real time qpcr en la mesada problemas, más y más problemas…. feliz día a todas las mujeres!
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Real Time qPCR en la mesada
Problemas, más y más problemas….
Feliz día a todas las mujeres!
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Extracción de RNA
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Material de partida
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Tubos AXYGEN
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Buffer TAE nuevo,
Más tiempo NaOH
H2O nueva (prep muestras)
Loading buffer
EtBr
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Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosa
Tratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora
Usar agua estéril para preparación de buffer
NO reutilizar el buffer
Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer)
Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V)
Siempre usar agua miliQ para preparar muestras
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Hígado:
- centrifugación luego del TriZol
- doble extracción con cloroformo
Sangre:
- menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul)
- GlycoBlue
Particularidades…
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qPCR
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¿¿ Cq > 32/33 ??
- Gen de baja expresión?
- Problema en la RT
- RNA realmente íntegro?
- Problema en la qPCR Control + !!
Pre-amplificación
Cambiar de gen !!
Degradación post-extracción?
SD
Enzimas?
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Nueva tanda de cDNA
CHEQUEAR !
Con 1, 2 o 3 cDNAs
Pool de cDNAs
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Lámpara de excitación? SYBR??
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SYBR
Estabilidad
Inhibición
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AMPLIFICA EL NTC !!!
- Dímeros de primer ??
- Contaminación ??
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Dímeros de primer
- Diseñar nuevos
- T annealing
- Cc usada
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Contaminación
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• Juego de pipetas exclusivo
• NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas
• Gel agarosa en sala aparte
• No mezclar por pipeteo
• Alicuotar reactivos
• Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!!
• Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen
Lidiando con las contaminaciones…
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Construyendo una Curva Standard…
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Curva Standard
Ef = 10 ^ - (1/Pend)
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Puntos a tener en cuenta…
- cDNA a utilizar
- Temperatura de annealing (1,6 1,9)
- Puntos de la curva!!!
- muy concentrados: se va de la linealidad
NO incluir diluciones 1/10 – 1/20
- muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!
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Persevera…..
….. Y triunfarás!!