PRACTICA IV-Enterobacterias-

1.- ¿Que bacterias pertenecen a la familia de las Enterobacterias enumere cada una de ellas?AlishewanellaAlterococcusAquamonasAranicolaArsenophonusAzotivirgaBlochmanniaBrenneriaBuchneraBudviciaButtiauxellaCedeceaCitrobacterDickeyaEdwardsiellaEnterobacterErwinia

EscherichiaEwingellaGrimontellaHafniaKlebsiellaKluyveraLeclerciaLeminorellaMoellerellaMorganellaObesumbacteriumPantoeaParacolobactrumPectobacteriumPhlomobacterPhotorhabdusPlesiomonas

PragiaProteusProvidenciaRahnellaRaoultellaSalmonellaSamsoniaSerratiaShigellaSodalisTatumellaTrabulsiellaWigglesworthiaXenorhabdusYersiniaYokenella

2.- ¿Cuales son las Enterobacterias de importancia industrial?Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso intermedio de la ruta se produce acetoína que puede servir para la identificación de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reacción de Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter.3.- ¿Dentro de las Enterobacterias cuáles son las de interés clínico?SalmonellaEscherichiaYersinia (Peste)4.- Escriba las características de cada una de las Enterobacterias. Grupo I

Escherichia

Escherichia coli es la especie más aislada y más conocida pero se compone de otras 5 especies. Son un conjunto heterogéneo de cepas de las cuales la mayoría no son patógenas, sin embargo, existen patógenos oportunistas que producen como enfermedades más habituales:

gastroenteritis infecciones del tracto urinario En menor medido también pueden producir un tipo de meningitis muy grave pero poco

frecuente en recién nacidos y septicemias en inmunodeprimidos.Gastroenteritis

Existen distintos tipos de cepas:

E. colienterotoxigénica (ECET)Genera toxinas. Produce una diarrea parecida al cólera pero mucho menos grave, es la conocida como diarrea del viajero. También causa gastroenteritis en niños pequeños que puede ser grave siendo causa de muerte en niños del Tercer Mundo. Se produce por beber agua contaminada.E. colienteroinvasiva (ECEI)Provoca una gastroenteritis con fiebre, retortijones, heces con sangre. Invaden el epitelio intestinal destruyéndolo. Para su identificación química se realiza la prueba de Sereny, por la cual se inocula el ojo de una cobaya y si desarrolla conjuntivitis quiere decir que es esta cepa.E. colienteropatogénica (ECEP)Históricamente es muy importante, provoca diarrea infantil que en los países subdesarrollados es causa de muerte. Se adhiere a las fibras intestinales y se cargan las microvellosidades, son bacterias enteroadherentes.E. colienterohemorrágica (ECEH)Producen una toxina parecida a Shiga y se llama verotoxina. Puede provocar desde diarreas leves hasta colitis hemorrágicas, incluyendo el síndrome hemolítico urémico (HUS) consistente en insuficiencia renal y anemia severa. Éste es provocado por una cepa emergente aislada a principios de los años 80 llamada O157:H7 siendo una de las causas de brotes epidémicos de gastroenteritis en países desarrollados. Se puede contraer por tomar carne de ternera contaminada poco hecha, leche sin pasteurizar y en general, alimentos crudos. También se puede contraer por beber o nadar en aguas contaminadas. Esta cepa fue responsable de la crisis del pepino que produjo en Alemania más de 30 muertos y que finalmente no se hallaba en el pepino español sino en brotes de soja plantados en Alemania o gramíneas procedentes de Egipto.Infecciones del Tracto UrinarioSon cepas de E. coliuropátogenas que por lo general son virulentas porque poseen adhesinas que les permite fijarse en el tracto urinario y llegar al riñón causando pielonefritis que puede ser muy grave ya que pueden derivar en septicemias. También es causa de UTIs mal tratadas que son muy frecuentes en mujeres de edad fértil.SalmonellaEs un género muy relacionado con Escherichia ya que comparten alrededor del 50% de la secuencia de ADN pero son casi todas patógenas de humanos y animales de sangre caliente.Salmonella enterica

Es una especie de la que existen más de 1500 serotipos distintos, en clínica se llaman con el nombre del serotipo pues cada serotipo genera una enfermedad diferente.Se encuentra en todos los animales: aves, reptiles, vacas, animales domésticos… El reservorio de Salmonella se mantiene por contacto entre animales y por consumo de piensos contaminados.Salmonella typhi y Salmonella paratyphiSe transmiten por ingestión de alimentos o aguas manipulados por gente contaminada (higene).Para el resto de las especies se contrae infección por agua o alimentos contaminadas y en niños pequeños por contaminación oral-fecal.La mayor parte de los casos son niños en la estación cálida o que han ingerido alimentos que hayan estado al aire libre. Los huevos, carne de ave y por productos lácteos. Se dan más casos por el consumo de huevos crudos o poco cocidos porque Salmonella se encuentra en el intestino de las gallinas.En USA se dan 50.000 casos todos los años. Los más graves se refieren a niños pequeños y a ancianos. Para que se desarrolle la enfermedad es necesario ingerir una gran cantidad de Salmonella, del orden de 108 individuos aunque en el caso de niños, ancianos, inmunodeprimidos y personas con menor acidez en el estómago se necesita una menor dosis. En los meses cálidos se da una mayor incidencia porque permiten la reproducción de las bacterias con mayor facilidad. El tratamiento mejora con antibióticos.EnfermedadesSalmonellosis – Enteritis: Se produce de 6 a 48 horas después de consumir el alimento, provoca dolor de cabeza, fiebre, diarrea y vómitos. Su duración es de una semana y desaparece por sí misma pues no responde a antibióticos sino que el tratamiento es sintomático. El problema es que puede derivar en septicemia y puede darse en niños y ancianos.Fiebres tifoideas (S. tiphy) y paratíficas (S. paratyphi): son graves y su mortalidad es del 20% si no se tratan. Se contraen por ingerir alimentos contaminados por personas. Los síntomas aparecen después de 10-14 días. Las bacterias penetran en el intestino liberando LPS que provoca picos de fiebre. Es muy importante en el Tercer Mundo. Puede ocurrir que sean mantenidas en portadores humanos por colonización asintomática en el 1 a 5% de los casos y puede durar hasta un año o mucho más. El órgano donde se acantonan es en la vesícula.Existen muchas Salmonellas resistentes a antibióticos porque a las aves de granja se les suelen proporcionar en gran cantidad.ShigellaEs otro género muy relacionado con E. coli. Existen varias cepas al igual que en el caso de Salmonella.Son responsables de casos de disentería bacteriana: diarrea con sangre y mucosidad. Es muy frecuente en países del Tercer Mundo por ingestión de agua contaminada. La dosis infectiva es muy baja, con 200 bacterias ya es posible contraer la infección. Son muy resistentes al paso por el estómago. Es un peligro en el hielo de países subdesarrollados.En países desarrollados es básicamente una enfermedad pediátrica de las guarderías por contaminación oral-fecal. En adultos es autolimitada pero en niños y ancianos es muy

grave porque provoca HUS y complicaciones neurológicas que pueden conducir a la muerte.Esta bacteria coloniza el intestino grueso y no hace nunca septicemias. Es patógena porque es intracelular y puede pasar de una célula a otra sin pasar por el medio extracelular debido a las toxinas invasivas y la toxina shiga que está relacionada con el HUS y no con la disentería normal.GRUPO II

Estas bacterias realizan la fermentación butanodiólica.Enterobacter

En suelos y aguas y, a veces, en el intestino. Relacionadas con estas bacterias son Klebsiella que fija N2 y cuya especie K. pneumoniae provoca neumonía.SerratiaProduce prodigiosinas que son pgimentos y son pirroles que están en clorofilas y hemoglobinas pero no se sabe muy bien cuál es su función.ErwiniaSon patógenos de plantas.GRUPO III – Proteus-ProvidenciaLa mayoría son de vida libre aunque hay algún Proteus patógeno. Es ureasa + lo que quiere decir que hidroliza urea.En caso de ser patógenas provoca infecciones del tracto urinario y del riñón. Son muy rápidas moviéndose y crece en oleadas (en placa de cultivo se puede ver como círculos concéntricos).GRUPO IV – YergsiniaEs un grupo con siete especies de las cuales tres son patógenos muy importantes de humanos y animales.Y. pseudotuberculosisProvoca una enfermedad parecida en animales.Y. enterocoliticaProvoca enterocolitis, se da especialmente en Escandinavia y en las zonas frías de América.Y. pestisEs la responsable de la peste negra. Su reservorio se mantiene en poblaciones de roedores especialmente las ratas de las ciudades. Se transmite por las picaduras de las pulgas, en ésta se ubican en el intestino parando la digestión, aumentando la sensación de hambre y por tanto que piquen más.En el siglo XIV fue muy grave debido a que Europa estaba en muy malas condiciones higiénicas. En la actualidad no está erradicada pues se encuentra en otros hospedadores salvajes como ardillas, conejos, perrillos de las praderas…En general provoca dos tipos de infecciones: peste bubónica y la peste neumónica. El sistema inmunitario de las personas se activa, y al estar las células en cápsulas se disemina con mayor facilidad.Peste bubónica

Se forman bubones (o bubas) que son los ganglios inflamados muy dolorosos que provocan hemorragias subcutáneas provocando la piel negra. La tasa de mortalidad es del 60% si no hay tratamiento en 3-5 días.Peste neumónicaSe pasa de persona a persona por los aerosoles. Asoló Europa pues su tasa de mortalidad es del 90%. Actualmente es tratable y curable con estreptomicina y tetraciclina.

5.- ¿Cómo haría la identificación en el laboratorio de la familia de las Enterobacterias?La identificación requiere la realización de pruebas bioquímicas y de serotipificación, de distinta complejidad, dependiendo de la capacidad del laboratorio. Es conveniente que los laboratorios con menores disponibilidades envíen las cepas aisladas a laboratorios de nivel intermedio (provinciales y/o regionales), para completar las pruebas bioquímicas y realizar pruebas de serotipificación. A su vez el Laboratorio Nacional de Referencia realiza las pruebas bioquímicas de mayor complejidad y pruebas de serotipificación complementarias.

Para el aislamiento se utilizan medios diferenciales y selectivos como: agar MacConkey (MC),agar Eosina Azul de Metileno (EMB), agar Salmonella Shigella (SS), agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),agar Hektoen (HE), agar verde brillante (BG). Las placas se incuban a 37ºC durante 18 a 24 horas y se observan colonias, de 2 mm de diámetro, con las características indicadas en la Tabla 1.

6.- Que son las pruebas primarias y en qué consisten.

Para la identificación de las bacterias en el laboratorio es importante conocer sus características

morfológicas, la reacción a la tinción de Gram, agrupación, propiedades, morfología colonial,

reacciones metabólicas como producción de enzimas y reacciones de óxido-fermentación.

La identificación bacteriana primaria se basa en los siguientes puntos:

Tinción de Gram : Revela la forma de la bacteria, agrupación y grupo taxonómico al que

pertenece: Gram positivo o Gram negativo.

Tinción de Ziehl Neelsen : Las bacterias Alcohol-Ácido resistentes (BAAR), son difíciles de

cultivar, tal vez y en un agar sangre muestre algo de crecimiento, por eso es útil esta tinción de

identificación primaria.

Tinción de esporas: La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los géneros

Bacillus y Clostridium.

Prueba de catalasa: La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno en

oxígeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al

género Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias

facultativas tienen catalasa.

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al

cultivo.

El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia. Ejemplos:

Catalasa (+): Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas

sp.

Catalasa (-): Streptococcus spp.

Prueba de oxidasa: Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la

identificación de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del

sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno molecular, por

la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de electrones.

El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos. Un resultado

positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente auto-

oxidable del sistema de citocromo es al final catalizado. Utilizando un tubo capilar con tetrametil-p-

phenylendiamina al 1%, se adiciona una pequeña cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre

un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones: una reacción positiva (presencia de oxidasa)

se indica por la apariencia de un color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 segundos; al

contrario una reacción negativa, que consiste en una ausencia de color púrpura, indica según los

ejemplos:

Oxidasa (+): Pasteurella multocida

Oxidasa (-): Escherichia coli

Ácido de la Glucosa: La mayoría de las bacterias de interés médico usan la glucosa como

fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa

la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de dicho carbohidrato. En un tubo con agua

peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitación teniendo

cuidado de no mover el tubo de Durham e incubándolo 24 horas y 37°C se obtienen los

siguientes resultados.

Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observará

rosa, si produce gas, se observará una burbuja en el tubo de Durham. Ejemplos:

Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli

Negativo a producción de gas: Proteus stuartii.

Prueba de O/F: para realizar esta prueba se usa el medio básico de Hugh y Leisfon con un pH

de 7.1. Es un medio semisólido de color verde que se inocula por picadura, contiene

carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene

Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro con acetie o vaselina

sellándolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37°C por 24

horas, obteniéndose:

TUBO ABIERTO TUBO SELLADO INTEPRETACIÓN

Amarillo Verde Oxidación (aerobio)

Amarillo (anaerobio facultativo) Amarillo Fermentación

Verde (anaerobio estricto) Amarillo Fermentación

Verde Verde Negativo (NH3)

Prueba de Motilidad: Llamada también de la gota suspendida. Algunas bacterias son móviles

por presentar flagelo, los flagelos son encontrados principalmente en las formas bacilares y

pueden presentarse en número y posición variados(monotricos, peritricos, etc.). La base de

esta prueba es determinar si la bacteria es móvil o inmóvil. Con un asa de inoculación se le

coloca a un cubreobjetos un poco de muestra y se le agrega una gota de agua destilada. Se

coloca sobre un portaobjetos y se observa al microscopio. Podremos observar si las bacterias

tienen movimientos rectilíneos o curvos y en todas direcciones. Ejemplos:

Motilidad (+): como en Pseudomonas auruginosa.

Motilidad (-): como en Pasteurella multocida.

7.- Cuales son las pruebas secundarias y en qué consisten cada una de ellas.

La identificación se fundamenta en la comparación del microganismo que deseamos identificar con

los microorganismos de identidad conocida. La exactitud de la identificación depende de la eficacia

del trabajo preparatorio así como su grado. Estas pruebas se clasifican de la siguiente manera:

Simples: Citrato, Malonato, MR-VP, Nitrato y Leche Tornasol.

Múltiples: TSI, LIA y SIM.

Especiales: Coagulasa, Hialuronidasa y Acriflavina

8.- Dentro de la identificación cual considera usted que de manera rápida le serviría a usted para hacer la identificación de una bacteria.

Yo utilizaría tinción de Gram, ya que las enterobacterias se caracterizan por ser Gram negativas

9.- Si le enviarán a usted una muestra para analizar a el laboratorio cuál sería la metodología que seguiría usted para hacer la identificación y el aislamiento.METODO EXPERIMENTAL

1 OF, catalasa, oxidasa y motilidad

2 NO3, indol, MR-VP, citratos, TSI, malonatos, H2S ,Urea, descarboxilación de lisina,

ornitina, arginina

10.- Cual es material que se utilizaría para realizar esta práctica.Medios de cultivo y bioquímicas:

1 placa de AST o BHI 1 placa de MacConkey (MC) 1 placa de Eosina Azul de

Metileno (EMB) 1 placa de Sulfito Bismuto (SB) 1 placa de Xilosa Lisina

Desoxicolato (XLD) 1 placa de Salmonella Shigella (SS) 1 placa de Desoxicolato Citrato

(DC)

1 placa de Bilis Rojo Violeta (BRV) 2 tubos de OF 1 tubo con Nitratos 1 tubo con SIM 1 tubo con MR VP 1 tubo con Citratos 1 tubo con Urea 1 tubo con Malonatos 1 tubo con TSI 1 tubo con MIO

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

Cepa bacteriana

Gram

EMB MC SS XLD SB

Comparar la morfología colonial en estos medios

1.- bioquímicas primarias

Identificación con tablas

2.- bioquímicas secundarias

1 tubo con caldo arginina 1 tubo con LIA

Material Biológico Antisueros VS enterobacterias E. Coli Salmonella Shigella

Otros Mechero Microscopio Asa bacteriológica Agua destilada estéril Cubre objetos Portaobjetos

REACTIVOS Peróxido de hidrogeno 30% Tiras reactivas (oxidasa) Aceite mineral Reactivo de Kovack o Erlich´s Rojo de metilo KOH 40% Alfa-naftol Alfa-naftilamina Ac. Sulfanilico Colorantes de Gram