UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIASDEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUIMICAPRACTICA Nº 10

OBTENCIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS Y COMPROBACIÓN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCÓLISIS.

OBJETIVOS

1. Obtener preparados de amilasa salival y - d- fructofuranosidasa.2. Comprobar la actividad de estas dos enzimas en diferentes muestras.

CONSULTAR TEORÍA RELACIONADA.

Materiales reactivos

Beaker de 200 y 500 ml sacarosaEspátula lugolPipetas de 5 y 10ml hidroquinona al 0,5%Mortero peróxido de hidrógeno al 3%Cápsulas de porcelana ( 2 ) cloroformoFrasco lavador etanolProbeta de 50 ml fehling A y BEmbudo levadura (debe traerla cada grupo Bomba de vacío de práctica 4 días antes).Papel filtro.

PROCEDIMIENTO.

1. Obtención del preparado de amilasa salival y comprobación de su actividad.

Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de comida.

Se mide en una probeta 30 ml de agua destilada y con ella se enjuaga la boca por espacio de 3 a 5 min . el líquido recogido se filtra a través de un algodón y el filtrado se utiliza para los siguientes ensayos.

En dos tubos de ensayo se vierten 3 ml de solución de almidón al 1%, en uno de ellos se agrega 3ml de agua y en el otro 3ml del preparado enzimático y se introducen en un baño de maría a 40ºC por 5min. Tomando una gota de cada tubo y combinándola con una gota de lugol en una cápsula de porcelana. Repita esta operación a los 10, 15, 20,25 y 30 min.

Al tubo que contiene la enzima se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B o en su defecto 1ml de reactivo de benedict. Coloque a calentar hasta que ebulla. Observe.

2. Obtención del preparado de - d- fructofuranosidasa y comprobación de su actividad.

Se trituran 50 g de levadura de cerveza con 3 g de carbonato de calcio hasta formar una pasta homogénea que se coloca en un beaker de 200ml. Se añaden 13 ml de cloroformo y se deja por 4 días a temperatura ambiente, alejado de los roedores, después de los 4 días se filtra y al filtrado se le agrega un volumen igual de etanol, el precipitado se lava con mínimas cantidades de alcohol y éter y se seca al vacio, una solución al 1% de esta sustancia se utiliza para el experimento.

Prepare una solución de sacarosa al 1%.

En dos tubos de ensayo se vierten en cada uno 2.5 ml de la solución de sacarosa al 1% y 2.5 ml de solución de invertasa, en uno de ellos previamente calentado hasta ebullición. Ambos tubos de ensayo se colocan en un baño de maría a 30ºC por 5 min.

Para determinar el poder reductor se toma 0.5ml de cada tubo de ensayo y se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B, y se calienta hasta que comience a ebullir. Observar lo que sucede.

3. Obtención de un preparado de peroxidasa y comprobación de su actividad.

Se trituran 2.5 g de papa y se trasladan para una probeta y se le agrega agua hasta completar 20 ml. Se deja en reposo durante 10 min, y se filtra.

Se toman dos tubos de ensayo, en uno se vierte 1 ml de extracto enzimático y en el otro 1 ml de agua destilada. A cada uno se le agrega 1 ml de solución de hidroquinonoa al 0,5% y 1ml de solución de peróxido de hidrógeno al 3%.

Preguntas.

1. Por qué se utiliza lugol en la determinación de la actividad de amilasa salival.2. Por que a medida que pasa el tiempo la coloración de la mezcla de amilasa salival va

cambiando.3. Que función cumple el carbonato de calcio en la actividad enzimática de la enzima invertasa.4. Con que objeto se utiliza el cloroformo en la levadura para la determinación de la actividad de

la enzima - d- fructofuranosidasa.5. Cual es la reacción que permite la formación del color en la determinación de la actividad de la

peroxidasa.

BIBLIOGRAFÍA:

PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.

LÓPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogotá.