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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

(CURSO 2012–2013)

Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013) Martes

PRÁCTICAS A REALIZAR

ANÁLISIS CUANTITATIVO

DE ORINAM-1 Lectura

de la placa de Agar CLED

ANÁLISIS CUALITATIVO

DE ORINA

M-2Identificación presuntiva

de las colonias crecidas en las placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey

M-3Tinción de Gram

de colonias aisladas en las placas deAgar Cromogénico y Agar MacConkey

M-4 Prueba de la citocromo-oxidasaa la presunta enterobacteria

M-5 Siembra de la colonia seleccionadaen Agar MacConkey

LECTURA Y CONCLUSIONES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVODE LA MUESTRA DE ORINA

FUNDAMENTO

Tratamos de conocer el número de microorganismos presentes por cada mililitro de orina.

Independientemente del número, la presencia de ciertos microorganismos, por ejemplo, levaduras o estafilococos en cultivo puro, es suficiente para considerar que existe un proceso infeccioso.

METODOLOGÍA

Como hemos sembrado 1μL de muestra, si multiplicamos el número de UFC (unidades formadoras de colonias) que aparezcan en la placa por 1.000, obtendremos el número de microorganismos presentes por cada mL de orina.

La OMS recomienda utilizar el índice de Kass (105 UFC/mL de orina) como umbral para considerar o no la existencia de una posible infección (> 105 UFC, bacteriuria significativa).

De todas formas, este valor es sólo indicativo, ya que hay personas que presentando valores superiores al índice de Kass, están perfectamente sanas y otras, en cambio, tienen infección en el tracto urinario (ITU) aun cuando no presentan más de 102 ó 103 UFC/mL de orina.


ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINALectura de la placa de Agar CLED

Inoculada con un volumen de 1 μl de orina

Contar el número de UFC en la placa

Ejemplo:

Nº UFC/µL = 35

Nº UFC/mL = 35 x 103 = 3,5 x 104

Nº UFC/mL = 0,35 x 105

Nº BACTERIAS EN ORINA

Nº > 105 / mL Bacteriuria significativaProbable infección

105 /mL > Nº > 104 /mL Diagnóstico dudosoDebe repetirse el análisis

Nº < 104 / mL Bacteriuria no significativaProbable contaminación


ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINAIdentificación presuntiva de colonias

Utilizaremos las placas:

Agar de MacConkey Moderadamente selectivo

Agar Cromogénico No selectivo

Observaremos la pigmentación de las colonias y consultaremos la tabla.


INDIVIDUO SIN FACTORES

PREDISPONENTES

INDIVIDUO CON FACTORES

PREDISPONENTES

FRECUENTES

Escherichia coliProteus mirabilisKlebsiella pneumoniae

Escherichia coliPseudomonas aeruginosaOtras enterobacteriasEnterococosStaphylococcus epidermidisCandida albicans

POCO FRECUENTES

EnterococosStaphylococcus saprophyticus

Corynebacterium urealyticum

AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTEEN INFECCIONES URINARIAS


Agar de MacConkey

No fermentala lactosa

Fermentala lactosa


Agar de MacConkey

Zona oscurecida alrededor de las colonias debida al precipitado de las

sales biliares cuando el medio se hace fuertemente ácido


Microorganismo Fermentadorde lactosa

Tipo de fermentación de

la glucosa

Liberación de ácidos

Liberaciónde CO2

Escherichia coli Fuerte Ácido mixta Muchos Poco

Enterobacter aerogenes

Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho

Klebsiella pneumoniae Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho

Citrobacter Lento Ácido mixta Muchos Poco

Serratia Lento Ácido mixta Butilén-glicólica

Muchos Pocos

PocoMucho

FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS

Salmonella, Shigella, Proteus, Edwarsiella y Providencia: no fermentan la lactosa


PIGMENTACIÓN DE COLONIAS

BACTERIA CLED MACCONKEY CROMOGÉNICO

Escherichia coli Amarillo (grandes)Rojo-rosa

(precipitado)Rosa

Klebsiella Amarillo-azul-blanquecino

Rosa (mucosa)

Azul oscuroPúrpura

Proteus Azul translúcido Incolora Halo marrón

Salmonella Azul Incolora -

Pseudomonasaeruginosa Verde -

VerdeMarrón

Staphylococcusaureus Amarillo dorado No crece

BlancoCrema

S. epidermidis Amarillo pálido No creceRosa

Blanco pálido

Enterococcusfaecalis Amarillo No crece

AzulTurquesa

Estreptococcus - No crece Blanco


Se seleccionará una de estas colonias y se le realizará la prueba de la oxidasa

La prueba de la oxidasa debe salir negativa

(todas las enterobacterias sonoxidasa negativas)


Se realizarán tinciones de Gram a colonias aisladas y se observarán al microscopio

Interesan únicamente las colonias que se correspondan con bacilos Gram negativos

Tinción de Gram

1. Extensión.2. Desecación.3. Fijación.4. Colorante: Cristal violeta, 2 minutos.5. Lavar con agua.6. Mordiente: Lugol, 2 minutos.7. Lavar abundantemente con agua.8. Decoloración: Alcohol etílico 96%, 20 segundos.9. Lavar abundantemente con agua.10. Colorante de contraste: Safranina, 3-4 minutos.11. Lavar abundantemente con agua.12. Dejar secar a temperatura ambiente.13. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X).


Gram positiva Gram negativa

Extender y fijarla preparación

Etanol

Lugol

Cristal violeta

Safranina


Gram positivas

Gramnegativas

Tinciónde Gram


Prueba positiva

Aparición de color azul-violeta intenso en 10-15 segundos, debido a la formación de azul de indofenol.

Control positivo

Pseudomonas aeruginosa.

Procedimiento

Depositar unas gotas dereactivo (tetrametil-p-feniléndiamina) sobre un papel de filtro. Inmediatamente, con la ayuda de un palillo estéril extender un inóculo de la bacteria sobre el papel de filtro impregnado de reactivo.

Prueba de la citocromo oxidasa

Fundamento

Determinar la presencia delenzima citocromo c oxidasa.

- +


SIEMBRA DE LA COLONIA SELECCIONADACOMO PRESUNTA ENTEROBACTERIA EN PLACA DE AGAR DE MACCONKEY

La colonia seleccionada debe cumplir:

Haber sido aislada en Agar Cromogénico o en Agar de MacConkey

Se corresponde con bacilos cortos Gram negativos

Dar negativa la prueba de la oxidasa


Siembra por estrías en sectoresde la placa de Agar de MacConkey


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