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TEMA 9
MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
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INDICE DE CONTENIDOS
� Introducción� Tipos de microscopía óptica
� Microscopía de campo claro� Microscopía de campo oscuro� Microscopía de contraste de fases� Microscopía de fluorescencia
� Examen microscópico de material fresco� Examen microscópico de material fresco levemente modificado
� Hidróxido de potasio al 10 %� Tinta china (marca Pelikan) o nigrosina� Lugol� Lugol� Anticuerpos
� Microscopía óptica � Tinción de gram� Tinción ácido alcohol resistente
� Microscopía de fluorescencia. Fundamento� Colorantes para la microscopía de fluorescencia y aplicaciones
� Auramina-Rodamina� Naranja de acridina� Blanco de calcofúor� Isotiocianato de fluoresceína
� Inmunofluorescencia� Microscopía electrónica
� Barrido� Transmisión
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TIPOS DE MICROSCOPÍA
� MICROSCOPÍA ÓPTICA� MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO
� MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO
� MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES
� MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA� INMUNOFLUORESCENCIA
� MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA� TRANSMISIÓN
� BARRIDO
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TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE MUESTRAS SIN TEÑIR
� MONTAJE DIRECTO� OBSERVACIÓN DE MOVILIDAD� OBSERVACIÓN DE ESPIROQUETAS� OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O
CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado)
� TÉCNICA DE LA GOTA PENDIENTE� MOVILIDAD� OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O
CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado)
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OBSERVACIÓN DE Treponema pallidum ENCAMPO OSCURO O CONTRASTE DE FASES
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PREPARACIONES LEVEMENTE MODIFICADAS
� MONTAJE EN KOH 10%� AZUL DE LACTOFENOL PARAOBSERVACIÓN DE HONGOS
� TINTA CHINA O NIGROSINA� OBSERVACIÓN DE HONGOS
� MONTAJE EN YODO (LUGOL)� OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS
� REACCIÓN DE NEUFELD “QUELLUNG” PARA DETECCIÓN DE Streptococcus pneumoniae Y Haemophilus influenzae tipo b capsulado
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Observación de hongos
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Observación de huevos y parásitos
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MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO. OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES TEÑIDAS
•Tinción de Gram
•Gram positivos y Gram negativos
•Morfología
•Agrupaciones•Agrupaciones
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Ejemplos de bacterias y levaduras teñidas
Cocos gram positivos en extendidos directos de pus
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Ejemplos de bacterias gram positivas y gram negativas
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OBSERVACIÓN DE BAAR EN EXTENDIDOS DIRECTOS
Tinción ácido alcohol resistente:
Método en caliente (Ziehl-Nielsen)
Método en frío (Kinyoun)
Micobacterias, Nocardia, algunos Micobacterias, Nocardia, algunos hongos como Cryptococcus neoformans
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PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
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Principales fluorocromos utilizados
� Naranja de acridina colorante vital
� Auramina-Rodamina micobacterias
� Blanco de calcoflúor hongos
� Isotiocianato (inmunofluorescencia)
de fluoresceínade fluoresceína
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COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA FLUORESCENTE CON LA TINCIÓN DE GRAM
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COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE FLUORESCENCIA Y ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA PARA LA DETECCIÓN DE MICOBACTERIAS
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Ventajas de la fluorescencia
� Ventajas de la fluorescencia� Mayor sensibilidad
� Microscopio 25x ó 40x
� Especificidad en la tinción de auramina-� Especificidad en la tinción de auramina-rodamina
� Naranja de acridina colorante vital (permite ver si son viables)
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PRINCIPIO DE LA INMUNOFLUORESCENCIA
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DETECCIÓN DE LEGIONELLA Y BORDETELLAMEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA
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DETECCIÓN DE YERSINIA PESTIS
Detección de Yersinia pestis mediante inmunofluorescencia
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DETECCIÓN DE VIRUS POR INMUNOFLUORESCENCIA
Detección de CMV mediante inmunofluorescencia directa
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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
� MICROSCOPÍA ÓPTICA� HAZ DE LUZ� LENTES� MUESTRAS INTACTAS O
FIJADAS� AMPLIFICACIÓN 1000X
� MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
� HAZ DE ELECTRONES� CAMPOS
MAGNÉTICOS
TRANSMISIÓN BARRIDO
�MUESTRAS FIJADAS E INCLUIDAS EN RESINA�CORTES ULTRAFINOS (TRANSMISIÓN)�AMPLIFICACIÓN 100.000X
�MUESTRAS FIJADAS SOBRE UNA SUPERFICIE�BARRIDO DEL HAZ SOBRE LA SUPERFICIE�AMPLIFICACIÓN 100.000X
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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
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DETECCIÓN DE PARTÍCULAS DE VIRUS POR MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
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USOS MÁS FRECUENTES DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA
GRUPO DE MICROORGANISMO
MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
BACTERIAS + + +/- -
HONGOS + + - -+ + - -
PARÁSITOS + + - -
VIRUS - + - ´+
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Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones
Microscopia óptica
Campo claro El contraste se logra por absorción. Imagen clara. Las muestras requieren tinción. Para
observar organismos completos.
Contraste de fases El contraste se consigue por
interferencia; las diferencias en
el indice de refracción cambian
la fase de la luz
Imágenes claras y detalladas rodeadas
de un balo.
No requiere tinción; se pueden observar
preparaciones en fresco de
células vivas.
Movilidad
Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la
muestra entra en el objetivo,
produciéndose un contraste
elevado.
Imagen brillante contra un fondo
oscuro.
Para observar células vivas o flagelos
demasiado finos para la
microscopia de contraste de
fases; pocos detalles internos.
CARACTERÍSTICAS CLAVE DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
elevado. fases; pocos detalles internos.
Movilidad.
Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir luz
visible que tienen los
especimenes fluorescentes
cuando se les ilumina con luz uv.
Especimenes muy coloreados
(luminosos) contra un fondo
oscuro.
Utilizando anticuerpos fluorescentes se
pueden identificar tipos
especificos de microorganismos
en una mezcla compleja.
Microscopía electrónica
Transmisión (MET) Hace pasar un haz de electrones a través
de la preparación, produciendo
un gran aumento útil
Imágenes muy ampliadas con gran
detalle.
Para observar virus y la ultraestructura
celular. No se pueden observar
organismos vivos porque las
preparaciones ban de ser
totalmente desecadas.
Barrido (MEB) Barre los especimenes con un chorro de
electrones, produciendo la salida
de electrones secundarios que
crean una señal, que, a su vez,
genera una imagen por
ordenador.
Imagen tridimensional. Para ver estructuras de organismos
intactos, e incluso estructuras
internas con detalles reales. Las
muestras han de ser desecadas,
por tanto, no se puede aplicar a
organismos vivos