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Diseño, ejecución y reporte de experimentos de Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Luis Veggi
Introducción a las variables involucradas en la cuantificación de ARN por la técnica de la RT-qPCR
La qPCR, cuantificando la intensidad de fluorescencia
Seguir la cinética de una reacción química midiendo la cantidad de producto
El output de la qPCR: el perfil cinético de la reacción PCR
la curva sigmoidea de amplificación
Los pasos de la reacción de la polimerasa
La qPCR: el termociclador
Ecuación Nro. moléculas =2n
La reacción en cadena
Las fases del perfil cinético de amplificación
Ecuación Nro. moléculas =2n
La cuantificación se realiza en base al ajuste sobre la fase de crecimiento exponencial de la ecuación
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos
Grafico de cinética de amplificación
log intensidad fluorescencia vs nro ciclointensidad fluorescencia vs nro ciclo
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Log Qn ciclos = log Qini + log 2 x n ciclos
Identifico la zona de crecimiento exponencial por la observación una zona recta con la duplicación de un valor cte de punto a punto, si hay varias muestras las curvas deben ser paralelas
La eficiencia de la amplificación
Qn ciclos = Qini x (Ef)n ciclos
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Eficiencia en % =100 % ???
el valor de referencia para cuantificar la cantidad inicial
Cq
QCq = Qini x (Ef)Cq valor arbitrario
Grafico de cinética de amplificación
log intensidad fluorescencia vs nro ciclointensidad fluorescencia vs nro ciclo
QCq = Qini x (Ef)Cq Log QCq = log Qini + log (Ef) x Cq
Línea de cuantificación
Línea de cuantificación
CqC
q
Como realizo la cuantificación de la cantidad inicial de ADN de un gen de
interés (GOI)?
Muestra 1
QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1
En esta ecuación Cq1 lo obtengo del resultado de la medición de la muestra, la eficiencia lo obtengo de la curva estándar, entonces necesito el valor de QCq1.
Cual es la diferencia de hacer una cuantificación relativa o una cuantificación absoluta?
Cuantificación absoluta
Se obtienen valores de la cantidad absoluta (numero de copias, mg etc) en base una curva de calibración que permite obtener el valor de la cantidad de ADN en la línea de cuantificación
Cuantificación relativa
Los valores de concentración se obtienen dándole un valor arbitrario al valor QCq a todos los valores de las muestras que fueron procesadas y medidas en las mismas condiciones y con una misma línea de base y
de cuantificación.
La diferencia esta en la estrategia que se utiliza para superar la situación de desconocer el valor de cantidad ADN en el sitio de cruce de la curve de amplificación y la línea de cuantificación.
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4
Calibrador (estándar calibrador) es la muestra que se utiliza para superar esta situación
Cuantificación absoluta
Muestra de cantidad conocida del gen que permite dar un valor a QCqcal
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4 = Qinical x (Ef)Cqcal
Cuantificación Relativa
Muestra sobre la cual se relacionan (dividen o relativizan) todas las muestras
Cuantificación absoluta del gen de interés (GOI)
QCq = Qini x (Ef)Cq QCq = constante
Transformación logarítmica
Log Qcq = Log Qini + Log(Ef) x Cq
Cq = (Log Qcq /(Ef)) – (1/(Log(Ef)) Log Qini
(Ef)= 10-1/pte
Curva de calibración
Cuantificación absoluta
Condiciones que debe tener una curva de calibración para ser utilizada con una determinada muestra
Condiciones
•Misma línea de base y de cuantificación
•Misma corrida de qPCR
•Mismo lote de RT
•Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento extracción, mismo tipo de muestra Los calibradores tienen que ser muestras muy similares a las de estudio
QCqcal = Qinical x (Ef)Cq1
QCqcal = QCq1
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1
Variación aleatoria del instrumento PCR block, lámpara, filtro, detector, etc).
Variación en el seteo del análisis de resultados, corrección de la línea de base y la línea de cuantificación, reactivos (polimerasa, fluoróforos etc) y propiedades ópticas de los plásticos
En general se mide en la misma corrida que la misma muestra
La cantidad de ADN formada en el cruce de la curva cinética de amplificación y la línea de cuantificación es la misma
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
Condiciones
•Misma línea de base y línea cuantificación
•Misma corrida de qPCR
•Mismo lote de RT
•Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento extracción, mismo tipo de muestra
Cuantificación relativa del GOI
Se asigna un valor arbitrario cómo calibrador
De esta manera matemáticamente se cancela de las ecuaciones el QCq
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1 Qini2 = QCq2 / (Ef)Cq2 Qini3 = QCq3 / (Ef)Cq3
Se dividen, se relativizan al valor de una muestra arbitraria denominada calibrador
Qinical = QCqcal / (Ef)Cqcal
Ejemplo para muestra 1
Qini1 / Qinical = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1 entonces RQ1 = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1
Cuantificación relativa del GOI (RQ)
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1
QCq2 = Qini2 x (Ef)Cq2
QCq3 = Qini3 x (Ef)Cq3
QCq4 = Qini4 x (Ef)Cq4
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4
Para poder tener un valor de las relaciones entre ellos podemos relativizarlos a todas respecto a un mismo valor de Qini y expresión al que denominamos a esta muestra calibrador
La elección del calibrador o el valor del ciclo no influencia los resultados de la cuantificación relativa; los números pueden ser diferentes pero las diferencia de la relación de la cantidad del GOI en las muestras es idéntica, los resultados son equivalentes nada mas son reescalados. Si embargo la elección del calibrador es importante en el error final de las cantidades relativas si el error estimado para la eficiencia de amplificación es tenido en cuenta en el proceso de propagación de errores. Por la tanto para minimizar este error se recomienda el uso del valor promedio.
Muestra calibrador
-Muestra real o imaginaria
-la relación entre las muestras es siempre las mismas mas allá del valor del calibrador
Se usa frecuentemente como calibrador la muestra con mayor Cq o menor Cq o el valor promedio de los Cq de las muestras controles
Cuantificación relativa: elección del calibrador
Lo optimo es usar como calibrador el valor promedio de todos los Cq de las muestras evaluadas.
qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCRdata;Jan Hellemans, Geert Mortier, Anne De Paepe, Frank Speleman and Jo VandesompeleGenome Biology 2007, 8:R19 (doi:10.1186/gb-2007-8-2-r19)
Cuantificación relativa del GOI (RQ)Cant gen A (Q) en muestra 1 sobre cantidad (real o imaginaria) del gen usado
como calibrador
QCq1 = Qini1 x (Ef1)Cq1 QCqcal = Qinical x (Efcal)Cqcal
si las eficiencias son iguales Ef1= Efcal en ambos perfiles de amplificación e igual a 2
Qini1 /Qinical = (Efcal)Cqcal / (Ef1)Cq1
Muestra Calibrador (cal)
Qini1 /Qinical = (2)-(Cq1-Cqcal)
RQGOI = (2)-deltaCq
QCq1 = Qcqcal
Cantidad establecida arbitrariamente al establecer la línea de cuantificación
Cociente de las dos cantidades
Muestra 1
Cq calibrador es el Cq promedio de todas las muestras evaluadas
Elementos a tener en cuenta para una correcta cuantificación utilizando la curva cinética de
amplificación de la qPCR
•Estimación de la línea de base
•Establecimiento de la línea de cuantificación
•Determinación de la eficiencia de la amplificación
El comienzo del fase de crecimiento exponencial La línea de base
En todos los tubos hay una fluorescencia de base o de fondo, que se denomina en ingles background fluorescence que se debe a:
•Colorante libre
•Auto fluorescencia de la muestra
Es una característica normal de la PCR, por lo tanto los equipos lo que hacen es realizar una cuantificación del background y restarle este valor a los valores crudos (R) de fluorescencia de todas las mediciones.
ΔR o dR = R – línea de base de la fluorescencia
El background es mas evidente y se mide en la primer etapa de la reacción de PCR, donde la cantidad de producto es indetectable y solo se mide background.
Durante esta primer etapa entonces se establece la línea de base de la fluorescencia que se obtiene a partir de un algoritmo propio del equipo (o puede poseer varios) y que luego es aplicado a todos los valores de medición de fluorescencia en todos los ciclos de la PCR.
Errores en la estimación de la línea de base
Una línea de base errónea provoca:
1. Alteración en la orientación de la curva cinética de amplificación
2. Alteración en los cálculos de eficiencia
3. valor absoluto alto de background
Para evitar este error se debe tener en cuenta el intervalo de ciclos que esta seteado en el programa para evaluar a línea de base
Primero ciclos de dan comportamientos anómalos
Últimos ciclos chequear que no se superpone con Cq de un gen de alta expresión
Caso 1 Caso 2
En el caso de la eficiencia, se produce por el hecho que un mal calculo de la línea de base por ejemplo en defecto produce la suma de una valor constante que disminuye el valor de eficiencia
Caso 3
Valores alto de background generan un valor alto de la línea de base que puede producir la perdida de valores de la fase de crecimiento exponencial
la línea de cuantificación
Ubicada en fase crecimiento exponencial
Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq Log Qn ciclos = log Qini + log (Ef) x Cq
Línea de cuantificación Línea de cuantificación
Cq
La línea de cuantificación Diferentes métodos de establecerla
La condición de la línea de cuantificación es que se ubique en la zona de amplificación exponencial
Nosotros utilizaremos el método fit point que es un método manual donde se chequea en la curva logarítmica que la línea de cuantificación se ubique en la zona de crecimiento exponencial
Es importante en el caso que se evalúen varios genes juntos en los cuales no pueden caer para un gene en la zona de crecimiento exponencial y otro no.
La eficiencia de amplificación
Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq
Diferentes corridas diferentes eficiencias
Maximización por gen
Run layout RQGOI = (Ef)-deltaCq
Determinación de la eficiencia de la qPCR
Determinación en cada reacción de cada muestra: medición sobre cada curva de amplificación
Problemas para determinar la eficiencia en cada perfil de amplificación
Realizar la curva estándar:
Escala logarítmica dilución de cDNA cantidad relativa
(Ef)= 10-1/pte
Realizar diluciones de cDNA (pool), 1/1, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/200
Cálculos de cantidades relativas con eficiencia erróneas
Problemas de usar
Delta delta Cq
Medimos la expresión de un GOI y un RG en una muestra y en una dilución de la misma muestra considerando que la eficiencia de ambos son iguales calculando las cantidades relativas normalizadas (NRQ)