Dra. en C. Verónica Nava Ramírez

Febrero de 2015.

PRÁCTICA 2. EXTRACCIÓN Y

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS. •  Adiestrar al alumno en la extracción y

separación de proteínas totales por SDS-PAGE para identificar similaridades y diferencias entre patrones proteínicos.

•  Conocer las aplicaciones médicas de la proteomica.

Le interesa reconocer los factores que determinan la predisposición a enfermedades (hipertensión arterial, diabetes mellitus, asma, infarto agudo del miocardio, enfermedades infecciosas, etc.), y con ello evitarlas o retrasar su aparición y disminuir las complicaciones y secuelas asociadas.

Medicina genómica

Para la síntesis de proteínas ocurren diversos procesos celulares:

Genoma ≈ 30 000 genes Proteoma ≈120 000 proteínas

¿Cómo es posible? •  Polimorfismos genéticos •  Modificaciones post-transcricionales •  Modificaciones post-traduccionales

•  Le interesa la caracterización de la expresión de las proteínas codificadas por un genoma (PROTEOMA).

•  Permite identificar, categorizar y clasificar a las proteínas con respecto a su función y las interacciones que establecen entre ellas.

Proteomica

El proteoma de un organismo refleja su estado fisiológico y no es estático, cambia y está influenciado por el ambiente.

Proteoma

•  La proteómica de expresión se encarga del estudio de la abundancia relativa de las proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales

•  La proteómica estructural se encarga de la caracterización de la estructura tridimensional de las proteínas

•  La proteómica funcional se encarga de la localización y distribución subcelular de proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras moléculas con el fin de determinar su función

Existen tres ramas en la proteómica :

•  Identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades

•  Identificación de nuevos fármacos •  Determinación de mecanismos

moleculares involucrados en la patogenia de enfermedades

•  Análisis de rutas de transducción de señales

Aplicaciones

•  Técnicas empleadas para analizar globalmente el proteoma y separar sus proteínas (electroforesis mono y bidimensional.

•  Técnicas usadas para analizar individualmente las proteínas (espectrometría de masas MS).

•  Técnicas que se usan para estudiar interacciones entre proteínas (Bioinformática).

Técnicas que utiliza la proteómica

•  La electroforesis permite separar moléculas cargadas en función de su tamaño.

•  La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida para proteínas(PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis)

SDS-PAGE

•  Cuando la electroforesis se leva a cabo en condiciones desnaturalizantes se denomina así, en este caso se utiliza SDS (SDS-PAGE)

•  El SDS se une a las cadenas polipeptídicas en una proporción constante enmascarando la carga de la proteína y así la migración es proporcional al tamaño.

SDS-PAGE

Diagrama general de la práctica 2 Extracción de proteínas de

tejido muscular y cuantificación

Tinción y documentación del gel

Electroforesis

desnaturalizante en primera dimensión

(SDS-PAGE).

Preparación gel de acrilamida/bisarilamida

Análisis de los

resultados

Analizar el perfil proteico del tejido muscular de

diferentes organismos, para después identificar a

las principales proteínas musculares y

relacionarlos por los polipéptidos que

comparten

•  Los elementos fundamentales de las células musculares son las miofibrillas. Cada miofibrilla consiste en una serie lineal de unidades contráctiles llamadas sarcómeros.

Proteínas musculares

El sarcómero contiene los filamentos de actina (delgado) y miosina (grueso).

•  La contracción combinada de los sarcómeros a lo largo de la fibra muscular provoca la contracción del músculo completo

•  El sarcómero se acorta cuando la miosina hidroliza ATP y los filamentos de actina se deslizan hacia adentro entre los filamentos de miosina.

Otras proteínas musculares Proteína   PM (kD)   Función  

Titina   3000   Centra a la mios ina en e l sarcomero  

filamina   270   Entrecruza los filamentos de actina en redes ortogonales  

Miosina (c. pesada)  

210   Desliza los filamentos de actina  

Α-actinina   100   participa en el establecimiento de la red de microfilamentos  

fimbrina   68   interviene en la formación de retículas de microfilamentos  

actina   42   Forma filamentos  

Troponina (T)   30   Regula la contracción  

Miosina (c. ligera)  

15-25   Desliza filamentos de actina  

timosina   5   Secuestra monómeros de actina