la unión inespecífica a la membrana, con objeto de estabilizar la estructura del centro catalítico. Es más, en la secuencia que lleva a la unión de la enzima a la membrana, primero se une Ca2+ a C2 (esta unión de Ca2+ tanto permite la asociación a la membrana como estabiliza la estructura del dominio catalítico), y esto a su vez determina la unión de C2 a fosfolípidos de la membrana. El siguiente paso es la unión de PH a la membrana (con afinidad selectiva hacia PIP2), y por último se unirá a PIP2 el centro catalítico.

Dominios funcionales adicionales – Regulación de isoformas

1. Regulación de la familia Plasa Cδ. Contiene cuatro dominios EF de unión a Ca2+

estimulado (no a niveles basales, sino regulado a la alza) funcionales. Hay que tener en cuenta que todas las demás isoformas presentan dominios EF, pero en las demás familias no son funcionales; y por tanto, característicamente, la familia se activa por altos niveles deδ Ca2+ citosólicos. Esto es una paradoja, el IP3 aumenta los niveles de Ca2+, y a su vez se genera como consecuencia de la actividad Plasa C de PIP2, que se activa por Ca2+. Sin embargo, de aquí precisamente parte la función de esta familia: esta isoforma se encuentra en todas las células, y su papel es el de amplificar la señal generada por las demás isoformas. Es decir, una Plasa C de PIP2 genérica genera IP3, el cual aumenta los niveles de Ca2+, que a su vez activan a la Plasa C , que aumenta aún más los niveles de Caδ 2+.

Además de en la amplificación, esta familia tiene un papel en la propagación de la señal. En el óvulo, cuando se inyecta la isoforma (que está constitutivamente activa), se escindeξ PIP2 tal que el IP3 aumenta los niveles de Ca2+, que después revierten por los mecanismos off. Pero si en los márgenes del área de subida de Ca2+ hay Plasa C , esto conduce a másδ hidrólisis de PIP2, que generará más IP3, aumentando los niveles de Ca2+ en la zona marginal del aumento del catión. Así se propaga el Ca2+ en forma de ondas hasta la zona distal.

2. Regulación de la familia Plasa Cβ. Esta familia está regulada por GPCR (receptores acoplados a proteína G), concretamente los la proteína Gq/11(siendo necesarios, como en todas las familias, niveles basales de Ca2+). Esta familia se diferencia de la modelo en elδ dominio carboxilo terminal, donde presenta dos dominios funcionales adicionales, uno de los cuales precisamente sirve para la unión de la subunidad Gq/11 . α A priorí las isoformas β se encuentran plegadas, y por tanto inactivas. Con la activación de una proteína Gq/11, la

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Ilustración 23: Secuencia de activación de la Plasa C de PIP2


subunidad αq/11 a este dominio de unión de la región carboxilo terminal, provocando que la enzima se despliegue. Posteriormente, el cambio conformacional que supone el despliegue va a permitir que los dímeros βγ (de la proteína G anterior u otra cualquiera) se puedan unir al linker XY, cooperando en la activación de este tipo de Plasas.

De esta manera los dímeros cooperan en la activación, que realmente está promovida porβγ la subunidad αq/11. Si experimentalmente a una proteína intacta le añado el dímero , noβγ obtengo ningún efecto sobre la actividad de la enzima, pues el sitio de unión al dímero (el linker XY) no se encuentra accesible. Ahora bien, si yo genero una proteína truncada mediante el tratamiento con calpaina tal que escindo la región carboxilo terminal, a la que se une la subunidad αq/11, y que funcionalmente enmascara el linker XY, dicha forma truncada podrá ser activada, debido a la correspondiente unión, por dímeros . Pero esta activaciónβγ es menor que cuando ocurre con αq/11 y .βγ

Además las isoformas de la familia Plasa C se comportan como β GAPs de la subunidad αq/11, es decir, se trata de un mecanismo de autoregulación donde Gq/11 promueve laα activación del efector (Plasa C ), y el efector activado va a promover la rápida detección deβ su activación.

En lo referente al segundo dominio funcional adicional, es un sitio de reconocimiento de dominios PDE en otras proteínas. Existen muchas proteínas con estos dominios, las cuales concretamente están en el núcleo, por tanto gracias a esta región estas Plasas C van a tener una localización nuclear. El núcleo es un orgánulo con una doble envuelta y una serie de poros, pero en definitiva se su envuelta está compuesta por las cisternas proximales de retículo endoplásmico, y por tanto contienen Ca2+, y en su membrana receptores de IP3. La Plasa C en el núcleo hidrolizan PIPβ 2 de la monocapa interna de la membrana nuclear interna, y genera IP3, que a su vez hará que salga Ca2+ del retículo endoplásmico al núcleo. Sin embargo, parece que su papel nuclear (está Plasa C también se encuentra en el citosol) complica la regulación de la Plasa C , sobretodo en lo que refiere a su activación porβ proteínas Gq/11. Como ya sabemos, las proteínas G se anclan a la membrana por modificación lipídica covalente de la subunidad y de la subunidad , y con la activación tendrá lugar laα γ disociación de la subunidad y el dímero . Pero esas modificaciones lipídicas sonα βγ reversibles, dado que existen tanto enzimas que pegan los lípidos a las subunidades de la poteína G, como otras que los despegan. Por tanto, existe una fracción de subunidades que cuando se encuentran disociadas pierden la modificación lipídica, y se liberan de la membrana. Los papeles de las proteínas G fuera de la membrana son amplios, así además de la activación de la Plasa C también están implicados por ejemplo en la polimerización deβ microtúbulos.

Estos dominios adicionales está también presentes en otra familia recientemente descubierta, la Plasa Cη (ita), cuya función no se conoce.

3. Regulación de la familia Plasa Cγ. En esta familia el linker XY es enorme, y precisamente los dominios adicionales se encuentran dentro de él:

• Con el plegamiento adecuado, los dominios P y H a ambos extremos del linker XY dan un dominio PH adicional (dominio de unión a PIP2) de alta afinidad. Por tanto estas proteínas tienen dos dominios PH, el genérico y el adicional.

• Presentan también un dominio SH3, un dominio que reconoce zonas de otras proteínas

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ricas en prolina (como por ejemplo el colágeno), propiciando la interacción de la enzima con ellas.

• Y por último, tienen un dominio SH2, capaz de reconocer residuos fosfotirosina en otras proteínas. Precisamente es el reconocimiento de tirosinafosfatos lo que promueve la activación de estas Plasas Cγ. Estos residuos son generados por Tirosin kinasas, por tanto la señal extracelular que activa estas isoformas son activadores de TKR (receptores con actividad tirosin kinasas).

4. Regulación de la familia Plasa Cε. Con respecto a la familia típica δ, estas isoformas tienen una extensión amino terminal y carboxilo terminal con dominios funcionales adicionales:

• El la extensión carboxilo terminal hay dominios denominados RA1 y RA2, a través de los cuales estas Plasas son activadas por GTPasas monoméricas.

• En la extensión amino terminal presenta un dominio CDC 25 que hace que esta Plasa actúe como una GEF las GTPasas monoméricas.

Por tanto esta familia son tanto efectores como activadores de proteínas G monoméricas.

2.3 Relación entre fosfolipasas C y flujos de Ca2+

Como hemos visto, las diferentes familias tienes distintos modos de regulación:

• La Plasa Cξ es inyectada en el óvulo por el espermatozoide, y está constitutivamente activa.

• La Plasa Cβ se activa por receptoers acoplados a proteína Gq/11.

• La Plasa Cγ se activa como consecuencia de un TKR (tirosin kinasa).

• La isoforma Plasa Cε se activa por GTPasas monoméricas (como por ejemplo la proteína RAS); existen dos formas de incidir en las proteínas G monoméricas:

◦ O bien incidiendo sobre los GEFs (que son imprescindibles, como ya vimos).

◦ O incidiendo sobre las GAPs.

Si contemplamos la primera opción, los GEF son activados por las vías de los TKRs (receptores con actividad tirosin kinasa),

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Ilustración 25: Familias de Fosfolipasas C de PIP2

Ilustración 24: Relación entre las Plasas C de PIP2 y los flujos de Ca2+


además de otras vías. Por tanto, la activación de los TKRs activa tanto a las Plasa C comoγ a proteínas G monoméricas que activan las Plasa C .ε

• Por último, la Plasa Cδ se activa como consecuencia del aumento de los niveles de Ca2+.

En las cinco primeras familias se genera IP3, que promoverá el aumento de la concentración de Ca2+, señal que a su vez será amplificada por las Plasas C .δ

3. Otras fosfolipasas

3.1 Fosfolipasas C de fosfatidil colinaEstas enzimas tienen como sustrato la fosfatidil colina, dando como producto DAG (diacil

glicerol) y el alcohol fosfato, en este caso la fosfocolina. Están reguladas por GPCRs (receptores acoplados a proteína G).

De los dos productos sólo el DAG actúa como mensajero, siendo por una parte capaz de activar la mayoría de las PKC (junto con el Ca2+) y por otra activador de GEFs de GTPasas monoméricas. Además, ya hemos visto que sobre el DAG puede ser fosforilado por la DAG Kinasa dando lugar al PA (ácido fosfatídico), que también va a actuar como mensajero y tendrá como dianas la PI4K y la PI5K.

3.2 Fosfolipasa A2

Esta fosfolipasa en principio no tiene especificidad de sustrato, es decir, puede hidrolizar cualquier fosfolípido (PL), se encuentra como la anterior regulada por GPCRs (receptores acoplados a proteína G) e hidroliza el ácido graso en posición 2 del fosfolípido, dando lugar a un lisofosfolípido y liberando por tanto ese ácido graso en posición 2, que en la mayoría de los casos es ácido araquidónico. El ácido araquidónico actúa como mensajero intracelular, y además sirve como precursor en la síntesis de eicosanoides (como por ejemplo las prostaglandinas). Estos eicosanoides pueden actuar de diferentes maneras:

• O bien de mensajeros extracelulares, como mediadores locales implicados en la inflamación debido a unión a GPCR (receptores acoplados a proteínas G).

• O bien como mensajeros intracelulares, que actúan sobre los PPARs (receptores activados

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PC DAG + FosfocolinaPlasa C de PC

GPCRs

PL LPL + Ácido araquidónico m.i. PPARs

PA LPA + Ácido araquidónico m.e. GPCRsPLA2

GPCRs

GPCRs

m.e.

m.i. Eicosanoides(Prostaglandinas)


por proliferadores de peroxisomas).

Cabe tener en cuenta estas enzimas pueden tener otros sustratos además de los fosfolípidos, como el ácido fosfatídico (PA), de forma que darán como producto de su metabolismo son ácido lisofosfatídico, un mensajero extracelular capaz de activar GPCRs (receptores acoplados a proteínas G), más ácido araquidónico.

3.3 Fosfolipasa DPresenta diferentes isoformas, que serán activadas de distinta manera, saber:

• Por PIP2.

• Por PKC.

• Por último, las Plasas también son efectores de GTPasas monoméricas.

La Plasas D son capaces de hidrolizar cualquier fosfolípido, y cortan entre el fosfato y el alcohol, liberando por tanto ácido fosfatídico (PA) y el alcohol correspondiente. Ya sabemos que el ácido fosfatídico es un mensajero intracelular, pero además mediante la acción de la enzima PA fosfohidrolasa puede ser metabolizado a DAG, otro mensajero intracelular diferente.

En lo referente al alcohol, en prinicipio no tiene ningún papel, sin embargo existe un fosfolípido en bajo nivel en las membranas que marca la excepción en este punto, la Naraquidonil fosfatidil etanolamina, cuyo alcohol es la Naraquidonil etanolamina (conocido vulgarmente como anandamida, ananda significa en griego felicidad), es decir, una etanolamina cuyo NH forma un enlace amida con el ácido araquidónico. De esta forma, si este fosfolípido es la Naraquidonil fosfatidil etanolamina la hidrólisis de Plasa D generará PA y el Naraquidonil etanolamina, un mensajero extracelular capaz de actuar sobre los GPCRs de tipo receptor de cannabinoides, siendo por tanto esta molécula un endocannabinoide.

TEMA 7: EL IÓN CALCIO COMO MENSAJERO INTRACELULAR

1. Flujos de Ca 2+ en las células excitables y no excitables El Ca2+ ni se sintetiza ni se degrada, únicamente se regulan sus flujos, en cuyo análisis

hemos de considerar tres compartimentos:

• El espacio extracelulular, donde la concentración de Ca2+ está en torno a 1mM.

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PL PA + Alcohol

PIP2 PKC GTPasa monomérica

Plasa D

PA fosfohidrolasa

H2O Pi

DAG

Ilustración 26: Formación de la Naraquidonil etanolamina o anandamida


• El citosol, donde la concentración de Ca2+ varía:

◦ En estado excitado se sitúa entre 0,5 – 1 μM.

◦ Y en estado basal está entre 0,1 μM.

• En el retículo endoplásmico, que supone el almacén del catión para las células, donde la concentración está, como en el espacio extracelular, en torno a 1 mM.

Por tanto, consideramos dos membranas, la plasmática y la del retículo endoplásmico:

1. Los niveles del estado excitado se consiguen metiendo Ca2+ del espacio extracelular y sacándolo del retículo endoplásmico, mediante los mecanismos ON. Se trata de transporte pasivo por difusión facilitada.

2. Y tras esto, los niveles basales se consiguen sacando Ca2+ al espacio extracelular y guardándolo en el retículo endoplásmico mediante los mecanismos OFF. Como refleja el esquema, estos mecanismos siempre mueven el Ca2+ en contra de un gradiente de tres órdenes de magnitud, por tanto son procesos de transporte activo en contra de gradiente, con gasto de ATP donde intervienen ATPasas e intercambiadores.

En el desarrollo del tema vamos a referirnos a alteraciones de los niveles del Ca2+

citosólicos, pero ya se ha comentado que también se producen alteraciones de los niveles en el núcleo.

A) Mecanismos ON

Son mecanismos que conducen al estado excitado, basados en transporte por difusión facilitada, es decir, mediante canales de Ca2+ situados en la membrana plasmática y en la membrana del retículo endoplásmico:

a) En la membrana plasmática va ha haber una entrada de Ca2+ extracelular que implica diferentes canales, presentes en las células de forma diferencial en función de si hablamos de células excitables o no excitables:

Exclusivamente en la membrana plasmática de excitables encontramos:

• Canales de Ca2+ dependientes de Voltaje, denominados VOCs (voltaje operated chanels).

• Receptores – canales de Ca2+, o ROCs (receptor operated chanels) dependientes de mensajeros extracelulares (por ejemplo el receptor de glutamato tipo NMDA).

En células no excitables únicamente nos encontramos con canales activados por salida de Ca2+ del retículo endoplásmico, conocidos como SOCs (store operated chanels ).

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ESP. EXTRACELULAR CITOSOL RET. ENDOPLÁSMICO

[Ca2+]: 1mM [Ca2+] excitado: 0,5 – 1 μM [Ca2+]: 1mM

[Ca2+] basal: 0,1 μM

Memb. Plasmática Memb. del RE


b) En la membrana del retículo endoplásmico se da una salida de Ca2+ desde dicho retículo mediada por ROCs (receptores – canales de Ca2+) dependientes de mensajeros intracelulares, que a su vez pueden ser de dos tipos:

Receptores de IP3 o IP3R, presentes en células excitables y no excitables.

Receptores de rianodina, denominados RYRs, que únicamente los encotramos en células excitables.

Estos receptores (tanto los IP3R como los RYRs) son homotetrámeros, en cuya pauta estructural presentan un gran dominio amino terminal orientado hacia el citosol, al que se une el mensajero intracelular, seis y ocho segmentos transmembrana (uno de los cuales define el poro), y en cualquier caso, el extremo carboxilo terminal hacia citosol. Y además, estos homotetrámeros están interaccionando con otras proteínas, formando estructuras muy complejas.

NOTA: Un segmento transmembrana en αhélice necesita de 20 aminoácidos para atravesar una bicapa; en principio han de ser hidrofóbicos, pero en el caso de proteínas que canales, al menos un paso a de ser anfipático.

B) Mecanimos OFF

Se trata de mecanismos dirigidos a conducir los niveles de Ca2+ al estado basal, basados en transporte activo en contro de gradiente, y por tanto implicando gasto de ATP. De igual modo que en los mecanismos ON, los encontramos en las dos membranas a considerar:

a) En la membrana plasmática los sistemas de transporte han de sacar Ca2+ del citosol al exterior:

La ATPasa de Ca2+ de membrana plasmática o PMCA, que realiza un transporte activo primario (hidrolizando ATP) y se encuentra activada por Ca2+/ CaM.

El intercambiador Na/Ca2+, conocido como NCX, mediante el cual el Ca2+ se transporta al exterior en contra de gradiente acoplado a un movimiento de Na+ a favor de gradiente y en sentido contrario. Por tanto, en este caso la hidrólisis de ATP no está acoplada directamente al transporte de Ca2+, sino que tiene como objeto generar el gradiente de Na+ mediante su hidrólisis por la ATPasa de Na+/K+ (que saca Na+ y mete K+, ambos flujos en contra de gradiente). Por tanto se tratoa de un sistema de transporte activo secundario, que debido al sentido opuesto de las especies, se conoce como cotransporte tipo antiporte.

b) En la membrana del retículo endoplásmico el sistema de transporte que media el retorno

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Ilustración 27: Pauta estructural de los receptores canales de Ca2+ dependientes de mensajero intracelular de retículo endoplásmico.


del Ca2+ al retículo es una ATPasa diferente, denominada SERCA (ATPasa de Ca2+ del retículo endoplásmico sarcomplasmático). La SERCA es activada mediante su fosforilación por la PKG (protein kinasa G) del fosfolambano, que a su vez será activa al estar fosforilada por una PK dependiente de GMPc; por tanto tenemos una cascada defosforilaciones iniciadas por el GMPc: la PK dependiente de GMPc, de estar activa (obviamente debido a la presencia del nucleótido cíclico), activa a su vez a la PKG del fosfolambano, enzima encargada de fosforilar, y por ende, activar a la SERCA.

Estos tres sistemas OFF, las dos ATPasas y el intercambiador, están presentes en cualquier tipo celular.

Velocidad del transporte de Ca2+

La comparación de las velocidades de transporte del catión en el compendio de los sistemas ONOFF, que cuentan canales, el intercambiador y las ATPasas, es la siguiente:

Canales >> Intercambiador > ATPasas

Esto se debe a que para que haya transporte por el canal, tan solo ha de darse la apertura de dicho canal, pero el funcionamiento del intercambidador es algo más complejo; y por supuesto, en el caso de las ATPasas es aun más complicado (y lento), pues requieren una actividad enzimática. Es decir, aunque funcionaran los mecanismos OFF constituvamente (y eso que realmente están regulados), bastaría con regular los mecanismos ON para regular los flujos de Ca2+, debido a que el flujo por los canales siempre va a primar por enzima de los otros dos mecanismos.

Dicho de otra forma, mientras que el incremento de los niveles de Ca2+ es muy rápido, la disminución es muy lenta. Pues bien, para hacer que la disminución de los niveles de Ca2+ sea más rápida, una parte de Ca2+ citosólico que retorna al retículo endoplásmico lo hace vía mitocondria, por tanto la misma mitocondria va a ser un orgánulo capaz de almacenar transitoriamente Ca2+. Esto va a implicar un intuitivo e interesante mecanismo de regulación, una elevada y transitoria concentración de Ca2+ mitocondrial va a implicar previa y necesariamente un incremento de Ca2+

citosólico, y dado que si hablamos de músculo, el Ca2+ produce la contracción, ese Ca2+

mitoconcrial hace referencia a un gasto anterior de ATP, que por tanto debe ser repuesto (como sabemos, desde la misma mitocondria).

Secuestro de Ca2+ y tampones

La concentración de Ca2+ en torno a 1mM dentro del retículo supone una estimación de catión presente en el orgánulo, pues gran parte del Ca2+ presente en el interior del RE no se encuentra libre, sino que está asociado a proteínas como la calsecuestrina o calreticulina; por tanto, en la estimación de la concentración de Ca2+ del retículo, se divide el peso de Ca2+ del retículo entre el peso del correspondiente retículo endoplásmico.

El objeto de este secuestro es evitar la rotura del retículo endoplásmico por entrada de agua del citosol, es decir, igualar presiones osmóticas.

Ahora bien, una parte del Ca2+ citosólico tampoco está libre, sino unido a proteínas que regulan, secuestran o tamponan el Ca2+ libre, proteínas que por tanto almacenan el Ca2+ citosólico in situ, pero que no son efectoras. A estas proteínas se les denomina tampones de Ca2+, siendo algunos ejemplos la parvalbúmina o la calbindina. Clásicamente se pensaba que las alteraciones de

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la contracción muscular, tanto esquelética como cardiaca, se basan en alteraciones del transporte de Ca2+; sin embargo, actualmente se ha visto que algunas patologías dependen de los niveles de estas proteínas tamponadoras, que pueden determinar que el Ca2+ que ingrese en el citosol no esté a disposición de las proteínas efectoras.

1.1 Movilización de Ca2+ a través de los receptores de rianodina (RYRs)Se trata de receptores de Ca2+ presentes en la membrana del retículo de células excitables,

que van a ser bloqueados por rianodina, un alcaloide de origen vegetal. Estos receptores desencadenan un papel fundamental en el acoplamiento excitación/contracción en el músculo esquelético/cardiaco (musculo estriado de contracción rápida voluntaria e invuntaria respectivamente). Presenta las siguientes características:

1. Son activados por Ca2+ extracelular. Están presentes en células excitables, que por tanto en la membrana plasmática tienen canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Secuencialmente en estas células primero a de darse una despolarización de la membrana plasmática, que abre los canales de Ca2+ dependientes de voltaje, a través de los cuales entra el catión que activara los RYRs (receptores de rianodina); de esta manera, en la cadena de sucesos primero entra el Ca2+ del exterior, y después se da la salida desde el retículo.

La función de estos receptores – canales de rianodina es amplificar el Ca2+ que entra desde el exterior. Esto es fundamental, pues hay determinadas respuestas que necesitan que la señal de Ca2+ sea superior a la que entra del exterior, y por tanto se requiere una amplificación (como por ejemplo sucede en la misma la contracción muscular); y estos receptores supenen el aumento de un factor de amplificación (se multiplica por 10 la concentración de Ca2+).

Sin embargo, si se tiene in vitro una fibra muscular en en medio carente de Ca2+, con la despolarización de la membrana será suficiente para que salga Ca2+ del retículo a través de los receptores de rianodina tipo I (existen dos tipos). Esto se debe a que, obviamente la señal de activación de estos receptores no es únicamente el Ca2+ que entra por los canales dependientes de voltaje, sino que también interviene en dicha señalización el cambio conformacional que se produce en los mismos canales dependientes de voltaje como consecuencia de la despolarización (que permite el flujo de Ca2+). Es decir, la propia apertura del canal en interacción proteína – proteína, interviene en la apertura del canal de rianodina. Obviamente esto no podría ocurrir de no existir zonas del sarcolema (membrana plasmática de las células musculares) en invaginación en estrecho contacto con el retículo sarcoplásmico (denominadas túbulos T).

2. Estos canales presentan regulación bifásica por el Ca2+ citosólico. Ya sabemos que el Ca2+

que entra del exterior activa el canal de rianodina, de forma que comienza a salir Ca2+ del retículo al citosol, donde activará aún más a los RYRs; lo que indica la regulación bifásica es que llegado a un punto, ese mismo Ca2+ es capaz de cerrar el canal, impidiendo que salga más del retículo. Esto se debe a una serie de características de los RYRs:

i. Presentan un sitio de alta afinidad al que se une el Ca2+ citosólico cuando sus niveles son bajos (pero no basales).

ii. A esta activación ccopera el Ca2+ del retículo endoplásmico por unión a sitios de baja afinidad, que se encuentran orientados hacia la cara luminal del retículo. Esto se

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traduce en que una señal alternativa que promueve la salida del Ca2+ es el hecho de que el retículo endoplásmico esté lleno, situación en la cual estos sitios, aún siendo de baja afinidad, estarán ocupados.

iii. Una vez halla entrado suficiente Ca2+ al citosol (desde el retículo o el exterior) habrá un cierre de los canales – receptores de rianodina a través de sitios de baja afinidad (obviamente hacia el citosol). El Ca2+ sólo es capaz de unirse a ellos cuando esté a altas concentraciones, y por tanto se halla alcanzado previamente en la célula el estado estimulado. Además, llegados a este punto, habrá disminuido la concentración del Ca2+ en el interior del retículo, y por ende los sitios de baja afinidad que promovían la apertura se vacían, cesando su correspondiente componente de la señal de apertura.

Esta regulación bifásica se asegura que se alcancen los niveles adecuados de Ca2+ citosólico, y por otra parte consigue que no se vacíe nunca el retículo endoplásmico. Es fundamental mantener severamente unos niveles adecuados de Ca2+ en el citosol debido a que los fosfatos de Ca2+ precipitan, y el fosfato más importante en la células es el ATP, es decir, si los niveles del catión son altos, el ATP precipita por el Ca2+. Además no puede agotarse el Ca2+ del retículo, pues entonces tendría que haber un transporte a favor de gradiente hacia él, y obviamente no lo hay.

Todos estos sitios de unión al Ca2+ que median la regulación bifásica están o bien en el propio receptor, y/o en proteínas asociadas que forman parte de complejos.

3. Los receptores de rianodina presentan, por último, regulación por fosforilación de PKA de una proteína asociada a la cara citosólica. Dicha fosforilación no es por tanto sobre el propio canal, y promueve la apertura.

1.2 Movilización del Ca2+ a través de IP3RsTienen un papel fundamental en la contracción del músculo liso. Presentan las siguentes

características:

1. Están activados por IP3, cuya producción implica la activación de una Plasa C de PIP2.

2. Como los receptores de rianodina, presentan una regulación bifásica por Ca2+. El Ca2+ que sale del retículo favorece la salida de más Ca2+, hasta que se alcanzan los niveles estimulantes, y entonces se unen a sitios de baja afinidad que propician el cierre del canal. Del mismo modo que en los anteriores también hay una cooperación en la apertura del Ca2+

del retícula, es decir, hay sitios de unión en el lumen de baja afinidad, que a medida que disminuyen las reservas del lumen son capaces de ayudar al cierre del canal. Los objetivos de esta regulación bifásica, serán también evitar que se vacíe de Ca2+ el retículo y asegurar unos niveles adecuados de Ca2+.

Como ocurría en los RYRs, los sitios de unión están o bien en el propio receptor, o en proteína asociadas, pero concretamente los de baja afinidad citosólicos, que conducen al cierre del canal, están en la CaM.

3. Mientras que los RYRs presentaban regulación por PKA, los receptores de IP3 están sujetos a regulación por fosforilación mediada por PKG (proteín kinasa dependiente de GMPc). Esta fosforilación tienen lugar sobre una proteína asociada a estos receptores en su cara

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citosólica, y promueve el cierre del canal. Esto determina un doble papel del GMPc vía PKG en la regulación negativa de los flujos de Ca2+:

i. Por una parte está implicado en la inhibición de los mecanismos ON, a través de los IP3.

ii. Por otra parte promueve una activación de los mecanismos OFF.

Globalmente, ambos fenómenos favorecen la disminución del Ca2+ citósólico, conduciendo a la relajación del músculo liso.

4. La salida de Ca2+ del retículo endoplásmico a través de estos receptores siempre va acompañada de una entrada de Ca2+ extracelular. Esta entrada tiene lugar a través de los SOCs (store operated chanles), cuya regulación no está del todo clara:

(a) Podría ser una interacción proteínaproteína con los receptores que nos ocupan, los IP3R, que a su vez podría ser directa o estar mediada por otras proteínas. Según este modelo, el cambio de conformación que se produciría con la activación de los IP3 se transmitiría directa o indirectamente a los receptores SOCs, que por tanto se abren. En este caso la salida de Ca2+ acontecería en la siguiente secuencia:

i. Primero sale el Ca2+ del retículo.

ii. Como consecuencia y posteiormente, se da una entrada de Ca2+ extracelular.

Como se puede observar, es al revés que lo ocurrido para los RYRs.

(b) Pero los SOCs también podrían estar regulados por mensajeros intracelulares que se produjeran de manera concomitante al IP3 (como consecuencia). Los candidatos para este papel son el DAG, el PA,el ácido araquidónico (proveniente de la hidrólisis del PA), o incluso el IP4.

En este caso la salida de Ca2+ del retículo y la entrada desde el exterior se producirían de forma paralela.

NOTA: Los tipos de canales iónicos son:

Dependientes de voltaje, presentes en la membrana plasmática.

Dependientes de ligando, que puede ser

Un mensajero extracelular, y por tanto tiene su diana en la membrana plasmática.

O un mensajero intracelular, cuya diana a su vez puede estar en diferentes membranas:

• En la membrana plasmática, como es el caso de los SOCs y los canales dependientes de nucleótidos cíclicos.

• Y en la membrana de orgánulos, en este caso del retículo endoplásmico, como por ejemplo los RYRs y los IP3Rs.

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Inactivación de mecanismos ON (IP3R)

GMPc PKG [Ca2+]↓

Activación de mecanismos OFF (SERCA)


2. Mecanismos de acción de Ca 2+ Calmodulina

2.1 Proteínas que unen Ca2+

Esta proteínas necesariamente han de presentar una serie de dominios que posibilite la unión de este ion, como pueden ser los dominios EF ya citados. Un dominio EF está formado por dos

hα élice en un ángulo de 90º, una de las cuales es anfipática (es decir, presenta tanto aminoácidos polares como apolares). Estas dos hélices están unidas por un α bucle formado por aminoácidos con un elevado contenido en átomos de O, de forma que precisamente estos átomos permiten la unión del ion Ca2+, de forma específica (por ejemplo, no se puede unir el Mg2+). Este bucle presenta además unos aminoácidos cuya estructura secundaria es una lámina β.

Los dominios EF siempre aparecen por pares (2,4,6...), pues cada par se necesita recíprocamente para estabilizar sus estructuras, en base a dos mecanismos de estabilización:

1. La αhélice anfipática va a interaccionar con la hélice anfipática del dominio contiguo.α

2. La lámina de un dominio se encuentra en orientación antiparalela con respecto a la láminaβ del dominio contíguo, interaccionando. β

2.2 Tipos de proteínas que unen Ca2+

Diversos tipos de proteínas unen Ca2+, muchos de ellas en EF. A saber:

a) Proteínas almacenadoras/ tamponadoras de Ca2+, que disminuyen la concentración libre.

b) Proteínas efectoras (mediadoras de los efectos del Ca2+). Es decir proteínas que resultan activadas por la unión de Ca2+. Destacan:

• PLC de PIP2, familia δ. Presenta dominios EF, y su función es amplificar la señal de Ca2+.

• PKC, una proteína kinasa a la que se une directamente el Ca2+.

• Calpaina, enzima proteolítica (proteasa) que se activa por Ca2+.

• Calcineurina, una fosfoproteína fosfatasa, que por tanto desfosforila.

• PYK2, que se trata de una tirosin kinasa no receptora, es decir, no dependiente de mensajero extracelar, sino de intracelular, el ion Ca2+.

c) Proteínas mediadoras, que actúan sobre proteínas efectoras y por tanto van a estar implicadas en los efectos indirectos del Ca2+. Las proteínas mediadoras más representativas son:

• Tropanina C, implicada en la contracción muscular, que si bien no es una proteína contráctil cuando se une al Ca2+ regula proteínas contráctiles.

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Ilustración 28: Modelo de la estructura de un dominio EF


• GCAP, proteína activadora de las isoformas de guanidil ciclasa particulada.

• Calmodulina.

Todas estas proteínas son o proteínas solubles o proteínas asociadas a membranas y nunca presentan fragmentos proteicos transmembrana. Los aminoácidos hidrofóbicos de la héliceα anfipática estarán interaccionando con otras aminoácidos hidrofóbicos de la otra héliceα anfipática.

Calmodulina

Concretamente la calmodulina es la proteína a través de la cual el Ca2+ ejerce la mayoría de sus efectos como mensajero intracelular. Se trata de una proteína soluble muy pequeña que se encuentra en todas las células eucariotas y que está muy conservada a lo largo de toda la escala evolutiva. Su estructura terciaria es un dominio globular hacia el extremo Nterminal y otro hacia el Cterminal, entre los que se haya un pequeño dominio, un péptido de unión (linker). En cada uno de los dominios globulares va a presentar dos motivos EF.

La apocalmodulina es la forma de la calmodulina libre de Ca2+, y que presenta por tanto cuatro motivos EF funcionales en los que podrá unir iones del catión. De forma opuesta, la forma de la calmodulina con cuatro iones Ca2+ se denomina Ca2+/ Calmodulina (o Ca2+/ CaM). La unión del Ca2+ a la calmodulina se hace con un valor de Kd=0,51μM (que es la concentración de Ca2+

citosólica en el estado excitado). Los dominios EF del dominio globular del extremo Cterminal tienen más afinidad por el Ca2+ que los del extremo Nterminal. La forma en la que interacciona con los efectores es la Ca2+/ CaM, y lo hace por las regiones globulares, y estos efectores van a resultar normalmente activados.

En algunos casos, dependiendo del efector, la apocalmodulina puede estar interaccionando con el efector a través del dominio globular Cterminal, pero esta unión no tiene efecto sobre la actividad de los efectores.

Los efectores están en general relacionados directamente o indirectamente con la fosforilación/ desfosforilación de proteínas, y son:

i. CaMKs, proteínas kinasas asociadas a CaM.

ii. Calcineurina, una fosfoproteína fosfatasa.

iii. Algunas isoformas de adenil ciclasa.

iv. La PDE1, que hidroliza a AMPc y GMPc; al disminuir AMPc o GMPc dejan de fosforilar proteínas PKA o PKG.

v. Ciertas isoformas constitutivas de NOS, por tanto se produce NO que activa la guanidil

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Ilustración 29: Estructura de la calmodulina


ciclasa, aumenta la concentración de GMPc que a su vez activa la PKG, que fosforila proteínas.

vi. Efectores implicados en los flujos de Ca2+:

• PCMA resulta activado.

• IP3R1 va a ser inhibido.

Por tanto la CaM media los efectos del Ca2+ provocando una serie de respuestas, y entre ellas estará la finalización de la respuestas: Si se activa PCMA saldrá el Ca2+ del citosol, y al inhibirse los receptores de IP3 se bloquea la salida del catión del retículo. En consecuencia, la activación de PMCA bloquea los mecanismos OFF, y la inhibición de IP3R1 bloquea los mecanismos ON.

TEMA 8: PROTEÍNA KINASAS DEPENDIENTES DE MENSAJEROS INTRACELULARES

1. Caracteres generales Una proteína kinasa (PK) es una enzima que fosforila restos de serina y treonina presentes en

otra proteína; ambos aminoácidos tienen OH en su cadena lateral. Ahora bien, este resto tiene que encontrarse en una secuencia consenso:

X B B X Ser/Thr X

Donde B es un aminoácido básico (arginina o lisina) y X es cualquier otro aminoácido.

Las PK se clasifican en diversos tipos, en función de sus mecanismos de regulación:

a) Dependientes de mensajeros intracelulares, entre las que tenemos:

i. PKA, dependiente de AMPc.

ii. PKG, dependiente de GMPc.

iii. CaMKs, dependiente de Ca2+/CaM.

iv. PKCs, dependiente de Ca2+ y DAG, de DAG y de otros mensajeros intracelulares.

v. PDK (PIP3 dependent kinase), dependiente por tanto de PIP3.

b) Reguladas por señales metabólicas, a saber:

i. AMPK, una kinasa activada por AMP.

ii. PDK (piruvato deshidrogenasa kinasa), que es activada por AcetilCoA, NADH y piruvato.

c) Reguladas por fosforilación, esto es, kinasas que se activan por su propia fosforilación por otra kinasa. Destacan:

i. PKB, que es fosforilada por PDK (PIP3 dependent kinase).

ii. PKD, que es fosforilada por PKCs.

iii. MAPKs (mitogen activated protein kinase), como dice su nombre, mayoritariamente se

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activan como consecuencia de la activación de receptores de crecimiento, que generará una cascada de fosforilaciones que desemboca en las MAPKs a través de las MAPKKs.

d) Efectores de GTPasas monoméricas, como la Raf, que es activada por RASGTP.

e) Kinasas que dependen de la activación de receptores acoplados a proteínas G. Estas kinasas siempre están activas, pero para llevar a cabo su acción necesitan que el sustrato este activado por la unión de un agonista, y de este modo tenga el residuo a fosforilar expuesto. Como ejemplo ilustrativo cabe citar las GRKs.

En las proteínas susceptibles de ser fosforiladas hay que distinguir entre secuencia consenso, capaz de ser forsforilada por todas estas kinasas, y secuencia específica, que da especificidad a cada proteína, es decir, los aminoácidos son concretos, y por tanto específicos para las Pks.

Pero además de la secuencia específica, que como secuencia se trata de estructura primaria, también son importantes las estructuras de orden superior, secundaria y terciaria, en la que se encuentra esa secuencia específica.

1.1 Estructura básica común de las PK dependientes de mensajeros intracelularesDistinguimos dos regiones:

1. Región reguladora, que a su vez presenta dos dominios funcionales:

a) Uno de ellos, cuya función es unir el mensajero intracelular.

b) El otro dominio va a ser un péptido pseudosustrato (secuencia consenso pero con una sustitución de Ser/Thr por otro aminoácido) o un sustrato, autoinhibidor (secuencia consenso). De esta manera, en la propia enzima hay una secuencia muy parecida o idéntica a la de la proteína sustrato fosforilable.

i. Sin está presente Ser/Thr se denomina péptido sustrato.

ii. Si está presente la secuencia consenso, salvo Ser/Thr, se denomina péptido pseudosustrato.

La función del péptido pseudosustrato y sustrato es ocupar el centro activo de la enzima, y por tanto impedir que pueda fosforilar otras proteínas, a no ser que esta situación se resuelva.

2. Región catalítica, que del mismo modo también presenta dos dominios funcionales:

a) Un dominio de unión a Mg2+ATP. El ATP es uno de los sustratos de la actividad catalítica de las PK, pues la fosforilación tiene lugar por la transferencia del sustrato en posición γ e un ATP al OH de una Ser/Thr con la formación de un enlace fosfoester.

b) El otro dominio funcional es el dominio de unión de la secuencia específica en la proteína sustrato, que puede estar ocupado por el péptido pseudosustrato/sustrato autoinhibidor, produciéndose una autoinhibición.

Estas regiones pueden encontrarse en la misma cadena polipeptídica (con región reguladora y catalítica) o en diferentes cadenas, hablándose en este aso de subunidades (subunidad reguladora y catalítica).

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Estas proteínas pueden ser solubles o estar asociadas a membrana, y pueden estar asociadas con otras proteínas, como por ejemplo la AKAP (proteína de anclaje a PKA, que también une PDE4).

1.2 Mecanismo de activaciónCuando no hay mensajero intracelular la PK se encuentra autoinhibida debido a que el

dominio del centro catalítico se encuentra bloqueado por el péptido autoinhibidor (ya sea sustrato o pseudosustrato). Cuando las concentraciones del mensajero intracelular aumentan, este se une su correspondiente dominio de unión, provocando un cambio conformacional que hace que el centro catalítico se desbloqué, y por tanto pueda fosforilar proteínas sustrato.

El mecanismo de inactivación es la disminución del mensajero intracelular, que determinará su disociación de la enzima, y por ende un cambio conformacional que bloquea el centro catalítico por su respectiva unión con el péptido autoinhibidor.

Diferencia entre péptido sustrato y pseudosustrato autoinhibidor

Cuando el péptido autoinhibidor es sustrato, al unirse el mensajero intracelular, antes de darse el consiguiente cambio conformacional que active la PK, su residuo Ser/Thr va a resultar fosforilado. Esto desfavorece la inhibición, es decir, se favorece el mantenimiento del estado activo, pues aunque desaparezca el mensajero intracelular (y por tanto se disocie de la PK) va a tardar más tiempo la enzima en autoinhibirse. No obstante, habrá fosfoproteínas fosfatasas encargadas de desfosforilar el péptido sustrato autoinhibidor.

Sin embargo, como ya se ha comentado antes, hay veces en que para la fosforilación de una proteína sustrato no es suficiente el que su PK esté activada, y se necesita también la acción de un modulador alostérico. Esta unión, o disociación, si estaba previamente unido (pues el modulador puede inactivar al unirse o al disociarse), permite que el sitio de fosforilación quede expuesto.

PK como amplificadores

Las PK dependientes de mensajeros intracelulares van a servir como amplificadores de la información contendida en sus respectivos mensajeros intracelulares, debido a que fosforilan un gran número de sustratos diversos. De esta manera, van a ser fosforiladas:

i. Proteínas de transporte.

ii. Proteínas implicadas en vías de señalización (Por ejemplo la AC; la PKC, que fosforila a PKD; y la PDK [kinasa dependiente de PIP3] a PKB).

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Ilustración 30: Mecanismo de acción de las PKs


iii. Proteínas del citoesqueleto, favoreciendo o desfavorenciendo su ensamblaje, y por tanto modulando procesos que dependen del citoesqueleto.

iv. Factores de elongación, implicados en la síntesis de proteínas.

v. Factores de transcripción.

vi. Enzimas reguladoras del metabolismo intermediario.

Es decir, los mensajeros intracelulares, a través de las PK regulan todo los aspectos de la fisiología celular.

Vamos a detenernos en el caso concreto de los factores de transcripción. En eucariotas la enzima implicada en la transcripción es la RNA polimerasa II, que se une al promotor de un gen y a un complejo de proteínas unidas directamente o indirectamente al mismo promotor (obviamente, en otras regiones). Estas proteínas se denominan factores de transcripción, y el complejo que forman junto con la RNA polimerasa II es el complejo de transcripción.

En la mayoría de los casos, la fosforilación de estos factores de transcripción promueve la estabilidad del complejo de transcripción, y por tanto promueve la transcripción del gen asociado a estos factores.

Gran parte de los genes cuya expresión está regulada por fosforilación de sus factores de transcripción se conocen como

IEG (inmediate early genes), y codifican otros factores de transcripción, que a su vez estarán implicados en la transcripción de los genes denominados LRG (late response genes). Así, se cuenciamente, para que se transcriba el LRG es necesario su factor de transcripción, que a su vez, para estar presente a necesitado la regulación por fosforilación de su factor de transcripción.

2. Proteínas quinasas dependientes de AMPc – PKAs La región catalítica y reguladora de las PKA está en cadenas polipeptídicas direntes, y por

tanto es un heterotetrámero formado por dos subunidades reguladoras y dos subunidades catalíticas, que funciona de la siguiente manera:

En ausencia de AMPc se encuentran las cuatro subunidades unidas, y al unirse el AMPc la holoenzima (el conjunto R2C2, es decir, la enzima completa) se disocie en dos subunidades catalíticas por un lado (que ahora se encontrarán activas) y por otro lado las dos subunidades reguladoras, que van a permanecer siempre asociadas, formando un homodímero. Por tanto se puede decir que la holoenzima es un heterotetrámero formado por dos unidades catalíticas unidas a un homodímero de subunidades reguladoras.

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Ilustración 31: Modelo de transcripción.

4 AMPc

R2C2 R2 + 2C*


2.1 Dominios funcionales de la subunidad reguladoraA saber:

1. Un dominio DID, por el cual una unidad reguladora se une a la otra, para formar el dímero. También es el sitio de unión a las AKAPs (proteínas de unión a PKAs), que a su vez están unidas a las membranas o por modificación covalente de tipo lipídico o por asociación a otras proteínas de membrana. Como ya se ha citado, las AKAPs no interaccionan sólo con la PKA, sino que también interaccionan con otras proteínas, concretamente la PDE4 de AMPc.

2. Un dominio IS. Este dominio es el péptido autoinhibidor. Cuando la enzima está inactiva, es decir, en forma de holoenzima, el péptido autoinhibidor se encuentra interaccionando con la subunidad catalítica, bloqueando la unión con la proteína sustrato.

3. Dominios A y B, cada uno de los cuales presenta un sitio de unión para el AMPc, y también median la interación de la subunidad reguladora con la catalítica. Por tanto cada subunidad reguladora puede unir dos moléculas de AMPc, y como la holoenzmia tiene dos subunidades reguladoras, une cuatro AMPc, produciéndose de este modo la disociación. En ese momento la subunidad catalítica estará libre de la inhibición del IS, y podrá fosforilar toda una serie de proteínas sustrato.

2.2 Isoformas de PKAExisten dos isoformas de PKA. En general presentan distinta afinidad por el AMPc, y

distinta modo de asociación entre las subunidades reguladoras; pero la diferencias más remarcables son:

• La PKA I no se autofosforila, es decir, el péptido IS es un péptido pseudosustrato (carece de Ser/Thr objeto de fosforilación). Por tanto, con la unión del AMPc se disocia sin más.

Además no interacciona nunca con las AKAPs, de forma que la PKA I como holoenzima se encuentra siempre en la fracción soluble.

• La PKA II se autofosforila, dado que el dominio IS es un péptido sustrato. Y a diferencia del tipo I es capaz de interaccionar con las AKAPs, y por tanto estas holoenzimas se encuentran asociadas a la membrana (no sólo la membrana plasmática). En estado activo, la subunidad catalítica se disocia y queda libre.

Fosforilación de factores de transcripción

La proteína quinasa de AMPc fue la primera quinasa de la que se demostró que era capaz de fosforilar factores de transcripción nucleares, concretamente que fosforilaba los denominados CREBs, factores de transcripción que se unen a secuencias nucleotídicas denominadas CREs (cAMP response element). Estos factores de transcripción pueden se fosforilados por otras proteínas, pero no en la misma secuencia.

3. Proteínas kinasas dependientes de GMPc (PKG) Son homodímeros, es decir, tienen dos subunidades idénticas, cada una de las cuales

contiene la parte catalítica y las regiones reguladoras. De esta manera, la estructura de cada

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subunidad es:

• Región de dimerización que contiene el dominio de autoinhibición que va a ser siempre un péptido sustrato, sujeto por tanto a autofosforilación.

• Dos sitios de unión a GMPc, uno con mayor afinidad que el otro.

• Parte catalítica con una zona de unión al Mg2+ATP y otra zona de unión a la secuencia específica de la proteína.

Existen dos isoformas autofosforilables, PKG I y PKG II. La PKG II se va a encontrar unida a la membrana por modificación covalente lipídica.

4. Proteína quinasas dependientes de Ca2+/ CaM (CaMKs) Es una familia amplia de proteínas, todas ellas activadas por Ca2+/ CaM. Los miembros de

esta familia van a tener o un solo sustrato, o unos pocos sustratos, y una concretamente tendrá múltiples, la CaMKII. Cada subunidad va a tener los siguientes dominios:

• Un dominio catalítico con dos partes, una de unión a Mg2+ATP, y otra de unión a la secuencia peptídica que se fosforilará.

• Un dominio regulador con el péptido autoinhibidor, que será un péptido sustrato (tiene una treonina que será autofosforilada).

• Un dominio de asociación en el Cterminal.

La proteína se trata de un hexámero que se va a disponer de forma radial, de forma que las subunidades están asociadas a través del dominio de asociación. Realmente puede ser un único hexámero, o pueden disponerse un hexámero encima de otro (teniendo por tanto 12 subunidades).

Cuando se une la Ca2+/CaM a su dominio correspondiente en la región reguladora se dará un cambio conformacional que desbloquea el centro activo, y por tanto la kinasa resulta activada. Un monómero fosforila en la treonina del dominio regulador al monómero vecino, por tanto no se da una autofosforilación en sentido estricto. Esta fosforilación es muy importante, dado que tiene lugar cuando las concentraciones citosólicas de Ca2+ aumentan (la secuencia sería la siguiente: el Ca2+ se une a la CaM, que en conjunto se unen al sitio de unión de la región reguladora, y se dan las fosforilaciones).

Las consecuencias de la fosforilación son el aumenta de la afinidad del sitio de unión para Ca2+/ CaM por la apocalmodulina. Posteriormente al disminuir las concentraciones de Ca2+, el catión se disocia de la CaM, y por tanto se disocia del monómero, pero la apocalmodulina permanece unida al sitio de unión, y por tanto la enzima mantiene el 100% de su actividad (realmente la enzima tiene más afinidad, aún estando fosforilada por la Ca2+/ CaM).

Es más, aunque se disocie la apocalmodulina, la enzima mantiene entre el 20 – 80% de actividad residual hasta que no se produzca la desfoforilación del residuo de treonina (a esto fenómenos se denomima mecanismo de memoria molecular).

Gracias a todo esto la CaMK II juega un papel importante en la LTP.

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5. Proteína kinasa C (PKC) Dentro de esta familia tendríamos tres grupos:

1. Las denominadas clásicas, cuatro isoformas que van a ser activadas por DAG y Ca2+.

2. Las denominadas nuevas, tres isoformas que sólo serán activadas por DAG.

3. Por último, las atípicas son tres isoformas que no serán activadas ni por DAG ni por Ca2+. Todavía no está muy claro, pero se piensa que podrían ser activadas por ácido araquidónico y ceramidas.

Cabe destacar que las PKD son activadas por las clásicas y por las nuevas, por lo que estas otras kinasas son activadas indirectamente por DAG y por Ca2+.

Todas las PKC son monoméricas, la unidad que las conforma tendrá las regiones catalíticas y las regiones reguladoras correspondientes. De esta manera, la estructura de las PKC clásicas se basa en una serie de dominios variables (C) y una serie de dominios constantes (V), de forma que los dominios constantes están flanqueados por variables. Así, la estructura desde el Nterminal al Cterminal es:

• Péptido pseudosustrato autoinhibidor en V1, que al ser pseudosustrato no va a presentar autofosforilación. Este pseudosustrato en las nuevas y en las atípicas estará localizado en otros sitio.

• Dominio C1 (duplicado), que a su vez presentará dos subdominios, A y B, cada uno de los cuales estará formado por dos dedos de zinc. Un dedo de zinc es una estructura formada por la coordinación de un ión zinc con cuatro aminoácidos, que a su vez pueden ser cuatro cisteínas, tres cisteínas y una histidina o dos cistidinas y dos histidinas. La función de los de dos de zinc es generar un bolsillo hidrófóbico en el cual la proteína va a unirse con el DAG. El dominio C1 también aparece duplicado en las nuevas (activadas por DAG) pero no en las atípicas (no activadas por DAG).

• Dominio C2 en el que encontramos:

◦ Dos o tres sitios de unión a Ca2+ en concentraciones estimuladas.

◦ Un sitio de unión para fosfatidilserina (PS).

◦ Un sitio de unión a RACKs (proteínas de membrana denominadas receptores de la proteína quinasa C activada).

◦ Un péptido pseudoRACK.

Cuando la PKC se encuentra activada, va a estar unida a la membrana a través del sitio de unión a RACKs, Pero cuando no se encuentre activa, el sitio de unión a RACKs va a estar bloqueado por el péptido pseudoRACK, y por lo tanto PKC no podrá interaccionar con RACKs, y no podrá unirse a la membrana.

El dominio C2 en las nuevas va a estar interrumpido por secuencias variables V1, esto determina que el dominio C2 no una Ca2+, y por eso las nuevas no son activadas por Ca2+.

• Si continuamos hacia el extremo Cterminal nos encontramos el dominio V3, un sitio de corte para proteínas.

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• Posteriormente el dominio C3, de unión a Mg2+ATP.

• El dominio C4, de unión a la proteína sustrato.

• Y por último el dominio V5, que presenta sitios susceptibles de fosforilación, y sitios de unión a otras proteínas.

5.1 Activación de las PKC clásicasExisten proteínas llamadas anfitrópilas, cuya localización depende de su activación, como

es el caso de la PKC; de este modo, cuando están inactivas se localizan en el citosol de manera soluble, y cuando están activas están asociadas a la membrana.

En el ciclo de activación de las PKC clásicas diferenciamos tres estadíos:

a) La unión de Ca2+ estimulado a C2, que desbloquea (o rompe) la interacción del sitio de unión a RACKs con el péptido pseudoRACKs. Por tanto, este desbloqueo promueve la translocación de la PKC a la membrana.

b) Posteriormente se produce la unión de la PKC a RACKs y fosfatidilserina (PS), una vez en la membrana. Hay que tener en cuenta que la proporción de RACKs y fosfatidilserina es más alta en la membrana que la proporción de DAG, por tanto una vez unida comienza a buscar DAG.

c) Por último se da la búsqueda de DAG y la unión a DAG por C1 (duplicado), con lo que se revierte el bloqueo que ejerce el péptido pseudosustrato autoinhibidor sobre el dominio C4, y la la PKC se activa.

Parece que en el caso que en la regulación de las PKC influye algún factor más, además del péptido autoinhibidor, pues la delección de V1 tendría que generar una enzima constitutivamente activa, pero experimentalmente no se consigue (sólo se a logrado por un corte enV3).

TEMA 9: PROTEÍNAS FOSFATASAS

1. Conceptos básicos Existen tres familias de proteínas fosfatasas:

• Familia PPP, fosfoproteína fosfatasas, que son serina/ treonina fosfatasas. En esta familia se encuentra la PPasa 1, la PPasa 2A y la PPasa 2B o calcineurina.

• Familia PPM, proteínas fosfatasas dependentes de Mg2+ ,también serina/ treonina fosfatasas. En esta se incluyen la PPasa 2C y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa o PDP.

• Familia PTP, fosfotirosina fosfatasas obviamente tirosina fosfatasas. Donde a su vez diferenciamos:

◦ Las PTP clásicas, que desfosforilan sólo residuos de tirosina fosforilados.

◦ Las duales, que son capaces de actuar tanto sobre residuos de tirosina fosforilados, como sobre serina/ treoina fosfatos (algunas veces la PPasa 2A también se comporta como

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dual).

Toda esta clasificación se hace atendiendo al aminoácidos que desfosforilan, a la secuencia de la proteína sustrato, a las semejanzas en su estructura tridimensional, al mecanimos catalítico...

2. Fosfoproteína fosfatasas (PPP)

2.1 Fosfoproteína fosfatasa 1 (PPasa 1)Se trata de un heterodímero compuesto por:

• Una subunidad catalítica.

• Una subunidad reguladora (que aveces no lo es), que acerca la PPasa a sus sustratos.

Concretamente una de las subunidades reguladoras, denominada subunidad G acerca la PPasa 1 al glucógeno, de forma que la PPasa 1 tiene como sustrato enzimas que participan en el metabolismo del glucógeno.

La regulación de la PPasa 1 se da por fosforilación/ desfosforilación de la subunidad reguladora y/o por interacción de la subunidad catalítica con proteínas inhibidoras termoestables de bajo peso molecular (la I1 e I2) (en este caso la subunidad reguladora no está regulando). La interacción de las proteínas inhibidoras termoestables de bajo peso molecular viene determinado por su propio grado de fosforilación.

2.2 PPasa 2B o calcineurinaSe trata de un heterodímero con las siguientes subunidades:

• Una subunidad catalítica (A) con las siguientes dominios:

◦ Un dominio de unión que hace interacción con la subunidad reguladora.

◦ Un dominio catalítico.

◦ Un dominio de unión de apocalmodulina y de Ca2+/ CaM.

◦ Un dominio autoinhibidor, que bloquea el dominio catalítico.

La subunidad catalítica siempre va a estar unida a la CaM, ya sea con Ca2+ o sin el.

• Una subunidad reguladora (B) con cuatro dominios EF

En lo referente a su regulación, se activa por altas concentraciones de Ca2+ citosólico por una doble vía:

a) El Ca2+ se une a la subunidad reguladora.

b) Y por otro lado también a la apocalmodulina,que se encuentra unida a la subunidad catalítica.

Esto determina un cambio de conformación en la subunidad catalítica tal que revierte el bloqueo impuesto por la subunidad reguladora, activándose la PPasa 2B.

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3. Familia fofotirosina fofsatasas (PTPs) Donde como ya hemos visto, diferenciamos entre clásicas y duales:

1. Entre las clásicas, a su vez podemos dividirlas en:

a) Receptores de membrana con actividad tirosin fosfatasa, como por ejemplo la proteína CD45 de los leucocitos. Los ligandos son o bien proteínas de la superficie celular vencinas o de la matriz extracelular, de forma que estos receptores están implicados en la adhesión célulacélula o célulamatriz.

b) PTB no transmembranales, que son o bien enzimas solubles o enzimas ancladas a la membrana, pero que no presentan fragmento transmembrana.

Un mismo gen puede dar variantes de splicing que de variantes de las dos categorías.

2. En las PTP duales, que aunque pueden fosforilar los tres tipos de residuos, tienen más preferencia por fosforilar sustratos de tirosina, se incluyen fosfatasas que desfosforilan sustratos no proteicos, como el RNA.

TEMA 10: RECEPTORES DE MEMBRANA CON ACTIVIDAD TIROSIN KINASA

Existe una secuencia consenso de fosforilación (esto no sucede en las Ppasas), es decir, los residuos de tirosina que van a ser fosforilados se encuentran acompañados por una pareja de aminoácidos ácidos:

– X – A – X – X – A – Tyr – X –

Donde X es cualquier aminoácidos y A es un aminoácido ácido, como glutamato o aspartato.

Nos encontramos dos tipos de receptores con actividad tirosin kinasa, de forma paráloga a sus fosfatasas:

• Proteínas tirosin kinasa clásicos, donde a su vez se diferencian:

◦ Receptores de membrana con actividad tirosin kinasa, donde obviamente tratamos de proteínas transmembranales, al monos por un trozo.

◦ Proteínas tirosin kinasa no transmembranales.

• Proteín tirosin kinasas duales, capaces de fosforilar tanto tirosinas, como serinas y treoninas.

1. Tipos de receptores Atendiendo a una clasificación estructural, tenemos:

i. Receptores heteroméricos, formados por cuatro subunidades diferentes. Es el caso del receptor de insulina y de los IGFs (insulinlike growth factor). De estas cuatro subunidades, dos son unidades y dos son unidades (por tanto 2 , 2 α β α β ), pero en todas las cadenas polipeptídicas la parte de arriba es extrecelular y la de abajo intracelular.

a) Las subundiades α son extracelulares y van a definir el sitio de unión del ligando

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hacia la zona Nterminal.

b) Las subunidades β presentan un segmento transmembrana, y en la región Cterminal intracelular van a poseer el centro catalítico, es decir, la actividad tirosin kinasa.

Las dos subunidades se encuentran unidas por un puente disulfuro, y a su vez lasα subunidades y están también unidas por un puente disulfuro, esto determina que hay tresα β puentes disulfuro en la proteína (una entre las dos , y las otras dos entre el par de y ).α α β Esta estructura establece un eje de simetría, y por tanto permite decir que se trata de dímeros heterodímeros.

La unión del mensajero extracelular va a promover una activación de la actividad tirosin kinasa, actividad que obviamente reside en el deminio catalítico, de forma que habrá una fosforilación cruzada de ambas subunidades en su región intracelular, es decir, el centroβ catalítico fosforila la otra cadena, y viceversa.

ii. Receptores monoméricos, como es el caso del EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial) y el PDGFR (receptor del factor de crecimiento derivados de plaquetas). Presentan una única subunidad transmembranal, de un sólo segmento proteíco. El ligando se va a unir a la región Nterminal (de forma análoga a como sucedía en los heteroméricos), y en la región Cterminal intracelular va a haber un centro catalítico con actividad tirosin kinasa.

Cuando se une el ligando, el receptor se va a desplazar lateralmente en el seno de la bicapa, y formará un dímero con otro receptor monomérico. Por tanto tenemos secuencialmente, desplazamiento lateral, dimerización, y posteriormente habrá una fosforilación cruzada, pero previa dimerización del receptor activado. Se necesita que el centro activo de un receptor fosforile el centro activo de otro receptor para que, y como consecuencia vendrá la activación tirosin kinasa.

iii. Por último están los homodímeros sin actividad asociada, donde se incluyen las proteín tirosin kinasas tipo Janus (JAK) (interferon, interleuquinas, prolactinas, hormonas de crecimiento, leptina,... [la leptina es na hormona liberada por los adipocitos en respuesta a los acúmulos de grasa y su papel metabólico es similar al de la insulina]). Van a estar formados por dos subunidades, y cada una sólo presenta un segmento transmembrana. Estos receptores no presentan en sí activadad enzimática, pero su parte intracelular va a estar asociada a tirosin kiansas no transmembranales de tipo Janus, que contienen dos regiones muy parecidas:

a) Una con actividad enzimática tirosin kinasa.

b) Otra que no la posee (cara falsa).

El ligando se une a las regiones Nterminal extracelulares, y con esto se da un cambio de conformación en cada monómero que aproxima las Janus kinasas entre sí, con lo que acontecerán una serie de fosforilaciones: (a) primero una fosforilación cruzada de las dos moléculas Janus kinasas, (b) y una segunda fosforilación se da en la región Cterminal de los receptores. Como consecuencia aparecen por tanto residuos tirosin kinasa en los receptores, que serán reconocidos por dominios SH2, y la interacción de proteínas con estos residuos va a desencadenar la señalización.

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2. Vías de señalización Pueden ser independientes y/o dependientes de la participación de mensajeros intracelulares.

Los efectos de la activación de estas vías de señalización pueden darse sobre la proliferación celular o sobre el metabolismo.

2.1 Vías de señalización independientes de mensajeros intracelularesCabe destacar:

1. Activación de las vías de las MAPKs (proteínas kinasas activadas por mutágenos). El mecanismos va a ser común en los diferentes tipos de receptores, concretamente para los receptores de EGF, los residuos de tirosin fosfato generados en el receptor EGF como consecuencia de su activación van a ser reconocidos por la proteína Grb2 (growth factor binding protein). Esta proteína tiene dominios SH2 tal que al reconocer los dominios tirosina fosforilados experimetará un cambio conformacional que permitirá la interacción a través de sus dominios SH3 con regiones ricas en prolina de la proteína SOS. La proteína SOS es un GEF de Ras, y por tanto va a promover la entrada de GTP, y por ende la activación de Ras. Como consecuencia de la activación de Ras se va a activar Raf, una proteína kinasa que va a a fosforilar y activar la proteína kinasa de la MAPK (MAPKK o MEK [MEK es una kinasa dual que va a fosforilar a la MAPK en residuos de tirosina y treonina]). En última instancia la MAPK (también llamada ERK) se activa y se transloca al núcleo. La MAPK es una serina/ treonina kinasa, pero dirigida por prolina, es decir, va a fosforilar residuos dentro de una región en que se encuentren con prolina. En el núcleo fosforilará proteínas que fundamentalmente son factores de transcripción de genes que va a a jugar un papel en el ciclo celular

2. En el caso del receptor de PDGF, los dominios SH2 van a reconocer a la proteína CShc, una proteína transmembranal que con su activación promueve la fosforilación de un sustrato llamado Shc, en el que se forman residuos de tirosina. Estos residuos de tirosin fosfato generados en e Shc van a ser reconocidos por SH2, y seguirá el proceso comentado anteriormente con el EGPR.

3. En el caso del receptor de insulina, Grb2 tampoco puede reconocer los residuos de tirosina fosforilados generados en dicho receptor, pero como consecuencia de la activación Shc también será sustrato del receptor de insulina, con lo cual se generan residuos de tirosina fosforilados en la proteína Shc, y estos residuos sí que son reconocidos por Grb2, de forma que se inicia la cascada antes mencionada (Grb2/ SOS/ RAsGTP/ RasGDP/ Raf/ MEK/ ERK/ translocación al núcleo/ transcripción de genes implicados en el ciclo celular).

4. En el cuarto caso, en los receptores de lectina (en los que se daba un acercamiento, y como consecuencia una fosforilación cruzada de las Janus kinasas y su activación) se generan residuos de tirosina fosforilados en el recepto, y estos residuos hace que se pegue a ellos una proteína SHP2 (con dominios SH2). Al estar próxima al receptor esta proteína, también los está a las Janus kinasas, que la fosforilarán, de forma que las Grb2 reconocerán estasr fosfotirosinas generadas por las JAK en las SHP2, y se inicia la vía de las JAK.

5. Los STAT son factores de transcripción situados en el citosol, que cuando se han generado

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residuos fosfotirosin en el receptor por la acción de las JAK van a asociarse a receptores de citokinas (que no poseen actividad tirosin kinasa intrínseca). Su fusforilación por las JAK conduce a la dimerizaciónde estos factores de transcripción por medio de su acomplamiento por SH2. Tras dimerizarse se translocarán al núcleo para regular la transcripción.

2.2 Vías de señalización dependientes de mensajero intracelularPueden depender de diferentes mensajeros intracelulares:

1. Dependientes de IP3 y DAG. Los residuos tirosina fosfato generados en los receptores y/o en otras proteínas van a poder ser reconocidos por la Plasa C de PIP2. Concretamente la Plasa Cγ contenía dominios SH2 en el linker, que reconoce los residuos de fosfotirosina en el receptor (o en el sustrato) y se activa la Plasa C, generándose los mensajeros intracelulares.

Por otro lado, al Plasa Cε presenta dominios RA1 y RA2 hacia el extremo Cterminal a través de los cuales puede resultar fosforilado por Ras, generándose IP3 y DAG.

2. Dependientes de PIP3. Como por ejemplo los IRS (sustato del receptor de insulina), que también van a ser sustrato de las JAK asociadas al receptor de leptina. Los IRS reconocen los residuos de fosfotirosina generados por el receptor como consecuencia de la activación así como los residuos generados por el receptor de leptina como consecuencia de la fosforilación por las JAK, y actuarán como sustrato de estas dos actividades tirosin kinasas (del receptor de insulina y de la JAK), generándose residuos de fosfotirosina en la proteína IRS. Posteriormente P85 reconoce estas fosfotirosinas generadas en el sustrato del receptor de insulina (IRS), y provoca que se active P110, que genera PIP3 en la monocapa interna. PIP3 va a ser un mensajero intracelular que va a activar la PDK (kinasa dependiente de PIP3), que a su vez fosforila y activa la PKB, que fosforila sustratos implicados en el transporte de glucosa, síntesis de glucógeno y lipolisis; por tanto, efector metabólicos (además, PDK también fosforila a otros sutratos implicados en transcripción de genes).

De esta manera, como resumen, la insulina presenta importantes papeles en las dos vías:

• En la vía independiente de mensajeros intracelulares tiene efectos transcripcionales (MAPKs).

• En la vía dependiente de mensajeros intracelulares tiene efectos metabólicos, y algunos transcripcionales.

TEMA 10: RECEPTORES INTRACELULARESVan a unir mensajeros extracelulares de naturaleza lipofílica, que debido a su naturaleza irán

unidos a proteínas de transporte en el plasma, y atraviesan la membrana plasmática por difusión simpre. Estos receptores son sistemas receptor efector, y modulan la transcripicón génica. En general se pueden dividior en receptores hormonales esteroideos y no esteroideos.

1. Receptores de hormonas esteroides En lo referente a su localización, cabe distinguir:

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• Principalmente en el citosol se encuentra el receptor de glucocorticoides y el de andrógenos.

• Principalmente en el núcleo está el receptor de estrógenos.

• En el citosol y en el núcleo por igual están el rceptor de mineralocorticoides.

Los receptores vacíos se encuentran en forma monomérica, y anque se localicen en el núcleo nunca van a estar interaccionando con el DNA.

1.1 Dominios funcionales1. Un dominio Nterminal (NTD) de interacción con correguladores, con proteínas que van a

estar implicadas en la remodelación de la cromatina y en la unión de la RNA polimerasa II. Existen dos tipos de correguladores, coactivadores y correpresores.

2. Un domnio de unión al DNA (DBD), que contiene dos dedos de Zinc, cuya función es interaccionar con el DNA, y para ello exponen aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH fisiológico) para poder interaccionar con las cargas negativas del material genético. Las secuencias de DNA a las que se unen estos receptores se denominan HRE (hormone response element), que se localizan en las regiones promotoras de genes diana.

Estos dos dominios constituyen la región efectora de este sistema receptor.

3. Un dominio visagra (H de Hinge), que va a contener motivos de localización nuclear.

4. Un dominio de unión al ligando (LBD), que es la región receptor a de este sistema receptor. Se encuentra en el extremo Cterminal, y presenta una gran concentración de aminoácidos lipofílicos, dado que ha de interaccionar con ligandos lipofílicos.

Estos receptores presentan múltiples sitios de fosforilación (en serinas, treoninas y tirosinas), pero mayoritariamente la fosforilación tiene lugar en residuos de serina, que se suelen encontrar en motivos serinaprolina, y por tanto serán fosforilados por kinasas dirigidas por prolina, concretamente las MAPKs.

1.2 Mecanismo de acción – Receptor de glucocorticoidesLos receptores vacíos se van a localizar en el citosol, en forma monomérica, pero estos

monómeos van a estar formando heterocomplejos con proteínas de choque térmico, y con otras proteínas. La función de esta interacción es la estabilización por parte de las proteínas del receptor para que pueda unir el ligando. Los receptores vacíos se van a encontrar en un estado de fosorilación basal.

Posteriormente acontece la unión del ligando, el receptor se va a disociar de los heterocomplejos y además se va a dimerizar con otro receptor también unido a ligando, y estos dímeros va a interaccionar con proteínas MNAR (modulator of non genomic action of receptor), que van a activar proteínas tirosina kinasas, que fosforilarán Src. Las fosfotirosinas generadas en este sustrato van a ser reconocidas por Grb2, y de esta forma comienza una vía de señalización de las MAPKs. Como consecuencia se va a activar la vía de las MAPKs, que van a poder fosforilar diferentes sustratos, uno de los cuales serán los propios receptores. De esta manera, en los receptores ocupados habrá un incremento del grado de fosforilación, y por otro lado también habrá una fosforilación por las mismas MAPK de los correguladores con los que interaccionan estos

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receptores. En última instancia esto conduce a la translocación al núcleo, y su efecto en la transcripción.

2. Receptores de hormonas no esteroideas Los principales ligandos son:

• Las hormonas tiroideas, mensajeros intracelulares.

• La vitamina D3, también un mensajero intracelular.

• Mensajeros intracelares del metabolismo lipípido, como los eicosanoides, cuyos receptores se denominan PPARs (receptores activado por proliferación de peroxisomas)

• Retinoides (vitamina A), que presenta dos tipos de receptores, el tipo A y tipo X, que presentan una extraordinaria importancia.

Todos los receptores no esteroideos van a presentar una estructura similar a los receptores esteroideos, siendo las principales diferencias:

1. Se localizan siempre en el núcleo, siempre en forma de heterodímeros R'RX (siendo R' un receptor para cualquier hormona no esteroidea y RX el receptor para retinoides tipo X).

2. Siempre se encuentran interaccionando con el DNA, en secuencias HRE de los genes dianas, tanto en sus estados vacíos como ocupados.

3. Para que se de la respuesta sólo necesitan de la ocupación de R'. Por tanto, cabe preguntarse ¿Para qué sirve el RX?:

a) Si están vacíos sirven para estabilizar el R', es decir su conformación, permitiendo que el ligando se una al R'.

b) Ocupados regulan la respuesta originada por R' en unión a su ligando.

4. Estos receptores suponen un punto de integracción de diferentes vías de señalización, pues también están regulados por hormonas esteroideas mediante fosforilación (por PKA, principalmente).

TEMA 12: METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

1. Metabolismo del glucógeno

1.1 Papel central del hígado en la homeostasis de la glucemiaInterrelaciones metabólicas en el metabolismo energético (mirar fotocopias)

La glucosa va a entran en las células a favor de gradiente, mediante difusión facilitada por GLUT (transportador de glucosa), salvo en las células del epitelio intestinal, en las que entra por transporte activo (contransporte acoplado a Na+). El transportador de glucosa hepático, GLUT II

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tiene una KM mucho mayor que la de los transportadores expresados en otros tejidos, y por tanto, a concentraciones de glucosa basales estos transportadores estarán saturados, y la glucosa pasará a otros tejidos pero no al hígado. Esto determina que al hígado sólo entra glucosa cuando hay mucha concentración en sangre.

Una vez entra es fosforilada por una enzima hexokinasa a glucosa6P; en todos los tejidos la glucosa al pasar es fosforilada por una kinasa, pero en el hígado en particular actúa la glucoquinasa, una hexokinasa con una mayor KM que las hexokinasas de otros tejidos. De esta forma, una vez que está en forma de glucosa6P no puede salir por el transportador, y queda retenida en el interior celular. Sin embargo, la glucosa sólo entra y queda retenida cuando las concentraciones de glucosa en sangre son muy altas, debido a que como hemos visto el transportador de glucosa, así como la hexokinasa hepática (glucokinasa) tienen una KM mayor que las presentes en otros tejidos. Es decir, de no fosforilarse, la glucosa que entra puede volver a salir, y estar a disposición de otros tejidos.

En lo referente a los demás tejidos, al aumentar la concentración de glucosa en sangre estará en gran medida (debido a que la afinidad de sus transportadores es mayor), y esa glucosa será fosforilada a glucosa6P, como ya hemos visto en el hígado; pero la hexokinasa implicada presenta una característica que la diferencia de la glucoquinasa, y es que es inhibida por su procucto. Por tanto, en condiciones de alta glucemia entra glucosa, se fosforila y se acumula, pero si no es utilizada la hexokinasa será pronto inhibida, y no transformará más glucosa en glucosa6P, con lo que la glucosa que entre en estos tejidos periféricos, en estas condiciones sale de nuevo a la sangre.

Es decir, como la glucoquinasa no se inhibe por el sustrato en condiciones de alta glucemia la capacidad del hígado de captar glucosa es ilimitada. Y esta glucosa6P puede almacenarse como glucógeno. El hígado es el órgano que más glucógeno almacena respecto a su peso, además este glucógeno es diferente del de las demás células, pues se trata de una reserva energética del organismo, no para si mismo.

En glucemia elevada

El hígado el es principal tejido lipogénico en muchas especies de mamíferos, incluido el humano, por tanto en glucemia elevada la glucosa6P se puede degradar vía glicolítica a piruvato, que puede ser descarboxilado a acetilCoA por el complejo Piruvatodescarboxilasa, y el acetilCoA entra en el ciclo de Krebs para que el hígado obtenda su energía; o puede pasar a glucógeno. Pero como la entrada en el ciclo de Krebs y el paso a glucógeno son limitados, la acetil colina se acumulará, y por tanto se deriva a la síntesis de ácidos grasos. Por eso la glicolisis hepática a de ser considerada una etapa previa a la síntesis de ácidos grasos.

Una vez formados los ácidos grasos, van a ser esterificados en glicerol para formar triglicéridos. Estos triglicéridos son esportados a la sangre; sin embargo, aún siendo el glicerol polar con su grupos OH, estos estará esterificados por los mismo ácidos grasos, y por tanto en esta paso serán incorporados en el plasma a las VLDLs (lipoproteínas de muy baja densidad), y estos triglicéridos serán almacenados en el tejido adiposo de manera prácticamente ilimitada. Esta reserva de triglicéridos constituye la principal reserva energética del organismo.

Por su parte, el glucógeno hepático es una reserva energética limitada, lo cual es comprensible si tenemos en cuenta que el hígado es un órgano central en el metabolismo del organismo (en la lipogénesis, síntesis de urea, almacén de glucógeno...), es decir los hepatocitos tienen múltiples funciones, pero la principal función del adipocito es almacenar triglicéridos, es

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decir, tan solo reserva energética. En este contexto, cabe preguntarse: ¿Porqué los adipocitos no almacenan glucógeno?, pues bien, en respuesta se puede citar estos puntos:

1. Los ácidos grasos son más energéticos que la glucosa. Si comparamos el ácido hexanoico (incluso teniendo en cuenta que no se encuentran ácidos grasos con tan pocos carbonos en el organismo), C6H12O2, con la glucosa, C6H12O6, vemos que el carbono está más reducido en el ácido hexanoico (pues tiene menos O/C), y debido a que el objeto de estas moléculas en el metabolismo es oxidarse completamente a CO2, en su oxidación los ácidos grasos liberarán más electrones, y por tanto se obtendrá más NADH y FADH2, y en definitiva más energía (este poder reductor da ATP en la respiración).

2. Además una misma cantidad de calorías supone más peso en forma de glucógeno que en triglicéridos. Y además, la partícula de glucógeno está hidratada, es decir, retiene agua, mientras que los triglicéridos son anhidros, es decir, apolares. En consecuencia, el animal pesaría mucho más para almacenar una cantidad de energía, si esta fuera exclusivamente en forma de glucógeno.

Un último destino de la glucosa6P, en condicione de alta glucemia, es emprender la vía de las pentosas6P, en la que se obtiene ribosa5P, necesaria para la síntesis de nucleótidos, y en la que además se produce NADPH. Esto es muy importante, pues como ya sabemos, las reacciones anabólicas o biosintéticas, además de requerir energía requieren poder reductor, y concretamente muchas biosíntesis requieren este poder reductor en forma de NADPH, como por ejemplo la síntesis de ácidos grasos.

Si la glucemia baja

En estas condiciones el hígado se ve encargado en reponer los niveles de glucemia normales, y en primer lugar pasará a obtener energía a partir de la βoxidación de ácidos grasos. Estos ácidos grasos llegan al hígado procedentes de los triglicéridos almacenados en tejido adiposo, que se están hidrolizando con el fin de obtener los mencionados ácidos grasos libres y el glicerol (lipolísis es opuesto a esterificación), saliendo ambos a la sangre. Por su parte, el glicerol es polar (tiene tres OH), y por tanto es soluble en el plasma; pero los ácidos grasos, aunque tengan un carboxilo (grupo polar), tienen muchos más carbonos apolares, y para su transporte en el plasma utilizan seroalbúminas (a correlación, otra de las funciones del hígado es sintetizar proteínas plasmáticas, como esta). Estos ácidos grasos llegan al hígado, donde sufren la oxidación queβ generará acetilCoA, que pasará al ciclo de Krebs.

En esta situación, además el hígado degrada glucógeno a glucosa 6P, que será exportada a a la sangre para ser utilizada por el resto de los tejidos. Pero como ya hemos comentado, la glucosa 6P no puede pasar por el trasnportador de glucosa; sin embargo, el hígado posee glucosa6fosfatasa, que permite la desfosforilación de la glucosa6P, y por ende su conversión en glucosa. Esta glucosa ya si puede salir a favor de gradiente a través del transportador hepático GLUTII. Por esto, las reservas de glucosa del organismo son reservas energéticas del organismo.

De forma análoga a la anterior pregunta, cabría preguntarse ¿Porqué el hígado no almacena triglicéridos y almacena glucógeno? De hecho, los triglicéridos según se sintetizan se esportan, es más, la esteatosis hepática es un estado patológico (debido a alcoholismo u obesidad). A saber:

1. El glucógeno es un polímero ramificado, y esto hace que cuando es necesario que el

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hígado sintetice glucógeno, o que libere glucosa, el proceso se hace con mucha rapidez.

2. La oxidaciónβ de los ácidos grasos es un proceso (a) mitocondrial, y (b) su obtención de energía por la misma oxidación es absolutamente independiente de Oβ 2, pues en la βoxidación se obtiene acetilCoA, y por tanto la energía se obtiene cuando este ingresa en el ciclo de Krebs, es más la misma oxidación requiere Oβ 2.

Sin embargo, el glucógeno libera glucosa, y el primer paso de su metabolismo es la glicolisis que (a) es una ruta citosólica y (b) anaerobia, es decir no requiere nada de O2. Además, en la glicolisis se obtiene energía por fosforilación a nivel de sustrato.

En relación con esto se pueden citar dos ejemplos que ilustran la importancia del glucógeno como reserva energética:

a) Por un lado en los eritrocitos, como no tienen mitoncondrias necesitan la glucosa para obtener energía.

b) Y el músculo esquelético, en condiciones de trabajo intenso gasta mucho ATP, y por tanto lo requiere, con lo que la cadena de transporte mitocondrial estará funcionando al máximo, lo que significa que está consumiendo todo el O2 disponible; de esta forma, si aún necesita más ATP este lo obtendrá por la degradación de glucosa6P a piruvato (glicolisis).

3. La glucosa es soluble, mientas que los ácidos grasos necesitan de seroalbúmina para ser transportados en la sangre. Por tanto, la glucosa podrá atravesar la barrera hematoencefálica, y así utilizada por el cerebro. Por contra, los ácidos grasos no pueden atravesar la barrera hematoencefálica, y no podrán ser utilizados como combustible para el cerebro.

Además, el hígado también sintetiza glucosa de novo, es decir, realiza la gluconeogénesis, que por tanto será otro mecanismo mediante el cual el hígado restaura los niveles de glucosa basales. La gluconeogénesis es, como ya sabemos, la síntesis de glucosa a partir de precursores no glicídicos de tres átomos de carbono. Los principales sustratos gluconeogénicos son la alanina, el lactato y el glicerol.

El acetilCoA no se puede transformar en piruvato, es decir, no es un precursor gluconeogénico. Por eso la glucosa se puede transformar en ácidos grasos, pero los ácidos grasos no se pueden transformar en glucosa, y por tanto la oxidación nunca será una etapa previa a laβ gluconeogénesis.

A continuación pasaremos a comentar los tres sustratos gluconeogénicos:

1. El lactato. En primer lugar, en el músculo se produce el paso de glucosa6P a piruvato (primer paso de la glicolisis), que se trata de una oxidación, y por tanto tendrá acoplada una reducción en la que se forma NADH, que podrá ir a la cadena de transporte electrónico (pero que en eritrocitos y en músculo se requiere en el siguiente paso, como veremos). Posteriormente el piruvato es reducido a lactato por la láctico deshidrogenasa (LDH), reducción que tiene acoplada la oxidación de NADH a NAD+.

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En el hígado, el láctico se introduce a nivel del piruvato en la gluconeogénesis, una vez dado un paso previo de oxidación.

2. La alanina. Se trata de la manera en que el hígado esporta el amonio, que en el hígado se acaba transformando en urea.

La alanina es el αaminoácido correspondiente cetoácido pirúvico, y por tanto pasa porα transaminación a pirúvico. En las transaminaciones un aminoácido pasa a cetoácido a expensan de que un cetoácido pase a aminoácido, y en este caso se trata de una reacción catalizada por la alanina aminotransferasa (o también glumamico piruvato transaminasa) que transamina el cetoglutaratoα a glutamato.

3. El glicerol. Procede del tejido adiposo, y es el producto de la hidrólisis total de los triglicéridos. El glicerol es soluble, y llega al hígado, donde pasa a glicero3P por una reacción catalizada por la glicerol3K. A continuación el glicerol3P da dihidroxiacetonaP; el glicerol es un alcohol,y la DHAP es una acetona, por tanto es una reacción de oxidación, y a de tener en paralelo un redición, concretamente de NAD+ a NADPH.

Entonces el glicerol se incorpora en la gluconeogénesis a nivel de la DHAP.

Prácticamente todas las células almacenan glucosa6P, pero eso no implica que todas las células tengan la glucosa6Pasa, pues puede ser que almacenen glucosa para consumo propio, pero cuando en los tejidos donde se da gluconeogénesis, la glucosa6P formada es para exportación, y por tanto ha de haber necesariamente glucosa6Pasa, para que la glucosa pueda salir de la célula con el objeto de restaurar los niveles sanguíneos.

Otro órgano gluconeogénico (y que por tanto presenta glucosa6Pasa), que también contribuye por ende a la regulación de los niveles de glucosa en sangre es el riñón, pero dada la

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Glucosa6P Piruvato (Músculo)

Piruvato Lactato (Músculo)

Lactato Piruvato (Hígado)

Glicolisis

NAD+ NADHGlicolisis

Glicolisis

NAD+ NADH

Alanina PiruvatoAla amino transferasa

cetoglutarato α Glutamato

Glicerol Glicerol3P DHAP

ATP ADP NAD+ NADH

Glicerol3K Glicero3P DH


diferencia de tamaño tiene una menor contribución.

2. Degradación de glucógeno El glucógeno es un polímero de glucosa en el que las moléculas se encuentran unidas por

enlaces glucosídicos α(14), formando cadenas unidas a la glucogenina, una proteína que constituye el núcleo central de la partícula de glucógeno. Además, estas cadenas pueden ramificarse formando enlaces glicosídicos (16). α

Las partículas de glucógeno se almacenan en el citosol de las células. Desde un punto de vista absoluto, el principal órgano que acumula glucógeno es el músculo esquelético, pues hay mucho más tejido, pero en relación con el peso del órgano, almacena más el hígado. Cabe descatar que existe una importante diferencia entre el glucógeno muscular y hepático, y es que la degradación de glucógeno en el hígado se da cuando hay baja glucemia en sangre con el objeto de recuperar los niveles normales; mientras que la señal que hace que el glucógeno muscular se degrade es la contracción muscular, y el objeto es que la glucosa que proviene de esta degradación de glucógeno sigua la vía glicolítica para obtener energía.

Enzimas de la degradación de glucógeno

Participan dos o tres enzimas:

1. La glucógeno fosforilasa (GPh) rompe por fosforolisis (mediante una molécula de ácido fosfórico) los enlaces α(14), y lo hace sencuencialmente, empezando por los extremos de las ramificaciones y liberando glucosa1P.

2. La fosfoglucomutasa transforma la glucosa1P a glucosa6P, pues en el metabolismo de la glucosa, la molécula que juega el papel central es la glucosa6P.

3. Como es un polimero ramificado, distintivas moléculas pueden llevar a cabo de forma paralela su degradación, y la glucógeno fosforilasa va a degradando por cada extremo hasta que faltan cuatro residuos para llegar a un punto de ramificación, en este punto la enzima se para e intervine una enzima desramificante que es bifuncional, pues hidroliza el enlace

(16) y transfiere el resto de cuatro residuos al extremo de otra ramifiación para que laα glucógeno fosforilasa pueda degradarlo.

La degradación del glucógeno nunca es total, y esto tiene como objeto que siempre queden los suficientes extremos libres para que cuando la situación que a llevada a la degradación se revierta, la síntesis sera rápida. Uno de los factores que interviene en que la degradación no sea total es que la afinidadde la GPh baja por la molécula de glucógeno a medida que su tamaño disminuye.

La GPh cataliza la etapa limitante de la degradación de glucógeno, y por tanto es la sometida a regulación, concretamente los dos tipos de regulación más importantes: regulación por fosforilación/ desfosforilación, y modulación alostérica.

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Existen dos isoenzimas diferenes de la GPh en hígado y en músculo, que van a presentar idéntica regulación por fosforilación/ desfosforilación, pero diferente modulación alostérica. Esto es un ejemplo de compartimentalización tisular del metabolismo, esto es, la existencia de isoenzimas diferentes, con diferente regulación, y en distintos tejidos, en función de las características metabóliscas de esos tejidos.

La fosforilación está catalizada por la GPh kinasa (GPhK), de forma que la GPh queda activa. La desfosforilación está catalizada por la PPasa1 y provoca la inactivación de la GPh. Por tanto, la GPhK promueve la degradación de glucógeno, y la PPasa1 la inhibe.

Además la forma fosforilada, y por tanto activa está sometida a regulación alostérica en el hígado, mientras que en el músculo es la forma desfosforilada e inactiva la que está sujeta a esta regulación. Además, como muestra el esquema, los moduladores de esta regulación alostérica son diferentes, lo que refleja las características metabólicas distintas de hígado y músculo.

2.1 Regulación de la GPhKEs la enzima que activa la glucógeno fosforilasa, enzima que como ya hemos dicho cataliza

la etapa limitante de la degradación de glucógeno.

La GPhK esta constituida por cuatro tipos de subunidades diferentes, y como en el caso de la calcineurina, la GPhK va a unir siempre CaM, tanto en su forma de apocalmodulina como unida a Ca2+, y esta unión es tan estrecha que la CaM se considera una subunidad de la enzima. Por tanto una de estos cuatro subtipos de subunidades es la CaM. De hecho, la GPhK pertenece a la familia de las CaMKs.

Otra de las subunidades resulta fosforilada por PKA. De forma que esta enzima resulta parcialmente activada por altos niveles citosólicos de Ca2+ (por su unión a CaM), o por fosforilación por PKA, pero cuando ambas circunstancias concurren a la vez, la GPhK se encuentra totalmente activa (por tanto, con altos niveles de Ca2+ y da AMPc). La GPhK se inactiva o bien poque disminuye el Ca2+ de forma que el catión se disocia de la CaM (que pasa su forma Ca2+/CaM a

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Músculo Hígado

AMP

ATP GPh GPhP Glucosa

Glucosa6P

ATP ADP

Pi H2O

GPhK

PPasa1

Inactiva Activa

GPhK (apoCaM) GPhK (Ca2+/CaM)P

PKAATP ADP↑Ca2+

PPasa1 H2OPi↓Ca2+

Inactiva Activa

↑AMP +


apocalmodulina) o bien por desfosforilación catalizada por PPasa1 (que también está implicada en la desactivación de GPh).

La regulación de la GPhK es igual en músculo y en hígado, lo único que varía son las señales extracelulares que elevan el Ca2+ y el AMPc. Estas señales extracelulares son:

1. En músculo esquelético hay dos tipos de señales que conducen a la activación de las GPhK:

a) La acetilcolina que se libera en la sinapsis neuromuscular se une al receptor nicotínico del sarcolema, que se abre, provocando la despolarización de la membrana. Esta despolarización provoca a su vez la apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje, y entre Ca2+ del exterior, y además es acompañado de la salida de Ca2+ del retículo a través de los RYRs. En consecuencia aumentan los niveles citosólicos de Ca2+, y estos niveles provocan la contracción muscular, y también mediante la activación de la GPhK median la degradación de glucógeno (que por tanto será paralela a la contracción).

b) La adrenalina es una enzima que se libera en situaciones de estrés (como un ejercicio intenso), actúa a través del receptor adrenérgβ ico, acoplado a proteína G, lo que conduce a la activación de la AC, y por ende al incremento de los niveles de AMPc.

De esta forma, en una situación de contracción muscular normal, la GPhK estará parcialemente activa, pero en ejercicio físico intenso concurren los dos niveles de activación, y la GPhK estará completamente activa.

En resumen:

R nicotínico/ despolarización/ CCDV/ RYR Incremento de Ca→ 2+

adrenérgicoβ / Gs/ AC Incremento de AMPc→

2. En el hígado afectan otros mensajeros extraceluares:

a) El glucagón es la hormana del ayuno, actúa a través de los receptores de glucagón (de 7 pasos transmembrana, como todos los receptores acoplados a proteína G), que están acoplados a proteína G, y provocan la activación de la AC, y por tanto el aumento de AMPc.

b) En el ayuno prologando también se libera adrenalina, pues también se considera una situación de estrés. La adrenalina en el hígado actúa a través de dos tipos de receptores:

i. O bien a través de los receptores βadrenérgicos, activando a Gs, y por tanto activando la AC y aumentando los niveles de AMPc. Aunque como vemos esta vía hace los mismo que el glucagón, esta vía no es muy importante en el hígado, pues este tejido no tiene muchos de estos receptores.

ii. O bien a través de los receptores adrenérgiα cos, que están acoplados a la proteína Gq, que promueve la activación alostérica de la Plasa C de PIP2 , por tanto seβ elevan los niveles de IP3, que se unirán a los receptores de IP3 del retículo, y provocarán la salida de Ca2+ desde del retículo endoplásmico. Pero la salida de Ca2+

del retículo no es suficiente para alcanazar los niveles de Ca2+ estimulados, y es necesario que hay por tanto también entrada del catión desde el citosol a través de los SOCs. En última instancia, aumentan los niveles de Ca2+ que conducen a la respuesta, es decir, en una situación de ayuno tendremos la GPhK parcialmente

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activada, pero en ayuno prolongado la tendremos totalmente activa.

En resumen:

R glucacón/ Gs/ AC → Incremento de AMPc

(R βadrenérgico/ Gs/ AC Incremento de AMPc)→

R adrenérgico/ Gq/ Plasa C de PIPα 2/ IP3R/ SOC Incremento de Ca→ 2+

2.2 Regulación alostérica de la GPhLa GPh se regula de dos maneras, por fosforilación y por modulación alostérica (en la

desfosoforilación también interviene la modulación alostérica). Hay dos isoformas de GPh, una en músculo y otra en hígado, cuyas regulaciones se llevan a cabo por señales metabólicos, que por tanto varían mucho más rápido que las señales extracelulares.

1. En lo referente a la isoenzima muscular, se regula la forma desfosforilada e inactiva de la GPh, e intervienen las señales metabólicas AMP, ATP y glucosa6P. Esta modulación alostérica refleja las necesidades metabólicas del músculo (es decir, que el músculo degrada glucógeno para obtener glucosa6P que será degradada).

De esta forma, en lo referente a las necesidades metabólicas de este tejido, al comienzo de la contracción muscular hay una caida de ATP, y por tanto el ADP sube. Entonces el músculo tiende a degradar glucógeno a glucosa6Ppara que vía glicolítica se obtenga piruvato, que pase a acetilCoA, que a su vez se internalice en la cadena de electrones y se obtenga ATP. Pero este mecanismo se toma su tiempo, y esto a propiciado que el músculo tenga otros dos sistemas para recuperar rápidamente el ATP consumido en la contracción:

• El primer sistema es el paso de ADP y creatinaP a ATP y creatina, catalizada por la creatina kinasa.

El problema que tiene este paso es que la creatinaP se acaba pronto, y entonces entra en juego el siguiente sistema.

• El paso de dos ADP a un AMP y un ATP, catalizado por la adenilato kinasa.

En consecuencia, en la contracción muscular, como consecuencia del segundo sistema de regeneración de ATP no sólo hay una disminución de ATP, sino que también hay un incremento de AMP. La relación ATP/ AMP indica la carga energética celular.

De esta forma, la GPh muscular se regula alostéricamente en su forma desfosoforilada, y por tanto inactiva, aunque como veremos, habría que decir mayoritariamente inactiva, pues realmente la GPh desfosforilada se encuentra en equilibrio entre dos estados:

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ADP + creatinaP ATP + creatina Creatina Kinasa

2ADP ATP + AMPAdenilato kinasa


• Un estado T (tenso), inactivo.

• Un estado R (relajado), activo.

Pero lógicamente este equilibrio se encuentra muy desplazado hacia el estado T, y por tanto la enzima estará mayoritariamente inactiva, y en este contexto el AMP es un modulador alostérico positivo de la GPh muscular, lo que significa que va a favorecer el desplazamiento

de este equilibrio hacia la forma R, una forma anque desfosforilada activa. El significado de esta regulación es que si hay AMP se debe ha que la carga energética a disminuido porque ha habido contracción muscular.

Por otra parte, el ATP y la glucosa6P son moduladores alostéricos negativos, y los dos estabilizan la forma T, inactiva. Es decir, si se unen a la forma T, esta se estabiliza, y se inhibe el paso de T a R. El significado de esta regulaciónes que si aumentan los niveles de ATP no es necesario degradar glucógeno, y si aumentan los niveles de glucosa6P se debe a que la glucosa6P obtenida a partir de la degradación del glucógeno no se están utilizando, por tanto se acumula, y tampoco es necesario degradar más glucógeno.

2. En los referente a la insoenzima hepática, se regula su forma fosforilada y activa. Igualmente, la regulación alostérica refleja el objeto de la degradación del glucógeno en el hígado, que tiene el objeto de la obtener glucosa para exportarlo. De esta forma, el modulador alostérico es la glucosa, cuyo efecto es la inhibición. En lo referente al significado, si hay altos niveles de glucosa, significa que se acumula porque no puede salir dado que hay suficiente fuera, y por tanto, no es necesario degradar más glucógeno.

El mecanismo de acción de la glucosa es favorecer la desfoforilación de la GPh, y por ende su inactivación. Se trata de un ejemplo de interrelación entre los dos mecanismos principales de regulación, la alostérica y por fosforilación/ desfosforilación, es decir, la GPhP se desfosforila más rápidamente cuando se le une glucosa.

2.3 Regulación de la degradación de glucógeno por PPasa1

a) En músculo

Como ya sabemos, la PPasa1 no tiene especificiadad de sustrato, y presentan como 50 subunidades reguladoras, que aproximan la PPasa a los posibles sustratos. Respecto al músculo, la subunidad reguladora es la GM (G de glucógeno y M de músculo) que interacciona por un lado con el glucógeno, y por otro con la PPasa1, de forma que aproxima la proteasa a sus sustratos, la glucógeno fosforilasa (GPh) y la glucógeno fosforilasa kinasa (GphK).

En cuanto a la regulación del proceso, la subunidad reguladora GM es fosforilada por PKA en respuesta a adrenalina (por ejemplo debido a un ejercicio intenso), y esta fosforilación provoca la disociación de la PPasa1, y por tanto su alejamiento para con los sustratos implicados con la degradación de glucógeno. Además, en su estado disociado la PPasa1 interacciona con una proteína

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GPh (inactiva) GPh(activa)

AMP


termoestable inhibidora de bajo peso molecular denominada I1, y concretamente con su estado fosforilado. Previamente, la fosforilación de I1 también a sido llevado a cabo por PKA, y también por respuesta a adrenalina. En cualquier caso, la PPasa1 en interacción con I1 fosforilada no sólo estará alejada de sus sustratos relacionados con la regulacion del glucógeno, sino que estará inactiva. En última instancia, se favorece el estado fosforilado, y por tanto activa de la glucógeno fosforilasa y la glucógeno fosforilasa kinasa, y por ende la degradación de glucógeno (necesaria en una situación hipotética de ejercicio intenso, por ejemplo).

b) En hígado

La subunidad reguladora que aproxima la PPasa1 al glucógeno, y por tanto a sus sustratos relacionados con la degradación de glucógeno es la GL (G de glucógeno y L de liver). En este caso, no sólo estará unida a la GL la PPasa1, sino que también se une la glucógeno fosforilasa en estado fosforilado (GPhP); de forma que cuando se forma este complejo ternario, la PPasa1 estará inhibida.

En lo referente a la regulación del proceso, la glucosa se une a la GPh fosforilada y provoca su disociación del complejo ternario, que por tanto queda desecho. En esta situación, la PPasa1 se activa (al disociarse el complejo), y desfosforila a dos proteinas:

• Tanto a la GPh fosforilada, y por tanto la inhibe.

• Como a la GPhK (glucógeno fosforilasa kinasa), su otro sustrato que interviene en la degradación del glucógeno.

Es decir, la activación de la PPasa1, llevada a cabo por la glucosa bloquea la degradación de glucógeno; el significado de este fenómeno parte de que la glucosa libre en el hígado procede de la degradación del glucógeno o de la gluconeogénesis, y sus altos niveles en el citosol de los hepatocitos indica que no puede salir de ellos debido a altos niveles en sangre. En consecuencia, no es necesaria la degradación de glucógeno.

Si contrastamos la regulación de la degradación en hígado y en músculo, hay que tener en cuenta que I1 también se expresa en hepatocitos, pero no desempeña aquí ningún papel en la inhibición de la degradación del glucógeno debido a que las subunidades de PPasa1 siempre están unidas a GL, nunca se disocian, y en este estado no pueden interaccionar con el inhibidor I1. Obviamente, existe en los hepatocitos más PPasa1 en otras localizaciones, libre, tal que es susceptible al efecto de I1.

3. Síntesis de glucógeno. Regulación coordinada y recíproca del metabolismo del glucógeno

En la síntesis de glucógeno intervienen dos enzimas

1. La glucógeno sintasa (GS), que añade glucosa en forma de UDPGlucosa a un extremo de una rama de glucógeno, generando un enlace (α 14), y liberando UDP. Se trata de una síntesis no reductora, y por tanto como en toda síntesis se necesita energía (hidrólisis de ATP), aunque claramente la acción de la glucógeno sintasa no necesita de ATP:

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UDPGlucosa + Glucógenon UDP + Glucógenon+1

Glucógeno sintasa


La UDPGlucosa se forma a través de glucosa1P y UTP, que dan UDPGlucosa y PPi (que es transformado en 2P por una pirofosfatasa). Y la glucosa1P viene de la acción de una fosfoglucomutasa sobre la glucosa6P. El paso donde se necesita ATP es en la regeneración del UTP a partir de UDP, catalizada por la nucleosidodifosfato kinasa (NDP Kinasa):

En cada extremo del glucógeno hay un OH en posición 4, que formará con OH en posición 1 de la glucosa que entra el enlace. Ya sabemos que en los puntos de ramificación la glucosa forma un enlace con su C1 con el C4 de la anterior, y su OH en posición 6 forma un enlace con el OH en posición a de la primera glucosa de la ramificación.

La glucógeno sintasa añade unidades de glucosa hasta que halla una rama de al menos 11 residuos de glucosa a partir de un punto de ramificación. Una vez se a satisfecho esta condición de longitud de ramificación, potencialmente puede actuar la otra enzima.

2. De esta forma, la enzima ramificante bifuncional, cuando la ramificación alcanza 11 residuos desde su punto de ramificación, transfiere un fragmento de 7 residuos a un punto interno de la partícula de glucógeno (es bifuncional porque es tanto capaz de cortar como de pegar). Esto tiene como objeto generar más ramas, y por tanto más puntos de degradación y síntesis de glucógeno.

La enzima que cataliza la etapa limitante de la síntesis es la glucógeno sintasa (GS), y por tanto es la sometida a regulación, tanto por fosforilación/ desfosforilación como modulación alostérica.

La GS en su forma desfosforilada se encuentra activa, pero en su regulación por fosforilación/ desfosforilación será fosforilada hasta en 9 residuos diferentes por distintas proteínas kinasas; a saber: GSK (glucógeno sistasa kinasa), PKA, GphK y AMPK (PK activada por AMP). La fosforilación de estos residuos conduce a la progresiva inactivación de la glucógeno sintasa. En principio, para reactivación de la enzima deberá tener lugar la desfosforilación por PPasa1.

Por tanto la PPasa1 por un lado desfosforila la glucógeno fosforilasa y la glucógeno fosforilasa kinasa, y por tanto bloquea la degradación de glucógeno; y de forma paralela promueve

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Glucosa6P Glucosa1P

Glucosa1P + UTP UTPGlucosa + PPi (PPi 2P)

UDP (liberado) + ATP UTP + ADP

Fosfoglucomutasa

Pirofosfatasa

NDP Kinasa

GS GS – P Glucosa6PActiva Totalmente inactiva

nPi nH2O

GSKPKA

GPhKAMPK +

PPasa1


el estado desfosforilado y por tanto activo de la GS, promoviendo la síntesis de glucógeno. De esta forma la PPasa es la primera enzima que coordina la degradación y la síntesis, provocando que cuando activa la síntesis, este inactiva la degradación.

Cabe destacar que tanto la regulación por fosforilación/ desfosforilación como la regulación alostérica es igual en músculo esquelético y en hígado.

Regulación alostérica

La regulación alostérica tienen lugar sobre la forma fosforilada, y por tanto inactiva. Es llevada a cabo por la glucosa6P, que actúa como modulador positivo, es decir, activa alostéricamente la enzima que al estar fosforilada debería estar inactiva.

Si los niveles de glucosa6P aumentan en hígado y músculo significa que está entrado glucosa del exterior, no se está utilizando en otras vías, y por tanto a de almacenarse en forma de glucógeno. De aquí el significado de que la misma glucosa6P sea el modulador.

Esto es importante, porque los mensajeros intracelulares (que estaban promoviendo la fosforilación) tardan mucho en degradarse, y además la PPasa1 tarda en ejercer su función; por ello, la señal alostérica es más rápida.

En conclusión, aquí vemos la glucosa6P como modulador alostérico positivo de la GS. Sin embargo, la glucosa6P ya la hemos visto como modulador alostérico de la GPh muscular, siendo concretamente un inhibidor de la forma desfosforilada. Es decir, la glucosa6P es un modulador alostérico que participa en la regulación coordinada y recíproca de síntesis y degradación de glucógeno en músculo. Por un lado promueve la síntesis del glucógeno muscular, y por otro lado bloquea la degradación (como hemos visto, tanto en músculo como en hígado).

Regulación por fosforilación/ desfosforilación

• La presencia de insulina indica que hay elevados niveles de glucosa, y por tanto a de promover la síntesis de glucógeno. Esto lo hará a través del sustrato del receptor de insulina (IRS), que acaba activando la PI3K, que a su vez tiene como sustrato la PI(4,5)P2 y genera PIP3. A su vez el PIP3 activa la PDK (kinasa dependiente de PIP3), que inhibe la GSK, con lo que se favorece el estado activo de la GS, y por tanto la síntesis de glucógeno.

Insulina IRS/ PI3K (PIP→ 3)/ PDK Inhibición de la GSK Síntesis del glucógeno→ →

• Otras dos PK señaladas en el esquema son la GPhK y la PKA:

Ya habíamos visto que la GPhK fosforila la GPh, y por tanto la activa, tanto en hígado como en músculo. Entonces, en la degradación la GPhK es activadora, y por tanto tiene sentido que aquí haga un bloqueo de la síntesis.

Además la GPhK se activa por dos vías, el Ca2+ y la fosforilación por PKA, y también vemos que la PKA es capaz de fosforilar a la GS, inactivándola.

En general, todas las situaciones que llevan a una activación de la GPhK y e la PKA promueven la degradación de glucógeno, mientras que inducen la desfosforilación y por tanto la inhibición de la GS, por tanto esto supone otro punto de regulación coordinada y recíproca de síntesis y degradación de glucosa en músculo e hígado.

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• Por último, en cuanto a la regulación por AMPK, se trata de una PK activada por una señal metabólica, el AMP, y por tanto se trata de una PK dependiente de la carga energética celular.

La activación de la AMPK tiene lugar a dos niveles:

◦ Por una activación directa por AMP, es decir, el AMP funciona como modulador alostérico.

◦ En segundo lugar la activación por AMP de una AMPKK, es decir, una PK de AMPK, que la fosforila y por ende la activa.

Este doble mecanismo hace que la AMPK sea una enzima muy sensible incluso a pequeñas variaciones de la carga energética celular. Es decir, no es necesario que haya variaciones muy bruscas para su activación.

Por contra, Las enzimas reguladas directamente moduladas por AMP (por ejemplo la isoenzima muscular de la GPh) responden a elevados niveles de AMP, por eso la GPh muscular tiene como modulador alostérico el AMP, por eso la GPh muscular tiene como modulador alostérico el AMP, pero no la hepática, pues en el hígado no hay cambios bruscos de AMP. Sin embargo, como hemos visto, las enzimas reguladas por fosforilación por AMPK (GS en hígado y músculo) responden a variaciones más pequeñas en la carga energética, como hemos visto

De esta forma, el AMP tiene un papel en el músculo en la síntesis y degradación coordinada y recíproca del metabolismo del glucógeno, pues si aumenta el AMP debido al ejercicio, por un lado bloquea la síntesis, y por otro promueve la degradación.

En lo referente a la desfosforilación, tanto en hígado como en músculo hay que resaltar por último el papel de la PPasa1 en la coordinación recíproca de síntesis y degradación, pues todas las situaciones que lleven a la activación de la PPasa1 en ambos tejidos fuerzan la activación de la GS, y por tanto promueven la síntesis de glucógeno; mientras que como ya hemos visto, bloquean la degradación.

Por último, el tamaño de la partícula de glucógeno es limitado, y en este fenómeno intervienen varios factores, pero en general la afinidad de la GS disminuye a medida que la partícula crece, y por tanto, a un determinado tamaño, la partícula se disocia.

TEMA 13: GLICOLISIS Y GLUCOGENOGÉNESIS

1. Regulación de la glicolisis muscular En la glicosisis hay tres pasos irreversibles (que sólo son capaces de llevarse a cabo por

enzimas diferentes), el paso de glucosa a glucosa6P (no esclusivo), el paso de fructosa6P a fructosa(1,6)P2, y el paso de PEP a piruvato. Las etapas irreversibles y específicas a la glucosisis son las que se encuentran reguladas, y esta regulación está encargada a satisfacer las necesidades energéticas del músculo (en el hígado la glicolísis no sólo es energética, es previa a la síntesis de ácidos grasos)

Toda la glicolísis se lleva a cabo en el citosol.

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1.1 FosfofructoquinasaEsta enzima cataliza el punto de control más importante de la glicolísis, la conversión de

fructosa6P a Fructosa1,6bisfosfato. La fosfofructoquinasa se encuentra sometida a modulación alostérica, que va a depender:

1. De la carga energética, de forma que:

a) El ATP es un modulador alostérico negativo, es decir, un inhibidor de la enzima. Si hay suficiente ATP, hay suficiente energía, y por tanto la glucolisis se para.

b) El AMP, actuando directamente (no a través de AMPK) ejerce un control alostérico positivo. El significado de esto es que si hay AMP significa que se necesita energía, y por tanto la glucoslisis se activa.

2. El citrato es un modulador alostérico negativo. El músculo en reposo obtiene energía a partir de la degradación de ácidos grasos (que pueden estar almacenados en el músculo en forma de triglicéridos), que mediante la oxidación se degradan a acetilCoA, que va alβ ciclo de Krebs. Por otro lado durante el ayuno prolongado el hígado sintetiza cuerpos cetónicos, y el músculo puede obtener energía a partir de su degradación, obteniendo también acetilCoA.

En resumen, cuando tanto ácidos grasos como cuerpos cetónicos se degradan, aumentan lso niveles de acetilCoA en la mitocondria, y este acetilCoA va a producir un incremento de los niveles citosólicos de citrato. Este citrato citosólico actúa como modulador alostérico negativo, y se detiene la glucolisis. El significado de esto es que ante la presencia de fuentes alternativas de energía la glicolisis se para.

3. También los protones (o el bajo pH) son un modulador alostéricos negativo de la enzima. Durante el ejercicio intenso tiene lugar la glicolísis hasta pirúvico, y su conversión a lactato, y la produción de lactato siempre va acompañada de producción de protones (pues se produce realmente ácido láctico, que se disocia a lactato y protones). El lactato va a la sangre, y en el hígado es sustrato gluconeogénico. Pero los protones también pueden salir a la sangre y provocan acidosis láctica. Para prevenir esto, los protones actúan como modulador alostérico negativo, y la glucolísis se para.

1.2 Piruvato quinasaEl otro paso irreversible y esclusivo de la glicolísis es el llevado a cabo por la piruvato

quinasa, que pasa de PEP a piruvato, y también está sujeta a modulación alostérica.

1. En primer lugar debido a la carga energética celular, donde:

a) El ATP es, como en la fosfofructoquinasa, un modulador alostérico negativo.

b) Mientras que el AMP va a ser un modulador alostérico negativo, pero indirectamente. El AMP activa la fosfofructoquinasa que produce fructosa1,6bisfosfato, como hemos visto, que es el modulador alostérico real de esta enzima

2. El otro modulador alostérico es la alanina, que va a ser un modulador alostérico negativo de la enzima. El significado de esto es que el aumento de alanina significa que está teniendo lugar en el músculo el catabolismo de aminoácidos. El primer paso de la degradación de

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aminoácidos es separar pro un lado el esqueleto carbonato (para obtener energía), mientras que el alfaamino será transportado al hígado (donde se sintetiza urea) incorporado en alanina. Por tanto, como se ha dicho, la alanina es una señal del catabolismo de aminoácidos, y señala que por tanto el músculo tiene una fuente de energía alternativa, y no tiene porqué consumir glucosa. Por tanto, la glucolísis se frena, con lo que se acumula fructosa6P, que mediante la isomerasa pasa a glucosa6Pn y por tanto se inhibe por producto la hexokinasa; por tanto, la glucosa que entra no se fosforila, y puede volver a salir, quedando disponible para otros tejidos exclusivos de glucosa.

2. Regulación coordinada y recíproca de la glicolisis y glucogénesis hepática

En una situación de elevada glucemia, el hígado realiza la glicolisis, que da piruvato, a partir del cual se obtiene acetilCoA que va al ciclo de Krebs. Pero si se genera un excedente de acetilCoA es utilizado en la síntesis de ácidos grasos (que se transportarán al tejido adiposo). En una situación por contra, de baja glucemia el hígado realiza la gluconeogénesis, y en esta situación obtiene su energía a partir de los ácidos grasos, desgradándolos a acetilCoA, e introduciéndolos en el ciclo de Krebs. Estos ácidos grasos viajan al tejido adiposo incorporados en seroalbúmina.

El primer paso de la gluconeogénesis tiene lugar en la mitocondria, es el paso de piruvato a oxalacetato. Este oxalacetato tiene que pasar al citosol, pues el siguiente paso se da aquí, y es concretamente el paso de oxalacetato a PEP; para su transporte el oxalacetato pasa a malato, que en el citosol será transformado en oxalacetato. Y por otro lado, el último paso de la gluconeogénsis es el paso de glucosa6P a glucosa, y es llevado a cabo por la glucosa6Pasa (que se encuntra en todos los tejidos que exportan glucosa), y se encuentra en el RER. En consecuencia, la gluconeogénesis pasa de piruvato a glucosa, pasando por los tres compartimentos.

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regulaciÓn del metabolismovaleroneuroscience.com/regmetabolismo.pdf · 2019-02-04 · regulación...

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