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PROBLEMAS PARTE II. Dra. Gonzalez IV) AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS 1. Cuál sería el pH de una solución de aminoácidos para que: a) Migre en una electroforesis. b) Vaya al ánodo en una electroforesis. c) Forme un ión doble. d) Precipite de la solución. e) Predomine la forma de carga neta cero. f) La concentración del ión doble sea máxima. g) Predomine la especie con mayor cantidad de cargas positivas. 2. Señalar con Verdadero o Falso. a) A pH 4 la Ser va al ánodo (pK1 2.21, pK2 9.15 y pKR 13.6) b) A pH 2 el Asp migra al cátodo (pK1 1.88, pK2 9.6 y pKR 3.65). c) En de la electroforesis de un aminoácido se obtiene siempre una sola banda independientemente del pH. 3. a) Dibuje los posibles estados de ionización del aminoácido Ser (pk1 1.88; pK2 9.6; pKR 13.6) b) Indique a simple vista, cuál de los estados de ionización predominan a valores de pH iguales a: 1; 3; 7 y11. 4. Calcule la pI de los siguientes aminoácidos:

pK1 pK2 pKR

a) Asp 1.99 9.90 3.90 b) Arg 1.82 8.99 12.48

5. Describir la preparación de 800 ml de buffer 0.3 M, pH 2.4 a partir de glicina sólida y de una solución 1N de HCl (pKs 2.34 y 9.6). 6. La curva de titulación del aminoácido Ala muestra la ionización de dos grupos funcionales con valores de pKa de 2.34 y 9.69. La titulación de di-, tri-, y otros oligopéptidos mayores de Ala también muestran la ionización de sólo dos grupos funcionales, aunque los valores experimentales de pKa son diferentes. La tendencia de los valores de pKa es: aa-péptido pK1 pK2 Ala 2.34 9.69 Ala-Ala 3.12 8.30 Ala-Ala-Ala 3.39 8.03 Ala-(Ala)n-Ala (n ≥ 4) 3.42 7.94

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a) Dibuje la estructura de Ala-Ala-Ala. Identifique los grupos funcionales asociados con pK1 y pK2. b) El valor de pK1 de Ala es mayor al del oligopéptido de Ala. Justifique. c) El valor de pK2 disminuye al pasar del aminoácido Ala a un oligopéptido de Ala. Explique. 7. Un péptido tiene la estructura primaria Ala-Leu-Glu-Tir-Cis-Gli. ¿A que pHs estima que podría utilizarse para preparar soluciones tampones? 8. Cuáles son las concentraciones de las diversas especies iónicas en una solución 1M de Lis a pHs 4.7 y 10? (pK1 2.18, pK2 8.95 y pKR 10.53) 9. Se prepara una solución 0.1M de Glu a un pH igual a su pI = 3. a. Calcule la concentración de su forma isoeléctrica principal b. Calcule la concentración de la forma completamente protonada. c. Que formas isoeléctricas se hallan presentes en la solución? V) PROTEÍNAS

1. El desplegamiento de la estructura en hélice alfa de un polipéptido para dar lugar a una conformación al azar viene acompañado por un gran descenso en una propiedad que se denomina “rotación específica”, la cual es una medida de la capacidad de una disolución para hacer rotar el plano de la luz polarizada. El poli-Glutámico, un polipéptido formado únicamente por residuos de L-Glu, tiene una conformación en hélice alfa a pH 5. Sin embargo, al aumentar el pH a 7 se observa un gran descenso en la rotación específica de la disolución. De manera similar la poli-Lisina (residuos de L-Lis) es una hélice alfa a pH 10, pero su rotación específica desciende al cambiar a pH 7, como se muestra en el gráfico siguiente.

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a) ¿Cuál es la explicación del efecto del pH sobre las conformaciones de poli(Glu) y poli(Lis)? b) ¿Porqué se produce la transición en un margen tan estrecho de pH? 3. La mayoría de las proteínas globulares se desnaturalizan y pierden su actividad cuando se calientan brevemente a 65ºC. A menudo, se observa que las proteínas globulares que contienen muchos enlaces disulfuro deben ser calentadas durante más tiempo y a mayor temperatura para desnaturalizarlas. Una de estas proteínas es el inhibidor pancreático bovino de tripsina (BPTI), que tiene 58 residuos de aminoácidos en una sola cadena y contiene 3 enlaces disulfuro. Al enfriar una solución de BPTI desnaturalizado, se recupera la actividad de la proteína. ¿Puede sugerir una posible base molecular para esta propiedad? 4. ¿En qué dirección migrarían en un campo eléctrico, las siguientes proteínas a los pH que se indican? a. Ovoalbúmina (pI 4.6) a pH 5 b. Alfa-lactoglobulina (pI 5.2) a pHs 5 y 7 c. Quimotripsinógeno (pI 9.5) a pHs 5, 9.5 y 1 VI) CINÉTICA ENZIMÁTICA 1. Para estudiar una reacción enzimática se prepararon una serie de tubos con diferentes concentraciones de sustrato (S) y una cantidad constante de enzima (E) y se incubaron en buffer fosfato 20 mM, pH 7 y a 37ºC. Como el gráfico Producto vs. Tiempo resultó ser lineal hasta 2 min. de incubación se tomó 1 min. como el tiempo óptimo. Se frenó la reacción por el agregado de NaOH 2N, y se determinó la concentración del producto formado. Concentración de S (mmoles/tubo) vi (µmol producto formado/min) 0.05 15.4 0.08 20.0 0.12 24.0 0.20 31.2 0.30 36.5 0.40 39.2 0.50 40.0 0.60 40.0 a) Calcule las concentraciones molares de S. b) Indique como se obtuvieron las vi. c) Mediante observación estime el valor de VM y KM. d) Calcule el valor de VM y KM gráficamente por Lineweaver-Burk. e) Si la concentración de enzima se incrementa al doble, como varía la vi, VM y KM

para S= 0.08 mM?

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f) Si se parte de S=0.10, en cuánto tiempo la concentración de S será igual a la mitad de la inicial? ¿En qué proporción debe incrementarse la concentración de enzima para que dicho tiempo se reduzca a la tercera parte? g) Expresar la Km obtenida en 3) en mM, µM, µmol S/ml, ng S/incubado, mg S/100ml, y la Vmax en µmol P/min, mmol P/100ml.min, µmol P/ml.min. Datos = Volumen de incubación: 500 µl y Mr S: 550 2. La fosfatasa alcalina es una enzima que hidroliza grupos fosfatos de diversos sustratos en medio alcalino. Su actividad puede medirse utilizando un sustrato artificial p-nitrofenilfosfato (PNFP), formándose como productos p-nitrofenol (PNF) y fosfato inorgánico (Pi). Este último puede detectarse espectrofotométricamente a 405 nm. Fosfatasa alcalina pH 10

PNFP PNF + Pi Para estudiar los parámetros cinéticos de la enzima de un extracto de placenta de rinoceronte, se realizó la mezcla de reacción en la cubeta del espectrofotómetro y se midió la variación de la absorbancia a distintos tiempos, según el siguiente cuadro:

Mezcla ml PNFP

(25 mM)

H2O (ml)

Buffer CO3

= (ml) Enzima (ml)

Absorb. t=0 min

Absorb. t=5 min

Absorb. t=10 min

Absorb. t=15 min

1 0.1 0.9 3 1 0.02 0.07 0.12 0.17

2 0.2 0.8 3 1 0.04 0.12 0.20 0.26

3 0.5 0.5 3 1 0.08 0.20 0.33 0.39

Mediante una curva de calibración realizada con PNF se obtuvo un factor (f) = 2.5 umol/unidad de absorbancia, en las mismas condiciones del ensayo. a) Obtener gráficamente KM y VM. b) Si el extracto poseía 2mg/ml de proteína, ¿cuál sería la actividad específica (AE)? c) Si se hubiese realizado una dilución al medio del extracto, ¿cuáles serían los valores de KM, VM y AE? 3.Cuando se produce un daño severo en el hígado, la enzima E1 es liberada al torrente sanguíneo. Luego de un ejercicio severo, la enzima del músculo E2, que cataliza la misma reacción que E1, es liberada a sangre. E1 y E2 pueden diferenciarse fácilmente debido a que poseen valores de KM distintos (KM E1= 0.3 M, KM E2= 0.02 M). Teniendo en cuenta los resultados que se muestran en la tabla, obtenidos al medir la enzima en la sangre de un paciente, establecer si el paciente sufre daño hepático o simplemente ha sido sometido a ejercicios bruscos.

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Concentración S (M) vi (µmol/ml suero.min) 5 x 10 -2 43 7 x 10 -2 57 1 x 10 -1 75 1.5 x 10 -1 100 2 x 10 -1 120 3 x 10 -1 150 6 x 10 -1 200 4. A una mezcla de reacción conteniendo 2.2 ml de clorhidrato de bencilamina, buffer fosfato de pH 7.6 y 3 g de enzima monoamina oxidasa mitocondrial de rata se le adiciona los inhibidores -naftol o -naftol. Luego se siguió la reacción espectrofotométricamente a 250 nm. La velocidad se midió en ua/min. Vf=2.5ml a) Que mide la absorbancia? b) A partir de los datos de la tabla calcular gráficamente KM, VM, Ki y la naturaleza de la inhibición.

1/S 1/vi

sin inhibidor α-naftol β-naftol

150 20 60 103

86 10 39 61

70 8 33 52

44 4 25 34

Datos = S estaba en mM, vi estaba en µmol P/min, α-naftol: 0.2 mM, β-naftol: 200 µM 5. La hidrólisis de fenil-β-galactósido por la β-D-galactosidasa es parcialmente inhibida por iones Be++. La vi expresadas como mol S/gr enzima x segundo se determinaron en ausencia y en presencia de 1mM de cationes Be++, empleando las concentraciones de S indicadas en la tabla. El Mr de la enzima es 750.000. a) Determinar si la inhibición es competitiva o no competitiva. b) Determinar el valor de Ki y KM. c) Cuál es la diferencia entre expresar VM como mol P/min y mol P/min.mg enzima? Concentración S (M) vi (mol S/gr enzima.seg) sin Be++ con Be++ 0.010 0.000077 0.0000385 0.005 0.000625 0.0000300 0.002 0.000040 0.0000192 0.001 0.000025 0.0000122 0.0005 0.000016 0.0000069

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6. Se investigó el efecto de Asp sobre la reacción catalizada por la malato deshidrogenasa-NAD dependiente. Para ello se prepararon 8 cubetas a las que se les agregó 0.1 ml de NAD+ (1mM) y 0.5 ml de buffer Tris pH 8.0. A las cuatro primeras cubetas se les agregó 0.2 ml de Asp (1mM) y a las restantes 0.2 ml de buffer. A las 8 cubetas se les agregó Malato y cantidad suficiente de agua para llegar a volumen final de 1.9 ml. La reacción se inició mediante el agregado de 0.1 ml de enzima y se la evaluó espectrofotométricamente a 340 nm. Volumen agregado vi (ua/min) Malato 1mM con Aspártico sin Aspártico 0.1 0.009 0.016 0.2 0.017 0.028 0.4 0.029 0.043 0.5 0.033 0.050 a) Calcular la VM de la reacción en presencia y ausencia de Asp. b) Calcular el KM para el Malato y la constante de equilibrio de disociación (Kd) entre el Asp y la enzima. 7. Se estudiaron las características de la enzima ATP-sintetasa de mitocondria de hígado de rata bajo distintas condiciones. a. Determinación de las constantes cinéticas en función de sus cofactores (Tabla II).

Indique, ¿cuál de esos cofactores elegiría para determinar actividad de la enzima y por qué?

b. Se estudiaron las constantes cinéticas en presencia del sustrato ATP, ATP S, y

ATP S y dos de sus cofactores Mg2+ y Cd2+.

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Indique cual es el mejor sustrato, ¿por qué? ¿Cómo lo analizó? ¿Cuál es su opinión acerca del mejor sustrato, depende del sustrato exclusivamente o de la presencia del cofactor? ¿Porque? 8. Se caracterizaron dos diferentes tipos de catalasas de Klebsiella pneumoniae, denominadas KpCP y KpT frente al medio. a. se analizó el efecto del pH sobre la actividad catalítica de ambas catalasas (fig. 2) y del extracto crudo (fig. 3) donde se hallan las dos enzimas juntas.

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Describa ambos gráficos, indique el rango de pH de trabajo de las enzimas. ¿Porque el grafico del extracto crudo tiene esa forma? ¿Puede saber con este estudio si el efecto del pH se debe a cambios en la “estabilidad” o “actividad” de la enzima? ¿Porque? ¿Cómo haría para saberlo? b. Se estudió el efecto de la temperatura sobre la actividad catalítica de las catalasas analizadas previamente, obteniéndose la siguiente tabla. Efecto de la T sobre las catalasas de K pseudomoiae Actividad (% control) Temperatura (ºC) KpCP KpT 25 90 30 37 48 77 52 0 100 60 0 100 70 0 100 100 0 74 Describa el comportamiento de ambas enzimas frente a los cambios de temperatura. Estas enzimas fueron incubadas durante 20 min a la T indicada. ¿Se podría decir que KpT es termoresistente? ¿Porque? ¿Y KpCP?

c. Se incubaron a las T indicadas, ambas enzimas en presencia de Ca2+ y se obtuvo la siguiente tabla.

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Efecto de la T y Ca2+ sobre las catalasas de K pseudomoiae Actividad (% control) Temperatura (ºC) KpCP KpT 25 90 30 37 66 77 52 37 100 60 12 100 70 0 100 100 0 74 Por favor, describa el efecto observado. ¿Qué función estaría cumpliendo el Ca2+? ¿El efecto es el mismo en ambas enzimas? ¿Porque? 9. Se hicieron estudios de la creatina kinasa mitocondrial de corazón de perro, se estableció que el KCl ejercía un efecto inhibitorio. a. Con el propósito de conocer el tipo de inhibición, se determinaron las constantes cinéticas en presencia y ausencia de KCl obteniéndose los siguientes datos. Km (M) Vm (umol/min) Mg-ATP (Sustrato) 142 65 Mg-ATP + 0.5M KCl 75 35 Mg-ATP + 1.0M KCl 41 20

¿Qué tipo de inhibición se tiene frente al KCl? ¿Por favor, indique a que se une el inhibidor? ¿Si la concentración del S fuera muy baja el efecto del inhibidor se mantendría? ¿Porque?

b. Para los estudios indicados en a. se utilizaron 2 mL de enzima. Si cada mL de enzima contiene 23 mg de proteína calcule la actividad específica de la enzima (AE en umol/min.mg proteína). Muestre sus cálculos para que tenga validez la respuesta. 10. En el estudio de las propiedades cinéticas de la pirofosfatasa de cloroplastos-Mg dependiente (PPasa-Mg), se encontraron los siguientes resultados:

a. A una concentración de Mg constante e igual a 10 mM, se estudió la respuesta frente a diferentes concentraciones de sustrato (Pirofosfato-PPi), entre 5 x 10-4 y 5 x 10-2 mM a pH 8.0, obteniéndose el grafico de la Fig. 4.

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Calcule el KM (indique las unidades) y la VM (expresada en umol de PPi hidrolizados/min) para esta enzima

b. Se analizó la especificidad por el S (PPi) utilizando varios fosfoesteres orgánicos e inorgánicos (Tabla II) en concentración 5mM. La velocidad obtenida cuando se utilizó PPi como S en esas mismas condiciones fue de 0.37 umol PPi hidrolizado/min. Indique si podría reemplazarse el PPi como sustrato de la enzima por alguno de los fosfoesteres utilizados, ¿ por qué? Nil significa no detectado.

c. Se estudió el efecto de diversos cationes en el ensayo en presencia de Mg

(Tabla III) y se midió el % de actividad es forma relativa a la actividad observada en ausencia de los cationes listados. Describa el efecto de estos cationes sobre la actividad enzimática. Cual/les es el más potente? Leer en este orden: Control, Cd, Mn, Ca, Co, Zn, Cu y Ni.

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d. Se estudió también el efecto del Mg a distintos pHs (Fig. 5). pH 7.0 = circulo

vacío, pH 8.0 = cuadrado negro, y pH 9.0 = circulo negro. Describa el efecto de la concentración del cofactor, Mg a los diferentes pHs

e. Finalmente se estudió el efecto de concentraciones altas de PPi (1mM,

triangulo vacío), y dos agentes quelantes EDTA (circulo vacío) y Citrato (cuadrado vacío) en la misma concentración. El control (circulo negro) en ausencia de quelantes y con S concentración 0.033 mM. Describa el efecto observado para cada uno de ellos en relación a la actividad enzimática. Fig. 6

pH 7

pH 9

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f. ¿Qué características posee el sitio activo de una enzima? Descríbalas g. Describa la inhibición por exceso de Sustrato. ¿Porque ocurre? h. Explique la activación proteolítica de una enzima.

11. Se estudiaron las propiedades de la enzima Sulfotransferasa I (STI) de hígado de rata (Arch Biochem & Bioph 196 (2), 340-349, 1979) responsable de la sulfatación de glucocorticoides y se obtuvieron los siguientes resultados:

a. El gráfico de doble reciprocas (Linewiver Burk) de velocidades iníciales de la

enzima STI en función de la concentración de Cortisol (HC) y de 3`-

fosfoadenosina-3`-fosfosulfato (PAPS), sus respectivos sustratos (figura 3). En

el gráfico A varia HC, y PAPS es constante en las concentraciones indicadas; en

grafico B es al revés.

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Las concentraciones utilizadas a pH 6.8 son: HC 4 y 8 uM, y PAPS 4.35; 21.8; y 218 uM. La velocidad se expresa en nmol HC sulfatada/hora Calcular KM y VM para ambos sustratos (aclaración; HC es el corticoide que será sulfatado y PAPS es la coenzima que dona el grupo sulfato). Por favor, una vez realizado los cálculos, cuéntenos qué opina sobre la afinidad y velocidad de catálisis con la que la enzima trabaja para cada S.

b. Se estudió el rango de pH optimo al cual se espera trabajar con la STI (grafico 4)

Indicar, ¿en qué rango de pH trabajaría Ud. con esta enzima y porque piensa que

trabaja mejor a esos pH? Sugerencia: piense en cuál es la función de la enzima.

c. Se estudió también (fig. 5) como afectaba la cinética de esta enzima la

incorporación al tubo de ensayo de p-hidroximercurio benzoato (pHMB).

¿Cuál es el efecto observado y que intuye que estará haciendo este

compuesto? Calcule la concentración que produce el 50% del “efecto” y según

el efecto por Ud. descripto que indicaría este último cálculo.

Sugerencia: piense en cuál es la función de la enzima.

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Ayuda: si se le agrega betamercaptoetanol (BME) -protector de grupos sulfhídrilos- el

pHMB no logra su efecto.

d. Se estudió el efecto de distintos iones sobre la actividad de la enzima en dos

fracciones purificadas (Tabla II; para el análisis solo se tomará la fracción

denominada ADP pool). Se midió la actividad de la enzima en ausencia de

metales y en presencia de 5 mM de los metales indicados en tabla. Los datos

de la tabla indican el % de actividad de la enzima para cada Ion respecto del

valor de actividad de la enzima en ausencia del metal (100%).

Describa el efecto de cada ion metálico, diga cuál sería el más potente. porqué?

e. Describa las propiedades del sitio activo de una enzima.

f. Describa la cinética de inhibición de una enzima por exceso de sustrato.

g. Como seria los gráficos del Método de Dixon para la determinación de la Ki de

una enzima frente a los distintos tipos de inhibición.

12. La familia de las enzimas Sulfotransferasa (ST) de hígado de rata catalizan la

formación de esteres de sulfato a partir de un gran número de sustratos que poseen

grupos hidroxilos funcionales. Concretamente la enzima ST IV cataliza esta reacción a

partir de alquil alcoholes, alcoholes primarios o secundarios e hidroxiesteroides. ROH + adenosina 3`-fosfato 5`-fosfosulfato (PAPS) ROSO3H + adenosina 3`,5`-fosfato (PAP)

Para caracterizar sus propiedades cinéticas se hicieron varios ensayos a 37º durante

30 min.

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a. El estudio de la actividad enzimática en función del pH se hizo en presencia

de los buffers indicados (fig. 1), todos a la concentración de 125 mM y se

analizó para dos sustratos diferentes (ver leyenda figura).

Describa el efecto del pH sobre la actividad enzimática.

b. Se estudió el efecto de las sales sobre la actividad enzimática, a pH 5.5 en presencia de buffer Na Acetato 30mM pH 5.5 (fig. 2).

Describa el efecto de las 4 sales. ¿Qué puede decir acerca del efecto de la

sal a altas concentraciones?

¿A qué se debe el efecto, al catión o anión? ¿Porque?

c. Se probaron diferentes sustratos a sus pHs óptimos a efectos de continuar con los estudios utilizando las mejores condiciones de ensayo.

Fig. 1 Actividad enzimática en

función al pH. B-Naftol y Tirosina

Metil Ester como sustratos.

Buffers: Na Acetato, Na Succinato

y Tris-HCl

Fig. 2 Efecto de las sales sobre

la actividad enzimática: A. Na

Acetato, B. K Cloruro, C. Na

Cloruro, D. Na fosfato.

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¿Cuál es para Ud. el o los mejores sustratos? porque?

Analizando todos estos ensayos y la información dada… ¿cuáles serían las condiciones

óptimas para el ensayo de actividad de la ST IV?

13. La enzima endo-mananasa de levadura hidroliza grupos funcionales unidos en

posición alfa en el manano liberando grupos reducidos. El ensayo se realiza en

presencia de 25 mg de manano en 0.1M buffer acetato pH 5.0 y un volumen

final de 0.4 ml a 40ºC por 4 hs.

a. Se realizó un gráfico de doble reciproca para calcular KM y VM (fig. 3)

Calcule KM y VM del grafico 3, indique las unidades. Exprese KM en

concentraciones molares (M)

Tabla I.

Constantes

cinéticas frente a

diferentes

sustratos.

Concentración de

los Sustratos 0.1

mM

Fig. 3 Grafico de

Lineweaver-Burk.

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b. Se sabe que algunos iones metálicos y otros compuestos inhiben la enzima, para ello se realizó un ensayo con potenciales inhibidores a dos concentraciones diferentes (Tabla II).

Cual/cuales es el inhibidor más potente y por qué?

¿Qué ensayo realizaría con estos compuestos para conocer el inhibidor más

potente con mayor exactitud?

14. La tirosinasa de hongo es una enzima que posee Cu en su estructura, cataliza la

hidroxilacion de fenoles y la oxidación de catecoles a o-quinonas. Los ensayos

de actividad se hicieron a 25ºC y pH 6 en presencia de L-Dopa y O2 como

sustratos.

a. Se sabe que la azida es un inhibidor de esta enzima, por lo tanto, se estudió la

cinética de esta inhibición y sus resultados se muestran en la figura 4.

Fig. 4. Gráfico de doble-reciproca (1/V vs.

1/S) para la inhibición de Azida.

L-Dopa es el sustrato variable y O2 se

ensayó a una concentración de 250uM a

pH 5.6 (a) y pH 7.0 (b).

Azida: (●) 0, ( ) 0.30, ( ) 0.50 mM

Tabla II. Efecto de iones

metálicos e inhibidores

sobre la actividad de la

enzima endo-mananasa.

100 es el máximo de

actividad.

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c. ¿Qué tipo de inhibición produce la azida? ¿Porque? Explique las

características de esta inhibición.

d. La inhibición es la misma a pH 5.6 y 7.0? por qué?

e. ¿Cuáles son las diferencias en las propiedades cinéticas entre una enzima

michaeliana y una enzima alostérica? Explique.