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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE GENES CANDIDATOS A SER RESPONSABLES DEL FENOTIPO 

Athena EN Arabidopsis thaliana.

Proyecto Pregrado 2011

p

Laboratorio de Biotecnología Vegetal Facultad de Ciencias Agronómicas 

Universidad de Tarapacá.

ALUMNO: VÍCTOR EDUARDO ROJAS PÉREZA. PATROCINANTE:  DR. WILSON HUANCA‐MAMANI

Arica‐Chile.2012

El ciclo de vida de las plantas consta de dos fases.

MICROSPORA (N) MEGASPORA (N)

MEIOSIS

( ) ( )

MITOSIS Y DIFERENCIACIÓN

ESPOROFITO (2N)

FECUNDACIÓN

Con la fecundación se inicia el desarrollo de la semilla.

Núcleos Espermáticos

LA DOBLE FECUNDACIÓNES LA SEÑAL DE INICIO

Endospermo

Embrión

Tubo Polínico

ES LA SEÑAL DE INICIO

PARA LOS PROGRAMAS DE DESARROLLO

Cubierta de la semilla

El desarrollo embrionario sigue un patrón ordenado de divisiones celulares. 

Estado globular Estado de corazón

Estado de torpedo

Estado de cotiledónCigoto 1era División celular 

Identificación de Athena

Identificada por el Dr. Wilson Huanca en un escrutinio genético

Desarrolla un embrión secundario

Tiene una mutación en una región Intergénica del cromosoma 5

Sitio de la mutación en el genoma de Athena 

Cromosoma 5

Athena 

895 pbGen‐1 Gen‐2Gen‐2

6105 pb

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Objetivo

Determinar el nivel de expresión de cinco genes 

candidatos de ser responsables del fenotipo Athena

en Arabidopsis thaliana

• Analizar fenotipos de líneas mutantes Athena e insercionales

• Realizar análisis histológico de la embriogénesis en Athena

• Determinar el nivel de expresión de los cinco genes candidatos en plantas silvestres y en Athena, en tejido reproductivo

• Analizar cruzas con marcadores moleculares del desarrollo 

Resultados

AthenaSilvestre

Semillas abortadas en plantas mutantes Athena

Desarrollo embrionario normal en semillas de Arabidopsis tipo silvestre

Semillas fueron clareadas con solución de clareo y analizadas con óptica de Nomarski  

Estado globular Estado de corazón Estado de torpedo

Proembrión 2 Células

Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante 

AB

DC

Estado globular Estado de corazón

FE

Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante 

Estado de corazón Estado de torpedo

En la mutante Athena existe proliferación celular anormal en el suspensor

◄

AB

*◄

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En Athena la mutación se inserta en una región intergénica

Cromosoma 5

Athena 

¿ La región intergénica es la responsable ?

¿Algún elemento regulatorio está siendo afectado ?

895 pbGen‐1 Gen‐2Gen‐2

6105 pb

Líneas mutantes que poseen una inserción en una región 

intergénica cercana a Athena

Cromosoma 5

Gen‐1 Gen‐2

Salk_073901 Salk_130478 

895 pb

598 pbGen 2

718 pb

Athena 

6105 pb

Líneas insercionales muestran proliferación celular en el suspensor y desarrollo de embriones aberrantes

Semillas fueron clareadas con solución de clareo y vistas con optica de Nomarski  

Salk_130478 Salk_073901

P.F.D. ATPProteasa i L

P.F.D.

Cromosoma 5

Athena 

¿ Cuál es el gen responsable ?

Salk_073901Salk_130478

Proteína de unión a 

ribonucleasa S

ATPsintetasa

tipo Lon 

Se realizó análisis de expresión por RT‐PCR

Reacción en cadena de la polimerasa en retrotranscripción (RT‐PCR) 

Extracción de RNA total Método TRIzol ( Invitrogen )

RNA total

Cuantificación del RNA total

Se colectaron muestras

1 ug RNA total + DNAsa I

RTAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTTTRNAmOligo dT

RT‐PCR

TTTTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTTT

TTTTTTTTTTTTT

TTTTTTTTTTTTT

Oligo dT

RNAmcDNA

Transcriptasa Inversa

dNTP’s

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TTTTTTTTTTTTT cDNA

PCR

Taq Polimerasa

dNTP’s

VisualizaciónVisualización Gel de agarosa

gen 1gen 1

Athena

gen 2gen 2 gen 1gen 1 gen 2gen 2

RT‐PCR

Productos de PCR  

WT

GEL

Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante Athena

ACTINA 11 P.F.D 1ATP 

Sintetasa Proteasatipo Lon

Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2100pb

400 pb

Tamaños esperados : 

Actina‐11 :                    180pbP.F.D 1 :                         391pb ATP Sintetasa:              357pb   

200 pb

p

Proteasa Lon:               364pbProteína unión a Ribonucleasa S:             342pbP.F.D 2 :                          389pb

Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante

Athena

ACTINA 11 P.F.D 1ATP 

Sintetasa Proteasatipo Lon

Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2100pb

400 pb

200 pb

p

Tamaños esperados : 

Actina‐11 :                    180pbP.F.D 1 :                         391pb ATP Sintetasa:              357pb   

Proteasa Lon:                364pbProteína unión a Ribonucleasa S:              342pbP.F.D 2:                            389pb

En Athena la región intergénica produce una sobrexpresión del gen para ATP Sintetasa( Sub‐unidadδ)   

Cromosoma 5 Salk_073901Salk_130478

Proteína de unión a 

ribonucleasa S

P.F.D. ATPsintetasa

Proteasa tipo Lon 

P.F.D.Athena 

¿ Son células del suspensor?.

¿Que tipo de células son?.

¿ Se está desarrollando un nuevo embrión?.

Se analizaron cruzas de Athena con marcadores moleculares del desarrollo

¿ Hay cambios en los patrones de desarrollo?

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Athena cruzada con marcadores del desarrollo

Marcador Athena 

F 1F 1

óResultados esperados

Wild‐typePIN 1:: GFP

A B

E F

Línea marcador

Expresión normal de marcadores 

moleculares del desarrollo embrionario

WOX‐5:: GFP

WOX‐8 :: GFP

JI

Wild‐type Athena

A B

Línea marcador Athena

C D E F

Expresión de marcadores para desarrollo embrionario en la mutante Athena

PIN 1:: GFP

A

G

Línea marcador Athena

C

H I J

E

WOX‐5:: GFP

Línea marcador  Athena

WOX‐8 :: GFP

L M NK

Conclusiones

• La mutante Athena y las líneas insercionales Salk_130478 ySalk_073901 presentan fenotipos asociados a la semilla endesarrollo.

• En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante debido a• En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante, debido aque sufre proliferación celular lo cual origina, en algunos casos,el desarrollo de una estructura tipo embrión o embriónsecundario.

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Conclusiones

• En Athena el gen que codifica para la subunidad δ de la ATPSintetasa se desregula, aumentando su expresióntranscripcional, posiblemente esta desregulación sería laresponsable de la proliferación celular en el suspensor. Paralos otros cuatro genes analizados, no se detecta actividadtranscripcionaltranscripcional.

• En Athena el análisis con marcadores moleculares deldesarrollo, muestra que las células que proliferan en elsuspensor, cambian su programa de desarrollo e identidadcelular, adquiriendo un destino embrionario.

Perspectivas

Para confirmar que el gen de la ATP Sintetasa subunidad δ esrealmente responsable de producir el fenotipo mutante Athena,se podrían realizar las siguientes actividades:

1.‐ Análisis de expresión por RT‐PCR para los cinco genes en estudio,en plantas de mutantes Salk. El patrón de expresión para loscinco genes, en estas mutantes debería ser similar al de lamutante Athena.

2.‐ Sobreexpresión del gen de la ATP Sintetasa en un fondo genéticosilvestre, a través de la generación de plantas transgénicas deArabidopsis, portando una construcción que consiste en el gende la ATP Sintetasa comandada por un promotor fuerte. Seespera que la expresión de este gen dentro de la planta produzcaun desarrollo anormal del suspensor.

Control embrionario del suspensor en sus y twn

Genes SUS son necesarios para la morfogénesis normal

Schwartz et al. (1994)

Agradecimientos

Dr. Wilson Huanca‐Mamani, Laboratorio de Biotecnología Vegetal (U.T.A.) por el apoyo académico y técnico brindado en la realización de este seminario. 

Factores genéticos en el desarrollo temprano

YDAMPK3 TAA1

WOX 8MPK6 WOX 2SSP

PIN 1PIN 7

TAR 1 y 2MPWOX 8SSP PIN 7 MP

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Factores genéticos en estados avanzados

WOX 5

WUS

KNOX

STM

Mutantes en Arabidopsis

twn 1

Vernon et al. A.J.B.(2001)

sus 

Schwartz et al.Development (1994)

twn2

Zhang, J. (1997 )