RNA (RIBOSOMAL)

El cido ribonucleico ribosmico (ARNr) es el componente de RNA del ribosoma, y es esencial para la sntesis de protenas en todos los organismos vivos. Comprende el material predominante en el ribosoma, que es aprox. 60% rRNA y 40% protena por peso. Los ribosomas contienen dos rRNAs principales y 50 o ms protenas. Los rRNAs LSU y SSU se encuentran dentro de las grandes y pequeas subunidades ribosomales, respectivamente. El rRNA LSU acta como una ribozima, catalizando la formacin del enlace peptdico. secuencias del rRNA son ampliamente utilizadas para la elaboracin de relaciones evolutivas entre organismos, ya que son de origen antiguo y se encuentran en todas las formas conocidas de vida.

Dentro del ribosoma los ribosomas RNAs forman dos subunidades, la subunidad grande (LSU) y la subunidad pequea (SSU). mRNA se intercala entre las subunidades pequeas y grandes y el ribosoma cataliza la formacin de un enlace peptdico entre los 2 aminocidos que se encuentran en la rRNA. El ribosoma tambin tiene 3 sitios de Unin, llamados sitios A, P, y s E. El sitio A en el ribosoma se une a un aminoacil-tRNA (un tRNA enlazado a un aminocido).

Los ribosomas procariticos y eucariticos pueden dividirse en dos subunidades (S en 16S representa unidades Svedberg), nt = longitud en nucletidos de los rRNAs respectivos, para ejemplares de la especie E. coli (clula procariota) y humanos (eucariotas):

TypeSizeLarge subunit(rRNAs)Small subunit(rRNA)prokaryotic70S50S(5S: 120 nt,23S: 2906 nt)30S(16S: 1542 nt)eukaryotic80S60S(5S: 121 nt,[1]5.8S: 156 nt,[2]28S: 5070 nt[3])40S (18S: 1869 nt[4])

EUCARIOTAS

En cambio, las eucariotas tienen generalmente muchas copias de los genes del rRNA organizados en repeticiones en tndem; en los seres humanos aproximadamente 400 repeticiones estn presentes en cinco grupos (en los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). Debido a su especial estructura y comportamiento de la transcripcin, racimos de gene del rRNA son comnmente llamados "ADN ribosomal" (tenga en cuenta que el trmino parece implicar que los ribosomas contienen ADN, que no es el caso).

RNAr

Simbolizado como rRNA. Son los componentes estructurales de los ribosomas.

En procariontes se distinguen molculas de rRNA 5s, 16s y 23s; en eucariontes se encuentran molculas de rRNA de 5s, 5.8s, 18s y 28s.

El ARN ribosmico (ARNr) 16S es la macromolcula ms ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonoma bacterianas.

Su aplicacin como cronmetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a principios de la dcada de 1970

Los estudios de Carl Woese originaron la divisin de los procariotas en dos grupos o reinos: Eubacteria y Archaeobacteria.

Woese introdujo el trmino dominio para sustituir al reino como categora taxonmica de rango superior, y distribuy a los organismos celulares en tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, el ltimo de los cuales engloba a todos los seres eucariotas

Los ARNr 16S pueden caracterizarse en trminos de secuencia parcial, mediante el mtodo de catalogacin de oligonucletidos, utilizado en los estudios pioneros de Woese.

Siguiendo esta tcnica, el ARNr 16S marcado in vivo, y purificado, se trata con la enzima ribonucleasa T1.

RibosomasSon orgnulos complejos, altamente especializados, que utilizan los organismos para el complicado proceso de sntesis de protenas.

Operones se utiliza como una unidad gentica funcional formada por un grupo o complejo de genescapaces de ejercer una regulacin de su propia expresin por medio de los sustratos con los que interaccionan lasprotenascodificadas por sus genes

Este complejo est formado por genes estructurales que codifican para la sntesis de protenas (generalmenteenzimas), que participan en vas metablicas cuya expresin generalmente est regulada por otros 3 factores de control.

ARNr 16SEs un polirribonucletido de aproximadamente 1.500 nt, codificado por el gen rrs, tambin denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puede obtener informacin filogentica y taxonmica. Como cualquier secuencia de nucletidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla.

Los ARNr SSU se encuentran altamente conservados, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen adems variaciones que se concentran en zonas especficas.El anlisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenticos revel un hecho adicional de gran importancia prctica: la presencia de una o ms secuencias caractersticas que se denominan oligonucletidos firma. Se trata de secuencias especficas cortas que aparecen en todos (o en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo filogentico, y nunca (o slo raramente) estn presentes en otros grupos, incluidos los ms prximos. Por ello, los oligonucletios firma pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo.

El nmero de copias del opern ribosmico por genoma bacteriano vara considerablemente, de 1 a 15, siendo relativamente constante a nivel de especie, gnero e incluso familia7 (tabla 1). Entre las copias de los ARNr 16S codificadas por un mismo genoma se ha detectado un cierto grado de heterogeneidad (denominada microheterogeneidad).

El anlisis de 14 genomas bacterianos, cuya secuencia completa se encuentra disponible, indic una divergencia mxima del 1,23%, que corresponde a los ADNr

16S de Escherichia coli (tabla 1). Adems, diferentes autores encontraron variabilidad intragenmica entre los ADNr 16S de otras bacterias de inters clnico, cuyo genoma an no ha sido secuenciado. Destaca la elevada heterogeneidad (1,43%) detectada entre las 4 copias del ADNr 16S presentes en la cepa clnica ADV 360.1 de Veillonella8. Obviamente, la variabilidad intragenmica, tiene importantes implicaciones prcticas para la identificacin. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, todas las copias del ADNr 16S de un organismos son idnticas o casi idnticas.

Caractersticas relevantes del ARNr 16S para su utilizacin como herramienta filogentica y taxonmicaAunque existen cronmetros moleculares alternativos al ARNr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarle. De hecho, esta macromolcula presenta una serie de caractersticas, en base a las cuales fue considerado por Woese como cronmetro molecular definitivo:

Se trata de una molcula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana universal para su identificacin.

2. Su estructura y funcin han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios.

3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar informacin acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los ARNr 18S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no slo los organismos ms alejados, sinotambin los ms prximos.

4. El tamao relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluctuaciones estadsticas.

5. La conservacin en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.

6. Dado que resulta relativamente fcil secuenciar los ADNr 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento.

Aspectos metodolgicos de la identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ADNr 16SEl mtodo molecular de identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ADNr 16S incluye tres etapas:a) amplificacin del gen a partir de la muestra apropiada;b) determinacin de la secuencia de nucletidos.c) anlisis de la secuencia.

AmplificacinLa amplificacin del ADNr 16S se consigue en un termociclador, gracias a la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Como sustrato se utiliza normalmente ADN purificado a partir de un cultivo puro del agentepatgeno. Alternativamente, el ADN podr obtenerse directamente de la muestra clnica, en el caso de bacterias fastidiosas o no cultivables, cuando aquella proceda de rganos o tejidos normalmente estriles. Para la extraccin del ADN bacteriano existen protocolos generales12, pero pueden requerirse modificaciones, dependiendo de la bacteria. Adems, la amplificacin tambin puede conseguirse directamente a partir de una colonia aislada o un cultivo lquido de la bacteria de inters, o incluso a partir de una muestra clnica, simplificando significativamente la identificacin, al evitar el laborioso proceso de extraccin del ADN.

Oligonucletidos iniciadores

Para la amplificacin del ADNr 16S, las regiones conservadas facilitan el diseo de oligonucletidos, se utilizan iniciadores diseados en base a secuencias conservadas prximas a los extremos 5 y 3 del gen, que originan amplicones de 1.500 pb.

Se utilizan oligonucletidos que permiten la amplificacin de fragmentos de menor tamao, las 500 pb corresponden al extremo 5 del gen, en cualquier caso (electroforesis).

Secuenciacin del amplicon

Se llevan a cabo las reacciones de secuenciacin y el anlisis de los productos por electroforesis, y utiliza un nico iniciador por reaccin y terminadores marcados con fluorocromos , que interrumpen la sntesis de manera aleatoria, y facilitarn la deteccin de los fragmentos .

El nmero de bases generadas por un secuenciador automtico es de 500 a 900, Por ello, para la secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S completo, son necesarios de 8 a 4 iniciadores, dos de los cuales podrn ser los mismos utilizados en la amplificacin.

la secuenciacin de una cadena del amplicn puede conducir a una correcta identificacin ,la calidad de la secuencia es ptima cuando la comparacin de ambas cadenas se utiliza para la correccin de errores.

La mayor variabilidad se concentra en las primeras 500 bases, correspondientes al extremo 5, para la identificacin de un aislado clnico, necesitndo solo 2 iniciadores11,13-15, la secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S completo, ser necesaria a la hora de identificar nuevos patgenos.

Anlisis de la secuencia La comparacin de la secuencia del ADNr 16S con las bases de datos. Permite la comparacin de secuencias. En octubre de 2003 contena ms de 78.000 secuencias de ADNr 16S, que son alineadas, teniendo en cuenta la estructura secundaria de la molcula. La base de datos RIDOM, se limita tambin a secuencias de ADNr, centrndose en microorganismos patgenos. Finalmentese construye un rbol filogentico, que refleja, de forma esquemtica, el grado de parentesco gentico entre las bacterias comparadas.

Sistemas comerciales

MicroSeq500, diseado para la identificacin rpida y correcta de bacterias patgenas. Este sistema utiliza un par de oligonucletidos que permiten amplificar un fragmento de 527-bp correspondiente al extremo 5 del ADNr 16S. Se trata de una versin simplificada del MicroSeq 16S rRNA slo requiere dos iniciadores para la secuenciacin de ambas cadenas, reduciendo el coste y el trabajo, el sistema incluye una base de datos para determinar el gnero y la especie del aislado. Adems, el software permite exportar las secuencias que podrn ser comparadas con otras bases de datos, e incluye herramientas para el anlisis filogentico.

Aplicaciones de la secuenciacin del ARNr 16Sen el diagnstico microbiolgico

La identificacin basada en la secuenciacin del gen que codifica el ARNr 16S en los laboratorios clnicos se centra en cepas cuya identificacin por mtodos fenotpicos resulta imposible, difcil o requiere mucho tiempo, incluyendo los siguientes casos:

1. Bacterias no cultivables presentes en muestras clnicas.

2. Bacterias cuyas caractersticas bioqumicas no se adaptan a las de ningn gnero o especie reconocido.

3. Bacterias para las cuales la caracterizacin fenotpica sea sustancialmente deficiente.

4. Bacterias fastidiosas, a consecuencia de sus requerimientos nutricionales.

5. Bacterias de crecimiento lento, que retrasa considerablemente la identificacin convencional.

Ejemplo:En 1980, pacientes infectados por VIH, manifestaron angiomatosis, con lesiones en la piel que recordaban a las caractersticas del sarcoma de Kaposi. Estas lesiones contenan grupos de bacilos pleomrficos, y se denomin angiomatosis bacilar16, se utiliz por primera vez el ADNr 16S para la identificacin, independiente de cultivo, de un agente patgeno17. El ADNr 16S del agente causal de la angiomatosis bacilar se amplific a partir de tejido infectado, utilizando oligonucletidos deducidos en base a regiones conservadas, comunes a todas las bacterias. El anlisis de la secuencia amplificada revel una nueva bacteria, estrechamente relacionada con Rochalimaea (despus Bartonella) quintana.

TAMBIEN:

Se han identificado bacterias patgenas presentes en el lquido cefalorraqudeo 20,21, lquido sinovial 22, vlvulas cardacas23 y sangre24-26

Actualmente:

La aplicacin ms importantes del ADNr 16S es la identificacin de micobacterias no tuberculosas, cuya incidencia ha aumentado,asociada a la pandemia del sida. El mtodo de identificacin de estas micobacterias se basa en caractersticas fenotpicas (pruebas bioqumicas, produccin de pigmento, fisiologa, y morfologa de las colonias), la determinacin requiere un tiempo considerable, como consecuencia del crecimiento lento de estas bacterias en medios.

Sistema MicroSeq500:

Identificacin de bacterias corineformes. Tanget al14 analizaron un total de 52 aislados, y encontraron que a nivel de gnero los resultados de la identificacin por secuenciacin eran concordantes con los obtenidos utilizando criterios fenotpicos. A nivel de especie, la identificacin por secuenciacin fue ms fiable en las dos especies de Corynebacterium con mayor relevancia clnica: C. diphteriae y C. jeikeium. El tiempo requerido fue inferior a 24 h.

Ejemplo de aplicacin a la identificacin de bacterias: Sistema MicroSeq500, identificacin de 37 aislados bacteriano incluan bacterias aerobias grampositivas -gramnegativas y especies del gnero Mycobacterium, identificadas por mtodos fenotpicos. El 81,1% de los aislados fueron correctas, y el 13,5% incorrectas y en el 5,4% (2 de 37), de especie. En 5 casos, la identificacin errnea se debi a la ausencia de las secuencias ADNr 16S de las bacterias correctas en la base de datos del sistema MicroSeq500

Conclusin

La secuenciacin del ADNr 16S constituye un mtodo rpido y eficaz de identificacin bacteriana, del cual puede beneficiarse la microbiologa clnica, al igual que otras ramas de la microbiologa. A medida que los recursos tcnicos aumentan, el precio se hace ms competitivo, por lo que probablemente su utilizacin para la identificacin sistemtica de bacterias patgenas ser slo cuestin de tiempo.