proteínas: determinación de la estructura primaria
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PROTEÍNAS: DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA
PRIMARIA.
Proteínas
Macromoléculas complejas desde los punto de vista físico y funcional.
Funciones.EstructuralContráctilDe defensaDe transporteEnzimática Receptora.
Ciclo de vida de una proteína hipotética.
División proteólica
Enlacesdisulfuro
defector
ubiquitina
Las proteínas y los polipéptidos se deben purificar antes de analizarlos.
Las células contienen miles de proteínas distintas, cada una en cantidades variables. El aislamiento de una proteína especifica, para su análisis, puede requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas de purificación
La cromatografía separa una proteína de la otra con base en:
Diferencia de tamaño CargaHidrofobicidadCapacidad para unirse a un ligando especifico.
Cromatografía de columna
Cromatografía líquida
de alta presión (HPLC)
Puede separar derivados de las cuentas de fase estacionaria para cubrir su superficie con los grupos ácido, básico, hidrofóbico o tipo ligando requeridos para cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, o de afinidad.
La reducción del tamaño de las partículas ofrecio el potencial de aumentar mucho la resolución . Sin embargo, la resistencia creada por la matriz requirió el uso de presiones muy altas .
Cromatografía de exclusión de tamaño.
Cromatografía de intercambio iónico.
Filtracion de gel.Separa las proteínas con base en su radio Stokes (funcion de la masa y la forma moleculares) Emplean cuentas porosas.
Con una carga positiva se adhieren estrechamente a cuentas con grupos funcionales que tienen carga negativa (carboxilatos o sulfatos). Con una carga negativa se adhieren a cuentas que tienen grupos funcionales positivos , mientras las proteínas no adherentes fluyen a través de la matriz
Cromatografía de interacción hidrofóbica.
Cromatografía de afinidad.
Separa proteínas con base a su tendencia a asociarse con una matriz de fase estacionaria cubierta con grupos hidrofóbicos
Usando sustratos, productos, coenzimas o inhibidores , inmovilizados; solo las proteínas que interactúan con el ligando inmovilizado se adhieren.
EL MÉTODO MAS USADO ES LA SDS -PAGE( ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA)
• LA ACRILAMIDA SE POLIMERIZA Y SE ENTRECRUZA PARA FORMAR UNA
MATRIZ POROSA.
• EL SDS SE UNE A PROTEÍNAS EN PROPORCIÓN DE 1 MOLÉCULA POR CADA 2 ENLACES PEPTÍDICOS (SE
DESDOBLA O DESNATURALIZA.
• LOS POLIPÉPTIDOS SE SEPARAN CON BASE A SU PESO MOLECULAR
Pureza de las proteínas
Enfoque isoeléctrico(IEF)
Se usan amortiguadores iónicos (anfolitos) y un campo electric para generar un gradiente de PH dentro de una matriz de poliacrilamida.
Las proteinas migran hasta la region donde el PH coincide con su punto isoeléctrico.
Se usa junto a SDS-PAGE para electroforesis bidimensional:
-En base en el punto isoeléctrico.-En base en el peso molecular.
Sanger determina la secuencia de un polipéptido
• Frederick Sanger dividió cada cadena de polipéptidos usando tripsina, quimotripsina y pepsina.
• Hizo reaccionar los péptidos con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (reactivo de Sanger).
• Logró reconstruir la secuencia completa de la insulina.
Reacción de Edman
Pehr Edman introdujo el fenilisotiocianato (reactivo de Edman) para marcar el residuo amino terminal de un péptido.
Las proteinas se dividen en péptidos usando proteasa o bromuro de cianógeno.
Espectrometría de masa (MS)
La MS ha reemplazado a la técnica de Edman para determinar secuencia de péptidos y proteínas.
Puede usarse para analizar metabolitos, carbohidratos.
Los péptidos pueden volatilizarse para análisis mediante ionización de electrospray o desorción láser
asistida por matriz
En el análisis de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masa inicialmente estuvo obstaculizado por dificultades para volatizar moléculas orgánicas grandes.
Las moléculas orgánicas pequeñas podían vaporizarse fácilmente; las proteínas, oligonucleótidos, entre otros, quedaban destruidos en estas condiciones.
La dispersión hacia la fase de vapor se logra mediante ionización de electrospray y desorción y ionización láser asistida por matriz (MALDI)
Un espectrómetro de masas tándem es un instrumento especializado que detecta moléculas midiendo su peso (masa). Los espectrómetros de masas miden el peso electrónicamente y presentan los resultados en la forma de espectro de masas.
La espectrometría de masas tándem puede usarse para efectuar
pruebas en muestras de sangre provenientes de
recién nacidos para detectar la presencia y las
concentraciones de aminoácidos, ácidos
grasos y otros metabolitos.
Las anormalidades de las concentraciones de metabolitos pueden servir como indicadores diagnósticos para diversos trastornos genéticos, como:
• Fenilcetonuria• Encefalopatía
con acidemia metilmalónica
• Acidemia glutárica tipo 1
La proteómica se dirige a
identificar la totalidad de
proteínas elaboradas por una célula en condiciones
diversas
El proteoma es el conjunto de todas
las proteínas expresadas por
una célula individual en un
momento particular
• La electroforesis bidimensional, es una forma de electroforesis en gel comúnmente utilizada para analizar proteínas.
• Las micromatrices multigénicas, a veces llamadas microchips DNA, en las cuales se detecta expresión de los mRNA que codifican para proteínas
Se desconocen las funciones de una gran proporción de las proteínas codificadas por el genoma humano. Aún esta en sus inicios la creación de micromatrices proteínicas para practicar pruebas de manera directa respecto a las funciones potenciales de proteínas a una escala masiva.De este modo, la información acerca de las propiedades y la función fisiológica de una proteína recién descubierta puede inferirse al comparar su estructura primaria con la de proteínas conocidas.
Bioinformática ayuda a la identificación de funciones de las proteínas
Bibliografía:Biquímica de Harper. Edición 28. Capítulo 4.