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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA, UNAM
SEMANA ACADEMICA DICIEMBRE 2014 RESÚMENES
Lunes 8 de Diciembre 9:30 Plática Inaugural Dr. José Sarukán “Biodiversidad y Soberanía alimentaria” Las poblaciones humanas han dependido desde su presencia en este Planeta de lo que ahora llamamos biodiversidad: plantas y animales para su subsistencia y bienestar. La mayor parte del esfuerzo científico global para conocer, catalogar y entender esa diversidad biológica en las últimas décadas y específicamente a partir del establecimiento del Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB) se ha enfocado sobre lo que podríamos llamar como la “biodiversidad silvestre”. La atención y el estudio sistemático dedicados a los componentes de la biodiversidad de los cuales la humanidad depende para su alimentación, salud y bienestar, han sido escasos, muy centrados a algunos grupos o subgrupos de especies incluso desde el punto de vista agrícola, pecuario o de pesquerías. Confrontados por la impredecibilidad de los efectos que los cambios ambientales globales pueden tener sobre la disponibilidad de estos recursos esenciales para nuestra subsistencia, parece crecientemente imperativo el conocer y entender de manera mucho más integral los potenciales y limitaciones de la diversidad biológica manejada por la humanidad así como la forma en que producimos esos bienes ahora y en especial para las generaciones futuras. 10:55 Dra. Claudia Treviño “Canales iónicos del espermatozoide…………volver a empezar?” La fertilización es un proceso biológico fundamental que produce un individuo nuevo y único, permitiendo la preservación de las especies y la evolución mediante la reproducción sexual. La interacción y el diálogo molecular establecidos entre los gametos masculinos y femeninos son materia bajo intenso estudio. Los espermatozoides están singularmente equipados para alcanzar, reconocer y fusionarse con el óvulo. Para realizar estas tareas, los espermatozoides deben estar preparados para enfrentar un entorno en constante cambio, y para sobrellevar varias barreras físicas. Dado que básicamente son células silenciosas transcripcional y traduccionalmente, los espermatozoides dependen profundamente de diversos mecanismos de señalización para nadar de manera dirigida, y para ajustarse a condiciones ambientales desafiantes. La señalización mediada por iones y segundos mensajeros es entonces particularmente importante en los espermatozoides. Cambios en el potencial de membrana, el calcio y el pH intracelular (pHi) regulan las funciones del espermatozoide que le permiten fecundar al ovulo. Los modelos que pretenden explicar el funcionamiento del espermatozoide durante la fecundación, han surgido principalmente de información derivada de experimentación con modelos como el ratón. Sin embargo, a pesar de que muchas de las funciones pueden ser parecidas entre especies y la extrapolación de resultados ha sido útil, es importante explorar directamente, dentro de lo posible, en el modelo de estudio de interés. Particularmente porque en años recientes se ha comprobado que hay diferencias muy importantes en el funcionamiento del espermatozoide de ratón con respecto a otras especies. En concordancia con esto, nuestros esfuerzos actualmente se enfocan en abordar algunas de las controversias y la ruptura de paradigmas que recientemente han surgido en el campo de la fisiología del espermatozoide. Por esto, es necesario re-‐explorar muchos de los aspectos que se creían resueltos, y a su vez tomar en
cuenta las diferencias que puede haber entre especies, por ejemplo se ha explorado pobremente en el espermatozoide de humano los cambios de potencial de membrana que ocurren durante la capacitación que está bien definidos para el caso del espermatozoide ratón. En este período demostramos que ocurre una hiperpolarización de la membrana durante la capacitación en espermatozoides de humano y propusimos que esta mediada por los canales de potasio Slo1 y Slo3. Ahora estamos explorando cuál es la función de esta hiperpolarización y como se relaciona con los cambios de pHi que también ocurren durante la capacitación. Por otro lado, reportamos que el espermatozoide de humano responde con un incremento de calcio intracelular tras la adición del segundo mensajero NAADP y que esta célula cuenta con la actividad enzimática para sintetizarlo. 11:30 Dra. Gloria Saab “Cambiando la especificidad de reacción de glicosil-‐hidrolasas” El objetivo central de nuestro laboratorio es poder entender la relación entre la secuencia de aminoácidos, su estructura y su función. Existen proyectos que tratan de abordar estos temas desde una perspectiva de ciencia básica y otros en los que intentamos aplicar los principios aprendidos para generar variantes que tengan un potencial de aplicación. Dentro de los primeros mencionados, se encuentra el proyecto de identificación de subunidades de plegamiento en proteínas con plegamiento de barril TIM y el estudio de determinantes estructurales en la formación de fibras amiloidogénicas en la triosa fosfato isomerasa de humano, proyectos de los que sólo hablaré brevemente. En esta ocasión, mi plática se enfocará principalmente en los resultados obtenidos en el proyecto de uso de α-‐amilasa para la obtención de productos de alto valor agregado. En este proyecto estamos utilizando diferentes estrategias para cambiar la especificidad de reacción de la α-‐amilasa de Thermotoga maritima. Uno de los intereses de nuestro laboratorio desde hace tiempo es la producción de alquil-‐glucósidos a partir de almidón. Los alquil-‐glucósidos se utilizan como agentes tensoactivos en las industrias de alimentos, farmacéutica y de cosméticos por su baja toxicidad y alta estabilidad. Sin embargo, su producción por síntesis química, requiere de varios pasos de protección y desprotección de los grupos hidroxilo que merman el rendimiento de la reacción. Su síntesis a partir de biocatalizadores, resulta así muy atractiva dada la alta enantio, estéreo y regio selectividad que presentan las enzimas. Aunque una transferasa sería la enzima que naturalmente catalice esta reacción, éstas utilizan azúcares activados con grupos fosfatos cuya liberación aporta la energía necesaria para la formación del nuevo enlace entre el azúcar y el alcohol. Sin embargo, la producción de estos azúcares activados puede ser tan costosa como los alquil glucósidos que se desean producir. Como alternativa, desde hace varios años en nuestro laboratorio hemos investigado la insipiente capacidad de realizar reacciones de transferencia de algunas alfa-‐amilasas. La ventaja de estas enzimas es que utilizan almidón como sustrato, un material abundante en la naturaleza y de bajo costo. Hemos explorado diferentes alfa-‐amilasas y por su alta actividad trasnglicosídica y alta estabilidad no sólo a temperatura, sino también a alcoholes, nos hemos enfocado en la de Thermotoga maritima. La estrategia más exitosa para favorecer una reacción sobre la otra es aumentar la concentración del reactivo que da lugar al producto de interés (alcohol) disminuyendo a su vez, el de la reacción que se quiere evitar (agua). Sin embargo, la concentración de alcohol que podemos utilizar en el medio de reacción está limitada por su solubilidad en medios acuosos y por la estabilidad de la enzima en presencia de alcoholes. Alternativamente también es deseable aumentar la actividad transglicosídica de la enzima. Nuestros esfuerzos en estos dos años se han canalizado, por un lado, a tratar de aumentar la actividad transglicosídica y estabilidad a alcoholes de esta enzima mediante mutagénesis, y por el otro, a diseñar medios de reacción que permitan aumentar la concentración de alcohol manteniendo una sola fase. En el primer caso hemos utilizado enfoques basados en bioinformática, así como evolución dirigida y que están en proceso. En el segundo caso hemos incursionado en el área de la ingeniería de solventes para aumentar la solubilidad de
alcohol en el medio de reacción y disminuir a su vez la de agua. Hasta el momento, hemos llegado al límite de la estabilidad de la enzima y se ha logrado incrementar en un 25 % el rendimiento de las reacciones de alcohólisis, pero más importante, se ha logrado aumentar tres veces la selectividad de la reacción de alcohólisis sobre la de hidrólisis. Los esfuerzos futuros estarán enfocados a combinar estas tres estrategias para aumentar aún más el rendimiento de las reacciones de alcohólisis. 12:05 Dra. Yvonne Rosenstein El trabajo de nuestro grupo se reparte en dos grandes temas: 1.-‐ “Entender los procesos a través de los cuales CD43 participa en la percepción que tienen distintas células de su entorno” y 2.-‐ “Identificación de péptidos antimicrobianos con funciones inmunoreguladoras”. 1.-‐ La molécula CD43 es una mucina transmembranal expresada por las células del sistema inmune, aunque recientemente varios estudios documentan la expresión de CD43 en riñón, cerebro e intestino y en ciertos tumores no linfoides. CD43 es una proteína multifuncional que regula las interacciones célula-‐célula, proporcionando señales que modulan distintas facetas de la vida celular.
Nuestro interés general es entender los procesos a través de los cuales CD43 participa en la percepción que tiene una célula de su medio ambiente y como traduce esta percepción en señales intracelulares que impactaran la respuesta celular. Durante el periodo 2013-‐2014, hemos abordado este punto en células linfoides de distintas estirpes (linfocitos T, macrófagos, y neutrófilos) en distintos escenarios de activación, así como en células tumorales no linfoides CD43+. Reportamos que a través de CD43, las células polimorfonucleares responden a las señales quimioatractantes de Gal-‐1, siendo este reporte el primero en que se asocia una función a uno de los múltiples ligndos de CD43.
El hecho que CD43 sea específicamente reconocido por múltiples agentes patógenos tales como el virus de la influenza A en células polimorfonucleares, y M. tuberculosis en macrófagos coloca a CD43 en la categoría de la moléculas que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos, las cuales no solo son los blancos de los patógenos sino que también regulan la inmunidad. En macrófagos, hemos caracterizado el impacto de la interacción de CD43 con dos de sus ligandos microbianos, las chaperonas de M. tuberculosis DnaK y Cpn60.2, en la regulación del balance entre citocinas pro-‐ y anti-‐inflamatorias, del cual depende la evolución de la infección con este importante patógeno. Con este trabajo, se asocia por segunda vez, una función a dos ligandos de CD43, en este caso, ligandos derivados de agentes patógenos.
En linfocitos T, las señales proporcionadas por CD43 participan en el proceso de diferenciación celular. Con la finalidad de profundizar nuestro conocimiento de las vías de señalización reclutadas por CD43, realizamos un estudio proteómico que resalto la participación de la piruvato cinasa (PKM2), una de las enzimas limitantes en la vía de la glicolisis. Sin embargo, la actividad glicolitica de la enzima no aumenta en respuesta a las señales combinadas de CD43 y del receptor para el antígeno (TCR). En cambio, a través de sus funciones alternas como cinasa de proteínas, PKM2 recluta a STAT3, activando la vía de MEK5/ERK5 y propiciando la localización nuclear de c-‐MYC, NFkB y CREB, así como la degradación de BAD, una proteína pro-‐apoptótica. En conjunto estas señales favorecen la sobrevida, lo cual concuerda con el hecho que las mismas señales llevan a un aumento en la expresión del transportador de glucosa Glut1 en la membrana de los linfocitos y prepara a los linfocitos para iniciar los procesos de diferenciación, para los cuales la
expresión de receptores para citocinas como IFNg e IL-‐4 propiciada también por las señales de CD43, es indispensable .
El efecto de la temporalidad sobre la calidad de las respuestas celulares es poco estudiado. Para abordar este punto nos preguntamos si el orden con el que una célula percibe las señales proporcionadas por el TCR y por moléculas accesorias, como son CD43 y CD28, repercute en los patrones de expresión de un panel de 42 citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. Encontramos que si las señales de CD43 o de CD28 anteceden o son simultaneas con las del TCR se inducen señales intracelulares que favorecen la expresión de las 42 proteínas del panel en mayor o menor grado; no así cuando las señales del TCR anteceden las de CD28 o CD43. Esto comprueba una vez mas que durante la activación antígeno-‐especifica de un linfocito T, es indispensable al combinación de las señales del TCR y de las moléculas accesorias, pero además indica que según el orden en el que los linfocitos perciben las señales del TCR y de las moléculas accesorias, las señales que se generan en el interior de la célula son claramente distintas, lo cual a su vez se traduce en un programa de diferenciación diferente. Con los resultados del proyecto ENCODE y la base de datos PATCH TRANSFAC, analizamos los factores de transcripción que regulan la transcripción de las 42 proteínas del panel. Encontramos que los patrones de expresión definidos por el orden en el que los linfocitos T perciben las señales de CD43/CD28 y el TCR e identificados a nivel de proteína, se asocian con el uso preferencial de ciertos factores de transcripción, lo cual sugiere que el reclutamiento de laos factores de transcripción pudiera estar regulado por vías de señalización comunes.
Por otra parte, en células tumorales no linfoides, los experimentos de ganancia y perdida de función de CD43 indican que las señales proporcionadas por CD43 cooperan con las de protooncogenes y oncogenes como EGFR y la proteína E6 del virus del papiloma para promover transformación celular, promoviendo, como en linfocitos T, la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas y de factores de crecimiento como VEGF. Así mismo, participa en la transformación celular bloqueando los mecanismos de inhibición por contacto al promover la fosforilación de Merlina, lo que a su vez favorece la translocación al núcleo de YAP, y la subsecuente activación de sus genes blanco. Estos resultados sugieren que la expresión de CD43 en tumores de origen no linfoide favorece proliferación, migración, sobrevida y remodelamiento del microambiente tumoral.
En conjunto, estos resultados establecen nuevas funciones y nuevos efectores para la mucina CD43 tanto en células linfoides como tumorales, los cuales podrían ser blancos terapéuticos para manipular la respuesta inmune y para combatir con mayor éxito tumores que son CD43+.
2.-‐ De una manera tradicional el termino “péptidos antimicrobianos” se refiere a péptidos que se caracterizan por tener una actividad antibiótica y antifúngica. Sin embargo, estos péptidos tienen además la capacidad de regular la respuesta inmune (innata y adaptativa) a distintos niveles. Desde hace varios años, nuestro laboratorio se intereso por identificar nuevos péptidos antimicrobianos a partir de la secreción cutánea de anfibios mexicanos, en particular de la rana de árbol Pachymedusa dacnicolor, una especie endémica de Morelos. Hemos identificado péptidos que regulan de manera positiva la migración direccional de monocitos, linfocitos T y células polimorfonucleares, así como péptidos que promueven apoptosis de poblaciones particulares de células linfoides o bien de células tumorales. Estamos interesados en producir algunos de estos péptidos como proteínas recombinantes para poder realizar un análisis estructura/función mas
detallado, pues pensamos que estas moléculas pueden ser usadas como moléculas inmunoreguladoras. 12:20 M.en C. Carmen Quinto “PvRbohB, un gen que codifica una NADPH oxidasa en frijol, regula positivamente la infección por rizobia y negativamente, la colonización por hongos edomicorrízicos arbusculares” Carmen Quinto, Manoj-‐Kumar Arthikala, Jesús Montiel, Rosana Sánchez–López, Luis Cárdenas, Noreide Nava y Olivia Santana Las NADPH oxidasas fueron descritas por primera vez, en células fagocíticas humanas, en donde promueven la muerte de patógenos mediante la generación de especies de oxígeno reactivas (EORs) (Bedard et al., 2007). En plantas se les denomina Respiratory Burst Oxidase Homologs (RBOHs,) y participan en numerosos procesos de señalización celular, tales como la apertura y cerrado de los estomas, en la inmunidad innata y en la regulación de muerte celular, entre otros. En Phaseolus vulgaris, identificamos nueve genes Rbohs, a los que llamamos PvRbohA-‐PvRbohI. Los transcritos de estos genes se acumulan diferencialmente en distintos órganos de planta y tejidos de la raíz. El transcrito PvRbohB se acumula preferencialmente en tallos, raíces y nódulos (Montiel, et al., 2012). Con el objetivo de analizar el papel de este gen en la simbiosis frijol-‐rizobia (Rhizobium tropici) y frijol-‐hongo entomicorrízico arbuscular (Rhizophagus irregularis), llevamos a cabo experimentos de genética reversa en raíces transgénicas de plantas compuestas. Como consecuencia de la pérdida de función de PvRbohB la producción de EORs disminuye y el avance del hilo de infección se detiene a nivel del pelo radical, sin embargo la colonización por hongos endomicorrízicos incrementa en las raíces de P. vulgaris (Montiel, et al., 2012; Arthikala, et al., 2013). Por otro lado, al sobre-‐expresar el gen PvRbohB, observamos en las raíces transgénicas de frijol, un aumento significativo tanto en las EORs generadas, como en la formación de los hilos de infección, en la biomasa del nódulo, en la actividad de fijación de nitrógeno y en el número de bacteroides dentro de los simbiosiomas. En contraste la colonización por el hongo micorrízico arbuscular, disminuye (Arthikala, et al., 2014). En base a estos datos, proponemos que PvRbohB funciona como un regulador positivo y negativo en la simbiosis con R. tropici y con R. irregularis, respectivamente. Actualmente estamos llevando a cabo el análisis funcional de los PvRbohA, PvRbohC y PvRbohD, cuyos transcritos también se acumulan en las raíces y los nódulos de frijol. En el caso de PvRbohC, los datos que tenemos de genética reversa, no indican que dicho gen tenga aparentemente un papel importante en la simbiosis con frijol. -‐Arthikala, et al., (2013) PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiology, 54:1391-‐1402 -‐Arthikala, et al., (2014) RbohB, a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytologist, 202:886-‐900 -‐Bedard, et al., (2007) NOX family NADPH oxidases: not just in mammals. Biochimie, 89:1107-‐1112. -‐Montiel, et al., (2012) A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by rhizobia. Plant Cell Physiol, 53:1752-‐1767 12:55 Dra. Alejandra Bravo. “Resistencia en insectos al efecto de las toxinas Cry insecticidas” En esta platica se presentara un reporte de las actividades realizadas en las diferentes estancias de investigación realizadas durante el presente año, las cuales estuvieron enfocadas al análisis de resistencia de insectos al efecto de las toxinas Cry producidas por Bacillus thuringiensis. Además presentaré últimos avances en el estudio de las toxinas Cyt las cuales presentan un mecanismo de
acción diferente y representan una estrategia para control de insectos resistentes a toxinas Cry. La utilización de las toxinas Cry en el control de insectos plaga en agricultura se ha incrementado notablemente en los últimos años debido al uso de plantas genéticamente modificadas que expresan estas toxinas, llamadas cultivos Bt. Esto ha resultado en incrementos en la productividad, disminución en el uso de pesticidas químicos y en generar un medio ambiente mas sano (1, 2). Diferentes poblaciones de insectos resistentes a las toxinas Cry1A se han seleccionado en condiciones de laboratorio o en campos de cultivos Bt. El desarrollo de insectos resistentes a las toxinas Cry es la principal amenaza de esta tecnología. En Brasil se ha presentado un problema muy serio de resistencia a toxinas Cry1F y Cry1A en insectos plaga de maíz y algodón. Se presentará la problemática y el posible mecanismo de resistencia en Spodoptera frugiperda. También el análisis de toxicidad de las toxinas Cry1AMod las cuales demostraron ser efectivas contra estos insectos resistentes, así como contra los sensibles, por lo que representan una alternativa para el control de resistencia de esta plaga. Las toxinas Cry1AMod, desarrolladas por nuestro grupo, son capaces de oligomerizar en ausencia de receptores y de matar a poblaciones de insectos resistentes afectados en diferentes receptores, lo cual indica que la oligomerización es un paso importante en el mecanismo de acción de estas proteínas (3, 4). En China se ha estudiado el mecanismo molecular de diferentes poblaciones de insectos resistentes. En este país trabajamos en la caracterización de diferentes poblaciones afectadas en diferentes receptores de las toxinas Cry1A (ALP ó caderina). También trabajamos sobre el análisis de oligómeros de toxinas Cry y Cyt por medio de microscopia de fuerza atómica. En Estados Unidos trabajamos en la expresión transciente de proteínas en células vegetales con la idea de optimizar la actividad de las toxinas Cry1AMod en plantas genéticamente modificadas. También trabajamos en la medición de formación de poro de las toxinas de Bt utilizando un equipo de fijación de voltaje y medición de corrientes de corto circuito que recientemente adquirimos en nuestro laboratorio. Durante este tiempo participamos en la escritura de dos nuevas patentes de nuestro grupo. En todas estas estancias se establecieron nuevas colaboraciones con diferentes grupos de investigación. 1. Blanco CA, Pellegaud JG, Nava-‐Camberos U, Lugo-‐Barrera D, Vega-‐Aquino P, Coello J, Terán-‐Vargas AP, Vargas-‐Camplis J. 2014. Maize pests in Mexico and challenges for the adoption of integrated pest management programs. J. Integ. Pest Mngmt. 5(4): 2014; DOI: http://dx.doi.org/10.1603/IPM14006
2. James C (2013) Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013. ISAAA Brief 46. ISAAA: Ithaca, NY
3. Soberón M, Pardo-‐López L, López I, Gómez I, Tabashnik B, Bravo A (2007). Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance. Science 318: 1640-‐1642.
4. Tabashnik BE, Huang F, Ghimire MN, Leonard BR, Siegfried BD, Rangasamy M, Yang Y, Wu Y, Gahan LJ, Heckel DG, Bravo A, Soberón M (2011) Efficacy of genetically modified Bt toxins against insects with different mechanisms of resistance. Nature Biotechnol 29: 1128-‐1131.
Martes 9 de diciembre 9:00 Dra. Leonor Pérez “De la diferenciación neuronal a la neurodegeneración, pasando por la regulación homeostática del hipotálamo: la función de los microRNAs” El hipotálamo es el centro de control de la homeostasis del organismo al poseer la capacidad de interpretar e integrar diferentes señales tanto internas como del medio ambiente y responder a estas a través del sistema neuroendocrino. A pesar de esto, se sabe muy poco acerca de los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de las neuronas hipotalámicas durante la embriogénesis. En años recientes se ha mostrado que transcritos producidos a partir de regiones no codificantes pueden funcionar directamente como RNAs regulatorios, entre estos están los microRNAs (miRNAs), los cuales están presentes en plantas, Drosophila, C. elegans, murinos y humano. Así, se ha demostrado que los miRNAs participan en una amplia variedad de procesos que requieren una regulación espacio-‐temporal fina de la expresión génica, tales como el desarrollo, el metabolismo, la proliferación, la muerte celular así como, la diferenciación de diferentes tipos celulares. Consistente con estas observaciones, la expresión de ciertos miRNAs es regulada de manera diferencial en el cerebro y la deficiencia en la expresión de algunos de éstos resulta en defectos en el desarrollo cerebral. Es por ello que nuestro grupo está interesado en determinar si los miRNAs forman parte de la cascada de eventos moleculares que regulan el establecimiento y maduración de los fenotipos neurales hipotalámicos. Adicionalmente al control endócrino, estudios recientes sugieren una estrecha relación funcional hipotálamo-‐sistema inmune en el control de la homeostasis del organismo ante distintos insultos. En particular resalta el hecho de que el hipotálamo, en respuesta a diferentes estímulos medioambientales, previene el desarrollo de diferentes patologías como cáncer y las alteraciones metabólicas asociadas a la obesidad. Estos efectos están mediados por un aumento en los niveles de expresión del factor neurotrófico derivado de cerebro específicamente en el hipotálamo, que a su vez, mejora la respuesta inmune contra las células cancerosas y promueve la diferenciación del tejido adiposo blanco hacia pardo, respectivamente. Dado que el medio ambiente puede alterar los niveles de expresión génica y a su vez favorecer las funciones homeostáticas del hipotálamo resulta interesante definir los cambios de expresión de miRNAs y los efectos que pueden tener para modular la inflamación asociada a la obesidad. De esta forma, en este seminario discutiré el paradigma que estamos abordando para identificar miRNAs que regulen positivamente la función homeostática y neuroinmunomoduladora del hipotálamo. Adicionalmente, mostraré datos sobre los mecanismos que controlan el proceso inflamatorio en ratones modelo de la enfermedad de Alzheimer y la búsqueda de alternativas encaminadas a retrasar la neurodegeneración. 9:35 Dra. Laura Palomares “La N-‐glicosilación: Una modificación postraduccional que determina la función de las proteínas recombinantes” La mayoría de las proteínas de las células eucariontes están glicosiladas. La N-‐glicosilación ha sido la modificación más extensamente estudiada. Esta modificación postraduccional constituye una importante carga energética para la célula, por lo que el patrón de N-‐glicosilación puede ser afectado por el estado fisiológico y energético celular. Presentaremos como las condiciones de cultivo determinan el patrón de N-‐glicosilación de proteína recombinantes. Específicamente, se mostrará el caso de la N-‐glicosilación de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, proteína que forma parte de una vacuna recombinante en el mercado. La hemaglutinina se produjo en cultivos de células de insecto, fue purificada y parte de ella desglicosilada. Se encontró que el perfil de N-‐glicosilación de HA depende del tipo de hemaglutinina. Se caracterizó el comportamiento de la proteína glicosilada y la desglicosilada en distintas condiciones,
encontrando que la proteína desglicosilada es inestable. Se inmunizaron ratones con las variantes glicosiladas y las desglicosiladas, encontrando que la proteína desglicosilada produjo un mayor título de anticuerpos anti HA que la glicosilada. Se demostró que el perfil de N-‐glicosilación determina la estabilidad de HA y su capacidad de inducir la producción de anticuerpos en el suero de ratones. 10:10 Dr. Takuya Nishigaki “Ca2+, pH y AMPc: 3 factores fundamentales en el movimiento flagelar del espermatozoide” La movilidad del flagelo es una función fundamental del espermatozoide para que lleve acabo la fecundación en la condición natural (fecundación in vivo). Se sabe que Ca2+, pH y AMPc son 3 parametros fisiológicos muy importantes para controlar el batido flagelar del espermatozoide. De hecho, el espermatozoide de mamiferos tiene proteinas especificas que modulan estos parametros: El canal de Ca2+ especifico de espermatozoide (CatSper), El intercambiador Na+/H+ especifico de espermatozoide (sNHE) y La adenilato ciclasa soluble (sAC). Los ratones transgénicos que carecen de cada una de estas proteinas presentan infertilidad masculina debido a defectos en la movilidad del espermatozoide, lo cual confirma la importancia de estos tres parametros. Desgraciadamente, no existen un metodo de expresión heterologa de CatSper ni de sNHE, por lo que el avance del estudio de estos transportadores iónicos se lleva lentamente. Para obtener nuevos conocimientos sobre la función de CatSper y sNHE se requieren estrategias ingeniosas. En mi presentación explicaré algunos avances de investigación sobre los siguientes puntos:
1) Establecimiento del determinación de Ca2+ y pH intracelular con indicadores fluorescentes de emissión dual (Indo-‐1 y SNARF-‐5F).
2) Intento de crear ratón transgénicos que expresa un sensor de Ca2+ en las mitocondrias del espermatozoide.
3) Determinación del Ca2+ en las mitocondrias del espermatozoide usando Rhod-‐2, un indicador de Ca2+ que se acumula en las mitocondrias.
4) Selectividad de cation de CatSper y mimetización de selectividad a CatSper usando canal de Ca2+ voltage dependiente tipo T.
5) Caracterización de un dominio de unión al nucleótido cíclico (CNBD) predicho del sNHE. 6) Desarrollo de un ensayo de unión de un CNBD reconbinante y un analogo fluorescentes de
AMP ciclico uanso la tecnica de FRET y mejoramientos con nuevos pares de FRET. 7) Analisis bioinformaticos sobre arbol filogeneticos de CatSper, sNHE y sAC. 8) Preparacíon y caracterización de speract recombinante fusionado con una proteína
fluorescente. 12:30 Dra. Susana López “La interaccion rotavirus-‐célula huésped: una guerra armamentista” Como parásitos intracelulares obligados, los virus dependen de la maquinaria biosintética de la célula para traducir sus proteínas y para replicar sus genomas. Las células responden a las invasiones virales mediante una serie de respuestas antivirales para prevenir y o eliminar al invasor. A su vez, los virus han desarrollado una serie de estrategias para contrarrestar las respuestas antivirales de la célula y defenderse de dichos ataques para establecer una infección productiva. Como cualquier infección viral, los rotavirus, que son el agente etiológico mas importante de gastroenteritis viral en infantes, disparan una respuesta antiviral de su célula blanco. Nosotros estamos interesados en entender como los rotavirus contienden con las diferentes estrategias antivirales de la célula. El estudiar esta guerra armamentista entre virus y célula huésped, nos ha permitido aprender varios mecanismos celulares y virales. En esta ocasión les describiremos lo
aprendido acerca de la regulación que el virus ejerce sobre la traducción celular, los gránulos de RNA y la via OAS-‐RNAsa L. 13:05 Dr. Agustín López “Caprilvainillinamida: una irritante molécula !!!!” Esta conferencia sobre el trabajo del grupo inicia con una breve presentación de dos líneas generales del grupo en la que participa la mayor parte de los estudiantes, a saber: la estructura, función y aplicación de glicosiltransferasas, y la glicosilación y acilación de moléculas de interés alimentario y farmacéutico. Sin embargo, el tema principal será el recuento de un desarrollo tecnológico derivado de un "descubrimiento" en el laboratorio hace poco más de una década. Se trata de la aplicación de una enzima lipasa comercial, en general en la síntesis de amidas, en particular en la síntesis de una amida análoga de la capsaicina (la molécula picante del chile) de interés industrial. Se trata de la caproilvainillinamida, a la que se encontró una capacidad pungente similar (80%) a la de la capsaicina. Se presentan los fundamentos bioquímicos y biocatalíticos de la reacción enzimática, la forma en la que el proyecto fue avanzando en el laboratorio hasta la integración de la reacción a un proceso integral de síntesis, las dificultades para implementarlo a pequeña y mediana escala, los cambios necesarios para darle viabilidad económica e industrial y finalmente la creación de una empresa y el escalamiento del proceso. Miércoles 10 de diciembre 9:00 Dra. Patricia Joseph La homeostasis energética depende de la respuesta concertada del sistema nervioso y el endócrino a las señales de consumo, almacén y gasto. Las hormonas tiroideas controlan la tasa metabólica basal, la termogénesis, y junto con los glucocorticoides, el metabolismo de lípidos y carbohidratos colocando a los ejes hipotálamo (TRH)-‐pituitaria (TSH)-‐tiroides (hormonas tiroideas) (HPT) y HP-‐adrenal en la interface central y en particular, a las neuronas TRHergicas del núcleo paraventricular del hipotálamo como los integradores metabólicos al controlar tanto el consumo de alimento como el gasto energetico. Hemos caracterizado la respuesta de las neuronas TRHérgicas y del eje HPT a diversos estímulos agudos como el frío, estrés y actividad física demostrando que aquéllas condiciones que causan una demanda energética activan al eje mientras que el estrés o el ayuno lo inhiben. Además, un estrés previo a la estimulación por frío inhibe la activación del HPT inducida por el frío. La caracterización de los principales elementos de respuesta en el promotor del gen de TRH que regulan su biosíntesis nos ha permitido evidenciar que, el sitio de unión de CREB
fosforilado, en respuesta a activadores de la PKA, está protegido junto con secuencias aledañas que reconocen a los sitios SP/Kruppel, y son indispensables tanto para la expresión basal de TRH como la estimulada. Adicionalmente, el sitio GRE compuesto que reconoce al monómero del receptor a glucocorticoides (GR) y a cJun. Esto nos permitió demostrar que la interferencia que causan los glucocorticoides al efecto estimulador de activadores de la PKA impiden la unión de GR y de fosfo-‐CREB a sus sitios de respuesta sugiriendo una interacción que precede a su unión al promotor. Hemos ahora concluido que la interacción proteína-‐proteina entre GR y PKA ocurre no sólo en células de cultivos primarios de hipotálamo sino además en líneas de neuroblastoma y, que la dinámica de activación de GR o PKA es importante para que ocurra la interacción (Sotelo-‐Rivera en proceso). Si bien estos datos apoyan el efecto inhibidor de corticosterona sobre la activación que pueden causar distintos estímulos neuronales, su significado fisiológico depende de comprobación in vivo.
El eje HPT responde rápidamente a estímulos como la exposición por una hora al frío, incrementando transitoriamente los niveles de RNAm de TRH, de TSH y mas tarde, de hormonas tiroideas (T4 y T3) que activan la termogénesis. En este modelo estudiamos el efecto de la administración aguda de corticosterona, 2h antes de la exposición al frío. Encontramos una atenuación en la respuesta tanto a nivel hipotalámico como pituitario, reprimiendo el incremento de los niveles de RNAm de TRH así como los de tirotropina circulante; a estos tiempos no se observan cambios en los niveles circulantes de hormonas tiroideas si bien, la respuesta de su órgano blanco, el tejido adiposo pardo, también está atenuada al no incrementar la expresión de la desiodasa 2 (Sotelo-‐Rivera et al., 2014).
El estrés crónico o los niveles elevados de glucocorticoides por tiempos largos contribuyen a la obesidad y el desarrollo del síndroma metabólico. La actividad del eje HPT y de la expression de TRH se inhiben en ciertas condiciones de estrés crónico o bajo administración prolongada de glucocorticoides mientras que la de los péptidos orexigénicos como NPY y AgRP están incrementados. Hay múltiples cambios que dificultan la interpretación sobre posibles efectos directos sobre el eje HPT.
Nos interesamos entonces en estudiar la
respuesta del eje HPT en un paradigma de demanda energética como es el ejercicio voluntario crónico (2 semanas) y comparar con el efecto de un estrés moderado o de un ayuno equivalente al causado por el ejercicio. Las ratas ejercitadas o las sometidas a un estrés por restricción de movimiento, dejaron de comer un 18% de calorías comparadas a las sedentarias; después de dos semanas, las ejercitadas redujeron peso corporal y masa adiposa, los niveles de leptina, de TSH sérico y de TRH hipotalámico. Sin embargo, los animales sometidos a la dieta equivalente redujeron igual peso pero no de grasa y los cambios en TSH o TRH fueron mayores, disminuyendo además los niveles de T3 y de actividad en tejido adiposo pardo e, incrementando los de corticosterona comparados a animales control. Estos datos apoyan a que los cambios causados por el ejercicio contrarrestan la inhibición causada por deficiencia energética de la dieta incrementando adecuadamente el metabolismo (lipólisis vs. degradación de masa muscular o tisular) (Uribe et al., 2014).
Entre los cambios reconocidos causados por el ejercicio es el aumento del factor neurotrófico BDNF el cual hemos reportado incrementa la expresión de TRH. Otros reportes han asociado la expresión de BDNF y de TRH con una mayor capacidad metabólica; por ej, ratones transgénicos que expresan BDNF incrementan la expresión de TRH, genes involucrados en metabolismo y disminuyen tejido adiposo; la comparación de animales gordos o flacos (los primeros expresan mas BDNF y TRH) y, similares resultados se han obtenido en ratones crecidos en ambiente enriquecido. Se ha postulado que la proporción entre la expresión de BDNF y de GR en hipocampo determinan la respuesta al estrés del animal. Las condiciones de crecimiento del animal, ya sea ambiente enriquecido o estrés, causan efectos positivos o negativos (respectivamente) en el animal adulto en particular, en su respuesta a eventos agudos y estos cambios coinciden con metilaciones del promotor de GR y de BDNF hipocampal. El estrés infringido en el animal prenatal, o durante las etapas de lactancia, infancia o adolescencia pueden causar cambios epigenéticos que subsisten hasta la etapa adulta.
Realizamos experimentos sobre los efectos del estrés neonatal en la respuesta de la rata adulta a estresores metabólicos que se sabe afectan al eje HPT. Tenemos resultados preliminares que apoyan un efecto negativo sobre la respuesta del HPT. DESAFORTUNADAMENTE, las construcciones del bioterio y en particular aquéllas que iniciaron al final del 2012 sin aviso alguno, obligaron a exterminar la colonia de ratas además de que muchos experimentos que estaban en proceso, fueron dañados. La prolongación de la obra de extensión nos
ha imposibilitado la conclusión adecuada de algunos experimentos prometedores que involucran experimentos a largo plazo; también, a aceptar nuevos estudiantes ya que las ratas que se obtienen de Harlan no han dado resultados reproducibles. Es hasta agosto de este año que la colonia se ha reiniciado.
Las contribuciones de nuestro grupo han sido reconocidas al invitarnos a escribir una revisión para el Journal of Endocrinology la cual se encuentra en prensa.
9:35 Dr. Guillermo Gosset “Fisiología Microbiana e Ingeniería de Vías Metabólicas” Nuestro grupo está interesado en el estudio y modificación de la fisiología microbiana con el propósito de generar nuevas cepas y procesos sustentables para la producción de compuestos con aplicación industrial. Empleamos varios modelos microbianos con los cuales realizamos estudios que nos están ayudando a entender los procesos celulares relacionados al transporte de fuentes de carbono, el metabolismo central, las vías de síntesis de compuestos aromáticos y la resistencia a diferentes tipos de estrés. Mediante la aplicación de las técnicas de la ingeniería genética, modificamos funciones celulares que de forma directa o indirecta alteran al metabolismo celular (ingeniería metabólica). La glucosa constituye la fuente de carbono y energía preferida por Escherichia coli y es utilizada como materia prima en la mayoría de los procesos biotecnológicos de producción. Cuando E. coli crece en presencia de este carbohidrato en las concentraciones frecuentemente utilizadas en fermentadores, se produce un efecto de desbalance metabólico que ocasiona la síntesis de acetato. La producción de este ácido orgánico representa una pérdida de carbono y su acumulación tiene un efecto negativo sobre la productividad. Soluciones a este problema se basan en la limitación de este substrato mediante alimentación controlada o el uso de cepas mutantes. Aunque este es un fenómeno estudiado por diversos grupos desde hace ya varios años, aún no es clara la relación entre la velocidad de consumo de glucosa, la tasa de producción de acetato y el desempeño de cepas de producción. Con el propósito de aportar conocimiento sobre este tema, se generaron y caracterizaron cepas de E. coli con modificaciones en la capacidad para el consumo de glucosa. Se generó un grupo de 15 derivadas isogénicas de la cepa W3110 de E. coli con inactivaciones sencillas o múltiples de
genes que codifican para componentes de los complejos de glucosa, manosa, beta-‐glucósidos, maltosa y N-‐acetilglucosamina del sistema de fosfotransferasa (PTS), así como el transportador de glucosa/galactosa GalP y el transportador tipo ABS de glucosa Mgl. Estas cepas se caracterizaron en cultivos en matraz en medio mínimo con 2.5 g/L de glucosa. En estos experimentos se observó un rango en la velocidad específica de consumo de glucosa (qS) de 1.33 a 0.32 g/g h y velocidades específicas de crecimiento de 0.65 a 0.18 h-‐1. Así mismo, se observó una reducción o eliminación en la producción de acetato en las cepas mutantes. Se seleccionaron la cepa W3110 y cinco cepas mutantes para ser transformadas con el plásmido pHN, el cual se utiliza como vacuna de ADN contra paperas. Comparando con la cepa W3110/pHN, se observó un aumento del 320% en el rendimiento de pHN a partir de biomasa en una cepa mutante en la que inactivaron los genes de componentes PTS de glucosa y manosa, así como Mgl. Estos resultados demuestran que es posible mejorar el desempeño de E. coli como productora de una vacuna de ADN al reducir la qS. Se espera que esta colección de mutantes permita identificar fenotipos que impacten de forma positiva la capacidad de producción de otros productos biotecnológicos como lo serían las proteínas recombinantes. 10:10 Dra. Guadalupe Espín Azotobacter vinelandii es una bacteria filogenéticamente cercana a especies de Pseudomonas que sufre un proceso de diferenciación para formar quistes resistentes a la desecación. Esta bacteria también produce varios compuestos de importancia industrial entre los que se encuentran: los alginatos, polisacáridos extracelulares; polihidroxibutirato (PHB), un poliéster intracelular y una familia de 5-n-alquilresorcinoles (AR), que son lípidos fenólicos sintetizados comúnmente por plantas. Estos tres polímeros están presentes en los quistes maduros. En mi grupo estudiamos la genética molecular de la biosíntesis de alginatos, de PHB y de alquilresorcinoles, así como la genética y la fisiología del enquistamiento. El objetivo de nuestra investigaciónes contribuir a la generación del conocimiento sobre la expresión génica que conduce a la diferenciación bacteriana y a la producción de polímeros y su papel en esta bacteria. Otro de los objetivos de nuestro grupo es el uso del conocimiento generado para la construcción de cepas que puedan ser utilizadas para la producción de alginatos y de PHB. En mi grupo se identificaron y caracterizaron los genes que codifican para las enzimas de las vías biosintéticas de los componentes de los quistes alginatos, PHB y AR También hemos identificado y estudiado sistemas de regulación que controlan la expresión de los genes biosintéticos de estos compuestosos y de otros genes cuyos productos son contribuyen a la reesistencia a la desecación. de algunas proteinas la diferenciación. Los sistemas de regulación incluyen Estos incluyen a) genes reguladores especificos como ArpR que activa los genes de la síntesis de alquilresorcinoles, y PhbR que activa los genes de la síntesis de PHB y b) sistemas globales como el sistema de dos componentes gacS-gacA, el sistema de regulacion post-transcripcional Rsm, los factores sigma alternativos AlgU (RpoE) y RpoS, el sistema PTS-Ntr y el sistema de dos componentes CbrB/CbrA y el sistema de regulación post transcripcional CrC/CrcZ. Respecto al PHB, también estamos estudiando la biogénesis y composición de los granulos de PHB así como su degradación. 12:30 Dra. Gladys Cassab “Análisis genético y fisiológico del hidrotropismo en Zea mays L. y Arabidopsis thaliana” El hidrotropismo es una respuesta adaptativa altamente conservada que se define como el crecimiento diferencial de la raíz hacia una fuente de agua, la cual es percibida por las células de la cofia [1]. El hidrotropismo interactúa con otros tropismos de la raíz, como el gravitropismo
positivo (hacia el vector de la gravedad), el tigmotropismo (la evasión de obstáculos) y el fototropismo negativo (la evasión a la luz). En Arabidopsis, los genes MIZ1, MIZ2 [2], NHR1, AHR1 y AHR2 (identificados en nuestro grupo) participan en la modulación de la percepción y respuesta a gradientes de humedad. El hidrotropismo podría ayudar a disminuir en gran medida los efectos de la sequía, ya que las raíces con mayor capacidad de detectar gradientes de humedad crecerían hacia las zonas donde se encuentra este recurso y asegurarían que la planta obtenga agua durante su ciclo de vida.
La mutante con respuesta hidrotrópica alterada ahr2 muestra una respuesta hidrotrópica robusta y además presenta tolerancia a la sequía. Mapeo fino junto con datos de secuenciación masiva de la misma, indican que probablemente el gen responsable del fenotipo corresponde a TIME FOR COFFEA (TIC), el cual funciona como conector central entre el ciclo circadiano, la señalización por estrés y la homeostasis metabólica [3]. TIC es un regulador del ciclo circadiano que restablece el reloj justo antes del amanecer. Una vez que determinemos por estudios de complementación que TIC es el gen correspondiente a AHR2, podríamos concluir que el ciclo circadiano regula al hidrotropismo.
Evaluamos en el laboratorio la respuesta hidrotrópica de 284 híbridos de maíz DTMA (Drought Tolerant Maize for Africa) del CIMMYT ya genotipificadas con el método GBS [4], el cual ubicó 1,000,000 SNPs en cada DTMA [CIMMYT, datos no publicados]. Posteriormente, realizamos GWAS en colaboración con nuestros colegas del CIMMYT, identificando 27 SNPs candidatos que se asociaban fuertemente a la varianza del hidrotropismo. También, se evaluaron en campo por duplicado 5 DTMAs con respuesta hidrotrópica robusta y 5 con respuesta débil, para someter a prueba la hipótesis de que una respuesta hidrotrópica robusta de la raíz mejora su adaptación a la sequía en campo. La correlación entre la arquitectura de la raíz en plantas DTMAs con respuesta hidrotrópica robusta y productividad de grano (Ton/Ha) fue positiva, por lo que el análisis a futuro de los genes identificados en los SNPs por GWAS y su posterior validación por análisis de ligamiento nos permitirá generar variedades de maíz sintético, mediante el uso de los marcadores identificados que tengan una respuesta hidrotrópica robusta y alto rendimiento bajo sequía y/o calor.
1. Cassab GI et al. 2013. Am J Bot 100:14-‐24 2. Moriwaki T et al. 2013. Am J Bot 100:25-‐34 3. Sánchez-‐Villareal et al. 2013. The Plant Journal 76:188–200 4. Elshire RJ et al. 2011. Plos One 6(5):e1E9379
13:05 Dr. Alejandro Alagón