Práctica IV Amplificación de un gen eucarionte por la técnica de PCR

Laboratorio de Ingeniería Genética Grupo 1 M. en C. Ana Laura Torres Huerta

Equipo 5 Xochitl Citlalli Romo Sandoval A01163289 Elia Arenas Cruz A01163232 Mario Alfonso Arenas García A01162581

9/26/2012

Introducción

La PCR (reacción en cadena de polimerización, por sus siglas en inglés) es un método que permite la amplificación exponencial del ADN; consiste en la separación del ADN por medio del calor para que pueda ser copiada por el ADN polimerasa y el proceso se repite cuantas veces se desee.

Al hacer la PCR, se requiere de un primer y de una DNA polimerasa adecuada para lo que se desea obtener. Como tal, son necesarios dos primers (para cada cadena) que flanqueen la secuencia deseada; si se desea hacer amplificación selectiva, es recomendable tener un poco de la información de la secuencia, y se agregan en exceso para que no se detenga el proceso. En cuanto al DNA polimerasa, ésta debe resistir al calor para evitar que se desnaturalice y que se agregue constantemente al proceso; por lo general se usa a Taq polimerasa (proviene de Thermus aquaticus) ya que se puede dejar por múltiples ciclos sin cambiarlo. [1]

En síntesis, el proceso ocurre de la siguiente forma [2]:

i. Se agrega ADN deseado y los componentes de la reacción (se mezclan bien desde un inicio)ii. Se calienta a 90ºC para desnaturalizar el ADNiii. Conforme la temperatura baja, los primers se hibridan en sus secuencias indicadas y Taq pol.

inicia el copiado de las cadenas templadoiv. Se completa el ciclo y nuevamente se repite, iniciando en el paso i.

Es importante destacar que si hay trazas diminutas de contaminación en la muestra, puede que se pueda arruinar el experimento como tal ya que su finalidad es ampliar la cantidad de ADN presente; por lo que es necesario que se lleve a cabo con particular limpieza y con cuidado.

Hay múltiples variaciones del PCR, que se detallan a continuación:

Anidada ( Nested )

Se utilizan dos sets de primers; el primero genera un producto normal de PCR mientras que el segundo se encuentra más ‘adentro’ de este producto (por eso se denominan internos o nested) y éstos generean un producto más corto. Esta PCR aumenta la sensibilidad y la especificidad de la reacción, esto es debido a que con un solo ciclo no se puede obtener un producto único (aquél que contiene el fragmento correcto de ADN que tiene los sitios de hibridación para el segundo par de primers) ya que se parte de un molde complejo. [3]

Transcriptasa Reversa

La técnica de transcriptasa reversa de PCR permite la amplificación de moléculas de mARN en forma de ADN complementario (cDNA). Este método se utiliza principalmente para la detección de virus como el de la Inmunodeficiencia Humana o el de la Hepatitis C. [4] La detección de mRNA permite el análisis de microorganismos así como el estudio de la expresión génica en células huéspedes humanos. También se usa para la síntesis de cDNA se requiere de dNTPs, un buffer, Taq polimerasa, primers, la enzima transcriptasa reversa y un molde de RNA. La reacción es calentada a 37° C, lo que permite que la enzima de la transcriptasa reversa trabaje y se efectúe la producción del cDNA. Después de la síntesis de la primera hebra, se realiza una PCR tradicional para la amplificación del producto del cDNA. Posteriormente, el ADN de doble cadena se amplifica de manera tradicional. [5]

Figura 1. Nested PCR

Múltiple

El método de la PCR múltiple amplifica simultáneamente en un único tubo distintas secuencias específicas. Se utiliza para la detección de patógenos múltiples en una reacción única, esto se logra a través de varios cebadores, puesto que cada uno se dirige a un patógeno diferente.[6] Es necesario tomar en cuenta para el diseño de primers que éstos no interaccionen entre sí, que funcionen a temperaturas similares y que los amplicones generados sean de tamaños distintos para que después de la amplificación puedan ser separados y diferenciados. Las limitaciones de la PCR múltiple se relacionan con las posibles interacciones entre los diferentes primers. [7]

Hot Start

La técnica de Hot Start PCR inhibe la actividad de la polimerasa durante la preparación de la reacción de la PCR, ésta comienza cuando la temperatura de la mezcla es alta para que de este modo no se produzcan hibridaciones inespecíficas. [8] Los métodos que permiten la activación de las DNA polimerasas incluyen modificaciones químicas, físicas, unión a anticuerpos entre otros.

PCR de colonia

Para la PCR de una colonia bacteriana se sigue el mismo protocolo que un PCR convencional, sin embargo, en esta técnica se utiliza una fracción de una colonia bacteriana en lugar del ADN templado, para esto se hace uso de una micropipeta. La colonia bacteriana utilizada no tiene la necesidad de crecer en un medio y se ahorra tiempo pues los plásmidos no requieren ser purificados. [9]

Polymerase cycling assembly

La técnica de Polymerase cycling assembly (PCA) permite la síntesis artificial de estructuras largas de DNA. Del mismo modo que en la PCR tradicional, se diseñan primers para la síntesis, sin embargo, en este método los oligonucleótidos tienen longitudes de 50 pb para asegurar una correcta hibridación. [10]

Tiempo Real

Uno de los inconvenientes de la PCR convencional es que carece de ser una técnica cuantitativa, por lo que para solucionar esta limitante se ha desarrollado una variación conocida como PCR en tiempo real. Esta variación consiste en detectar en tiempo real la amplificación de nuestra muestra de interés. [11] La técnica consiste en utilizar una sonda complementaria que lleve adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhiba esta fluorescencia. La molécula fluorescente se libera cuando la sonda es desplazada por la DNA polimerasa y a su vez emite fluorescencia al ser detectada por un láser. Se lleva a cabo una cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de PCR, la cual se cuantifica de manera proporcional a la cantidad de DNA amplificado. [12] Es importante mencionar que la cuantificación requiere de una curva patrón para conocer la cantidad total de DNA amplificado.

Droplet digital

Otra variante de la PCR convencional es llamada Droplet Digital PCR, esta técnica consiste en una partición de la muestra en miles de gotas en tamaño de nanolitros. Una vez obtenida la partición en miles de gotas (aprox. 20,000 gotas por cada 20 microlitros de muestra), se realiza una PCR en termociclador; finalmente un software especializado registra la fluorescencia emitida mediante detección de dos colores para determinar gotas positivas (secuencia blanco) y negativas. La fracción de gotas positivas permite determinar la concentración de DNA blanco en la muestra por cada microlitro. [13]

En esta práctica se reporta la amplificación de un gen ScRad51, de una muestra de DNA de E. coli y de una muestra de levadura mediante la técnica de PCR convencional; para finalmente realizar un análisis de los resultados en gel de agarosa.

Objetivos

Comprender los mecanismos para hacer los cálculos de MIX, aplicar una técnica de PCR para amplificar un gen eucarionte y finalmente analizar el producto de PCR en gel de agarosa.

Cuestionario

1. Cantidad requerida de ADN templado (genómico, plásmico y cDNA) para realizar la PCR. [1] [2]

- ADN genómico: 0.5 - 1.0 mg

- ADN plásmico: 1.0 – 2.0 ng

- cDNA: 20 – 25 μg

2. Características de la Taq polimerasa utilizada en la práctica (Kit Taq pol. Invitrogen Cat. 11615)

Se utiliza en la PCR ya que su actividad es estable a temperaturas altas (95ºC). Sus propiedades son [3]:

p.H óptimo de 9 Actividad volumétrica: 5 U/μl Termoestabilidad: retiene 80% de su actividad enzimática después de 30 ciclos

3. ¿Para qué sirve variar las características que deben cumplir los primers para considerarse en su diseño?

MgCl2 es un co-factor para el ADN pol.; entonces su variación en concentraciones influye mucho en la PCR. Muy poco magnesio causa que haya poco o nada de producto PCR; demasiado Mg2+ promueve el apareamiento erróneo de bases. Se debe de encontrar un punto óptimo. [4]

4. ¿Cuáles son las características que deben cumplir los primers para considerarse en su diseño? [5]

- Dentro de 18-30 bp en longitud, con %GC de entre 40 y 60

- Evitar usar primers con Tm mayor a 65-70ºC (particularmente cuando los templados tengan muchas GC)

Al diseñar un primer, también se considera lo siguiente:

- Elegir un sitio para el primer a una distancia mayor de 50 nucleótidos de la posición donde la nueva secuencia se requiere

- Evitar aquellos que usan regiones de baja calidad de secuencia

- Evitar sitios que presentan más del 90% de identidad con el sitio primario o que tiene unión con más de siete nucleótidos consecutivos en 3’

Descongelar DNA

Posteriormente colocar en hielo.

Descongelar buffer 10X y

MgCl2

La enzima se sacará hasta el momento de utilizarse.

Metodología

Poner reacciones en termociclador

Programar con condiciones para gen RcRad51

Visualizar los productos en

un gel de agarosa 0.8% -

TBE 0.5X

Utilizar marcador de peso molecularCondiciones de corrimiento: 100V por 45 min.

Analizar en transiluminador

Documentar la imagen.

Guardar el producto de PCR a -20ºC

Realizar reacciones para:

1. Control positivo (plásmido que contiene ScRad51)2. Control negativo (DNA de bacteria)3. Muestra problema (DNA de Saccharomyces cerevisiae)

Preparar 3 mezclas 'Mix' en tubo eppendorf

(0.6 mL)

MgCl2, Buffer PCR 10X, dNTPs mix, Oligo F, Oligo R, Taq Polimerasa, H2O BM, DNA * Cálculos de cantidades para mezcla se encuentran posteriormente en este reporte.

Resultados

Pozos

correspondientes al Equipo 5.

1. Marcador 1 Kb Plus (5 µL)

2. Plásmido que contiene el gen ScRad51 (control +) (8 µL) + 3 µL de L.B.

4. DNA de bacteria E. coli (control -) (8 µL) + 3 µL de L.B.

6. DNA de levadura Saccharomyces cerevisiae (muestra) (8 µL) + 3 µL de L.B.

17 y 18. Resto del plásmido (42 µL) + 7 µL de L.B.

Cálculos para obtener mezcla mix de reacción:

Reactivo 1X 3X Concentración finalDNAMgCl2 (50mM)Buffer PCR 10XdNTPs mix 10 mMOligo F (10 μM)

1.0 μL1.5 μL5.0 μL1.0 μL1.0 μL

--4.5 μL15 μL3 μL3 μL

--1.5 mM

1X0.2 mM0.2 μM

Oligo R(10 μM)Taq PolimerasaH2O BM

1.0 μL0.2 μL39.3 μL

3 μL0.6 μL

**125.76 μL

0.2 μM

cbp 50 μLVolumen total de reacción: 50 μL 154.86 μL / 3

= 51 μL c/tubo ep.

** Se agregan 0.2 volúmenes adicionales de agua grado Biología Molecular.

- En los pozos 1, 17 y 18; se observa una banda del tamaño de 1240 pb.

Discusión

Xochitl Romo

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de amplificación de nucleótidos de una secuencia blanco. Se fundamenta principalmente en la capacidad de amplificación de la DNA polimerasa, iniciando la replicación del DNA templado gracias al uso de primers específicos.

Al realizar la técnica de PCR se deben tener ciertos cuidados. Debemos conocer parcialmente la secuencia de nuestro DNA templado para poder diseñar los primers específicos. En cuanto a los primers, para su diseño, se deben tener en cuenta los siguientes factores: deben ser ricos en contenido G-C, aprox. el 50% para que sean estables, tener entre 19 y 25 nucleótidos de longitud, deben ser complementarios a las regiones deseadas, su Tm debe ser similar a la de la muestra de DNA y no deben formar dímeros entre el primer Forward y Reverse, ni formar horquillas entre sí.

Al utilizar dNTPs se debe tomar en cuenta la concentración apropiada de MgCl2; pues los dNTPs ligan Mg++ y a mayor cantidad de dNTPs, menor cantidad de Mg++ libre. De preferencia la polimerasa utilizada en PCR debe tener actividad polimerasa 5’-3’ y actividad exonucleasa 5’-3’ , 3’-5’ para corrección; además debe soportar la temperatura a utilizar en el termociclador. Otro punto a mencionar es la elección de buffer; éste debe ser el óptimo para funcionar como medio de reacción en la técnica de PCR.

Las temperaturas en la PCR son muy importantes para lograr con éxito la amplificación de la muestra. En el caso de esta práctica se utilizó una temperatura de 94ºC para desnaturalizar las cadenas de DNA, en seguida se programó una temperatura de 57ºC para permitir la alineación de primers y finalmente se utilizó una temperatura de 72ºC para permitir que la polimerasa amplifique óptimamente la secuencia blanco.

En el proceso de amplificación es importante comprender que es a partir de 3er ciclo que ya se comienza a tener la amplificación de la secuencia de interés; entonces obtenemos que el número de copias será igual a 2N ( núm. de ciclos).

La cantidad de DNA templado necesario para la PCR varía dependiendo de si se trata de DNA genómico o de plásmido. En el caso de DNA de plásmido, por lo regular se requieren cantidades de aprox. 1-2 ng, mientras que la cantidad de DNA genómico necesario es de aproximadamente 100-500

ng. Esta variación se debe a que el DNA genómico es más grande que el plasmídico; y se sabe que colocar poca cantidad de DNA plasmídico no afectará la amplificación, pues hay bajo índice de error de la polimerasa al tener menor cantidad de pb.

En el caso de nuestros resultados de amplificación por PCR observamos claramente nuestro marcador de peso molecular. En el pozo #2 utilizado como control positivo, colocamos la muestra del plásmido que contiene el gen ScRad51 y observamos una banda definida de aproximadamente 1250 pb; lo cual indica que la amplificación se llevó a cabo correctamente, pues obtuvimos un producto específico.

En nuestro pozo #4, colocamos nuestro control negativo, producto de PCR de DNA de bacteria. En este pozo no observamos ninguna banda; lo cual es correcto pues nuestros primers estaban diseñados para amplificar secuencias específicas para levadura Saccharomyces cerevisiae, más no para secuencias de bacteria E. coli.

En nuestro pozo #6, se colocó el DNA de la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual fue nuestra muestra amplificación de PCR. No observamos ninguna banda en la fotografía del gel en este pozo. Debimos de haber obtenido una banda definida, pues los primers estaban diseñados para amplificar un gen ScRad51 que se encuentra en levadura. Definitivamente no se observó la amplificación en la muestra, ya que no obtuvimos una banda en nuestro pozo.

Es probable que la amplificación no se haya llevado a cabo exitosamente debido a que el DNA templado se encontraba ya degradado, lo que ocasionó que los primers se alinearan correctamente, y a su vez que la polimerasa no iniciara la replicación. Otra probable causa de esta falta de amplificación es que el DNA templado haya estado contaminado con proteínas, sales o fenol; ya que la presencia de estos compuestos afecta el desarrollo de la técnica de PCR. Existe también la probabilidad de que los primers diseñados para la amplificación no fueran capaces de reconocer el templado de DNA de levadura ya que tal vez existe una mutación en la región de reconocimiento y de esta forma no se logró la hibridación DNA – primer.

Elia Arenas

PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction, un método que permite amplificar un fragmento de DNA utilizando una polimerasa que trabaja a temperaturas elevadas. Para esto, es necesario un molde de DNA, polimerasa, un buffer, oligonucleótidos, dNTPs para simular lo ocurrido en las células para la síntesis de ADN. El termociclador permite aumentar la temperatura primero a 95°C, a la cual la doble cadena de la molécula consigue romper sus puentes de Hidrógeno para desnaturalizarse. Posteriormente, la temperatura se ajusta a entre 40° y 60°C a la cual se alinean los oligonucleótidos para que en seguida la polimerasa sintetice en sentido 5’-3’. La temperatura se aumenta a 72°C ya que así la polimerasa alcanza su actividad máxima continuándose así la síntesis de los fragmentos de ADN. Con cada ciclo, la cantidad de fragmentos con el tamaño esperado aumenta.

Para una buena reacción de PCR, es importante considerar la calidad de la extracción de DNA, ya que es importante que éste no se encuentre contaminado con proteínas o con una sustancia que inhiba la reacción de PCR. En el caso de nuestra muestra, influye en el resultado final el hecho de que no utilizamos RNasas durante la extracción del material genético de la levadura. Para la PCR también hay que considerar las concentraciones de magnesio usadas pues la polimerasa necesita iones de magnesio para su correcto funcionamiento. A su vez, una alta concentración de dNTPs puede inhibir la reacción ya que atrapa el magnesio requerido por la polimerasa. El buffer permite regular las condiciones de pH,

tomando en cuenta las características de la polimerasa utilizada. Los oligonucleótidos también deben ser revisados para descartar degradado, un mal diseño o que la cantidad usada no sea la correcta. Los primers tienen entre 19 y 25pb, siendo éstas complementarias a las secuencias que se desean amplificar, así como es importante un alto contenido en G-C para garantizar su estabilidad. Por otro lado, la cantidad de ADN templado requerido para la realización de la PCR varía dependiendo si es ADN genómico pues son requeridos entre 100-500 ng mientras que para el plásmido se necesitan entre 1-2 ng. Esto se debe a que el plásmido contiene menor cantidad de material genético.

En el primer pozo colocamos un marcador de peso molecular que arrojo bandas definidas. Para la PCR, se utiliza un control negativo que permite monitorear contaminación, en nuestro caso utilizamos 1μl de ADN bacteriano, el cual no presento ningún patrón de amplificación, lo cual se apega a lo esperado ya que los primers utilizados sólo permitían la amplificación de secuencias de levadura, no de bacteria. En el control positivo utilizamos una muestra de plásmido que contenía el gen ScRad5, en la que observamos una banda definida sabiendo que lo esperado era un producto específico. En el último pozo, colocamos una muestra de Saccharomyces cerevisiae que habíamos extraído en una práctica anterior. Lo que observamos en el gel de agarosa fue la ausencia de una banda que indicara la amplificación del fragmento. De haber tenido una mejor calidad de muestra, la amplificación no se hubiera visto inhibida. Del mismo modo, pudo haber errores en el protocolo de realización de la PCR, como la omisión de algún reactivo o equivocaciones en la adición o medición de algún reactivo.

Mario Arenas

El fundamento de la PCR es esencialmente la síntesis de grandes cantidades de una región específica del ADN, por medio del uso de DNA pol. termoestables y un molde de ADN con la secuencia deseada. El producto puede ser analizados en gel agarosa o con la digestión de enzimas de restricción para clonar, secuenciar o hacer el ‘fingerprint’. [1]

La PCR es una herramienta de mucha utilidad en la ingeniería genética; sin embargo, es susceptible a una variedad de factores, como lo puede ser [2]:

Limpieza: el método detecta una sola molécula de ADN, por lo que si presenta contaminación puede que influye considerablemente en el resultado final. Esto incluye usar soluciones específicamente para el proceso y usar múltiples reacciones de control para poder verificar resultados.

Compuestos químicos: es importante la integridad y pureza del molde de ADN y el diseño del primer. Los mejores primers tienen entre 12-34 bp sin estructuras secundarias con una distribución balanceada entre G-C y A-T y que no tienen complementariedad en los extremos 3’.

Reacción mezcla: el escoger una DNA pol. afecta la fidelidad de la reacción y la calidad del producto. En muchos laboratorios se ha sustituido Taq pol. por enzimas con mayor fidelidad. A su vez, la concentración de MgCl2 influye la PCR ya que es co-factor de la enzima. Por otro lado, se debe agragar cantidades iguales de dNTPs y algunas sustancias pueden afectar la eficiencia de la reacción.

Tipo de termociclador: la precisión varia entre cada uno; puede que no mantengan del todo las condiciones deseadas.

Condiciones del ciclo: el paso inicial para la desnaturalización debe ser lo suficiente como para poder romper los lazos entre las cadenas de ADN y los ciclos deben ser lo suficientemente largos como para poder evitar que se re-naturalice.

Un elemento importante a considerar en la PCR son las temperaturas a las cuales ocurren los pasos. La desnaturalización ocurre a temperaturas mayores a 90°C (92°C-94°C) y es por un periodo corto (menor a 1 min). La hibridación ocurre a 5°C debajo de la temperatura de fusión (melting) de los primers, el cual ocurre típicamente entre 45ºC a 55°C. Si es muy alta la temperatura entonces los primers no se hibridan adecuadamente mientras que si es muy baja entonces se unen de forma no específica. Finalmente, en la extensión, al usar Taq pol. su temperatura óptima es de 75°C-80°C; este puede cambiar dependiendo de la polimerasa que se emplea. [3]

Con respecto a las concentraciones requeridas para las cantidades de ADN molde, se observa lo siguiente [4] [5]:

ADN genómico: 0.5 - 1.0 mg ADN plásmico: 1.0 – 2.0 ng cDNA: 20 – 25 μg

Las cantidades varían dependiendo de una variedad de factores; tales como lo puede ser la calidad del ADN (si esta degradado o no), su tamaño o sencillamente por el tamaño del producto de PCR deseado. [6]

En el gel electroforesis que se realizó con el producto de la PCR; solo se observó la de la Reacción 1 (R1), la cual era el control que contenía el plásmido con el gen deseado. Tanto la Reacción 2 (R2) que contenía el ADN de la bacteria y la Reacción 3 (R3) que contenía la muestra con la PCR no se observaron sobre el gel de agarosa.

R1 era el control positivo y R2 el control negativo; el primero permite observar como se vería el producto de la PCR ya que contiene el gen deseado (ScRad51) mientras que el segundo era ADN de bacteria de la práctica previa (no contenía nada). Mientras R1 apareció en el gel, R2 no; por lo que puede asumirse que el ADN de la bacteria estaba sumamente degradado y no se retuvo en el gel. Errores con respecto a la cantidad del loading buffer es despreciable ya que se agregó la misma cantidad para las tres R (3 μl) y se observó R2.

Con respecto a R3; puede haber una variedad de factores que influyen en el hecho de que no haya aparecido en el gel electroforesis:

Se encontraba sumamente degradado o presentaba contaminantes que impedía que se uniera adecuadamente los primers.

Los primers no se diseñaron adecuadamente y sencillamente no se hibridaron con el ADN, el cual no permitía obtener un producto de PCR en los siguientes pasos

De esto; es más factible que haya sido por algún problema con relación al ADN, ya que en la segunda práctica se había establecido que el ADN de levadura presentaba contaminantes de ARN y proteínas. Estos pudieron haber afectado la reacción como tal.

Por otro lado, el proceso mismo pudo haber afectado el resultado final; no obstante, se realizó con los establecimientos indicados y es difícil que haya influido sobre ello.

Conclusiones

Xochitl Romo

Se observó una banda bien definida correspondiente a la muestre del gen ScRad51, por lo que éste se amplificó correctamente.

No se observó ninguna banda correspondiente a la muestra de DNA de levadura, por lo que ésta no se amplificó.

Se necesitó de un control negativo en esta práctica, por lo tanto se utilizó DNA de bacteria que no contiene el gen a amplificar.

Es importante que la polimerasa soporte las temperaturas a las cuales se programa el termociclador, por lo que para esta práctica se utilizó Taq Polimerasa para la amplificación.

Se diseñaron primers específicos para un gen, por lo tanto el producto de PCR fue la amplificación del gen llamado ScRad51.

La calidad del DNA templado de levadura era mala, por lo tanto no se observó amplificación por la técnica de PCR.

Elia ArenasNo hubo amplificación en la muestra de Saccharomyces cerevisiae debido a posibles errores en la adición de reactivos o a la contaminación de la muestra como resultado de la extracción de la misma. El control positivo presentó bandas específicas, así como se esperaba mientras que el control negativo no fue amplificado pues los primers no estaban diseñados para ese propósito. Para la PCR, se requiere de una enzima que trabaje a las temperaturas elevadas utilizadas en cada ciclo de la reacción. Del mismo modo, es importante el diseño de primers adecuados que permitan el inicio de la amplificación.

Mario Arenas

No se realizó exitosamente la PCR, puesto a que el producto presente en el ADN de la levadura no se encontraba presente en el gel de agarosa, denotando que el éste se encontraba o degradado o contaminado con proteínas y/o ARN. De manera similar, este resultado se observo con el control negativo R2, por lo que puede denotar que éste a su vez estaba degradado.

Por otro lado, los factores que influyen en la PCR son de suma importancia ya que si son controlados de una forma adecuada el producto final que se obtiene es de mayor calidad; al igual que diseñar primers adecuados y utilizar una DNA pol. que se adecue a lo que se desee hacer.

Fuentes de información

[1,2] Nicholl, D.S.T. (2008.) “The polymerase chain reaction” An Introduction to Genetic Engineering. (pp. 120-125) Cambridge University Press, New York: United States.

[3] Laboratorio Genomik. (2009.) “PCR Anidada o Nested” Obtenido el 22 de septiembre de 2012 de: http://www.laboratoriogenomik.com/modules.php?name=Content&pa=showpage&pid=48

[4] O'Connell, J. (2002). Methods in Molecular Biology RT PCR Protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press.

[5] Walker, J., & Rapley, R. (2009). Molecular Biology and Biotechnology. (5th ed.). Cambridge, UK: RSC Publishing.

[6] Méndez-Álvarez, S., & Pérez-Roth, E. (2010). La PCR múltiple en microbiología cl í n i c a. Recuperado el 23 de septiembre de 2012 de http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t10.pdf

[7] Koneman, I., & Elmer , W. (2008). Diagnóstico microbiológico. (6th ed.). Argentina: Editorial Médica Panamericana.

[8] Bing-Yuan , C., & Janes, H. (2002). PCR Cloning Protocols. (2nd ed.). Totowa, New Jersey: Humana Press.

[9] Calpena, E. (2008). Memoria de prácticas en Valentia Biopharma. Obtenido el 23 de septiembre de 2012 de http://facultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/MemoriasPracEmpresas/ValentiaBiopharma_08_EduardoCalpena.pdf

[10] Caldwell, G., Rahman, A., & Springer, B. (2005). Frontiers in drog design and discovery. Bentham Science Publishers.

[11] Buckingham, L. (2007). Molecular Diagnostics. Philadelphia: F.A Davis Company.

[12] Cultek. (s.f) PCR en tiempo real. Recuperado el 18 de septiembre de 2012 de: http://cultek.com

[13] Bio Rad. (s.f.) Droplet Digital PCR System. Recuperado el 18 de septiembre de 2012 de: http://bio-rad.com

Fuentes de discusión

Mario Arenas

[1] PCR Fundamentals. (s.f.) Obtenido el 25 de septiembre de 2012 de: https://www.msu.edu/course/lbs/159h/PCR04.pdf

[2] Phillips, T. (2012.) “Requisites for Superior PCR Results” About.com Obtenido el 25 de septiembre de 2012 de: http://biotech.about.com/od/application/tp/SuccessfulPCR.htm

[3] Maloy, S. (2002.) “Polymerase Chain Reaction” Microbial Genetics. Obtenido el 25 de septiembre de 2012 de: http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/in-vitro-genetics/PCR.html

[4] How much DNA in PCR. (s.f.) Obtenido el 11 de septiembre de 2012 de: http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/27516.html

[5] How much oligo dT cDNA to use in PCR. (s.f.) Obtenido el 22 de septiembre de 2012 de: http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/40830.html

[6] PCR principles and practices. (s.f.) Obtenido el 25 de septiembre de 2012 de: http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/PCR_principles.htm

Fuentes de cuestionario

[1] How much DNA in PCR. (s.f.) Obtenido el 11 de septiembre de 2012 de: http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/27516.html

[2] How much oligo dT cDNA to use in PCR. (s.f.) Obtenido el 22 de septiembre de 2012 de: http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/40830.html

[3] Roche. (s.f.) “Taq DNA Polymerase” Obtenido el 11 de septiembre de 2012 de: http://mvz.berkeley.edu/egl/resources/product%20inserts/RocheTaqPolymerase.pdf

[4] PCRWiz guide to PCR. (s.f.) Obtenido el 11 de septiembre de 2012 de: www.wantprogress.com/download10P35F3/PCR_guide016.pdf

[5] DNA Sequencing & Genotyping Facility. (2012.) University of Chicago Comprehensive Cancer Center.

Obtenido el 22 de septiembre de 2012 de: http://cancer-seqbase.uchicago.edu/primers.html