producción heteróloga de péptidos antimicrobianos en

Producción heteróloga de péptidos

antimicrobianos en Lactococcus lactis.

Instituto de Productos Lácteos de Asturias

(IPLA-CSIC).

Diego. López. Luelmo

Junio/2017

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En este trabajo vamos a estudiar y poner de manifiesto el uso de microorganismos como factorías celulares, es decir, la producción recombinante de proteínas utilizando como huésped un microorganismo, en este caso serán cepas de Lactococcus lactis, que es una de las bacterias que forman parte de las llamadas bacterias del ácido láctico (BAL). Las proteínas que queremos expresar van a tener actividad antimicrobiana, y en particular una de ellas va a formar parte de un grupo de péptidos antimicrobianos conocido como bacteriocinas, muy utilizadas por ejemplo en la industria alimentaria; la otra proteína va a ser una endolisina, que también va a tener actividad antimicrobiana pero que no es una bacteriocina, aunque el efecto final de ambas será el mismo. Las secuencias génicas que codifican para ambas proteínas se encuentran bajo la acción de un promotor inducible (NICE), es inducible por una bacteriocina llamada nisina (usada como conservante de alimentos). Las proteínas que queremos obtener son las siguientes: una proteína de Streptococcus penumoniae homóloga a la Lactococina 972 y la endolisina del fago MG-3 de Lactococcus lactis.

En el trabajo se pretende tanto dar con las condiciones óptimas de producción de las proteínas así como demostrar su actividad; para esta última parte se utilizarán técnicas como bioensayos y zimogramas.

In this work we will study and highlight the use of microorganisms as cell factories, i.e. the production of recombinant proteins using a microorganism, as a guest in this case will be strains of Lactococcus lactis, which is one of the bacteria that are part of the so called bacteria of lactic acid (LAB). The proteins that we express will have antimicrobial activity, and in particular one of them is going to be part of a group of antimicrobial peptides known as bacteriocins, widely used for example in the food industry; other protein is going to be an endolisin, which is also going to have antimicrobial activity but is not a bacteriocin, although the final effect of both will be the same. The gene sequences that encode for both proteins are found under the action of an inducible promoter (NICE), inducible by a bacteriocin called nisin (used as a preservative in food). Proteins that we get are the following: a protein of Streptococcus penumoniae homologous to the 972 Lactococina and the endolisina of the phage MG-3 of Lactococcus lactis. Labour

intends both to find the optimal conditions for production of proteins as well as demonstrate their activity; for this last part will be used bioassays.

Facultad de Biología. Junio 2017

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Índice:

1. Introducción ........................................................................................................... 4

1.1 L. Lactis como factoría celular ............................................................................. 4

1.2 Péptidos antimicrobianos (bacteriocinas) ............................................................ 4

1.3 Clasificación de las bacteriocinas ........................................................................ 5

1.4 Síntesis y regulación de las bacteriocinas ........................................................... 5

1.5 Método de acción de las bacteriocinas ................................................................ 5

1.6 Espectro de acción de las bacteriocinas .............................................................. 6

1.7 Lactococina 972 .................................................................................................. 6

1.8 Sistema de inducción por Nisina ......................................................................... 7

1.9 Homólogo de la Lactococina 972 en Streptococcus pneumoniae ....................... 8

1.10 Endolisina-MG3 ................................................................................................. 8

1.11 Transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9 ................. 9

2. Objetivos ................................................................................................................... 9

3. Material y métodos .................................................................................................. 10

3.1 Microorganismos, medios y condiciones de cultivo ........................................... 10

3.2 Curvas de crecimiento ....................................................................................... 10

3.3 Electroforesis .................................................................................................... 11

3.4 Tinción de las bandas........................................................................................ 11

3.5 Ensayos en placa de actividad antimicrobiana .................................................. 11

3.6 Extractos para obtener la endolisina MG3 ......................................................... 11

3.7 Zimogramas ...................................................................................................... 12

3.8 Extracción del plásmido (MiniPrep) ................................................................... 12

3.9 Células competentes para la transformación ..................................................... 13

3.10 Transformación ............................................................................................... 13

4. Resultados y discusión ........................................................................................... 14

4.1 Estudio del efecto de la Nisina en las cepas ...................................................... 14

4.2 Ensayos de producción y actividad de la proteína de S. pneumoniae homóloga a

la Lactococina 972 .................................................................................................. 15

4.3 Ensayos de producción y actividad de la endolisina del fago MG-3 ................... 19

4.4 Transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9 ................................. 21

5. Conclusión .............................................................................................................. 22

6. Bibliografía .............................................................................................................. 23


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1. Introducción

1.1 L. Lactis como factoría celular

El trabajo se centrará en la producción heteróloga de proteínas en L. lactis, esta

bacteria es una de las llamadas bacterias del ácido láctico (BAL), a pesar de que se

asocie con productos de este tipo, la bacteria fue aislada originalmente de plantas, en

las que se encontraba en estado de quiescencia y solo era activada en el tracto

intestinal de los rumiantes que ingerían la planta ( Bolotin et al., 2001).

Las BAL son bacterias gram positivas que incluyen, entre otros, los géneros:

Lactococcus, Streptococcus y Lactobacillus, estas bacterias llevan usándose mucho

tiempo como cultivos iniciadores en procesos de fermentación de la leche para obtener

distintos productos lácteos (Alexandrescu et al., 1990).

Gracias al gran desarrollo en las últimas décadas de la tecnología del ADN

recombinante , junto con otras técnicas (como el sistema NICE, del que luego se

hablará), este microorganismo por su fácil manejo y condiciones de cultivo se ha

convertido en una buena "factoría celular", podemos obtener productos de origen

bacteriano, vírico, eucariota. En este trabajo, nos hemos centrado en la producción de

péptidos antimicrobianos o bacteriocinas.

1.2 Péptidos antimicrobianos (bacteriocinas)

El estudio de las bacteriocinas comenzó en los años 20 del pasado siglo,

describiéndose por primera vez en Escherichia coli (Gratia, 1925) y ampliándose

posteriormente a bacterias Gram-positivas (Jacob et al., 1953; Tagg et al., 1976).

Basándose en un estudio sobre colicinas por bacterias Gram-negativas, Tagg et al.

(1976) definieron los péptidos antimicrobianos producidos por los organismos Gram-

positivos, como compuestos proteináceos que inhiben el desarrollo de las bacterias

relacionadas taxonómicamente con la cepa productora.

Posteriormente, Konisky (1982) propuso la siguiente definición: " las bacteriocinas son

compuestos de naturaleza proteica y síntesis ribosomal que inhiben el crecimiento de

otros organismos y no provocan la muerte de la célula productora."

Probablemente las BAL (bacterias del ácido láctico) sean el grupo de bacterias que

producen una mayor cantidad de bacteriocinas. Aunque, como se comentará más

adelante, que sean el grupo con más producción, no significa que su espectro de

acción sea el de mayor interés, por ejemplo a nivel clínico.


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1.3 Clasificación de las bacteriocinas

Clasificación de las bacteriocinas (Nes et al., 1996 y Cleveland et al., 2001):

Clase I o lantibióticos: son péptidos pequeños (<5 KDa) que afectan a la permeabilidad

selectiva de las membranas. Contienen aminoácidos inusuales como la lantionina

metil-lantionina, dehidro-butirina y dehidro-alanina. Se subdividen a su vez en:

lantibióticos de tipo A, forman poros en las membranas y poseen estructuras flexibles

(como la nisina); lantibióticos de tipo B, no se han detectado bacteriocinas de este

grupo producidas por las BAL.

Clase II o no lantibióticos: son péptidos de hasta 10 KDa, termoestables, no presentan

aminoácidos modificados post-traduccionalmente; éstos se subdividen en: clase IIa,

clase IIb y clase IIc.

Clase III: este grupo está formado por proteínas de gran tamaño (>30 KDa),

termolábiles.

1.4 Síntesis y regulación de las bacteriocinas

Los genes que codifican para la producción de bacteriocinas se encuentran

organizados en operones, que se localizan en plásmidos, en transposones (Engelke et

al., 1992) o en el cromosoma bacteriano (Altena et al., 2000; Diep et al., 1996).

La biosíntesis de bacteriocinas depende de una estructura genética compuesta

generalmente por (Nes et al., 1996):

- El gen estructural: que codifica la prebacteriocina, aunque en el caso de

bacteriocinas de dos componentes existen dos genes estructurales.

- El gen de inmunidad: cuyo producto protege frente al efecto antimicrobiano de la

bacteriocina y que generalmente está estrechamente ligado al gen estructural e

incluso forma parte de la misma unidad de transcripción.

- Un gen que codifica para un transportador ABC: que excreta la bacteriocina y cataliza

el procesamiento del péptido señal.

- Un gen que parece codificar para una proteína accesoria: parece ser esencial para la

secreción de la bacteriocina.

1.5 Método de acción de las bacteriocinas

Para aquellas bacteriocinas de BAL cuyo modo de acción se conoce, se ha

demostrado que, dada su naturaleza catiónica e hidrofóbica, éstas interaccionan con la

membrana plasmática de las células sensibles formando poros que anulan su

permeabilidad selectiva (Moll et al., 1999), lo que provoca irremediablemente la muerte

celular. Debido a este tipo de interacción, los principales sistemas de resistencia frente


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a las bacteriocinas se basan en alterar la carga neta de la membrana para dificultar la

interacción de la bacteriocina con ella.

Sin embargo, no todas las bacteriocinas forman poros. Se han descrito otros modos

de acción como la inhibición de la síntesis de peptidoglicano o de la formación del

septo de división (Héchard y Sahl, 2002).

Los lantibióicos tipo A, como la nisina, son capaces de formar poros de forma

transitoria en la membrana celular, provocando la disipación del potencial de

membrana y la pérdida de metabolitos pequeños, como aminoácidos, nucleótidos y

ATP, dando lugar a la detención del metabolismo celular (Brötz et al., 1998; Héchard y

Shal, 2002).

El proceso de formación de poros de las bacteriocinas de la clase II no ha sido tan

exactamente estudiado como el de los lantibióticos. Se sabe que la facultad de estas

bacteriocinas de adoptar una conformación anfipática-helicoidal es uno de los factores

determinantes para la formación de poros (Ennahar et al., 2000).

Por otro lado, estudios realizados con análogos de bacteriocinas han demostrado que

el enantiómero de la leucina A es inactivo biológicamente (Yan et al., 2000), lo cual

indicaría la necesidad de interacciones quirales con una molécula receptora para la

actividad de dicha bacteriocina. Además, la necesidad de un receptor también

explicaría el espectro restringido de estas bacteriocinas.

1.6 Espectro de acción de las bacteriocinas

En general, la acción de las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-positivas

está restringida principalmente a otras especies de Gram-positivas. El rango de

organismos inhibidos por cada bacteriocina varía considerablemente : por ejemplo,

mientras que la nisina es activa frente a especies de una gran variedad de géneros

bacterianos ( Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria y Mycobacterium),

la bacteriocina de clase II, lactococina A, solamente es activa frente a Lactococcus.

El espectro de acción de las bacteriocinas de BAL es poco interesante desde el punto

de vista clínico, ya que ninguna de éstas suele tener un efecto patogénico sobre el ser

humano, por eso se busca e investiga en la producción de otras bacteriocinas más

interesantes desde este punto de vista.

1.7 Lactococina 972

La lactococina 972 es una bacteriocina producida por la cepa Lactococcus lactis

subsp. lactis IPLA 972 (lcn972) (Martínez, 1996), con características muy peculiares

respecto a su estructura y modo de acción. Es un péptido hidrofílico de 66


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aminoácidos biológicos. Es termosensible, activa en un rango de pH comprendido

entre 4,0 y 9,0 y poco susceptible a la acción de proteasas.

La información genética tanto de la producción de la lactococina 972 como de su

inmunidad, se encuentra en un plásmido de 10,9 KDa denominado pBL1. Se

identificaron dos orfs, que codificaban la prebacteriocina (lclA) y una proteína integral

de membrana (lclB) (Martínez et al., 1996).

La producción de lcn 972 es máxima durante la fase exponencial de crecimiento de la

cepa L. lactis IPLA972. Los estudios de los niveles de expresión del ARNm de los

genes lclA y lclB indicaron que ambos genes formaban una única unidad de

transcripción, siendo la abundancia del transcrito proporcional a la velocidad de

acumulación de lactococina 972 en el sobrenadante de los cultivos (Martínez et al.,

1999).

La peculiaridad más destacable de la lactococina 972 reside en su modo de acción

que ha sido parcialmente caracterizado. Esta bacteriocina es bactericida y, en algunos

casos bacteriolítica, para cultivos de Lactococcus en fase exponencial, aunque se

están comenzando a aislar cepas resistentes a su acción. A diferencia de otras

bacteriocinas descritas, lcn 972 no forma poros en la membrana plasmática de las

células sensibles; sino que inhibe la síntesis del peptidoglicano en el septo, afectando

así a un proceso crucial en el ciclo biológico celular como es la división celular.

1.8 Sistema de inducción por Nisina

Se trata del uso de un promotor inducible por la bacteriocina nisina que es muy útil

para la producción heteróloga de proteínas en L.lactis.

El sistema NICE (Nisin controlled expression system), consiste en el promotor

inducible por nisina (Pnis) que es activado por el regulador NisR, que junto a la histidín

quinasa NisK constituye un sistema de dos componentes que detecta la nisina. Por

tanto, una vez que la nisina activa este sistema, se induce la expresión del gen que

haya sido clonado a continuación de Pnis.

Figura 1. Sistema de inducción por

Nisina, en este caso el gen X sería

sprO600 y X su producto proteico

(Hernández de Rojas., 2005).


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1.9 Homólogo de la Lactococina 972 en Streptococcus

pneumoniae

Con la secuenciación de todos los genes involucrados en la síntesis y regulación de

lcn972 se hizo un rastreo de los mapas genéticos de bacterias de interés, fue el caso

de Streptococcus pneumoniae, donde se aisló una secuencia génica con altas

coincidencias respecto a la de la lactococina 972, en un principio se creyó que esta

secuencia podría ser una bacteriocina que por homología a Lcn 972 podría inhibir

específicamente a la misma especie bacteriana, en cuyo caso sí que sería de interés

clínico, ya que este microorganismo es patógeno del ser humano.

Previamente a este trabajo, el gen spr0600 que codifica dicha bacteriocina se introdujo

en el plásmido PNZ8020,dando lugar a la construcción plasmídica pBL9 (Figura 2), la

expresión de esta proteína recombinante está bajo el sistema de expresión NICE, esta

construcción plasmídica se introdujo en L. lactis y se realizaron estudios de inducción

con nisina para la producción heteróloga de esta proteína homóloga a la Lactococina

972.

Figura 2. Plásmido pBL9 (sprO600 es la secuencia del gen que codifica la proteína homóloga a

la Lactococina 972).

1.10 Endolisina-MG3

Las endolisinas son un producto proteico con actividad lítica producido por los

bacteriófagos, que en algunos casos se encuentran integrados en el genoma de las

bacterias como profagos. Confieren gran variabilidad a las especies y cepas que los

tienen, solo cuando están en ciclo lisogénico, es decir, que no inducen la lisis del

huésped.


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Cuando los profagos se activan, entrarían en el ciclo lítico, y provocan la lisis del

huésped en el cual participan las endolisinas, con ayuda de otro tipo de proteínas que

son las holinas.

Las holinas son unas proteínas de pequeño tamaño que se insertan en la membrana

bacteriana formando canales que permiten la salida de las endolisinas al espacio

periplásmico donde atacan al petidoglicano (uno de los principales elementos de la

pared bacteriana), la degradación de la pared bacteriana induce la lisis celular, ya que

la célula queda muy desprotegida frente a gradientes moleculares y aspectos

osmóticos del medio donde se encuentre.

En la cepa L. lactis subsp. cremoris MG1613 se han encontrado los siguientes

profagos (se usa este término cuando el bacteriófago está insertado en el genoma y

sigue un ciclo lisogénico): MG-1, MG-2, MG-3, MG-4, MG-5, t712.

Basándose en la longitud de los profagos se cree que solo MG-3 y t712 son profagos

completos, mientras que el resto son secuencias incompletas (Ventura et al., 2007).

La secuencia del gen que codifica la endolisina del profago MG-3 se clonó en un

plásmido (PUK200), baja el control del sistema NICE y se introdujo en L. lactis, para la

realización de ensayos de producción y comprobar su actividad lítica.

1.11 Transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200

con pBL9

Como experimento complementario a la producción del producto de la secuencia de S.

pneumoniae homóloga a la Lactococina 972, se realizó una transformación con pBL9

de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200, estas dos cepas llevan insertado en su

genoma el operón de la Lactococina 972 junto con los genes necesarios para su

inmunidad.

El plásmido pBL9 solo tiene clonado la secuencia correspondiente a la proteína

homóloga de la Lactococina 972, no se pudo lograr una construcción plasmídica con

los genes de la inmunidad frente a esta proteína.

Nuestro objetivo consistía en comprobar si al producir la proteína de S. pneumonie en

estas cepas se da un mejor rendimiento de producción, en caso de que esta proteína

afectara a Lactococcus, tanto por la forma de producirla o porque el huésped fuera

diana de su acción.

2. Objetivos

El objetivo fundamental de este trabajo es ensayar la producción recombinante de

diferentes proteínas en cepas de L. lactis.


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En primer lugar se procederá a la producción de la proteína de S. pneumoniae, y su

posterior detección mediante electroforesis de las muestras de sobrenadante de los

cultivos.

Después trataremos de producir la endolisina del fago MG-3, y demostrar su actividad

mediante zimogramas donde el microorganismo indicador será Lactococcus.

Por último, se purificará plásmido pBL9 y se transformarán las cepas NZ9000-200 y

NZ9000-400; para hacer una comparación entre este tipo de producción y la

producción en L.lactis.

3. Material y métodos

3.1 Microorganismos, medios y condiciones de cultivo

Las cepas empleadas fueron las siguientes: L. lactis NZ9000 que es una cepa

derivada de L. lactis MG1363, contiene los genes NisK y NisR y es receptora de

pNZ8020 y pNZ8048E (Kuipers et al., 1998); pBL54 que es una cepa derivada de

NZ9000, es una cepa productora de la Lactococina 972 (Hernández de Rojas., 2005).

Plásmidos empleados para transformar NZ9000: MG-3 contiene la secuencia del gen

de la endolisina del fago que lleva el mismo nombre y pBL9 (Figura 2) contiene la

secuencia de la proteína de S,pneumoniae homóloga a la Lactococina 972.

Por último, se realizó la transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ-9000-200 con

el plásmido pBL9.

Las cepas de Lactococcus se propagaron en medio M17 (Oxoid, Baingstoke,

Hampshire, England) suplementado con glucosa al 0.5% y cloranfenicol a una

concentración de 10 µg/mL, a 32ºC y sin agitación. Para el caso de las cepas NZ9000-

400 y NZ9000-200 el antibiótico de selección fue la eritromicina a una concentración

de 5 µg/mL.

Para los bioensayos: mismo medio arriba indicado pero con agarosa al 1.2%.

3.2 Curvas de crecimiento

Se utilizó un espectrofotómetro (Eppendorf), para realizar las medidas puntuales de

densidad óptica (OD, de sus siglas en inglés) a una longitud de onda de 600 nm.

Para los estudios en los que necesitamos una medida de OD a intervalos de tiempo

constantes para construir una curva se utilizó un espectrofotómetro para placas

microtiter de 96 pocillos (Benchmark Plus, BioRad, EEUU), con incubación a 32ºC y

agitación suave antes de cada medida.


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3.3 Electroforesis

Para la detección de nuestras proteínas recombinantes se utilizó la electroforesis

(SDS-page), se usaron geles Acrilamida/Bisacrilamida con tricina y geles de

Acrilamida/Bisacrilamida con glicina; dependiendo del rango de tamaños que

quisiéramos discriminar (el porcentaje utilizado de Acrilamida/Bisacrilamida también

varió debido a este motivo).

Se utilizó el dispositivo MiniProtean de BioRad para realizarlas, a un voltaje constante

de 100 V.

Para las electroforesis de muestras de ADN se usaron geles al 1% de agarosa, se

realizaron también a voltaje constante de 100 V.

3.4 Tinción de las bandas

Para la tinción de las bandas de proteína de los geles se usaron dos métodos: Tinción

Coomassie y PlusOne Silver Staining Kit (GE Healthcare Life Sciences).

Tinción Coomassie: la solución de tinción contiene Azul Brillante Coomassie, ácido

acético, metanol y agua; el gel se deja cubierto por esta disolución unos 20 minutos en

agitación; la solución de desteñido contiene metanol, ácido acético y agua; en esta

última lo dejamos toda la noche sin agitación.

PlusOne Silver Staining Kit: fixing solution (40% etanol, 10% ácido acético) durante 30

minutos, sensitizing solution (30% etanol, 4% tiosulfato de sodio, 6,8% acetato de

sodio y 0.5% glutaraldehído) durante 30 minutos, silver reaction (10% nitrato de plata,

0.04% formaldehído) durante 20 minutos, developing solution (2.5% carbonato de

sodio, 0.08% formaldehído) y stop solution (1.5% EDTA-Na2●2H2O) durante 10

minutos.

Una vez desteñidos, los geles se escanearon con el programa LabScan y el equipo de

Amersham Biosciences.

3.5 Ensayos en placa de actividad antimicrobiana

Se inocula al 2% en profundidad la cepa indicadora (NZ9000) en 100 mL de medio

M17 con 1.2% de agar y se plaquea, se realizan pocillos en las placas y se introducen

20µl del agente antimicrobiano a ensayar, se pone a incubar toda la noche a 32ºC.

3.6 Extractos para obtener la endolisina MG3

Esta endolisina, como se ha comentado en la introducción, necesita de otra proteína

(la holina) para atravesar la membrana plasmática, por tanto, una vez producida por la

inducción del sistema NICE con nisina va a quedar en el citoplasma de la bacteria

huésped (NZ9000).


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Para poder "rescatarla" debemos romper la pared celular de Lactococcus, y para ello

se siguió el protocolo que se detalla a continuación.

Se inoculan 50 mL de M17, con glucosa y cloranfenicol, al 2% con un cultivo overnight

de la cepa MG3. Seguir la OD hasta un valor de 0.5, que será el más apto para la

inducción con nisina (una concentración entre 1-2 ng/mL) y que la cepa empiece a

producir la endolisina. Al cabo de 1 hora anotamos la OD del cultivo.

Centrifugamos en alícuotas de 10 mL a 3000 rpm durante 10 minutos, resuspendemos

cada alícuota en 1 mL de sacarosa al 25%. Mantenemos en hielo.

Se centrifuga 1 minuto a 14000 rpm y se resuspende en una disolución de sacarosa al

25% con una concentración de lisozima de 30 mg/mL; incubar 30 minutos a 37ºC.

Centrifugamos 1 minuto a 10000 rpm, resuspendemos en un volumen de buffer de

carga para la electroforesis atendiendo a este factor 0,025 unidades de O.D/µl LB

(buffer de carga) x 1. Hervimos las muestras a 100ºC durante 10 minutos (SDS-page).

3.7 Zimogramas

Este tipo de ensayo se realizó para poder poner de manifiesto la actividad de la

endolisina, para ello a los geles de acrilamida/bisacrilamida se les añade un 4% de

una suspensión de células de Lactococcus autoclavadas; el gel adquiere un aspecto

turbio debido a la presencia de las células. Una vez realizada la electroforesis se

incuba el gel en una disolución que permita la renaturalización de nuestra endolisina y

así poner de manifiesto su actividad, debemos renaturalizar ya que la electroforesis se

realiza en condiciones desnaturalizantes.

Los zimogramas se renaturalizaron siguiendo el siguiente protocolo: lavar los geles

con agua destilada en agitación durante 30 minutos, para añadirles después el buffer

de renaturalización (50 mM de MES, ácido 2-morfolinoetanosulfónico, 0.1% Tritón X-

100, pH 6), se incuban con la disolución a 37ºC en agitación durante toda la noche

(Jayaswal et al., 1990).

3.8 Extracción del plásmido (MiniPrep)

Para extraer y aislar el plásmido pBL9 de un cultivo en medio líquido, se utilizó High

pure plasmid isolation kit de Roche.

El kit está diseñado para extraer y purificar plásmidos de E.coli, de modo que se tuvo

que realizar un paso previo de digestión de la pared celular incubando con una

disolución 30 mg/ml de lisozima durante 1 hora a 37ºC.


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3.9 Células competentes para la transformación

Ya que el laboratorio no disponía de células competentes de NZ9000-400 y NZ9000-

200 para realizar una transformación (la transformación se realizó por electroporación),

se siguió el protocolo que se detalla a continuación para obtenerlas.

Para este protocolo se necesita medio M17 con glucosa al 0.5% y glicina al 1%, se

inoculan 50 mL de este medio al 10% con cultivos overnight de las cepas. Se dejan

crecer durante 2,5 horas a 32ºC , tras ello se ponen en hielo durante 10 minutos. Se

centrifugan las células a 3000 g durante 10 minutos y se resuspenden en 10 mL de

tampón de lavado (0.5 M sacarosa, 10% glicerol), se repite el mismo paso otras dos

veces, por último se resuspenden en 0,67 mL de tampón de lavado y se hacen

alícuotas de 40 µl. Estas alícuotas las almacenamos a -80ºC en nitrógeno líquido.

3.10 Transformación

Para la transformación de las células competentes obtenidas con pBL9 se realizó una

electroporación, este método tiene una alta mortalidad pero una gran eficiencia. El

electroporador usado es el Gene Pulser XCell de BioRad, los parámetros de la

electroporación fueron: 2000 Voltios, 25 Faradios, 200 Ohmios.


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4. Resultados y discusión

4.1 Estudio del efecto de la Nisina en las cepas

Lo primero que se hizo fue estudiar el efecto de distintas concentraciones de Nisina

sobre las cepas de trabajo. Se ensayaron distintas concentraciones que se detallan a

continuación.

Figura 3. Curvas de crecimiento de las cepas en presencia de Nisina, estudio del efecto de

distintas concentraciones de Nisina en NZ9000, e inducción a distintas concentraciones de

nisina de pMG3, pBL54 y pBL9.

En NZ9000 solo apreciamos un notable descenso en la curva de crecimiento a la

concentración más alta de nisina (5ng/mL). Respecto a la inducción de pBL9 vemos

una fuerte caída del crecimiento a todas las concentraciones de nisina, esto quiere

decir que el producto de pBL9 le está resultando tóxico a la célula o que la forma de

producirlo le resulta perjudicial para su crecimiento. Para pMG3 ocurre algo similar a

pBL9, y por último en el caso de pBL54 también vemos un efecto negativo en el

crecimiento al inducir la síntesis de la Lactococina 972, este efecto no debería ser tan


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acusado ya que en esta cepa se encuentran presentes los genes de resistencia a la

Lactococina 972.

4.2 Ensayos de producción y actividad de la proteína de S.

pneumoniae homóloga a la Lactococina 972

Los productos de pBL54 (Lactococina 972) y de pBL9 (proteína homóloga a la

Lactococina 972), se secretan al medio extracelular, por tanto podemos ver si tienen o

no actividad ensayando la actividad de los sobrenadantes de los cultivos inducidos a

diferentes concentraciones de nisina (sobrenadantes procedentes de los cultivos

utilizados para las curvas de crecimiento de la Figura 3).

Figura 4. Para este bioensayo se usó como cepa indicadora NZ9000, los números hacen

referencia a las concentraciones de nisina empleadas en la inducción de pBL54 y pBL9

respectivamente, también se usaron los sobrenadantes de NZ9000 con las mismas

concentraciones de nisina como control negativo del ensayo.

Solo se aprecian halos de inhibición para los sobrenadantes del cultivo de pBL54

donde se está expresando la Lactococina 972, que es fuertemente activa frente a

Lactococcus. La actividad del producto de pBL9 no se puede demostrar con este tipo

de experimentos.

Al no poder demostrar la actividad del producto de pBL9 en este tipo de ensayos en

medio sólido, se realizaron ensayos de actividad de los sobrenadantes en medio

líquido, es decir, añadiendo a cultivos de la cepa indicadora NZ9000 en fase

exponencial (O.D=0.5) los sobrenadantes de las inducciones de las cepas pBL9 y

pBL54, usando los sobrenadantes de NZ9000 como control.


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Figura 5. Ensayo de actividad de los sobrenadantes de pBL9 y pBL54 (control positivo), usando

como cepa indicadora NZ9000, se usa como control negativo los sobrenadantes de los cultivos

de NZ9000 con las mismas concentraciones de nisina empleadas en la inducción de pBL9 y

pBL54.

Se observa que en los sobrenadantes de NZ9000 (control negativo) solo afecta al

crecimiento el que tiene una concentración mayor de nisina (5 ng/mL), aspecto que ya

quedó demostrado en las curvas de crecimiento de la figura 3. La actividad de la

lactococina 972 se aprecia claramente comparando la bajada de los cultivos con

sobrenadante obtenido tras la inducción de pBL54 con nisina frente al cultivo con

sobrenadante de un cultivo no inducido de pBL54. Por otra parte, vemos que la

actividad del producto de pBL9 tampoco se detectó en este tipo de ensayo, vemos que

solo afecta al crecimiento de NZ9000 los sobrenadantes de la inducción con 5 ng/mL

de Nisina, y es debido a ella misma. Los principales motivos por los que no se puede

poner de manifiesto la actividad de la proteína homóloga son los siguientes: no está

siendo secretada, no se produce en suficiente cantidad para apreciar su actividad en

este tipo de ensayo, no se produce de forma activa, L. lactis no es diana de su acción.

No pudiendo demostrar la actividad del producto de pBL9 sobre Lactococcus, se

procedió a demostrar que efectivamente se estaba produciendo aunque no


17

pudiéramos ver su actividad, la proteína de S. pnemoniae homóloga de la Lactococina

972 tiene un tamaño esperado de unos 8.8 KDa.

Figura 6. Gel de Acrilamida /Bisacrilamida con tricina y teñido con nitrato de plata de las

muestras de sobrenadantes. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: P54 (pBL54),

P9 (pBL9), NZ (NZ9000); y los números se refieren a la concentración de nisina (ng/mL) con

que han sido inducidos los cultivos. Las muestras de sobrenadante de pBL9 han sido

concentrados 10 veces con acetona.

Se ha utilizado en el gel un marcador, cuyos tamaños se detallan en la imagen, y

además una muestra de sobrenadante de un cultivo de pBL54 inducido con 0.3 ng/mL

de nisina, nos servirá de referencia también porque el tamaño de su proteína

homóloga no difiere mucho.

En este gel no se puede observar la producción de nuestra proteína ya que el intenso

bandeo de las calles indica que se produjo lisis celular desde las concentraciones más

bajas de nisina empleadas (0.15 ng/mL), esto nos impediría ver la banda de nuestra

proteína, en caso de que se estuviera produciendo.

Debido a estos resultados, se probó a inducir pBL9 con concentraciones más bajas de

nisina y ver si se podía evitar la lisis celular para poder obtener sobrenadantes limpios

y demostrar que nuestra proteína es producida y secretada al medio extracelular.


18

Una vez realizado este ensayo de inducción a concentraciones más bajas de 0.15

ng/mL de nisina se corrieron en un gel las muestras de sobrenadantes

correspondientes (Figuras 7 y 8).

Figura 7. Curvas de crecimiento de los cultivos de pBL9 inducidos a concentraciones de nisina

desde 0.0024 ng/mL , se crecen cultivos de NZ9000 con las mismas concentraciones de nisina

como control.


muestras de sobrenadantes. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: P9 (pBL9), NZ

(NZ9000); y los números se refieren a la concentración de nisina (ng/mL) con que han sido

inducidos los cultivos.


19

Respecto a las curvas de crecimiento vemos que la inducción/producción de la

proteína homóloga no resulta ser tan tóxica; en el gel en las calles 5, 7 y 9 podemos

ver una banda entorno a los 9 KDa que además se va intensificando según aumenta la

concentración de nisina, en las calles 4, 6 y 8 vemos ausencia de esa banda; lo que

significa que tiene que ser el producto de la inducción de pBL9, por tanto, nuestra

proteína homóloga si está siendo producida; por tanto, hemos podido demostrar que la

proteína de S. pnemoniae homóloga a la Lactococina 972 está siendo producida

cuando las concentraciones de nisina empleadas en la inducción son de: 0.039 ng/mL,

0.078 ng/mL y 0.15 ng/mL.

4.3 Ensayos de producción y actividad de la endolisina del fago

MG-3

Para producir la endolisina, además de inducir el cultivo de pMG3 con nisina debemos

realizar extractos celulares (Apartado 3.6), ya que la endolisina por sí misma, como se

explicó en la introducción, no puede secretarse al medio.

En el apartado 4.1 ya hemos visto como le afecta la inducción con nisina al cultivo de

pMG3, y vemos que la bajada de las curvas de crecimiento es bastante notable a

todas las concentraciones de nisina salvo a la más baja que es de 0.15 ng/mL, ya que

para una producción eficiente nos interesa que haya la suficiente cantidad de células

produciendo nuestra endolisina, para que obtengamos unas concentraciones de

proteína que podamos verificar en un gel, de este modo, la inducción se realizó a 0.15

ng/mL de nisina, se indujo el cultivo de pMG3 en fase exponencial (O.D=0.5) a esa

concentración de nisina, se recogieron muestras a la hora y a las dos horas de la

inducción; el mismo protocolo se le aplicó a un cultivo de NZ9000 para disponer de un

control negativo. El tamaño de nuestra endolisina es de unos 31,8 KDa.

Para demostrar la actividad de nuestra endolisina, paralelamente al gel se realizó un

zimograma, en el que vamos a renaturalizar la endolisina con el tampón MES (

Apartado 3.7).

Los resultados de ambos ensayos se exponen a continuación en las figuras 9 y 10.


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muestras de extractos de pMG3. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: M3

(pMG3), NZ (NZ9000); y los números se refieren al tiempo en horas tras la inducción con 0.15

ng/mL de nisina.

Figura 10. Zimograma con las muestras de los extractos de pMG3 y NZ9000 (control negativo),

tras 1 y 2 horas de inducción con 0.15 ng/mL de nisina. Renaturalizado con el tampón MES. La

autolisina es una proteína de L.lactis que es secretada al medio y es capaz de digerir el

peptidoglicano, la lisozima se encuentra en los extractos porque se usa para digerir la pared de

petidoglicano, debido a esto ambas son controles positivos de los zimogramas.


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Como podemos ver en la Figura 9 tenemos una banda adicional en las muestras de

pMG3 que no tenemos en las de NZ9000, que es nuestro control negativo, por tanto la

endolisina sí se ha producido como demuestra el gel. Sin embargo la actividad de la

endolisina no ha podido demostrarse ya que no se ve nada a la altura del tamaño

esperado de la endolisina en el zimograma, bien porque no sean sus condiciones

óptimas de renaturalización (también se ensayó un tampón de acetato de sodio a pH

5.2, no se revelaron ni los controles positivos) o porque el péptido que se sintetiza

carece de actividad.

4.4 Transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9

Como se comentó en la introducción, la última parte de este trabajo será la

transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con el plásmido pBL9 (contiene la

secuencia de la proteína homóloga a la Lactococina 972); con ello queremos ver en

las curvas de crecimiento si la inducción/producción de pBL9 en estas cepas no

resulta tan tóxica para el huésped como ocurría en NZ9000 transformado con pBL9

(pBL9). Al ser proteínas homólogas se podría pensar que comparten alguna de las

rutas del sistema de inmunidad, las cepas que vamos a transformar tienen insertado

en su genoma no solo la secuencia del gen de la Lactococina 972 sino también los del

sistema de inmunidad a la misma. Tras la transformación (Apartado 3.10) de las

células competentes (Apartado 3.9) de ambas cepas, se realizó una MiniPrep

(Apartado 3.8) para correr un gel de agarosa al 1% y asegurarnos que el plásmido

estaba presente en las colonias seleccionadas con cloranfenicol (resistencia de pBL9).

Figura 11. Curvas de crecimiento de las cepas en presencia de Nisina, estudio del efecto de

distintas concentraciones de Nisina en NZ9000 (control), e inducción a distintas

concentraciones de nisina de pBL9, NZ9000-400 y NZ9000-200 transformadas con pBL9.


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A la vista de los resultados de las curvas de crecimiento no podríamos concluir que la

producción de la proteína homóloga fuera mejor en estas cepas transformadas. Ya

que apenas se produce cambio notable en el crecimiento entre unas y otras.

5. Conclusión

Con este trabajo se ha puesto de manifiesto la gran utilidad, presente y futura, que

tiene el uso de microorganismos como "factorías celulares." Se ha conseguido

demostrar que Lactococcus lactis es apto para la producción de las siguientes

proteínas: la proteína de Streptococcus pneumoniae homóloga a la Lactococina 972 y

la endolisina del fago MG-3; ambas han sido detectadas mediante electroforesis; con

los recursos y las técnicas empleadas no se ha podido poner de manifiesto su

actividad. En el caso del producto de pBL9 solo se ha enfrentado con Lactococcus

lactis pudiendo no ser éste su diana de acción específica, y aunque lo fuera tampoco

podemos asegurar que el péptido se produce en suficiente cantidad como para que

sea notable su efecto; tampoco podemos afirmar que el péptido producido tenga la

conformación y el plegamiento adecuado para poder ser funcional.

En el caso de la endolisina de MG-3 tampoco hemos podido poner de manifiesto su

actividad, por motivos similares a los de pBL9, con la diferencia de que aquí sí

sabemos que nuestra proteína actúa contra Lactococcus lactis, en el caso de los

zimogramas se deberían ensayar distintas condiciones de renaturalización, antes de

descartar que esta endolisina no fuera activa.


23

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