Preparación de Medios de Cultivo

Fundamento

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los

microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque

las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco

exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes

que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:

1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),

2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)

2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres

tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos. Este último

aspecto es importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o

sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir

comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de

agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse

por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.

Objetivos concretos de la práctica

1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro.

2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiología.

3. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.

Realización práctica

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Cada mesa de trabajo se encargará de la preparación de una cantidad suficiente de un

determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo

de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán del número de mesa y el medio de cultivo

asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.

2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento

de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento

será diferente:

a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al autoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.

b) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar enautoclave.

Esterilización, Desinfección y AntisepsisEn el laboratorio de microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Asimismo, se aprenderán las técnicas de laboratorio que nos permiten manejar esos medios e instrumental de forma que se minimice el riesgo de contaminación.

Autoclave Mechero Bunsen Ebullición Filtración Radiaciones: Ultravioleta

AutoclaveEn el laboratorio de Microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de comenzar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado. Se entiende por esterilización los procedimientos por los cuales se eliminan todas las formas vivas de microorganismos, sean patógenos o no, que se hallen en un material. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves.

¿Qué es el autoclave?

El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiología. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presión elevada, una atmósfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121ºC causando la desnaturalización de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destrucción de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos.

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El funcionamiento del autoclave

El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases:

1. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.

2. Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización.

3. Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a poco.

Algunas consideraciones para una correcta esterilización del material

1. Para que la esterilización de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido.

2. Los recipientes con cierre hermético deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave después de la esterilización procederemos a cerrar totalmente estos recipientes.

3. Los recipientes vacíos precisan de un tiempo de esterilización mayor que los recipientes con líquido en su interior.

EbulliciónLa ebullición no es un procedimiento de esterilización. Con este procedimiento físico tan sólo alcanzamos temperaturas de 100ºC, insuficientes para eliminar formas de resistencia como las endosporas. Peroe ste procedimiento nos puede permitir la eliminación de formas vegetativas, sobre todo de patógenos, reduciendo significativamente la carga microbiana.

Para la realización de esta práctica se parte de un tubo con un cultivo mixto que debe

de contener al menos una especie bacteriana del género Bacillus.

Inoculamos 100 microlitros del cultivo mixto en una placa de agar nutritivo. Este será nuestro control con el que comparar.

El tubo debe de cogerse con las pinzas de madera, encendemos el mechero Bunsen y le aplicamos la llama. Debemos estar vigilantes para evitar que el líquido rebose debido a la ebullición, o que el tapón salga despedido por los gases emitidos.

El tubo debe de ebullir al menos tres veces. Posteriormente lo dejamos enfriar e inoculamos un volumen de 100 microlitros en otra placa de agar nutritivo.

Tras incubar a 37ºC durante 24 horas las dos placas, observaremos que la placa con el inóculo que no ha sido llevado a ebullición muestra una gran cantidad y diversidad de colonias. Si la concentración microbiana era muy alta incluso puede observarse un cesped bacteriano. En cambio, la placa con el inóculo que ha sido llevado a ebullición sólo debe de mostrar unas cuantas colonias y todas ellas muy similares.

FiltraciónLa filtración es un procedimiento físico de esterilización de fluidos en el cual los microorganismos no son destruidos, sino simplemente retenidos por un material filtrante.

La filtración sólo puede ser utilizada con fluidos, sean líquidos o gaseosos. Se suele utilizar con soluciones cuyos componentes sean termolábiles y por lo tanto no pueden ser esterilizadas en el autoclave, por ejemplo, soluciones concentradas de azúcares, de urea, vitaminas, factores de crecimiento, etc.

La filtración tiene la desventaja de que es ineficaz con determinados microorganismos, como los virus o los micoplasmas. Los primeros son mucho más pequeños que el tamaño del poro, por lo que no son retenidos. Los segundos son pleomórficos ya que carecen de una pared de peptidoglicano y pueden adaptarse al tamaño de poro, por lo que tampoco son retenidos.

El material filtrante debe de ser inerte para no reaccionar con los componentes de la solución, presentar resistencia mecánica y tener un tamaño de poro menor que los microorganismos que deben ser retenidos. Tradicionalmente se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamaño de poro de 0,45 o de 0,22 micras. El fluido es impulsado mediante la presión ejercida por el embolo de una jeringuilla, o bien mediante el uso de un quitasato y un sistema de vacío.

Material

Cultivo mixto Placa con agar nutritivo Filtro desechable de 0,45 micras Jeringuilla desechable Tubos esteriles

Abrimos el recipiente del filtro pero no lo sacamos. Ajustamos la jeringuilla desechable sin el émbolo. Tomaremos 5 ml del cultivo mixto con una pipeta y los depositamos en el interior de la jeringuilla. Disponemos el filtro sobre la boca de un tubo ésteril y mediante el émbolo hacemos

pasar el cultivo a través del filtro. Sembramos una alícuota del filtrado sobre una placa de agar nutritivo y lo llevamos a incubar a 37ºC. Observamos la ausencia de crecimiento tras 24 horas de incubación.

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Radiaciones: UltravioletaLas radiaciones electromagnéticas ionizantes son una forma de esterilización física muy efectiva pero su manejo se ve restringido por la necesidad de disponer de instalaciones especiales para la emisión radioactiva. Durante las prácticas se manejará material adquirido de casas comerciales esterilizado mediante radiación γ, una radiación muy penetrante y útil para la esterilización de material termolábil como el plástico.

En el laboratorio de prácticas utilizaremos la luz ultravioleta (UV) cuyo efecto biocida se debe a que provoca la formación de dímeros de timina en el DNA. Esta radiación tiene muy baja capacidad de penetración por lo que su uso se ve restringido al tratamiento de superficies o a la esterilización del aire en "salas limpias" como los quirófanos o las instalaciones como las unidades de cultivo celular.

Material necesario:

Cultivo mixto Placa con agar nutritivo Papel de aluminio Lampara de luz ultravioleta germicida

Para la realización de esta práctica lo primero que haremos será inocular mediante un agotamiento de asa un cultivo mixto en una placa con agar nutritivo. Posteriormente, levantamos la tapa y cubriremos la mitad con el papel de aluminio (sin que éste toque la superficie del medio). Colocar la placa abierta bajo la acción de la lámpara ultravioleta durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, quitar el papel de alumnio, cerrar la placa y llevar aincubar a 37ºC. Tras 24 horas de incubación observaremos el desarrollo microbiano en la parte protegida de la radiación, frente a la ausencia de crecimiento en la parte expuesta.

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Técnicas de Aislamiento y RecuentoFundamento

En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran diversos

microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la

separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.

Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la

inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos. Al

depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta quedará

inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes del medio. Las

nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras sucesivas generaciones

conformarán lo que denominamos una "colonia" que no es más que un montón de células

derivadas de una sola célula madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al

sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y presenta diferentes características según el

microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas

que se encuentran en la muestra sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un

nuevo medio de cultivo estéril, a estos cultivos los consideraremos "puros" por poseer un sólo tipo

de microorganismo. (El fundamento es válido teniendo en cuenta sólo microorganismos cultivables)

Objetivos

Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto.

Aplicar técnicas de aislamiento para la localización de microorganismos concretos en muestras

contaminadas o con flora mixta.

Aplicar las técnicas del agotamiento y las estrías escocesas como las más habituales en

aislamiento de microorganismos cultivables.

Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos.

Realización práctica

Técnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en un

cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar nutritivo, una

mediante la técnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estrias escocesas.

Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de cultivo de

forma que, en los últimos trazos de la siembra, haya tan pocas células que queden suficientemente

separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias independientes.

Técnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de diluciones

seriadas a partir del cultivo mixto Con esta técnica conseguimos además de aislar colonias,

obtener un recuento del número de bacterias que tenemos en el cultivo.

Esquema que representa el aislamiento de un microorganismo cultivableunicelular (dibujos de José Mª Costa).

Influencia del medio ambienteLas condiciones físico químicas del medio ambiente tienen una gran influencia sobre el crecimiento de los microorganismos. La temperatura, el pH, la tensión de CO2, el potencial de oxidoreducción, la humedad, la presión osmótica y la aireación, son factores externos que deben ser controlados para optimizar la velocidad de crecimiento microbiano.

TemperaturaInfluencia de la temperatura en el crecimiento microbianoContenido

Factores que influyen en el desarrollo de microorganismos: la temperatura. Temperatura máxima,

óptima y mínima. Hipertermófilos, termófilos, mesófilos y psicrófilos.

Fundamento

El crecimiento de los microorganismos se encuentra influenciado por varios factores. Entre ellos los

más importantes son la aireación y la temperatura. En cuanto a este último, la Temperatura, los

microorganismos tienen un margen de temperaturas en el cual pueden crecer. Este margen viene

delimitado por la temperatura máxima de crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso

mueren; la temperatura mínima por debajo de la cual no pueden crecer aunque generalmente no

mueren; y la temperatura óptima a la cual ofrecen el mejor crecimiento.

Atendiendo a este margen de temperatura de crecimiento, los microorganismos se clasifican en:

Hipertermófilos:Su temperatura óptima se encuentra por encima de los 80ºC. Muchos de ellos son

arqueas.

Termófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre 45-70ºC. Suelen ser microorganismos de vida libreMesófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre los 25-45ºC. Incluye microorganismos patógenos y comensales del hombre y animales de sangre caliente y algunos de vida libre.Psicótrofos: La temperatura óptima de los microorganismos de este grupo está por debajo de los 25 – 30°C incluye microorganismos de vida libre.Psicrófilos: Su temperatura óptima de desarrollo se encuentra entre los 12 – 15°C

Los métodos que se emplean para obtener una temperatura constante para el cultivo in vitro de los microorganismos son:

1. La estufa de cultivo.- En ella pueden haber oscilaciones de 1 a 3ºC.

2. El baño termostatizado.- Permite un mantenimiento más estable de la temperatura. En él

las oscilaciones suelen ser inferiores a 1ºC.

Objetivos

Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los microorganismos.

Realización práctica

Se siembran tres placas de agar nutritivo con el cultivo mixto mediante la técnica de agotamiento

de asa o de las estrías escocesas.

Se llevan a incubar a temperatura ambiente (25ºC aproximadamente), 4ºC, 37ºC y 60ºC durante 24

horas.

Tras la incubación se observa que las placas que estuvieron a 4 y 60ºC no presentan crecimiento

alguno, mientras que las dos placas incubadas una a temperatura ambiente y otra a 37ºC, ambas

presentan crecimiento aunque este es mayor en la que se incubó a 37ºC. Por lo que la conclusión

es que los microorganismos presentes en el cultivo son mesófilos, ya que crecen óptimamente a

37ºC, mientras que la temperatura ambiente, de entre 22-25ºC, se encuentra dentro de su rango de

crecimiento ya que han crecido pero menos.

24 horas a temperatura ambiente 24 horas a 37ºC

24 horas a 4ºC 24 horas a 60ºCPara comprobar el efecto de la temperatura mínima (4ºC) y la temperatura máxima (60ºC) se llevan

a incubar estas dos placas ahora a 37ºC durante 24 horas. Tras este periodo de incubación se

observa que los microorganismos previamente sometidos a 4ºC crecen normalmente mientras que

en la placa que había sido incubada previamente a 60ºC o no crece nada, o pueden aparecer unas

pocas colonias lo que indica que alguna especie presente en el cultivo mixto es productora de

esporas, estructuras que son resistentes a factores ambientales adversos como las altas

temperaturas.

Placa de 4ºC incubada 24 h a 37ºC Placa de 60ºC incubada 24 h a 37ºC

Observación MicroscópicaEl microscopio es una herramienta de gran importancia para la observación e identificación de los microorganismos. Debemos distinguir entre las técnicas para observación de microorganismos vivos y las preparaciones para tinción. Las tinciones ofrecen una información adicional a la simple observación de la morfología, ya que ponen de manifiesto características de la pared celular o la existencia de estructuras especiales, como las esporas bacterianas.

Para observar bacterias al microscopio se utiliza el objetivo de inmersión (máximo aumento). Para ello se coloca sobre la preparación una gota de aceite de inmersión. Para enfocar con este objetivo, colocar la preparación con el aceite en la platina del microscopio, aproximarla con el tornillo macrométrico MIRANDO DESDE FUERA, hasta que el objetivo toque el aceite.

Posteriormente, ya mirando por el ocular, hacer un enfoque grosero con ayuda del mismo tornillo. Cuando se aprecie una imagen más o menos clara, ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico.

Observación en fresco Fijación al calor Tinción de Gram Tinción de esporas Tinción de Ziehl-Neelsen

Observación en frescoMaterial

Cultivo puro Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Aceite de inmersión

A partir de cultivos en medio líquido se procede de la siguiente forma: Cargar el asa bacteriológica con una gota de de cultivo y depositarla en un portaobjetos limpio. Colocar un cubreobjetos procurando que no queden atrapadas burbujas de aire. Si la cantidad de cultivo que recoge el asa es muy pequeña se carga 2 o 3 veces.

A partir de cultivos en medio sólido, en primer lugar se procede a colocar una gota de agua en el portaobjetos. A continuación se carga el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende en la gota de agua. Colocar el cubrebjetos. La preparación se observa al microscipio pudiendo determinar su morfología (cocos o bacilos) al igual que la movilidad.

A continuación se muestran imágenes de preparaciones bacterianas en un microscopio conectado a una televisión

Observación en fresco de un cultivo de Staphylococcus (cocos)

Observación en fresco de un cultivo de Pseudomonas (bacilos)

Fijación al calor

A partir de cultivos en medio líquido se carga el asa bacteriológica con una gota de de cultivo y se deposita en un portaobjetos limpio realizando una extensión de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis). Si partimos de un cultivo en medio sólido, primeramente dispondremos una pequeña gota de agua en el portaobjetos. A continuación se carga el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende en la gota de agua, tras lo cual realizaremos el frotis.

Posteriormente debemos secar la preparación acercándola a la llama del mechero evitando que se caliente demasiado (comprobar con el dorso de la mano que no quema). Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte inferior del portaobjetos). A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del tipo de tinción.

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Tinción de GramMaterial

Portaobjetos con muestra fijada al calor Batería de colorantes. Cristal-Violeta y Safranina Solución de decoloración de Alcohol-Acetona Pinzas metálicas Cronómetro

Procedimiento

1. Sumergir el portaobjetos en cristal-violeta de genciana y mantener durante 1 minuto.2. Lavar con agua y dejar escurrir3. Sumergir en lugol. Dejar actuar 1 minuto.4. Lavar con agua y dejar escurrir5. Decolorar con alcohol-acetona durante 15 segundos.6. Sacarlo e inmediatamente sumergirlo en safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto.7. Lavar con agua y secar con papel de filtro.

En la observación microscópica las bacterias Gram-positivas aparecen teñidas de color violeta, y las Gram-negativas de rosa.

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Tinción de Ziehl-NeelsenLa Tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción para micobacterias

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Tinción de esporasMaterial

Portaobjetos con muestra fijada al calor Batería de colorantes. Verde Malaquita y Safranina Hisopo para flamear Pinzas metálicas Cronómetro

Procedimiento

1. Cubrir el portaobjetos con verde malaquita.2. Calentar hasta la emisión de vapores. Mantener durante 3 minutos.3. Lavar con agua.4. Cubrir del portaobjetos con safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto.5. Lavar con agua y secar con papel de filtro.

En la observación microscópica las esporas aparecen teñidas de verde y las células vegetativas de rosa.

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Identificación BacterianaContenidos: Pruebas fisiológicas y bioquímicas de identificación bacteriana.FundamentoPara identificar bacterias es imprescindible poner de manifiesto rasgos especiales de su metabolismo y fisiología ya que, la simple observación de su forma y tamaño, ofrece una información muy limitada que apenas nos permite encuadrarlas en grandes grupos. Incluso las tinciones diferenciales son una herramienta muy útil pero insuficiente para llegar al nivel necesario de información que nos permita dar un diagnóstico, orientar la terapia y facilitar un pronóstico del proceso infeccioso.Objetivos concretos

Utilizar medios de cultivo y reactivos para poner de manifiesto peculiaridades en el

metabolismo bacteriano.

Leer resultados de pruebas metabólicas interpretando adecuadamente los mismos.

Identificar una bacteria mediante la realización de pruebas bioquímicas y observación

microscópica en fresco y con tinciones.

Realización prácticaPara la realización de esta práctica se trabajará con un cultivo puro en medio sólido (agar nutritivo) que se suministrará a cada mesa. Se repartirán distintas bacterias identificadas por un número o letra. Al finalizar la práctica, cada mesa de trabajo debe tener una sospecha de identificación para la cepa suministrada.

Acidificación de hidratos de carbonoFundamento

Se determina la capacidad de la bacteria para utilizar hidratos de carbono produciendo ácido o

ácido y gas.

Para ello se utiliza el medio con hierro de Kliger (Kliger Iron Agar o KIA), en el que también se

puede observar la producción de sulfhídrico.

Este medio contiene lactosa y glucosa como sustratos de carbono fermentables. Tiosulfato de

sodio como sustrato necesario para la producción de sulfhídrico, citrato de hierro y amonio como

fuente de iones de Fe+3 que se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro de

color negro. Además contiene rojo de fenol como indicador de pH.

Realización práctica

Se realiza una siembra de la bacteria problema utilizando el asa bacteriológica, comenzando por

una picadura desde el centro de la superficie inclinada (slant) hacia el fondo del tubo; al retroceder

se realiza una estría en la superficie del slant.

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Se incuba durante 24 horas a 37ºC. Transcurrido este tiempo se observa la aparición de

coloración amarilla en la superficie y en el fondo del tubo.

a) La coloración amarilla del fondo indica que se ha fermentado la glucosa, además esta

fermentación puede haber producido gas (metabolitos gaseosos) que se manifiestan por burbujas

o roturas del agar del fondo.

b) La coloración amarilla en el slant o superficie inclinada del medio indica que se ha degradado la

lactosa produciendo acidez.

Según esto podemos encontrarnos diferentes resultados que se observan en las figuras.

Glucosa - Lactosa - Gas - Glucosa- Lactosa + Gas -

Glucosa + Lactosa - Gas + Glucosa + Lactosa + Gas +

Capacidad hemolíticaFundamentoMuchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen responden de diferente manera según realicen o no la lisis de los glóbulos rojos (hemólisis) producida por la acción de una enzima llamada hemolisinaPodemos diferenciar tres tipos de hemólisis:Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso.

Hemólisis beta: en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente.

Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.

Realización práctica:Se realiza una siembra del cultivo puro mediante la técnica del agotamiento de asa en una placa de agar sangre. Tras 24 horas de incubación observar la presencia de halos de hemólisis alrededor de las colonias e identificar el tipo de hemólisis que realiza nuestro microorganismo.

CatalasaFundamentoPone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta enzima es capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas.

Realización prácticaUtilizar una placa con el microorganismos crecido y en una zona donde haya bastante crecimiento

añadir unas gotas de agua oxigenada y observar si en el transcurso de unos segundos se produce

o no la aparición de burbujas.

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Catalasa positivo: se produce la aparición de burbujas que corresponde a la liberación de oxígeno, lo que indica que la bacteria tiene el enzima catalasa. Catalasa negativo: no se producen burbujas por tanto la bacteria no posee dicho enzima.

Micrococcus luteus: catalasa positivo

OxidasaFundamentoEsta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.Se investiga la presencia del enzima citocromo-oxidasa en la bacteria en estudio.Realización prácticaUtilizamos tiras de papel impregnadas con el reactivo para-amino-N-dimetil-anilina, que se oxida por la citocromo-oxidasa. El procedimiento consiste en impregnar la zona coloreada de la tira reactiva con una masa de bacterias.Se observa si en el transcurso de un minuto la zona impregnada vira a un color azul-violeta.

oxidasa - oxidasa +

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AntibiogramaPara conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton.

Material

Cultivo Puro de un microorganismo Placa con medio de Mueller-Hinton Pinzas metálicas Discos de antibióticos

Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped. La siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo líquido o se impregna en un cultivo sólido.

Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibióticos a testar.

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Los antibióticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión en alcohol. Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no hayan interferencias entre la acción de unas sustancias y otras.

La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.