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Tesis de Posgrado

Reacciones de precipitación en gelReacciones de precipitación en gelde sistemas antígeno - anticuerpode sistemas antígeno - anticuerpo

Eiguer, Teresa

1957

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Eiguer, Teresa. (1957). Reacciones de precipitación en gel de sistemas antígeno - anticuerpo.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0935_Eiguer.pdf

Cita tipo Chicago:Eiguer, Teresa. "Reacciones de precipitación en gel de sistemas antígeno - anticuerpo". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1957.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0935_Eiguer.pdf

UNIVERSIDAD DE BIIEHOB AIRES

Facultad de Ciencias ¡netos y latir-¡lee

REACCIDNIB DE PRDOIPITACIOH El GEL DE SISTEMAS

ANTIOENO-MIGUERPO

Rem-x de Tesis pero optar el título de Doctor en Cinciasgarmin“. Especialidad minis. Biológico.

[nunkaLas tecnicas de precipitación m gel. milton en pro­

vocar, n el seno de un gel, como¡edio de dilusión. lc reacción del

1 antígeno con su correspondiente anticuerpo. Es un procedimiento me

preste al ensayode precipitinas y anticuerpo! de noculación, un alconce que nplitica. sus ys extraordinarias condiciones analíticas.

L1 provocar-ee le. rescción en el seno de un gel. el sspecto de ls.

reacción estará influenciado por lo menospor tres factores: la Velacidad de difusión del antígeno, le del anticuerpo 1 la. poca oclubili

dad del complejo formado. Esto tiene comoconsecuencia que le. parte

visible de le. reacción se produzca cn distintos fome. según las condiciones y de mera. my nítida. ici. mondose enfrenta un antígeno

simple con a: correspondiente snticusrpo, se producirá una sola zonade precipitación, que puede ser m rom de lines fins. Trotándocc

de reactivos que con complejos, naturalmente c por mezcla. cuyos con

ponentes o los remltados de sus reacciones. difieren en m pmpie­dades físico-químicas (velocidad de difusión de los elementos reaccignantes, solubilidad del precipitado formado). habrá distintas sonasde reacción, que se pondrán sn evidencia ya. son por anillos c lineasmás c amoo bien diferenciados.

Este. característica. que presta. el gel e. ln- rcaccianca dc preci­

pitación, es Justamente lc que permite obtener un diálisis más 0011117211

to. dilucide el minero de sistemas reactivos smJuegoy con técni­

cas más desarrolladas, la. comparación entre doc c más reaccionan eje­m Il lo.mismaforma(cinútaneamente).

/ \ r."S 754-fá7u/Jï d")

mmm:Teniendoen cuenta las amplias perspectivas ofrecida

por el método señalado, se comenzóel trabajo con una reseña biblio­

gráfica que pasa revista a las tecnicas conocidas para estudiar la

reacción antígeno-anticuerpo en sonortes gelifícados. Seguidmmente,

se describieron los antecedentes considerados para la parte experi­mantel.

T a o r m t: :De acuerdo con los antecedentes considerados

las experiencias se orientaron en dos lineas: series de ensayos cntubos y cubetas y otras en placas de Petri, con diversas variantes.

9e.describió 1a preparación de los reactivos y medios de difusión,

antígenos e inmunosueros;la técnica fotográfica utilizada y por úl­timo, las condiciones elegidas para efectuar el mecanismode las re­

acciones. Se estudiaron tres sistemas: diftórico, tetánioo y esta­filocóocioo.

El metodo en tubo consistió en colocar en el fondo el suero mez­

clado con gel, luego uns columnacentral, tambien gelificada, sobre

ls que se vertió el antígeno. Se introdujo una modificación ventajgsa, consistente en gelificar la capa antigínicn, con lo cual se uni­

formóla difusión de los reactivos. Si bien esta técnica ofreció mgyor sensibilidad en el desarrollo de las lineas de precipitado for­

madasen ls columnacentral, su interpretación fué dificultoss, porlo cual se adeptó definitivamente el metodoen placa. En este, las

sustancias reaccionantcs se colocaron en pequeños cilindros de vidri

dispuestos en forma triangular entre dos placas de gel superpuestas.

Cabe destacar que el agregado de gelatina al medio de difusión de a!

gar constituyó una variante de interés, pues produjo mayortranspa­

rencia del medio y en algunos casos aceleró la formación de lineas.

La disposición triangular señalada permitió la comparaciónsimutáncs de distintos antígünos y sueros.

Los sistemas diftórico 3 tetánico analizados permitieron obser­

var dos líneas principales.Finalmente, se realizaron erperiencias que demostraron la pocib}

lidad de crear espectros artificiales. medianteVariaciones de tío­

nioa. tele: comoe]. recargado de las sustancias mencionamos. queson un llamado a. 1a.prudencia en 1a interpretación do los resultados

Por otro lado. la termica de precipitación en gol desarrollada,ha.permitido danoetrar la. unload del métodopara observa: diferogccine de estructura en los reactivos oetudiadoa.

TERESA EIGUER

A//

Año 1957

UIIVERBIDAD DE BUENOS AIRES

Inaultad do Ciencias Exactas y Naturales

REACCIONES DE PRECIPITAOIOI El GEL DI SISTEMAS

AN‘I’IGENO-ANTICUERPO '

TESIS

Para apta: al título do Doctor un Giancias químicas

¡specialidad química Biológica

TERESA ¡IGUER

“1°1957 TES/J 033

Deseo expremente dejar conetanoie. de mi reconocimiento el

Dr. Hector Scee, por haberme señalado el caminohacia le. investi­

gación y el haber hecho poeible le. reelización de este trabajo ne­

diante ene coneejoe y eneeñanzne.

li agradecimiento ¡1 Dr. Raúl I'erremola y e. todas las perso­

nae de]. Inetitutc Malbrán, en donde ce efectuaron las experiencias,

que me han brindado eu colaboración en una. u otra. forma.

Las técnicas de precipitación en gel,cuyo desarrollo es objeto

del presente trabajo, consisten en provocar en el seno de un gel co­

momedio de difusión, 1a reacción del antígeno con su correspondien­

te anticuerpo. Es un procedimiento que presta al ensayo de precipi­

tinas y anticuerpos de floculación, un alcance que amplifica sus yaextraordinarias condicionesanalíticas.

Comoen realidad no es más que un perfeccionamiento de los métodos

de observación de las reacciones de precipitación y floculación, esconveniente hacer una somera revisión de los antecedentes de estos

procedimientos, antes de entrar en el tema.

La primera comunicación que se tuvo sobre las reacciones de pre­

cipitación se debe a Rudolph Kraus (1897), que fué más tarde merito­

rio director del Instituto Bacteriológico (hoy Instituto Nacional dc

Microbiología). Estudiando las propiedades del suero anticolórico

encontró que al agregarlo a un filtrado de cultivo del vibrión del

cólera, e incubarlo a 37°C., se producía una turbidez en el líquido

seguida de floculación, quedandoel sobrenadante límpido.

Unprecipitado similar se formó al mezclar suero antitífico con

filtrado de cultivo del bacilo de Eberth (Salmonella typhi), compro­

bándose 1a especificidad de 1a reacción.

Nicolle, en 1898, y otros investigadores, confirmaron el descu­brimiento de Kraus.

Charrin y Roger, en l889, casi simultaneamente, observaron por

vez primera el fenómenode aglutinación específica, al emplear sus­pensiones bacterianas.

Más tarde, el mismo fenómeno fué notado por Grunbaum (1896), Wi­

dal (1896) y Widal y Sicard (1897). Las bacterias sensibilizadas por

las aglutininas, sustancias específicas contenidas en el suero de a­nimales inmunizados, se aglomeran en presencia de concentraciones a­

decuadas de electrolitos, depositandose, bajo la acción de 1a grave­

dad, los grumos formados.

Otros autores aplicaron luego las reacciones de precipitación par

ra 1a determinación cuantitativa de diferentes materiales biológicos.

. u s.0 eee O

Así, Ramon,en 1922, describió el métodode floculación para ti­tular toxina y antitoxina diftórica. '

Dean y Webb(1926), don su método de las prOporciones-óptimas, ar

nalizaron en detalleglas condiciones más favorables para la formación

de los precipitados en experiencias de floculación y fijación del com­

plemento, demostrando la gran importancia de las relaciones en que de­ben mezclarse los constituyentes.

LuegoHeidelberger ¿1932-39), aportó numerosa información descri­

biendo el método que permite 1a comparación cuantitativa de sistemas

precipitantes simples.Es asi comofuó creada una técnica cuyo alcance ha superado a los

mótodos quimicos.

Entre proteínas que se comportanen forma ideútica frente a los

reactivos quimicos, comoser albúmina de liebre y conejo (Uhlenhuth

1905), la diferenciación con los mótodosinmunológicos, por las reac­

ciones de precipitación es clara, fácil y nítida. Así puedendistin­guirse especies muyvecinas y hasta distintas proteínas dentro de una

misma especie. Comoejemplo interesante pueden recordarse:

1°) la diferenciación antigónica entre albúminas y globulinas deun mismo animal.

2°) la obtención de anticuerpos con proteínas del prepio animal,

comolas del cristalino. Deberecalcarse que el suero obtenido puede

reaccionar con albúminade cristalinas de otras especies.Es decir que, si bien a veces esta tócnica permite diferenciar la

albúmina de una especie determinada, en casos especiales llega a ad­

quirir características que llamamosespecificidad de órgano: un anti­cuerpo reacciona con la proteína de un órgano determinado provenientede otro animal. '

Ahorabien, estas reacciones de precipitación, de resultados tan

delicados comomótodóanalítico, adquieren una nueva variante cuando

se ejecutan en un medio gelificado.

Al provocarse 1a reacción en el seno de un gel, el aspecto de la

reacción estará influenciado por lo menospor tres factores: la velo­

cidad de difusión del antígeno, la del anticuerpo y la poca solubili­

dad del complejo formado. Esto tiene comoconsecnencia que la parte

visible de 1a reacción se produzca en distintas formas, según las

condiciones de la experiencia y de manera muynítida, siempre que no

intervengan otros tipos de fenómenosajenos a la reacción antígeno­

anticuerpo, comoser el fenomeno de Liesegang.(citado por Hodges,1932)

Asi, cuando se enfrenta un antígeno simple con su correspondiente

anticuerpo, se producirá una sola zona de precipitación, que puede

ser sn forma de linea fina. Tratándose de reactivos que son complejos

naturalmente o por mezcla, cuyos componentes, o los resultados de sus

reacciones, difieren en sus propiedades fisicoquimicas (velocidad de

difusión de los elementos reaccionantes, solubilidad del precipitado

formado), habrá distintas zonas de reacción, que se pondrán en evi­

dencia, ya sea por anillos o lineas, más o menosbien diferenciados.

Esta caracteristica que presta el gel a las reacciones de preci­pitación es Justamente lo que permite obtener un análisis más comple­

to, dilucidando sl númerode sistemas reactivos en Juego y con técni­

.cas más desarrolladas, la comparación entre dos o más reacciones eje­cutadas en forma simultánea.

El plan de trabajo a realizar es el siguiente :Primera parte: _

Estudio bibliográficoa) Historia

b) Antecedentes considerados en el trabajo experimental

Segundaparte:Trabajo experimental

I) Material empleado

a) Preparación del medio de-difusión

b) Reactivos y forma de obtención

II) Técnicas de difusión

a) Métodoen tubos y cubetas de caras paralelas

b) Métodoen placa y sus variantes

Discusión y conclusiones

Resumen

WESTUDIO BIBLIOGRAFIOO

H I S T 0 R I A

Bechold (1905) fué el primero en demostrar la formación de un pre­

cipitado localizado, cuandoun antígeno (suero de cabra), difunde en

un medio gelificado (gelatina) que contiene el anticuerpo homólogo.

Probablemente 61 observó los dos anillos producidos, comodebidos al

fenómenode Liesegang y no a una precipitación de dos sistemas diferen­tes.

Ascoli y Valenti (1910), por superposición del antígeno y anticu­

erpo precipitante, obtuvieron un resultado efectivo en el diagnóstico

del carbunclo bacteriana. Despuésde mantener en ebullición el tejido

sospechoso, con el fin de liberar el antígeno termoestable Ppolisacá­ride) y una vez frio el filtrado, fué agregado lentamente al suero es­

pecifico respectivo (carbuncloso), evitando la mezcla de ambosliqui­

dos. La,aparición de un anillo de precipitado en 1a zona de separa­

ción fué considerada comoreacción positiva.

Observaciones similares a las de Becholdwfueronrealizadas por Rei­

ner-y Kopp (1927), al difundir suero de cerdo en gel de agar conteni­

endo suero de conejo anti-cerdo y anti-caballo, desarrollándose alre­dedor de cinco c seis anillos.

Nicolle, Cósari y Debains (1920), tratando de obtener una diferen­

ciación másnítida, modificaron la técnica de Ascoli, aplicandola a latitulación de toxinas diftérica y tetánica y las correspondientes an­titoxinas. Ellos determinaron la más baja concentración de uno de los

componentes, capaz de producir un disco visible cuando difunde en un

gel conteniendo una concentración conocida del otro componente. Los

resultados obtenidos fueron comparablesa la titulación in vitro y a

los hallados por inoculación en animales.Sia y Chung,en 1932, lograron la identificación de los distintos

tipos de neumooocos, al observar la formación de opacidadee anulares

alrededor de las colonias desarrolladas en una base de agar que conte­

nía el suero antineumocóccico homólogo. La naturaleza de la reacción

fue confirmada por experiencias que demostraron 1a especificidad de

estas cpaófladespara cada tipo.

Petrie, en 1932, extendió estos métodos al estudio de meningoco­

cos-y Shigellg dysenterigg, al observar halos alrededor de las colo­

nias que desarrollaron cuando sembródichas bacterias en placas de a­

gar conteniendo los sueros homólogos. Estos halos consistían en un

precipitado formadopor interacción del polieacárido específico conel correspondiente anticuerpo, y 1a capacidad para producirlos se to­

mócomo"test" para distinguir las-variaciones lisa y rugosa (Sy R).

En 1935, Hanks mezcló antígeno con gelatina y le cubrió con dilu­

ciones seriadas de anticuerpo.

En 1943, Petrie y Steabben usaron el procedimiento para reconocer

clostridias toxigónicas, aceptandose comoreacción positiva la for­mación de anillos concóntricos debidos al fenómeno de Liesegang.

En estudios posteriores intentó explicarse las causas de la mul­

tiplicidad de los componentesantigénicos en las reacciones de preci­

pitación en gel, ya que 1a inmunoquímicasólo contaba con métodos a­

proximados para su determinación.

Corresponde a Oudin, quien comenzósus trabajos en L946, la in­

vestigación más completa sobre la precipitación de sistemas antíge­

no-anticuerpo, pues sugirió la posibilidad de determinar el número

de antígenos presentes en una mezcla, por producción de diferentes

zonas de precipitación en tubos que contenían gel.

Otras autores tomaron comobase el procedimiento de Oudin para

ensayarlo en diversos sistemas.

Ouchterlony, en 1948, inició una serie de experiencias usando pla­

cas ds Petri, que significaron una nueva ruta. Entre ellas (1949 a),estimó la toxicidad de cepas de bacilos diftóricos, demostrando1aidentidad de la toxina diftórica, cualquiera sea la cepa que 1a se­

grega.Elek (1948), con el mismoprepósito, sugirió las razones de las

posibles causas en el fracaso de los trabajos de Petrie y Stsabben,al tratar de reconocer in vitro la virulencia del C. diphteriae, ex­tendiendo las observaciones al estáfilococo. Obtuvoun gradiente en

antitoxina embebiándolaen una tira de papel de filtro que colocó en

un medio especial destinado a la producción de toxina.

Enun trabajo posterior (1949), después de algunas consideracio­

nes respecto al análisis suerológico por métodos de floculación en

tubos, introdujo el gradiente de doble difusión, al permitir difundirlos dos reactivos en una base de agar. La ventaja consistía no sólo

en 1a interacción del antígeno y anticuerpo, sino también en el man­

tenimiento de una reacción continua y progresiva que llevó a la sepa­ración de cada uno de los sistemas reaccionantes.

Carter y Wilson, en 1949, demostraron la utilidad práctica de es­

tas pruebas.Elek y Levy (1950), enumeraron los antígenos hemolíticos de dife­

rentes cepas toxigónicas de estáfilocoeos, con 1a técnica basada en

el principio del gradiente de doble difusión. Así, encontraron que

el númeroprincipal de líneas producidas por cepas de origen animal,

fué significativamente menor que el producido por las de procedenciahumana.

En 1950, Munozy Becker, al comparar los resultados clásicos del

análisis inmunoquímico,con la difusión en geles, confirmaron las

conclusiones de Cudin respecto a la equivalencia entre el númerode

bandas de precipitación y el mínimode sistemas antígeno-anticuerpo

presentes en el material examinado.

POpey colaboradores (1951), gracias a esta técnica, llegaron a

demostrar la complejidad del antígeno diftórico purificado por Par

ppenheimy supuesto puro con los análisis fisieoquímicos.

Bjorklund, en 1952-3, modificando la técnica de Ouchterlony, fa­

cilitó el análisis de sistemas inmunológicoscomplejos, al incorporar

previamente al medio de difusión, uno de los componentes del sistema

heterogéneo en concentración suficiente. Obtuvouna inhibición com­

pleta en 1a aparición del precipitado correspondiente a dicho antíge­no particular, mientras que la difusión y posterior precipitación delos otros componentesno eran influenciados.

Másadelante, en 1954, dicho autor sugirió 1a posibilidad de es­

tudiar la naturaleza química de ciertos antígenos, mediante1a reten­

eión de algunas de sus prepiedades, después de formado el floculado

con el correspondiente anticuerpo. Usandovarias sistemas, permitió

desarrollar las líneas específicas en el gel, las que lavadas y ulte­riormente tratadas con soluciones colorantes, adquirieron el color en

forma selectiva. Asi demostró que, bajo ciertas condiciones, las re­acciones de coloración son específicas.

En 1953, Oakley y Fulthorpe aplicaron algunas modificaciones al

método de Oudin, consistentes en la introducción de una columna de a­

gar o gelatina comocentro difusor, entre las soluciones antigénicas

y los correspondientes antisueros solidificados en la base del tubo.

Estimaronasí, la probabilidad de que el total de líneas producidas,

era el minimonúmero de antígenos contenidos en la mezcla difusora,

pudiéndose ademásusar la técnica para demostrar la complejidad de

mezclas biológicas, o seguir su purificación.

Jensen y Francis, en 1953, obtuvieron bandas de precipitación es­

pecificas con diferentes cepas de virus gripal.Ambrosey Easty(l953), por medio de una técnica interferométrica,

tomaron fotografías muynítidas de las bandas, formadas en geles que

contienen el inmunosuero. Por ser un método novedoso e interesante,

se deseribirá con más detalle.

El aparato usado por los autores citados, está constituido esen­

cialmente por dos placas de vidrio, ópticamente planas, con una de las

superficiesplateada, para dar un cinco por ciento de transmisión de

luz. Las placas se colocan enfrentadas horizontalmente sobre 1a pla­tina de un microscOpioy entre ellas se dispone una célula que conti­

ene gel y donde se ha efectuado la reacción con el sistema antígeno­

anticuerpo. Luegose ajustan paralelamente y se ilumina desde abajo

con luz monocromática, cuyo ángulo de incidencia puede variarse medi­

ante una ranura movible. Se observaron así franjas de interferencia

paralelas, de caminoóptico constante, debidas a la reflexión produci­

da por los complejos formados.

Si en alguna región, por ejemplo, hay un incremento en el índice

de refracción, las franjas rectas se curvarán de modode no variar el

camino óptico, pues un aumento en el indice de refracción debe company

sarse por una menordistancia entre las placas. Esto ocurre cuando se

acumula el complejo en una zona particular, correspondiendo el pico de

a)

1a inflexión al punto de equivalencia. La cantidad de antígeno y anr

ticuerpo combinadaantes del comienzo de 1a precipitación puede esti- ‘marse por el área bajo el pico y espesor del gel, dado que los valo—

res para los indices e incrementos eepeoificos de refracción,_son casei constantes para 1a mayoría de las

proteínas.La figura 1) muestra loszsietemas

de bandas observados en un gel en.

el que-difunden antígenos y anticu­erpos} En a), se formó una banda de

precipitado (31). En b), la banda

de precipitado (El) observada dee­puéa, se ha enganchado y los picos

a}; u¿‘

Lfiéyfi5 wir-1.193€.“ ‘ 4

g 5% :20'5“..g. á ,,‘ 5g v de las bandas cruzan a 1a izquierdaz"; _ t», Í: {o .

den al punto de equivalencia de un

segundo sistema antígeno-anticuerpo

No se detectó ningún precipitadol

en (BE), cuando ee tomó la fotogra­iia b).precipitado en la bandaEl, ¿sta te­

“? .íentig. dift. “¡Antic.

Fig. 1

Antes de quesapareciera

nia la mismaapariencia de la Ba, dando picos en las bandas de inter­ferencia, pero siendo completamenteindetectables por otros medios.

Rafyt,

antígenos presentes en filtrados de cultivos tetánioos y por otra,Ghamsyy Delsal (1954), enumeraron, por una parte, loa

ccntrolaron su purificación, llegando a 1a conclusión de que 1a toxi­

na tetánica es un conjunto complejo de antígenos o haptenes liberados

en el medio de cultivo, pudiendo aumentar por autolisis bacteriana c

degradación de las moléculas gruesas en pequeños fragmentos, debida

al envejecimiento del cultivo. 4

En el mismoaño, Pierre Grabar, señalando la imposibilidad de de­

mostrar el grado de pureza u homogeneidadde una preparación, por unsólo métodoanalítico, asi cómo1a diferente sensibilidad que pueden

presentar dichos métodos, efectuó un estudio sobre las proteínas con.ayuda de la inmunoquimica. Usó para ello una técnica combinada, con­

de(Bl). Estos picos (Be), correspong

sistente en una separación electroforética en mediogelificado, delos constituyentes de mezclas biológicas y una reacción de precipi­

tación específica sobre el mismopreparado, que permite revelar 1a

presencia de los distintos componentes.

Al mismotiempo, otros autores confirmaron en sendas experiencias

la valiosa utilidad de la técnica de difusión en geles.

Relyveld, Turpin y colaboradores (1954), obtuvieron un método sen?

cillo de purificación del toxoide diftórico y controlaron las diferen­tes fracciones mediante la floculación en medios gelificados.

Guillaumie, Króguer y Geffroy (1954), determinaron las zonas for­

madas por difusión de las toxinas del 01. septicum y 01. oedematiens

en sueros antigangrenosos gelificados.

En el año 1953, Oudin introdujo una modificación en su técnica

con el fin de producir mayordensidad y diferenciación en las zonas

de precipitación, consistente en reemplazar la solución antigónicadespués de varias horas de difusión, por una solución de cloruro de

sodio 0.85 %. Este procedimiento debe realizarse sobre un cierto nú­

mero de tubos idénticos, en tiempos diferentes, de modo_que1a corres­

pondencia de las zonas en los tubos pueda restablecerse sin dificul­tad. 'En esta forma estudió los antígenos contenidos en 1a fracción

del suero humanoprecipitado por sulfato de amonio a 45 % de saturap

ción, encontrando alrededor de 10 componentes.

Estando el presente trabajo próximoa finalizar, apareció una nu­

eva presentación de O udin (1955), en la que, además de reseñar los

métodos de identificación de antígenos mediante el uso de geles, estar

blece una variante que permite reaccionar varias soluciones gelifica­das de antígenos con el mismo inmunosuero, usando cubetas de caras

paralelas no cerradas.

¿ETECEDENTES CONSIDERADOS EN EL TRABAJO EXPERIMENTAL

A Al iniciar estos trabajos, se presentaron dificultades en la ob­

tención de datos bibliográficos, por lo que hubo de improvisarse pro­

cedimientos, que aunque no originales, comodespués se supo, dejaron

su enseñanza al permitir apreciar los inconvenientes que tuvieron

que enfrentar los investigadores.

Oudin (1946) y Ouchterlony (1948), fueron los que dieron a las

reacciones de difusión en gel, el impulso y la importancia que tie­

nen actualmente. Conociendosus rumbos, las experiencias se orienta­

ron en dos líneas : series de ensayos en cubetas y tubos, comolo hi­ciera Oudiny otras en placas, con diversas variantes, de acuerdo al

sistema desarrollado por Oüchterlony.

METODO EN TUBO:_____—'_____——_En realidad, se debe a Nicclle, Césari y Debains

(1920) el primer intento para titular antígenos y anticuerpos por su­

perposición de los mismosen un medio gelificado. Inspirados en el

método de Ascoli (1910), repartieron en una serie de tubos, mezclas

de volumenes iguales (2m1.) de suero de caballo y gelatina 10%, de

reacción neutra. Deepuésde solidificarlos en heladera, vertieroncantidades decrecientes de suero de conejo anticaballo, permaneciendo

durante dos horas a temperatura ambiente. Se obtuvo así la formación

de anillos de precipitado características, en el límite del anticuer­po con el antígeno-gel. El anticuerpo fue determinado por la más ba­

ja concentración de suero que produjo dicho anillo.

Con el mismométodo» titularon el antígeno previamente concentra­

do. Posteriormente valoraron toxinas y sueros diftéricos y tetánicosencontrando correspondencia con las titulaciones in vivo.

El metodo original de Oudin (1948), consistía en superponer la sc­

lución de antígeno que se quería analizar, al suero previamente geli­

ficado. Primeramente distribuyó en una serie de tubos y cubetas de

caras paralelas, la mezcla del inmunosuero con solución de agar 0.6%

clarificadc por coagulación en caliente con suero normal de conejo.Los tubos fueron sometidos a un tratamiento previo, pues contraria­

mente a 1a gelatina, el agar no se adhiere al vidrio, razón P0r la

cual al superponer el antígeno al gel de inmunosuero, observó la

formación de un precipitado entre la pared del vidrio y la columna

gelificada, haciéndose irregulares las líneas de precipitado resul­tantes, lo cual dificultó la lectura posterior. Este inconvenientefue subsanadorevistiendo te superficie interior con una fina capa

de gel. Para ello calentó los tubos a 60-70°C.

llenándolos con una solución de agar 1%a la

misma temperatura. Despues de volcar, los co­

locó en baño a 0°C. y desecó en vacío en presen­

cia de ácido sulfúrico. Luegode agregar las

soluciones antigénicas, recubrió los tubos con

Fig, 2 cera y bálsamo de Canadá, manteniéndolos a tem­

peratura uniforme (22.5°C.) durante 8-10 días y registrando fotográ­

ficamente. Este registro fue mejorado por el uso de las cubetas.

Sistemas de reacción usados por Oudin : Comoreactivos usó los por

61 llamados sistemas precipitantes simples, formados por un sólo an­

tígeno, tales comoovoalbúmina de pollo, albúmina de suero de caballqantígeno somático 0 de Eberthella txphosa, productos de hidrólisis

comohaptene poliósido de neumococo, poliósido 0 de E. tlphosa y o­

tras fracciones. Los sistemas precipitantes complejos, comportaban

varios antígenos que 61 llamó completos; los múltiples se obtenían

cuandd varios sistemas simples o complejos reaccionaban en el mismo

tubo, estando al comienzode la reacción los antígenos reunidos en el

seno de 1a misma solución y los anticuerpos en el mismo inmunosuero

o mezcla de inmunosuero. Oudin consideraba como sistemas múltiples

la mayor parte de los humores del organismo animal, o extractos bac­

terianos no fraccionados, cuando reaccionaban con un suero obtenido

despues de inmunizar los animales oon inyecciones repetidas del mis­

mo líquido.

Factores gue influencian la reacción : Al realizar las condiciones

experimentales mencionadas, Oudin observó que 1a combinación de los

antígenos y sus correspondientes anticuerpos, daba origen a compues­

tos insolubles y específicos cuya densidad (cantidad de precipitado

por unidad de volumen) se admitió como constante en todos los puntos

equidistantes de la interfase. Si la precipitación tenía lugar enla capa de anticuerpos, se observaba una zona de precipitado aleján­

dose de la interfase en el curso del tiempo. Del borde inferior de

dicha zona hacia 1a interfase, la densidad de precipitado pasaba por

un máxima, decreciendo por exceso de antígeno (zona de inhibición).

Es decir que, cuando 1a concentración de la sustancia que difun­

de permanececonstante en la solución en contacto con el gel, la dis­

tancia de la frontera a la interfase aumentacon el tiempo: es pro­

porcional a su raíz cuadrada.

Al observar más de un máximode precipitado, Oudin concluyó que

el númerode máximoso fronteras desarrolladas, debíá;considerarse

comoun límite inferior del númerode antígenos presentes en la solu­

ción; podrá ser superior si la precipitación debida a uno de los anttígenos se produce totalmente en la capa de antígenos, bajo ciertas

condiciones de concentración, o si los máximosestuvieran situados a

dos niveles muypróximos para poder ser distinguidos.

La eventualidad de un fenómenode Liesegang, caracterizado por u­

na flcculación que progresa en forma periódica o rítmica, pero no conp

tinua (estrías inmóviles), pondría en defecto la conclusión de Oudin,

aunque 61 no lo observó en sus experiencias.

Condiciones necesarias para la formación del precipitado: Para que

se produzca la aparición de la zona de precipitado, se requiere unaconcentración mínima de antígeno. Comola distancia de esta zona a

la interfase aumentacon el tiempo, para un tiempo constante, la dis­

tancia franqueada varía en el mismosentido que la concentración del

antígeno y en sentido inverso a ¡a de los anticuerpos.

Cualquiera sea la concentración inicial del antígeno, existe unvalor de 1a concentración de los anticuerpos debajo del cual el má­

ximo de densidad dela zona es dóbil comopara poder ser perceptible.

Para cada concentración de anticuerpo, existe un valor de la concen­tración inicial del antígeno, debajo del cual el precipitado no apa­rece en el gel, sino que se forma en la capa líquida de la solución

antigónica.Oudinestudió la influencia de las principales variables sobre el

aspecto de la zona de precipitación, con la ovoalbúminade pollo cris­

talizada, estableciendo que el máximode densidad variaba poco con el

tiempo y con la concentración inicial del antígeno y variando,en el

mismosentido que la concentración de los anticuerpos. La mínima

concentración de ovoalbúmina puesta en evidencia fué del orden de

0.01 mg.ml. Para otros antígenos será diferente.

Causas de error 1 su eliminación: Entre las posibles causas de error

en la interpretación de las experiencias, Oudinseñaló las precipita­ciones no específicas debidas a productos bacterianas, estrías porcambios bruscos de temperatura o por fenómenos de Liesegang. Estos

accidentes fueron evitados tomandoprecauciones y efectuando expe­riencias en serie.

Resultados: En los casos en que un sólo antígeno reaccionaba, no se

observó más que un sólo máximode densidad de precipitado. Con las

cuatro albúminas ensayadas,1a zona presentaba el límite inferior muy

preciso, siendo en cambio difuso cuando se trataba de antígenos bac­terianos.

En una segunda parte, definiendo los sistemas precipitantes com­

plejos, estudió la reacción entre dos antígenos con los anticuerposhomólogos de uno sólo de ellos: albúmina de pollo y perro y antígeno

somátioo 0 y poliósido O de E. txphosa. Llegó a 1a conclusión que la

zona del antígeno homólogo es siempre 1a más prókima a la interfaSe.

En cuanto a los sistemas múltiples, demostró que la influencia

mutua de los diversos antígenos reunidos en una solúción es nula o

pequeña. La imagen dada por la reacción de los mismoscon los anti­

cuerpos correspondientes, indica la superposición de las imágenes quecada uno daría si reaccionara solo.

Técnicas de identificgpión de los antígenos: Después de algunas con­

sidoraciones sobre las posibilidades de aplicación del métodode di­

fusión y teniendo en Cuenta la naturaleza, desconocida a veces, de

algunos líquidos biológicos, indicó algunos medios para lograr su i­

dentificación. Así, estableciendo la identidad o semejanzaespecífi­

ca de los antígenos de un determinado origen, con los antígenos de

otro, o relacionando la zona de un antígeno aislado, oon la zona del

mismoantígeno perteneciente a una mezcla. En este caso, por ejemplo

se agotaba el inmunosuerodel sistema múltiple, por la solución que

contenía el.único antígeno y luego se hacía reaccionar comparativa­

mente la mezcla de antígenos, con el inmunosuero no modificado y con

el adsorbido, ambosen la misma concentración. La zona que estuvie­

ra ausente en uno de los tubos, sería la específica del antígeno oon­

tenido en la solución original.

Otra manera sería enriquecer la mezcla de antígenos estudiada, a­

gregándole en cantidad suficiente 1a solución de antígeno único, lo

cual produciría un aumentode la zona específica del antígeno, en re­

lación al testigo.De todo lo que precede, concluyó Oudin que el número de antígenos

contenidos en una mezcla tal comoun líquido biológico, es superior

o igual al número de zonas o máximos de densidad de precipitado que

se observa cuando se hace reaccionar esa mezcla con un inmunosuero,

dandoprecipitados específicos. La probabilidad de una apreciación

exacta del número de antígenos, es a priori más grande, cuanto más

específico sea el suero correspondiente a la solución en estudio.

En 1953, Oakley y rulthorpe introdujeron una modificación inte­

resante y ventajosa al metodode Oudin, al intercalar entre el antí­geno y el anticuerpo gelificado, una columnacentral de agar, que

facilita el desarrollo y la mejorperceptibili­dad de las reacciones de difusión. Ellos usar

ron tubos Lambeth (8x0.8 cm.), de diámetro uni­

forme, en los que vertieron mezclas de volúmenes""801-8-1113.--agar iguales de agar 2%,filtrado en caliente y enfri­-v -suero

ag ado a 54°C. y suero o diluciones de suero, a la

Fig_3 misma temperatura, cuidando de no tocar el inte­rior del tubo y de evitar la formación de burbu­

jas. Sobre ¡1 fondo, una vez frío, colocaron agar 1%, preservado con

ortocresol 0.5%, fundido y llevado a 54°C., hasta dar una columna

central de altura uniforme (Fig.3). Esta dependía de las circunstan­

cias: canto mas corta era, más rápido y densas aparecían las líneas,

pero también más anchas. Columnasmás largas darían bandas mejor se­

paradas pero más tenues, tardando más en desarrollar. Ellos usaron

una altura de 8mm.,sobre la que vertieron el filtrado bacteriana,

constituido por C. diphterriae y Cl. welchii A, B, C y Df Luego ce­

rraron los tubos con tapones de gomae incubaron a 37°C., obtenien­

do resultados satisfactorios generalmente a las 48 horas. El tiem­

po de aparición de las líneas y su exacta posición, dependía de las

concentraciones relativas de los antígenos y anticuerpos y de sus ve­

locidades de difusión, ya que estas no son las mismaspara todos los

antígenos de una mezcla, aunque sí pueden serlo para los anticuerpos.

Resultados: Líneas de distinta intensidad, se interpretaron comode­

bidas a antígenos diferentes (siempre en concentración adecuada res­

pecto a1 suero).

Además,señalaronuna posibilidad de error, muynecesario de te­

ner en cuenta: el por ellos llamado splitting de las líneas, es de­

cir, la separación horizontal del disco de ÍIOCulación, en dos de a­

parentemente igual densidad, que puede producirse cuando se prolon­

ga muchola incubación. Este efecto pudo ser distinguido de 1a re­acción verdadera.

Si la concentración del antígeno fues bastante mayorque 1a del

suero, la línea se formaría debajo de la columnacentral, dificultan­

do o impidiendo su visión.

Conesta consideración podría favorederse el desarrollo de líneas

correspondientes a componentesdébiles o complementarios, por incre­mento de la concentración de las mezclas a ensayar.

Del mismomodo, con un exceso de suero, las líneas se desplaza­

rían hacia arriba y si la reacción se prolongara, originaría la di­solución del precipitado en un exceso del anticuerpo que difunde,

formándose en un nivel superior.

Tambiendemostraron que un suero agregado a mezclas antígenicas,

puede ensayarse contra uno standard, por su capacidad de mover líneas

sobre la columna central y que muchosde los antígenos de filtrados

bacterianos responsables de la formación de líneas, eran toxinas bac­terianas bien conocidas.

En forma similar, si dos líneas se sobrepusieran, la adición de

suero a 1a capa superior permitiría separarlas, hacióndolas moverha­cia arriba a distintos niveles.(Figura 4).

1h.

¡r''¡io-—_...­ÏÉé:l.

LsñloL1¡‘

‘l\-.———

a.

Fig. 4 .- Adición creciente del antisuero al filtradoColumnade difusión mostrando el efecto sobre

un sistema complejo de líneas, de la adicióncreciente del antisuero a1 filtrado. Las líneasestán numeradas y su movimiento se sigue porflecha. El antisuero agregado a1 tOpe no tieneevidentemente anticuerpos contra los antígenosresponsables de las líneas 3 y 5; posee algunosanticuerpos para los otros antígenos.

Así, con este estudio, Oakley confirmó las observaciones de Ou­

din, al aceptar que el número de líneas producidas en una columna de

difusión, es el númerominimode antígenos presentes en la mezcla

antigónicaque difunde y señaló la utilidad del metodopara demostrar

la complejidad de algunas muestras y seguir su purificación.

METODO EN PLACA:Comose mencionara a1 principio, Ouohterlony de­

sarrolló el metodo de difusión en numerosas experiencias en las que

empleó cajas de Petri.

El procedimiento consistía en cubrir el fondo con una delgada p6­

lícula de agar clarificado con cloruro de calcio. Sobre dicha super­ficie colocó un molde metálico recubierto de parafina. Despues de

verter otra capa de agar y enfriar, separó cuidadosamenteel metal,quedandouna depresión en la capa superficial. En esta forma obtuvo

varias depresiones, ya sea en ángulo recto o colocados según los vér­

tices de un triángulo. Estos surcos fueron llenados con los reacti­vos a ensayar y recargados a intervalos de 12 o 24 horas. Posterior­

mente, debido a inconvenientes, se eliminó el recargado de líquido.

La temperatura se mantuvo a 37°C. y las observaciones se registrarondiariamente.

Ouchterlony mostró así que, si se permiten difundir preparaciones

de dos antígenos diferentes hacia el mismosuero, pueden detectarse

pequeñas diferencias en 1a composición antigónica.

ÏD D? 2%0:Z Z

A / B2.3.5 "o‘g-b

5 .- X, Y, Z,: antígenosx,y, z : anticuerpos correspondientes

En A, ambas preparaciones de antígeno son idénticas.En B, un antígeno está ausente de 1a preparación.

Fig.

Es decir que,según se ve en 1a figura, idénticos precipitados se

funden en una simple banda o línea, cruzando sin interferencia cuan­

do se trata de antígenos distintos.

Además,por absorción del suero con antígenos apropiados, o por

separación o destrucción de antígenos en la mezcla, 1a aparición de

líneas en el espectro puede ser evitada o selectivamente prevenida.

En general, Ouohterlcny confirmó las conclusiones encontradas

por Oudinrespecto a los factores que influencian las reacciones dedifusión. En uno de sus trabajos (1950), describió 1a técnica de

producción de 1a toxina diftárica, obteniendo correspondencia con ex­

periencias en animales. Encontrá en el suero antidiftérico comercial

por lo menoscuatro anticuerpos diferentes Junto a 1a antitoxina.E1mérito principal que le cabe a este investigador, a nuestro

Juicio, reside en haber facilitado 1a comparaciónde diferentes pre­

parados de antígenos e inmunosueros simultaneamente, aunque sin des- '

medro respecto de sus restantes conclusiones.

SEGUNDA PARTE

TRABAJO EXPERIMENTAL

Para su descripción se procederá en dos etapas :

Por un lado, la preparación de los reactivos y medios de difusión,

antígenos, sueros y geles; por el otro se tratarán las técnicas uti­lizadas para estudiar los diferentes sistemas de reacción.

MATERIAL EMPLEADO

PREPARACION DEL MEDIO DE DIFUSIQE

Se partió de una solución de gelatina al 10%y otra de agar al

2%.

Gelatina 10%: Se corten 10g. de gelatina neutra de buena calidad

en pequeños trozos y embebenen agua destilada fría, guardando duran­

te 24 horas en heladera. Se vierte el agua y funde alrededor de 86°C

Después de completar el volumenhasta 100 m1., se filtra en estufa a

37°C., por papel plegado, se adiciona de merthiolate 1:10.000 y con­serva en frío.

Agar 2%: 20g. de agar cortado en_finas tirillas se lavan en agua

destilada durante 24 horas. Deepuésde decanta: se completa a l li­

tro y funde en baño maría. Comolas reacciones de difusión requieren

un gel limpido, se siguieron tres métodospara su clarificación:

a) filtración, b) centrifugación y o) precipitación con cloruro decalcio. No se usó la purificación con agregado de proteínas coagu­

lables debido a la dificultad de su total separación y a su posibleinterferencia en la reacción.

a) Filtración: El agar fundido según ee indicó, se fil­tró dos veces en caliente por buchner conteniendo una capa de papel

en pasta. Las primeras porcionee,acuosas por la dilución dada por

la papilla, se desecharon y el resto se dejó congelar en heladera.

Luego se desheló con el fin de separar el agua y las impurezas que

pudiera contener. Esta Operación se repitió dos veces en días conse­

cutivos. A 1a esponja de agar obtenida, se le agregó agua destilada

hasta e1,volumenrequerido, se fundió y volvió a filtrar en calien­

te por buchner dos veces, distribuyóndose luego en tubos que se es­terilizaron en autcclave durante 20 minutos.

Para evitar la dilución que se produce al filtrar por pasta de

papel, se ensayóuna filtración por Seitz con membranaclarificante,

obteniéndose mayor limpidez.

b) Centrifugación: Después de lavado y fundido el agar en

baño maría, se distribuyó en tubos y centrifugó durante media hora

a 3500 revoluciones, en centrífuga Internacional con cabezal angular

Unavez solidificado, se separó el gel con ayuda de espátula ,corbtando y desechando la porción del fondo que contenía las impurezas

sedimentadas. Luegose volvió a fundir y repitió el procedimiento,

agregando fenol a1 4% como conservador.

c) Precipitación con cloruro de-calcio: El agar 2%fundido,

se precipitó con solución de cloruro de calcio hasta concentración

final del 5%, calentando suavemente alrededor de media hora. Luego

se centrifugó comose indica en b). Los trozos separados se lavaron,

primero en agua corriente y después en agua destilada, durante tresdías, llevando al volumenrequerido. Se volvió a fundir y centrifug

gar, eliminando asi el precipitado que pudiera estar incluído en elgel.

REACTIVOS Y FORMA DE OBTENCIÓN

1.- ANTIGENOS

1) Toxoidediftórico concentrado y purificado por precipitación en

figure isoeléctrico: a) del 28-1-54 (650 Lf.ml.); b) 215 (1200Lf.m1)

2) Toxoidcdiftórico crudo:(34 Lf.m1.). Este toxoids fuó concentra­do en tres formas:

a) Por evaporación en vacio : Dos placas de Petri contenien­

do 10 ml. de toxoide crudo cada una, se colocaron en desecador en

presencia de gol de sílice, se hizo el vacío y después de 24 horas

se agregó al residuo l ml. de solución fisiológica, obteniéndose una

concentración final de veinte veces.

b) Por ultrafiltración: 100 m1. del toxoide crudo indicado,

fueron vertidos, en pequeñas porciones, sobre una membranade colodio

adaptada a un ultrafiltro. Despuésde efectuar vacio y mantener en

heladera 24 horas, se extrajo el residuo seco con l m1. del liquido

filtrado, repitiendo dos veces más la extracción. El pHse reguló a

un valor de 7.4 aproximadamente, con solución de bicarbonato de sodio

5%. La concentración final fué de 25 veces.

c) Por precipitación ggn_gulfato de amonio1_l;ofilización:

Un litro de toxoide crudo se precipitó con 700 g. de sulfato de amo­

nio (70%)a 40°C. El material floculado recogido con espátula y ol

líquido de lavado, fueron puestos en tubos de celofán para diálisis

(esterilizado por ebullición). Para evitar la ruptura de los tubosde celofán, por la gran tensión osmótica desarrollada, fueron acon­

dicionados dentro de un armazónde filtro Berckefeld, rellenando los

espacios con arena gruesa. En las primeras 12 horas se pasó agua co­

rriente en forma continua, terminando1a diálisis en heladera frente

a agua destilada renovada hasta no dar reacción de ion sulfato. El

valor del toxoide obtenido fué de 500 Lf.ml., y considerándolo insu­

ficiente para algunas experiencias, sc procedió a concentrarlo porlíofilización. Para ello se usó el dispositivo indicado en la figu­

ra 5, que consta de dos frascos de Br­vació

_____S_:::::ïp¿:¡ lenmayer Ay B, unidos por un amplio

fi . } Ïgï Í tubo de vidrio C, en uno de cuyos ex­

¿ï \ Ey fi \EÉ tramos se soldó un tubo para conectar­k_:::) .::===_¡É lo a la bombade vacío (Cenoo Hyvac).

A 5 Las uniones al tubo fueron selladas

Fig. 5 con mástic en caliente.

Colocado el dializado en A y congelado, se sumergió B en mezcla

de nieve carbónica y etanol, dejando enfriar antes de conectar el vap

»cio. El proceso de sublimación fué acelerado con infrarrojo. Se ob­

tuvo un material fácil y rapidamente soluble en agua, que se diluyóhasta una concentración de 1400 Lf.ml.

3) Toxoide tetánico purificho del 18-VIIIe5E(534 DT; 1 DTcorres­

ponde a 0.1 U.)

4) Toxoide tetánico purificado (750 DT).

5) Toxoide tetánico no flogplantc (250 DT)

6) Toxoide tetánico concentrado y purifiqggo por sulfato de sodio

anhidro, de acuerdo a la técnica de Modern, Ruff y Gatti (Rev.

Inst. Malbrán, XV,N°3, 1950-53, 232). Be usó una concentración

de 1a sal del 15%, agregada al antígeno a 35°C. Después de man­

tener en cámarafria durante 2 horas, se centrifugó y disolvió en

agus destilada.

7) Toxina tetánicg.

8) Tgxina estsfilocóccica de 15 Lf.ml.

9) Selina estafilocóccica de 40 Lf.ml.

10) Toxoide estafilocóccico (Toxina formolada al 0.6%, grado de hemó­

lisis menordel 1/5 del valor inicial).11) Toxina gstgfilocócciqg Precipitggg con sulfato de amonioa satu­

racíon y dializada comose indica en (Iv2c).

II.- SUEROS

1) Suero antidiftérico proteolizado (2000 Lf.ml., proveniente de laSección Sueros del Instituto Malbrán.

2) gggro.antidiftérico 49 procedencia norteamericana (6000 UI. en 3.1m1.).

3) Suero antitetánico purificado (4500 U1.m1.).

u) Suero antitetánica purifiqggg (3000 u1.m1.)

5) ggcro antiestafilocóccico (200 UI.H1.)Estos últimos sueros (3,4 y 5), también fueron producidos por la

Sección Sueros del Instituto Malbrán. Todos son proteolizados.

III.- TECNICAS DE MEDICION DE ANTIGENOS Y SUEROS

Las titulaciones en Lf. para los antígenos diftérico y tetánico

fueron efectuadas siguiendo la técnica de lectura en óptimo de flocu­

lación, según Ramon(1922), en baño maría a 50°C.

Las toxinas estafilocóccicas fueron valoradas por su acción he­

molitica sobre glóbulos rojos de conejo. Para ello se mezcló l m1.

de la dilución 1/20 del suero "standard", es decir, lUI, con canti­dades crecientes de la toxina desconocida. Se incubó durante media

hora a 37°C. y luego se añadió 0.5 ml. de una suspensión de glóbulos

rojos de conejo al 5%, que se obtiene lavando 5 ml de sangre de cono­

Jo desfibrinada, con solución fisiológica y suspendióndolos con la

misma hasta completar los 100 m1.

La dosis "test" de toxina quedó determinada por el primer tubo

que presentó hemólisis despuós de incubar la mezcla a 37fic., durante

una hora._ La medición del toxoide estafilocóccico se efectuó sigui­endo 1a misma técnica, pero agregando a la mezcla del suero y toxoi­

de, después de completar con l m1. de solución fisiológica e incubar

a 37°C.media hora, media dosis "test". Se dejó media hora a 37°C. y

añadió 0.5 ml. de la suSpensión de glóbulos de conejo, leyendo a lahora de incubación los resultados.

Comotítulos de los sueros empleados, se tomaron los indicados

por el laboratorio productor.

IV.- TECNICA FOTOGRAFICA

Los registros fotográficos fueron hechos por contacto, tomandoci­

ertas precauciones técnicas para evitar la distorsión (Figura 6) :

fLuz 11° Fuente luminosa: Se usó una lámpara1 l puntiforme fijada a 1.5m. de distancia so­

Eúo‘m bre la mesa de trabajo, con interruptorE manual.

E 2° Con el objeto de corregir los defec­I p¡n¡ agua tos de fabricación del material de vidrio

t;;i;;;;á;__u//P°Po‘ empleado, las placas fucrpn sumergidas en._un recipiente con agua y fondo de vidrio

Fig.6 cpticamentc plano, cuidando de no incluir

burbujas. En esta forma, las imperfecciones de las placas de Petri

se redujeron a un mínimo. El papel fotográfico fuó colocado inmedia­

tamente debajo del fondo plano del recipiente. Se usó papel al cloro­

bromro.

En los ensayos con cubetas. comoéstas eran de caras paralelas

no fué necesario ningún artificio para obtener las pruebas fotográ­ticas.

Para. el revelado y fijación se procedió de acuerdo oon 1a técnica.habitual.

CONDICIONES EXPERIMENTALES

TECNICAS DE ¿DIFUSION ENSAYADAS

Para facilitar la descripción de las experiencias, se tomaroncomobase los distintos tipos de reacción, sin tener en cuenta es­

trictamente el orden en que fueron ejecutados los trabajos y consi­

derando sólo los de mayor significación.

Por ello, no se describen con detalla los ensayos en tubos y eu­

betaa, destacando con más amplitud lo referente al método en placa,

que fué definitivamente adeptado.

METODO EN TUBOS

Los trabajos de Nicolle, Cósari y Debains (1920), fueron repeti­

dos con sueros y toxinas diítéricos y tetánicos con el fin de compro­bar su efectividad comométodo de titulación.

Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios. Aunquela

formación de líneas es rápida y bastante visible, dicha teenica no

permite las lecturas en el punto óptimo de reacción, sino que sóloindica el límite.

Debido a esta razón es que posiblemente haya caido en desuso la

técnica de tales autores, residiendo su menciónen la importancia his­tórica.

Siguiendo la técnica de Oudin (1948) al comienzo y aplicando la

modificación de Oakley (1953) después, se realizaron algunos ensayos

introduciendo tambiénotras variantes que resultaron de mayorutili­dad.

Conel método de Oudin, se encontraron inconvenientes en la lec­

tura. La banda de precipitado se formó cn la interfase agar-toxoide,

o en zonas muypróximas a la misma, impidiendo la interpretación co­

rrecta de las experiencias.Al intorcalar la columnacentral dc gol entre el antígeno y el

agar-suero, comolo hiciera Oakley, se facilitó el desarrollo dc la

reacción. Los resultados obtenidos fueron mas claros, aunque se pre­

sentaron también distorsiones de las lineas, debidas al fenómenode

corrimiento del reactivo líquido entre el gel y la pared de vidrio­

Introducción de una variante al método de Oakley

Para evitar el inconveniente recién señalado, pudo haberse recu­

rrido al tratamiento previo de los tubos (utilizado por Oudin), perose prefirió gelificar también la capa superior del antígeno, comoseefectuara con el suero.

Ventajas z Las que se obtuvieron fueron grandes : Desapareció la

dificultad mencionada, uniformándose ademásla velocidad de difusión

del antígeno respecto a la del inmunosuero.

Materiales

Se estudiaron los sistemas diftórico y tetánico, con algunos de

los reactivos indicados en el capítulo anterior.

MBBIcsde difusión :Además de agar 1%, sc empleó gelatina como medio

de difusión, en diferentes concentraciones, encontrándose que la con­

centración del 1%procuraba mejor definición de las lineas.

Modificación del medio de difusión : El agregado de 1%de gelatina

a la columnacentral de agar, constituyó una variante interesante y

ventajosa, pues por comparacióncon las series anteriores, se obser­vó mayornitidez del medio, lo cual facilitó enormementela lectura.

Erocedimiento

Las primeras reacciones se efectuaron en

tubos de ensayo de 20:1.5 cm.,de diámetro u­a-to og x niforme. En el fondo se vertió la mezcla de

arag —— agar-suero (2ml.), luego la columna central de

agésuerc,gel, ya sea de agar, gelatina, o la mezcla de

F18, 7 ambas, el volumen dependía de las condiciones

necesarias para cada reacción. Todas las di­

luciones se hicieron con solución de cloruro de sodio al 0.9%. Por

último se agregaron 2ml. de tozoide-agar, previamente fundido y lle­

vado a 45°C., lo mismoque las mezclas anteriores.

Los tubos bien tapados se mantuvieron en estufa a 37°C., salvo

los que contenían gelatina central, que se incubaron en heladera.

Deepuésde efectuarse numerosas variantes en cuanto a factores

que podrian influir en la difusión, se adoptó comolímite de tiempo

de reacción, ocho días para el sistema dirtérico y veinte para el te­tánico.

Asi, se preparen series a distintas concentraciones de los reac­

tivos, unas con exceso de suero, otras oon aumento de antígenos o en

valores equivalentes. Tambiénse estudió el efecto de distintas tem­

peraturas y aooión de electrolitos, a veces agregados al gel de lacolumnacentral.

Posterirmente, se usaron tubos de menor tamaño, permitiendo elloreducir los volúmenesde reactivos.

RESULTADOS OBTENIDOS

Durante el desarrollo de las reacciones de difusión, se ha cons­

tatado en general, lo examinadopor los autores mencionados.

Sin embargo, se considera necesario remarcar la importancia que

tiene la concentración de los reactivos, en el númerode líneas for­madas.

Sistema diftórico : A1 comparar series cuyo valor estuvo compren?

dido entre 1000 y 10 Lf.ml., usando toxoide purificado por precipitar

ción en punto isoeléctrioo(I-l) y suero proteolizado (II-l), se pudoobservar lo siguiente (Fig. 8) :

¡cocifi ¡eotfï ¡o Lf.

Fig. 8

Con1000 Lf.ml., una linea de mayor densidad, en el centro de la

columnaintermedia, y 2 más tenues, a cada lado de la principal.

ConlOOLi. se formaron 2 líneas, la más débil sobre la central

Oon lO Lr.m1., solamente 1 línea, de menor densidad que la correSpons

diente a 1a serie anterior. Cuandose empleó columna central ds ge­

latina, se observó igual número de líneas que con agar, aunque la dicfusión fué más lenta.

En esta forma, confirmamosla idea de que, para visualizarse laformación de los precipitados producidos por la combinación antígeno­

anticuerpo, es necesario sobrepasar cierta concentración limite delos sistemas reaccionantes, ya que los componentes que se encuentran

sn menor prOporción, posiblemente responsables de las líneas secundar

rias, sólo aparecen por encima de ese valor.

Usandoconcentraciones muyelevadas se tropieza con la dificultad

de no distinguir las líneas muypróximas entre si.

Sistema tetánico : Se aplicó igual técnica que en el sistema dif­

téricc, pero con distintos valores de antígeno y antisuero, obtenién­dose mayor número de líneas: 3 densas y 4 más débiles.(Fig. 9)

¡iso 9

La interpretación del desarrollo y significado de la reacción seefectuará al tratar el métodoen placa.

Tanto en uno comoen otro sistema de reacción, los resultados con­

trastan evidentemente, en lo que a númerode lineas se refiere, con

los obtenidos por otros autores. Por ejemplo, Pope y colaboradores(1951), a1 desarrollar un sistema antígeno- anticuerpo diftérico engel de gelatina, alcanzaron a distinguir hasta 24 antígenos (líneas)

Estas diferencias nos indujeron a tratar de indagar la razón de

resultados tan dispares, pero dadas las dificultades de interpreta­ción de las líneas en las reacciones en tubo, sumadasa la falta de

equipo fotográfico adecuadopara obtener un buen registro, hicieron

derivar las invedtigaciones hacia procedimientos que se mostraran más

dócilee en nuestrae manos. Por le tanto, ee abandonó el método un

tubo, aunque :econeciendo su ventaja respecto a sensibilidad.

¡a así comose recurrió al neo de ctrce elementos que facilita­ran el desarrollo c interpretación de las reacciones de difusión.

Se contó para ello con algunas cubetas de vidrio de caras paralerlas; pero por ser incuricientee y no pudiendo disponer de otras, ae

improvieóuna serie, preparada cen portaobjetoe. Las experiencias

se efectuaron siguiendo el orden indicado a continuación.

EIBAÏOS IN CUBEIAS Q! CARAS PABALILAB

Se usaron de dos tamaños: una de 35:55 nm. y 5 nm. de espesor y

1a otra de 21x80 nm. e igual espesor.

La técnica y los reactivos fueron los mismosque para los ensayos

en tubo, ineietiándoee con el sistema tetánicc por la complejidad delas líneas obtenidas. i

Si bien pudohacerse en esta ocasión el registro fotúgrúticc, ee

presentaron algunas dificultades, púee 1a desecación del gel, a peea'

de la incubación en ambiente húmeda, inpidió en ciertod canoa la tan­nación de líneas.

rig 10

¡1 empleode inmuncunercy tczoide tetánicc purificada (¡-3 y11-3), mezclados en iguales prepcrcionee al gel de agar-gelatina (ex­

cese de anticuerpos), permitió 1a observación de 6 lineas de distin­

ta densidad, tal cone ¡e aprecia en 1a figura 10 y cuya interpretarcián ae hará más adelante.

ENSAYOS EN CÚBETAS PREPARADAS OON PORTAOBJETOS

Ante 1a imposibilidad de contar con mayor número de cubetas, se

decidió la preparación de otras. Se emplearonsaportes de tres ti­

pos para los portaobJetos :

a) alambres de bronce en forma de U; b) listones de madera barni­

zada después de haber permanecido en estufa, a 37°C., durante dos dí­

as y c) moldes de caucho.

Sobre dichos soportes se adaptaron dos portaobjetos colocados par

ralelamente y unidos con mástic. La distancia entre ambosfue de 4

mm. aproximadamente.

Despuésde algunos ensayos, fué nesesario desistir del uso de es­

tas cubetas, ya que se presentaron inconvenientes z escasa defini­

ción o irregularidad en las líneas, desecación del gel, separación

del saporte, 6to., difíciles de subsanar, a pesar de las modificacio­nes que se introdujeron.

METODO EN PLACAS

ENSAIOS EN PLACAS DE PETRI

Al comienzo de estas experiencias, no se contó con los anteceden­

tes de Ouohterlony (1948). Inspirándonos en los métodos de medición

de antibióticos para la aplicación de los reactivos, se usaron tresdispositivos diferentes: discos de papel de filtro,cilindros de pas­ta de papel de filtro y dedales de vidrio.

Los discos presentaron 1a desventaja de su escaso poder de impregh

nación; los cilindros de pasta de papel, si bien absorbieron mayor

volumen, tuvieron 1a dificultad de producir corrimiento de líquido.

En cambiolos dedales de vidrio, aplicados a la superficie del

gel, permitieron medir exactamente con pipeta los volúmenesde liqui­

do necesarios, con 1a consiguiente ventaja.

Comométodo de colocación se usó 1a técnica de Abrahamy colabo­

radores (1941), para medir penicilina, que consiste en aplicar los ci­lindros en caliente sobre el gel ya preparado.

Los redultados obtenidos, aunque muybuenos, fracasaron en varias

oportunidades, por eorrimiento del liquido entre el vidrio y el agar,por lo que se recurrió a algunos artificios para evitar dicho incon­veniente:

1) Impregnación previa del cilindro en agar fundido comomedio

de adhesión a 1a superficie.

2) Extensión del agar en dos capas superpuestas.

Comoeste segundo procedimiento fué adOptado definitivamente, será

tratado con mayordetalle.

Se usaron placas de retri de 10x1.5 cm., colocándose los dedales

apoyados sobre una primera capa solidificada, determinándose las con­

diciones más convenientes comosigue:

Enrtres placas se vertieron,en cada una, 5, 10 y 15 m1de agar e

mezcla de agar-gelatina 1%, fundidos y llevados a 50°C.. Se dejó en­

friar y sobre 1a superficie se dispusieron los cilindros. Luegose

vertió otra capa del mismo gel fundido, de 15, 10 y 5 m1., en forma

de completar un volumen de 20 m1. por placa. Así quedaron los cilinp

dros perfectamente fijados. Despuésde enfriar, agregar los reactivos

e incubar, se compararon las tres condiciones, observándose mayor ve­

locidad de difusión y mejor desarrollo en la tercera placa (15 y 5 m1)

La distancia uniforme entre los dedales se puede conseguir en

forma sencilla, colocando un papel con trazado de circulos debajo de

1a placa, o bien con un dispositivo de

/"W“m“‘\x metal comoel empleado por nosotros,

//// lá que por simple apoyo sobre la superfie

Í i cie permite la impresión deseada.i o o 5 El tamaño de los cilindros fué de 12

B C mm. de altura por 7.5 mmde diámetro y

de 10x5 mm.; su disposición, según los

vértices de un triángulo, comoindicarig. 11

la figura 11, siendo 1a distancia de

20 a 22 mm.de acuerdo a los cilindros usados, aunque en los trabajos

preliminares fue mayor. Los cilindros se llenaron con los líquidos

a ensayar, teniendo en cuenta las concentraciones necesarias para nep

da experiencia.

Las placas se mantuvieron en estufa a 37°C, en ambiente húmedo

para evitar la desecación del gel.Las experiencias fueron hechas por duplicado, de manera de usar

una para observación diaria, reservándose 1a otra sin variaciones detemperatura,para el registro fotográfico.

El tiempo de reacción fué distinto para cada sistema analizado.

Si bien, al describir la técnica de difusión en tubo se mencionóla

actividad de 1a gelatina, fué con este procedimiento en placa donde

se apreció aun mas su utilidad, al incorporarla a1 gel de agar en con­

centración del 1%: además de producir mayor transparencia del medio,

acelera la difusión y permite en algunos casos, la lectura de lineas

correspondientes a componentesadicionales, que no son detectados en

el gel simple.

Variante del método en placa

Cualquiera que sea 1a técnica utilizada, el métodode reacción en

placas de agar tiene el inconveniente de exigir cierta concentración

de reactivos que no siempre es fácil de conseguir. Para obviar estadificultad, se recurrió a una serie de artificios técnicos.

En el método indicado, el reactivo difunde en el medio, en redor

del punto donde es colocado, aunque sólo se utiliza una pequeña zona

para 1a reacción. Esto significa en realidad una dilución que puedeevitarse.

Se efectuaron los siguientes ensayos:

a) En portaobjetos

Si en un portaobjeto cubierto de agar, se cargan, según 1a distan

cia requerida para 1a reacción, dos de sus bordes con los reactivos,

(Fig 12), 1a difusión sólo se produce sobre el frente de reacción,e­

xigiendo menorcantidad,de material.1

a"«CWL l

a T t' |,—__,_’_.___.._.. ...v.-_.——_¿-. . ._‘

i‘m/<1; f¿.,/.¿.:Z'..e;.-':{. ‘_| g ,

"__.'f" ...¿_' --:.¿;‘.':,»..z. .­

Fig. 12

b) Ensayos sobre triángulos gg vidrio

Si se observa comodifunde el reactivo, partiendo del centro de

diapersión, según indican las flechas en 1a figura 13, se llega a laconclusión de que 1a zona útil es la limitada por 1a linea de puntos.

Oon1a base de esta deducción se cortaron triángulos de vidrio del

tamaño del área marcada, que al cu­

brirlos con agar, delimitaban 1a su­perficie de gel a lo;sstrictamente

necesario, reduciéndose a la sextaparte 1a cantidad de reactivos neoosaria para obtener una reacción.

En 1a copia fotográfica adjunta

Fig. 13 (Fig. 14), puede observarse el cepec­tro obtenido en esta forma, usando sistema tetanico.

’13. 14

latas dos prooadinioatoa, aunque presentaran las vantadaa coña»

inflar, tienda ¡1 ineonveniante do ¡or muy¡anniblen g la doaooaoién,

por lo cual no ¡o insiltió en un uso, oontinuanáo los ¡aragon een el

mítodo en placa ya descripto.

Puedo afirmarse, un tárntnos gcnoraloa, que can 1a disposición

triangular da los eilindroa antes mencionada,al difundir den anti­gcnon idénticos per un lado y su oorruapondiante anticuerpe par ol

otro, ¡o formarán al encontrarle y altándo un concentraciones 6pt1-.uqe (equivalencia), líneas de precipitado blancas, especificas y bi­en datinidaa.

¡1 prolongarse la difusión, estan lineas se unen, dando arcos dar

sinntría. Si no trata ¿o varios listemas involucrados, 1a forma, po»sición y ángulo ds cada línea dependerá ds 1; concentración o idan­ridad dc lo: rotativos.

Una¡uy pequeña concentración-on uno do los dodalee, producirá

desviación do la línea de interferencia on 01 lado opunsto, ¿ocuparrociondo 1a simetría. ln caubio, las línia: correspondientes a nin­tcnaz na idénticos cruzarín ¡in interfaruneia. luto ¡o ilustra un

la figura 15.Las aucecivaa experiencias permitirán aclarar dicho. conceptos.

con 01 ¡{todo en placa no examinaron tres sintomas antigínioos:

dift‘rico, tetánioo y estnfilocóccieo. 'Tucsonnumerosas las pruebas preliminares afectuadaa, que pirni­

tieron seleccionar las másdenottrativan. Estas ¡a inscribirán acontinuación.

a) b) o)

Antiauorpoo\/

O O

Antígeno Antígeno

En a) Antígenos idénticos en igual concentración.

En b) Antíganoa no idénticos.

En o) Identidad parcial.

:La danominaoiónde los antígenos, sueros y medios do difusión,

corresponde a 1a indicada en el capítulo relativo a materiales emple­ados.

ISISTEMnflx DE REACCION ENSAYADOS

SISTEMA DIFTERICO:

Egperiencia l

a) Toxoide crudo, concentrado por sulfato de amonio (1-20), en By C

contra inmunosucro (II-1), gg concentración equivalente, 200 Lf.en A.

Dosdías después de incubarse las placas, apareció entre el oi­

lindro del Suero y los del antígeno, una línea de precipitado bien

definida (I), auya posición no varió du­rante los ocho,dias de observación. Al

cuarto y quinto día respectivamente, se

observaron 3 líneas más, de menorniti­

dez: una dirigida hacia el cilindro con­

teniendo el antígeno, le número II y 2

próximas III y IV, de menor intensidadFig. 16

y algo difusas, del lado del suero.

Estas líneas se extendieron gradualmente hasta fundirse con las co­

rrespondientes a la reacción del lado ppuesto, formandoarcos concén­

tricos y simétricos en el punto de unión.

Por dificultades técnicas no pudo obtenerse el registro fotográrfico de este ensayo.

Experiencia 2

Preparaciones antigénicas diferentcs¿_cgntra el miemgninmunosuero

a) Toxoide crudo concentrado (I-2c) en B, comparado con toxoide pu­

rificado (I-lb); suero (II-1) de concentración eggivalentessjoo Lfen A.

En esta prueba, no apareció la línea III entre el toxoide purifi­cado y suero. La línea principal I, se unió simetricamente a la co­

rrespondiente del otro lado, no así la linea II secundaria, cuya_posi­ción ha variado. Esto explicaría que durante el proceso de refinacíon

desaparece un componentey se modifica 1a concentración de otro. En

cambio, el antígeno principal se mantiene invariable.La zona clara que rodea al cilindro que contiene el toxoide cone

centrado crudo, según puede observarse en 1a foto 2a). se debe a la

presencia de porfirinas y otros pigmentos que han precipitado Junta­mente con el toxoide.

b) Los mismos reactivos gge en al_en concentración eggivalcnte menor180 Lf. en cada cilindro.

El gel se preparó con agar purificado con Cloruro de calcio.

Se formaron las mismaslíneas que en la reacción anterior, pero las

secundarias fueron menosnítidas, posiblemente debido a la diferenciadel medio usado.

Egpcnencia 5

a) Toxoide concentrado crudo (1-20), contra inmunosuero (II-1), gn

concentraciones diferentes. 300 Lf en A, 300 y 200 Lf en O y B.

Las líneas de precipitado aparecieron a1 mismo tiempo a amboslap

dos: la principal, entre el toxoide y suero de distinto valor, casino modificó su posición, siendo practicamente constante el ángulo for­

mado. Las lineas II, III y IV, que aparecen invertidas respecto a las

experiencias anteriores, debido al cambiode disposición de los reas­tivos, (toxoide en A), sufrieron un ligero desplazamiento, tanto delángulo comode posición, correspondiente a 1a variación de concentrar

ción, moderada en este caso.

Aunqueen 1a foto (33), la visibilidad de las líneas III y Iv es

escasa en la zona de la derecha, el examendirecto de la placa no o­

freció dificultad de interpretación.

Exoeriencia 4

a) Toxoide purificada (I-lb) de diferente concentración, 60 Lf en B

y 240 Lf en C, contra el mismo inmunosuero (II-l), 200 Lf en A

En esta prueba, la línea de precipitación I, entre el antígeno

y anticuerpo de gran diferencia de concentración, apareció después

del segundo día. A1principio fué limitada y estrecha, aunque menos

intensa que 1a correspondiente del lado apuesto, pero luego migró her

cia el antígeno, haciéndose más ancha y difusa. Cuandose interrum­

pió 1a experiencia después de trece dias, la linea II del mismolado.se habia desdobladodandoel característico 'splitting', mencionado

por Oakley (1953)­

Estcs hechos pueden explicarse, porque al haber un exceso de re­

activo, el anticuerpo en este caso, por difusión continua (mayorve­

locidad), produce 1a disolución sucesiva del complejoprecipitado y

su posterior formación, más adelanto, ccmprobándoseque la posición

de las lineas dependede las concentraciones de los reactivos, tal

comoya se señalara.

En cambio, una diferencia moderada ( zona apuesta), apenas modi­

fica el aspecto de las líneas,

b) Efecto del recargado del cilindro de sugro

Tgxoide purificagg (I-lb), 200 Lf en A, contra inmunosucrg do vg­

lor eguivalcntc (II-1), 200 Lf en B y 0.

La experiencia se llevó a cabo en iguales condiciones que las an­

teriores. Pero al séptimo día, se volvió a llenar el cilindro B con

el mismosolumen de suero e incubó. Después de cuatro dias, se ob­

servó el ensanchamientode 1a linea I y su ulterior separación (foto#b)I); esta se hizo másnotoria a1 termino de la prueba (lo BIas)(fo­

to 413m ). La linea II también sufrió igual modificación, comose

aprecia en la foto.Estos resultados confirman 1a explicación dada en el ensayo ante­

rior.Comoconsecuencia puede deducirse la inconveniencia del agregado

de reactivos después de iniciada la reacción, aun haciendolo en todoslos cilindros.

¡minus 20.

¡guzman h ¡ganancia Sa.

,_._-__m.¿.‘

Egperiencia 5

a) Toxoide purificado (I—1b), en O y el miggp toxoide previamente

calentado a 80°C. durante 15 minutos. en B, contra suero(II-l)enA.

Segúnpuede observarse en la foto correspondiente (5a), el trar

tamiento s que fue sometido el toxoide no destruyó el antígeno prin­

cipal. Si bien se produjo interferencia entre ambaslíneas, 1a quecorresponde a1 toxoide oalentado es más difusa y no muestra simetríalo cual indicaría desnaturalización.

Ezperiencia 6

r. Ensayos comparativos entre sueros diferentes

a) Suero de procedencia norteamericana (II-2) en B y suero argentiy

gg (II-1) en C, contra toxoide purifiqsdo de concentración equi­valente (I-lb) en A, 200 Li’.

A1 segundo día de incubación, se formó 1a línea I, principal, en

cada lado de los cilindros de suero, que se unió en forma simétrica

posteriormente, lo mismoque la línea II. La línea III sólo aparecióentre el toxoide e inmunosueroargentino, sin mostrar interferencia.

Las líneas II y III no se perciben bien en el registro fotográfico.

b) Los mismossueros (II-2 y II-l) y disposición contra toxoide cru­

do o ncentrgdo con sulfato de amonioíI-2o), de concentración egu ­

valente, 600 Lf.

En la zona correspondiente al suero

norteamericano aparecieron dos nuevas

líneas de precipitación:,V y VI, éstaúltima muy tenue, que no se observaron

C) C) con nuestro suero. La linea II se forh

mómuycerca de 1a I. Las restantes,I,Fig. 17

II y IV, mostraron interferencia con

las del suero argentino.

Estas experiencias comparativas entre los dos sueros, indican di­

Ierencias en cantidad de elementos en reacción, cuyas resultantes se

analizarán más tarde, al tratar en conjunto las conclusiones genera­les.

c) Los mismos reactivos gue en b), en concentración equivalente mengr

Despuésde ocho dias de incubación, la linea principal presentó

igual nitidez y simetría. Noapareció la línea IV y las restantesmostraron menor intensidad,

Es decir, que a1 disminuir el valor de los reactivos empleados

algunos componentespresentes en menor concentración, no alcanzarían

a sobrepasar el valor crítico o umbral necesario para la producción

del precipitado, dando así un espectro de líneas reducido.

Gonrespecto a la línea predominante, la constancia en la posici­ón y ángulo de simetría, 1a nitidez e influencia escasa que 1a varia»ción de concentración de las sustancias reactivas tienen sobre la

línea de precipitado, revela 1a similitud específica del reactivoprincipal en los dos sueros.

m_“.,.w,4......uw.4....a.

Espai-neu 6a

Wo. 6h ¡aportada6°

SISTEMA ESTAFILOCOCCICO :

Enlas experiencias realizadas con toxinas y toxbides estafilo­

oócfiicos no se ha podido,llegar a una interpretación ooncluyente,de—

bido a que fue imposible contar con dichos reactivos despuesde efec­

tuados los ensayos preliminares. Es por ello que sólo se describen

algunos, cuyos registros fotográficos no figuran por ser de escasa

nitidez. Bi bien estas experiencias no aportan datos completos, sonde utilidad informativa.

¡aperiencia 1

a) Toxina (1-9), lOU en B y toxoide correspondiente (1410) en 0,

contra inmunosuero (II-5),10 U en A.

Despues de cuatro dias de incubación

y aparecieron dos líneas débiles en ambas,L zonas, que se fueron intensificando has­

ta unirse en forma casi simétrica. Las

líneas correspondientes a la región dela toxina fueron más densas y una ter­

Fig. 18 cer línea, la III, muytenue, se formó

sobre la I, entre la toxina y el suero. La reacción se interrumpióluego de veinte dias.

b) Los mismos reactivos, gg mazor concentración.

Se formaron las mismas lineas pero más nítidas.

Esperisncia 2

a) Toxina (1-9) en B y toxina precipitada z dializada (1-11) en o

contra inmunosuero (II-5) en A, de concentración equivalente.

Se observó el mismo tipo de reacción en ambas zonas.

Las resultantes del tratamiento de purificación hrecipifación con

sulfatoude amonioy diálisis) sobre la toxina, no evidenciaron difer

rencias apreciables con el metodo de difusión empleado.

Comono es posible obtener conclusiones con tan escasas experi­

eficias, se resta importancia por el momento,a la observación de una

SISTEMA TETÁNICO :

Las experiencias efectuadas con toxinas y toxoides tetánicos han

sido de interes para 1a mejor interpretación de lo observado en el s

sistema difterico, especialmente en lo que se refiere al efecto poste­rior de los reactivos sobre la línea de precipitación.

Comose hiciera al describir los ensayos anteriores, sólo se to­

manen cuenta los que tienen evidente significado para la exposición.

En esta forma,a1 simplificar ,se dejan de lado algunas experiencias

negativas y las que no aportan datos nuevos, evitando repeticiones

y manteniendo la unidad de presentación.

Entre estos últimos ensayos, pueden mencionarse los realizados

comparativamente con la toxina tetánioa, que produjo una reacción muy

debil y por lo tanto de escasa significación.

Experiencia 1

a) Toxoide purificado (1-3), en concentraciones diferentes, 25 Uen

el cilindro c y 7U en B, contra el suero (II-3), 25Hen A.

Placas con gel de agar 1%.

Despues del segundo día de reacción,

<:) n1' comenzóa observarse 1a formación de 2

\\:::::::::::::;I líneas muytenues, entre el toxoideysuero, en ambas zonas. Estas líneas se

(:> (:) extendieron gradualmente, haciendose más

nítidas y se unieron, dandoun ánguloFig. 19

fuera de la región del eje de simetría.Además, 1a intensidad no fue la misma, correspondiendo el máximode

precipitado a la zona de concentración equivalente. La experiencia

se prolongó hasta veinte dias, mostrando la presencia de 2 antígenosen el material analizado.(foto la).

b) zgrgide purificadc(1—4), en concentraciones diferentga: 7.5 U en

B y 30 U en O, contra suerg (II-4),}O U en A.

Placas con agar-gelatina 1%.

Coneste toxoide, la reacción se produjo en forma más clara y n1­

tida que en la prueba anterior. Las líneas correspondientes a 1a zo­

na de menorconcentración, se desplazaron hacia el cilindro de suero

sin presentar simetría respecto a las del lado apuesto. Sólo se no­taron 2 líneas.(foto lb).

Egperiencia 2

a) Toxoide purificada (1-3), de iggal concentración: lOU en B y c,

contra ¿pero de alto valor (Ii-3), 675 U en A.

Placas con agar-gelatina.

Por ser 1a primera en aparecer y la de más intensa reacción, se

debe homologarla segunda línea a partir del cilindro de suero, 1a

númeroI de las pruebas anteriores. Próximaa ella, en 1a parte su­

perior de la figura 20, se reconoce o­tra, perfectamente diferenciable; estase interpreta comocorrespondiente a la

número II, que por exceso de suero, ha

estrechado 1a distancia que 1a separa

C) C) de 1a línea I, fenómenoya estudiado

por Oudin.¡ig 20

Por debajo de la línea I, se observan

2 líneas más, designadas IV y III, siendo la IV poco visible en la

capia fotográfica (2a).

b) Suero (II-3), en distintas ooncentraciones:675 U en B y 7 U en O

contra toxoide purificado (1-3), 10 U en A.

Placas con gel de agar 1%.

En esta experiencia, el orden de las líneas aparece invertido,

por haberse modificado 1a colocación de los reactivos; los sueros se

encuentran en 1a parte inferior.

En un comienzo (sexto dia), las líneas I y II se produjeron casi

a1 mismotiempo en ambas zonas, aunque apenas perceptiblcs las corres­

pondientes al suero diluido. A1final de la reacción (20 dias), 1arelación e interferencia entre los dos sistemas desapareció casi com­pletamente, quedando como'barridas' las lineas de la zona de menor

concentración, cuya acción sobre el sistema preponderante se reduce

a una ligera incurvación de la linea I y a otra, másacentuada, sobre

la II. Esto fué interpretado comouna consecuencia de la gran difearencia en la concentración de suero en los cilindros B y c.(2b)

E eriencia

a) Toxoide purificgdg_(I-3), de igual concentración: 10 U en B y c

contra inmuncsucro diluido 1¿10 (II-3), 67 U en A.

Placas con agar 1%

Ppr defecto en la colocación de los cilindros B y C, hubo que re­

cargarlos con toxoide al quinto dia. La oOpia fotográfica (3a), fue

tomada al undécimo dia. En ella se observa un apreciable aumento en

el númerode líneas desarrolladas, de dificil interpretación en ese

momento,por lo que se resolvió complementar la observación con las

experiencias siguientes.

b) Toxoide purificadc (1-3), de igual concentración: 10 U en B y C,

contra inmunosuero concentradg,(II-3), 675 U en A.

Esta experiencia fué ideada con el objeto de comprobarsi se repe­

tia el fenómenoobservado en la prueba anterior, para lo cual se ree

cargaron los cilindros de tozoide al quinto dia de iniciada 1a reace

ción, frente a una dosis de suero diez veces mayor qui en a).

Comparadoel eSpectro formado, con el del ensayo anterior, se ve

quo es de estructura semejante, con mayor número de lineas y más niti­

dez.(foto 3h).

81W mas

incauta. 2a ¡animan zu

up. 3a mmm 3h

Egperiencig h

Efecto del recarggdo sucesivo en uno de los cilindros

a) Tgxoide purificado (1-3), 10 U en B y c, gontra guerg (II-3),6750en A.

Al realizar esta experiencia, no trató de mantener las condicio­

nes conatantea, menosla del eobrecargado, con el fin de efectuar una

observación comparativa en la mismaplaca. Así, en la zona de la iz­

quierda, se hizo la reacción normal con 10 unidades de toxoide y ex­

ceao de suero. A1 séptimo dia, se volvió a cargar el cilindro 0 con

otras 10 unidades de toxoide. E1 registro fotográfico (30,1), per­

mite comparar los dos espectros:

En la región izquierda ee observa la conformación del espectro simpleal lado del cual contrasta el aspecto artificioso, visiblemente, da­

do por el eobrecargado de la derecha.

Despues de obtener dicha cepia fotográfica,ee llenó nuevamenteel

cilindro C con toxoide y 5 dias más tarde se efectuó otro registre

(30,11), en el que puede apreciarse un aumento del número de lineas.

b) Toxoide purificado (1-3), #0 ü en B y C, contrafigugzg (II-3),

2800 U en A.

Para reforzar la observación, ee usó mayorcantidad de reactivos

en dedalea de más capacidad.

Las lineas comenzarona aparecer al sexto día. Al ¡óptimo y deci­

mo día se llenó nuevamente con toxoide el cilindro B, obteniéndose

los registros fotográficos 6, ll y 20 dias más tarde (fotos 4h,1‘,II' y III').

Comparandolas copias, puede apreciarse cómopermanece constante

el espectro original simple. En la zona del recargado, no aumentó

notablemente el númerode líneas reapecto al ensayo anterior, a pe­

sar de haberse prolongado la reacción. Sólo se nota un desplazamienp

to ligero de algunas líneas.

Egperiencia 5

a) Toxoide purificado (1-3), 10 U en C y otro toxoide purificada y

precipitado por gulfato de sodio (1-6) correspondiente a 15 U en

el toxoide original, contra suero (II-3), 675 U en A.

A1 quinto dia de incubación, ee formaron 2 lineas entre el cuero

y el toxoide simple, no observándose reacción en el lado Opueato,

hasta seis días dOSpuós,en que se volvieron a llenar loa tres cilin­

dros. Diez días más tarde, se interrumpió la. prueba.

En el registro fotográfico, se repite lo observado en las dos ex­

periencias anteriores, referente al efecto del recargado de los cilin­dros. En la zona correspondiente al toxoide tratado con sulfato de

sodio, ae percibe el mismoespectro, aunque en forma. mucho más tenue,

lo que probablemente es debido a su menor concentración en unidades,

comoconsecuencia de las perdidas inherentes al método.

Ensenada. ka I ¡ganancia ¡M¡I

Ensenada. kb 1' Experiencia¡#bu'

Em, ¿PhIII‘

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Conel trabajo precedente, se ha intentado destacar 1a importan­

cia que revisten para el análisis inmunológicc,las tócnicas de difu­

sión en gel, ya sea para indicar el grado de pureza de un material

biológico (a veces de naturaleza tan compleja, que es imposible su

determinación por otros métodos, químicos o fisicos), o bien para de­

mostrar la identidad o sspeoificidad serógica, por comparacióncon

otras sustancias de estructura conocida,Esto ha sido logrado a travel de las observaciones efectuadas al

difundir distintas preparaciones antígenicas con los inmunosuerosho­

mólogos, en medios gelificados, pues al sobrepasar los reactivos un

cierto umbral de concentración, se producen precipitados definidos,

poco solubles, cada uno de los cuales representa una reacción indivi­

dual entre el antígeno y su correspondiente anticuerpo. Es decir,

que la formación de tales preoipitados no impide o molesta la difup

sión de cada componentenc incluido en una reacción particular.

Las experiencias con los distintos sistemas ensayados, han permi­

tido conocer los diferentes factores que intervienen en la difusión

y su grado de importancia.

Es por ello que se comenzócon una reseña sobre los principales

mitodos empleadospor varios investigadores, describiendo además sus

fundamentos. Así, se compararon los ensayos en tubo y placa con var

riantes,indicando las ventajas e inconvenientes de cada método, para

adeptar al final comodefinitiva, la tecnica de difusión en placa.

Métodoen tubos z cubetas de caras paralelas:Comoya se señalar

ra, se introdujo una modificación ventajosa al mezclar tambien el an­

tígeno con gel, siguiendo el mismoprocedimiento que con el suero

Se logró evitar facilmente, de este modo, el escurrimiento de liqui­

do entre la pared del tubo y 1a columna central. Ademásse incorporó

la gelatina a esta ultima, lo que mejora la nitidez de la reacción

y en algunos casos acelera 1a aparición de las líneas de precipitado.

Aunquela sensibilidad del método parece ser mayor que ocn el de

placa, las dificultades para obtener un buen registro fotografico y

la imposibilidad de comparar distintos materiales, indujeron a adapá_

tar 1a t6cnica en placa de Petri, después de haber observado las ven­

tajas brindadas por esta última.POr la mismarazón, no se insistió en el uso de las cubetas de

caras paralelas, dados los inconvenientes señalados en el capitulorespectivo.

Metodo en placas

Cubetashorizontales 1 placas triangglargs:Los resultados obte­

nidos no estuvieron ds acuerdo con lo que se esperaba ds la aplicar

ción de principios que parecian promisorios. Frente a la ventaja ds

'poder utilizar menorcantidad de reactivos, por el menorefecto de

dilución, se presentó la dificultad de que no resistian periodos laru

gos de incubación. Las cámaras húmedas empleadas no fueron lo sufi­

cientemente perfectas comopara impedir la evaporación, defecto as

gravado por las deformaciones debidas a la retracción del agar.

Placas de Petri:Fue el metodo usado con preferencia. Las prinp

oipales ventajas halladas pueden resumirse comosigue:

La placa de Petri es un elementohabitual en los laboratorios de­

dicados al tema. Es de fácil esterilización y limpieza. Bumanejo

resulta muysimple, pues basta verter sn su interior un tubo de agar

fundido y dejar solidificar, para obtener una pelicula apta para e­fectuar las reacciones.

El principal inconveniente reside en el cierre imperfecto, perose corrige facilmente, disponiendo las placas en cajas que asegurenun ambiente húmedo.

por otra parte, el uso de los cilindros comoreoeptaculo de los

reactivos, eliminó la mezcla previa de estos con el gel. Bu disposi­

ción sobre la superficie de 1a película, posibilita la comparaciónsimultánea de distintos materiales.

Asi se llegó a desarrollar, durante el curso de estas investiga­

ciones, una técnica cuyas ventajas decidieron su elección comom6­

todc definitivo, dandopor terminados los ensayos preliminares.

Sistemas de reacción ensaladcs:Descartandc los ensayos con toxinas

estafilocóccicas, por su escaso número y tomando en conjunto los re- 1_su1tadcs obtenidos con las reacciones en gel de los sistemas diftó­

ricos y tetániccs, puede decirse:

Las conclusiones a las que se arribó, concuerdan con las de otrosautores en lo referente a su extraordinaria utilidad comométodode

análisis antigénico.Aunqueel númerode líneas observado está sujeto a artificios de

técnica, una cuidadosa y prudente interpretación, ligada a un proce­

dimiento riguroso, permite hacer deducciones acerca de 1a constitu­

ción antigónica de un reactivo precipitable.

Se encontró mayorutilidad en las reacciones comparativas y apli­

cando los principios recomendadospara el reconocimiento de antíge­

nos comuneesimilares o para su diferenciación.

fiera ello se practica la reacción en forma de que los frentes de

precipitación se encuentren en ángulo: las reacciones comunespara el

mismoantígeno, sumansus efectos en el punto de unión de las líneas

correspondientes, conformandouna sola linea, mientras que el flocu­

lado producido por antígenos o anticuerpos diferentes, reaccionan por

separado sin interferencia de las líneas, que se cruzan.Pero respecto de 1a interpretación de estos fenómenos, que Elek

(1949) designó con los tórminos lccping y verl , cabe hacer el mis­

mo llamado de atención ya señalado al hablar del númerode líneas,

pues, por artificios de técnica, también se pueden obtener aspectos

que se prestan a confusión.

Las experiencias efectuadas con toxoides'tetánico y diftéricc pc­nen en evidencia lc fácil que es producir distorsiones en los resul­tados.

Oonel objeto de indagar si en nuestras toxinas habia más reacti­

vos que los acusados por las dos líneas desarrolladas en los ensayos:aproximadamenteequivalentes sus proporciones, y considerando los con­

sejos de main (1948), se utilizó un procedimiento Similar.

Dichc autor recomiendaponer en exceso la sustancia reactiva del

lado de la zona que se desea analizar más minuciosamente. En esta g

forma consigue un aumento en el número de líneas observadas, con su

técnica en tubo. Para obtener este efecto, se recurrió primero a de­dales de mayorcapacidad, terminandopor utilizar el artificio deOuchterlony, que consistía en reforzar uno de los centros de difusión

por recargado del reactivo. Así, podía aumentarse la capacidad de

reacción en un sentido determinado; pero los resultados no fueron co­

mo se esperaba.

Mientras se usaron dedales de mayos tamaño y reactivos más con­

centrados, no se obtuvo modificación aparente del espectro, además

de la intensificación del precipitado (salvo un caso especial que ss

tratará más adelante). Pero en cuanto se dispuso del recurso del sc­

brecargado, posiblemente por efecto de la alteración en el ritmo de

la difusión, el aspecto de las reacciones cambió fundamentalmente.

Las figuras 4h) son muyrepresentativas de lo que ocurre en el sis­

tema diftérieo. La primera fue tomada a los 12 días de reacción, 4

después de haber recargado con suero el cilindro B. Puede notarse

el efecto de este aditamento, comparandolocon el aspecto de la reac­

ción normal, a la derecha. Se observa una segunda banda difusa que

simula conformaruna nueva línea, la que se unifica con las dos line­

as número I, comoindicando un sólo carácter antigenico. Una semana

más tarde, se obtuvo 1a segunda cepia fotográfica (thI), notandoso

lo siguiente:La línea I en la zona de la derecha, se ha intensificado (reac­

ción normal), mientras que la correspondiente al cilindro B ha dis­

minuido su intensidad. En tanto, la nueva línea formada se ha separ

rado más de ella, ampliando su zona difusa de reacción, pero conserv

vando el contacto ¿en el ángulo con el precipitado principal.

Conlo observado, es dificil reconocer la línea difusa comode­

mostrandola existencia de un antígeno especial, distinto del I.

Todohabla en favor de la presencia de unaartificio provocado por

el recargo del cilindro B, que al forzar un nuevo arance de reactivo.(suero), ha producidoun arrastre por solubilización parcial del pri­

mer precipitado, comolo evidencia la disminución de la densidad de

la línea I primitiva.Las experiencias efectuadas con totoide tetánice purificada, que

parecen diferir fundamentalmentede los ensayos anteriores, signifi­

can posiblemente un aporte a su mejor comprensión.

En el primer ensayo 3a), se recargaron los cilindros de toxoide

al 5° día y la cepia fotográfica tomadaal 11° día, revela un cambio

en el espectro habitual en tétano, que consta de dos lineas principaples. El número de líneas ha aumentado, lo que se demuestra con mayor

evidencia en la experiencia Bb), similar a la anterior, pero emplean!de una mayor cantidad de anticuerpos.

El ensayo Mb) se hizo recargando uno solo de los cilindros (como

en el sistema diftérico), para facilitar la observación comparativa.

El registro ua)I, que fue obtenido después de llenar nuevamenteel

dedal 0, permite apreciar la diferencia con una reacción normal y en

las mismascondiciones experimentales, salvo la variante indicada (r2

cargado). Es apreciable la multiplicación del númerode líneas, que

se hace más evidente en la cepia 4a) II, obtenida después de reaccio­

nar con un tercer agregado de toxoide.

En la experiencia posterior Hb), se siguió una normasemejante,con la diferencia de utilizar mayorcantidad de reactivos. En los

días 7° y 10°, se recargó el cilindro B y los registros fotográficos

fueron tomados 6, 11 y 20 días después del último agregado. Es re­

cién en esta última experiencia, que se encuentra algo que recuerdalo observado en difteria en condiciones similares. Aunquemuchomás

tenuementeque en difteria, se nota una difusión de la linea corres­

pondiente (por posición), a 1a segunda principal dbl espectro normal,

que se despliega en dos en el ángulo, comosignificando su tendenciaa desdoblarse.

Loobservado en los sistemas diftérico y tetánico, puede interprg

tarse comomanifestación de un mismofenómeno, que modifica su aspec­

to posiblemente por cualidades diferentes del precipitado formado.

El diftérice parece ser relativamente facil de solubilizar c de ser

suspendido en exceso de toxoide y el nuevo complejo sería incapaz de

dar líneas bien distintas y comoconsecuencia, produciría zonas di­fusas.

El complejo tetánico parece ser muchomás resistente a la redi­

solución c arrastre por exceso de reactivo. E1 suero en exceso po­

dría sobrepasar 1a zona de reacción, una vez agotado el antígeno.

Así, al sobrecargar con toxcide uno de los dedales, sc lo obliga a

actuar comosi el centro de difusión del anticuerpo estuviese más

próximo. Vale dbcir que el frente de contacto entre los reactivos,

puede no eonoordar con el primitivo, siendo posible la repeticiónde los espectros.

Ea así como, con el procedimiento de sobrecargado de los ciliné:

dros, se ha podido demostrar la posibilidad de crear espectros arti­ficiales.

Podría suponerse que en la práctica este no ocurriría empleando

las técnicas comunes. Pero en 1a cepia fotográfica 4a), puede obse;

varse que por simple exceso de un reactivo, se ha producido una di­

fusión de 1a linea principal, que en algunos puntos parece tener tendencia a desdoblarse y sin haber mediadoel artificio del recargado.

Ya Oudinhabló de distorsiones de los resultados por defectos de

constancia en 1a temperatura.

En el caso de 1a figura correspondiente a 4a), ss tuvo el cuidado

habitual de mantener una mismatemperatura durante toda 1a prueba, de

manera de no poder considerarla comocausa del fenómeno.

Cuandose observan algunos resultados publicados con gran númerode líneas obtenidas con reactivos considerados comorelativamente

simples, cabe preguntar hasta dondeel artificio de técnica, cuyascausales algunas se conocen y otras no, pudo haber intervenido, dos­virtuando los resultados.

Pepe y colaboradores (1951), en un magnifico trabajo sobre puri­

ficación de toxina y toxcide diftérico, hacen ensayos de precipita!

ción en gel y observan hasta 24 lineas desarrolladas en reacción en

tube con antígenos muy concentrados (1000 Lf).

Is indudable que los medios de cultivo, donde las bacterias han

elaborado 1a toxina, pueden contener, ademasde ella, otros elementos

antigénicos, entre los que se encuentran los productos de desintegrgción del cuerpo bacteriano. Lógico es esperar que tengan su repre­

sentación sn las reacciones en gel, con toxinas que no han sufrido

un proceso de purificación suficiente.

Pero es difícil comprenderla existencia de 24 antígenos separap

bles por difusión, cuando con las demás técnicas conocidas, sólo pu!

eden diferenciarse unos pocos, aunque por procesos de purificación

llegan a obtener un antígeno que sólo produce 3 líneas y un suero quedesarrolla una sóla.

En el curso de estas investigaciones se tuvo muyen cuenta las

observaciones efectuadas por Pope y colaboradores,en razón de las

diferencias en los resultados, pues el espectro fundamentalobteni­do fue siempre muyreducido.

Ante el conocimiento de que los sueros del Instituto Ialbrán u-Itilizados, fueron preparados con toxoides purificados por precipitasción en punto isoeléctrico, se trató de indagar más, dado que ello

podía tener influencia en los resultados,Por tal razón, se han ideado las experiencias 6a) y 63). En la

primera se usó un suero terapéutico proteolizado de procedencia nor­

teamericana, al mismotiempo que nuestro suero, frente a toxoids pu­

rificado. En sintesis, la reacción fue similar con ambossueros,

salvo pequeñas diferencias ya comentadas. En cambio, en 1a experi­

sncia 6h), se observan diferencias notables al poner los mismossue­ros frente a un antígeno de escasa purificación: un toxoide crudo

precipitado por sulfato de amonioa saturación y posteriormente di­alizado.

Analizando la foto correspondiente (6h), es encuentra un dese­

quilibrio evidente en redor de la línea principal. El suero argentino (8.A.), muestra su línea próxima al toroide muchomás marcada que

el norteamericano S.N. En cambio, este evidencia del lado contrario

un númeromayor ds lineas que 3.a.

Esto, que anteriormente fue expresado comodesequilibrio de la

reacción, demuestra una diferencia en el contenido de anticuerpos,

que puede ser debida al proceso de inmunización c al tratamiento

previo a que fueron sometidos los antígenos usados para la obten­ción de los sueros.

Para recalcar la fineza ds la técnica, cabe hacer otra aclara­ción. La figura 6b) no sólo ha mostrado diferencias entre 01 suero

americano y 01 del Instituto Halbrán, sino que ha permitido apreciar

una linea más en el suero argentino, que no se había observado en las

reacciones con tozoides purificados.

El problema pudo ser aclarado por la información posterior do

que al finalizar el proceso ds inmunización, el caballo dador fue i­

noculado con pequeñas dosis ds toxina sin purificar.

E1 hacer tales deducciones sólo ha sido posible por la aplicar

ción del método ds precipitación en gel, que abre nuevos puntos do

mira en la observación de la combinaciónantígeno-anticuerpo.

Otros métodos de más engorrosa ejecución, como el análisis por

absorción de anticuerpos o la precipitación especifica fraccionada,

no pueden dar los detalles de estructura que se evidencian tan far

cilmente con el método objeto del presente estudio y que actualmen­

te solc puede ser superado por 1a combinación de este mismoproce­

dimiento con el de la separación electroforétioa.

1° )

2°)

3' )

RESUMEI

Se pasa revista a los métodos conocidos para estudiar 1a

reacción de los antígenos con sus correspondientes anti­

cuerpos en seportes golificados.

Se desarrolla una técnica para ensayos de precipitación engel.

Aplicada a1 estudio de sistemas de reacción en difteria y

titanc, ha permitido por un lado, demostrar 1a sutileza delmétodopere observar diferencias de estructura en esos re­activos.

Por otro lado, ee obtienen mediante artificios de tecnica, aalteraciones de los espectros de precipitación que son un

llamado a 1a prudencia en 1a interpretación de los resul­tados.

o‘EW

BIBLIOGRAFIA

Los trabajos que fueron consultados directamente, figuran con

su título completo. Delos restantes, citados por otros autores,sólo se menciona1a revista correspondiente.

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