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Terapia
Investigación
Diagnóstico Detección
Decisiones
TECNICAS DE ESTUDIO MOLECULAR
PCR
¿Que es genotipificacion?
• Genoma: “es la totalidad de la información genética que posee un
organismo en particular y que codifica para él.. En humanos, el genoma
consiste de 23 pares de cromosomas”
• Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen”
• Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por
un individuo”
Genotipificación Determinación del genotipo de una persona
PCR
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
• Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
• (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Eventos en la Replicación del DNA:
• Apertura de las cadenas (origen de replicación)
• Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
• Eliminación de los iniciadores de RNA.
• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
• Componentes
– Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP,
dCTP
– Enzima Taq (Thermus aquaticus)
– Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena
de ADN
– ADN molde Concentracion de 20ng
PCR: Ciclador térmico
Desoxinucleotidos (dNTPs)
Bases Nitrogenadas del ADN
Union por puentes de hidrogeno
Adenina-Timina
Guanina-Citocina
ADN polimerasa
Actuar altas temperaturas
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Estable a altas
temperaturas
Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 5’—3’
5’ 3’
5’
5’
3’
3’
PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Únicos: Asegura alta especificidad:
La secuencia del extremo 3’ es critica para el
funcionamiento
Dos oligonucleótidos que
son complementarios a
cada una de las dos hebras
del ADN.
CARACTERÍSTICAS
IMPORTANTES
Únicos
Tamaño
Dimeros de primers
5’ 3’
3’ 5’
Tamaño
• Efectos en:
– Carácter de único
• Mas tamaño (15pb)
• Temperaturas de anillaje (ºTm)
– La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son
doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)
Par de“primers”
específicos
dH2O
estéril
MgCl2
dTTP
dGTP
dCTP
dATPDesoxinucleótidos
Buffer p/ ADN Pol.
PCRMezcla de Reacción
ADN templado
Desnaturación
94 oC 94 oC
Anillaje
50-60oC
Extension
72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensión: Generación de la nueva cadena
Etapas de la PCR
30 ciclos
Desnaturación
PCRMelting
94 oC
Tem
per
atura
100
0
50
Tiempo
5’3’
3’5’DNA de
cadena doble
PCR94 oC
Tem
per
atura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’
CalorDNA de
cadena simple
PCR94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’5’
5’
Melting
94 oC
Hibridación
de primers
PCR
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3’5’
5’3’
Calor
Calor
5’
5’
5’
PCR
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
PCR
94 oC 94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor
PCR94 oC 94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
PCR
94 oC 94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCT
emper
atura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers
se duplica en cada ciclo de PCR.
0
# ciclos
Numero de copias
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
PCR animation
PCR
El numero de copias del DNA delimitado por
los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
0
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
Numero de ciclos
Numero de copias
Electroforesis
Revelado
Separación de moléculas en un campo eléctrico
Cámara de electroforesisElectrodo (+)
Electrodo (-)
Camas para preparación del gel
de agarosa
Fuente de poder
Agarosa y su preparación
Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en
función del peso molecular
Agarosa
Mezclar agarosa con una solución
tampón como el TAE (tris-ac.
Acetico-EDTA)
Calentar
Tinción con Bromuro de etidio
Agente intercalante Bromuro
de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de la
molécula de DNA
Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
Factores que afectan la velocidad de migración
1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO
la velocidad de migración del fragmento es
inversamente proporcional al log del nº de
pares de bases
2. CONFORMACION DE LA
MOLECULA
ADN circular ADN Lineal
3. VOLTAJE APLICADO
La velocidad de migración es
proporcional al voltaje aplicado
4. CONCENTRACIÓN
AGAROSA
Inversamente proporcional a
velocidad de corrido
2% 1.5% 1% 0.5%
Interpretación de electroforesisMarcador de peso molecular
1.Permite identificar tamaño de fragmentos
25pb 100pb50pb
100pb
150pb
250pb
300pb400pb
400pb300pb
250pb
Ejemplos de corridos de electroforesis
Con marcador de 50pb
Con marcador de 100pb
M 1 2 3 4 5 6 7
M 1 2 3 4 M
350pb
Bandas Inespecíficas
Corrido de electroforesis con bandas
inespecíficas
Bandas definidas con diferentes
pesos moleculares
Interpretación de electroforesis
Calidad del ADN
1 2 3 4 CP CN1 2 3 4 5 6 CP CN
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
1-6: Pacientes
BUENA CALIDAD DE ADN DIFERENTES CALIDADES DE ADN
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
Pozo 2 No ADN
Pozos 3 y 4 Bajas concentraciones
Técnicas derivadas/ basadas en PCR
PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro
de otro previamente amplificada
PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma
simultánea
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
RT-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
SEGUNDA PCR
1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa
2 Reacción
Primers internos
para amplificación
de una región
especifica
PCR Nested (anidada)Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers
Genera mayor ESPECIFICIDAD
PCR Multiplex
• Amplificación de varias
secuencias de forma
simultanea
• Diferentes set de primers
• Ojo Tamaño del
amplicon
APLICACIONES
Ensayos de deleciones
Amplifica exones
Ensayos forenses
Biomarcadores polimórficos
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
RFLPs
Restriction fragment length polymorphism
• Estudios de polimorfismos:
variación en la secuencia de
ADN
METODOLOGIA
1. Extracción de ADN
2. PCR – se obtiene la
secuencia target
3. Digestión con enzimas de
restricción mecanismo de
defensa de bacterias
4. Electroforesis en gel
Cambios en el sitio de restricción
GGCC GGCC GGCC GGCC
GGCC GGCC GGTC GGCC
5' 3'
5' 3'
Person A
Person B
Hae III corta:
GGCC GGCC GGCC GGCC
GGCC GGCC GGTC GGCC
5' 3'
5' 3'
CC GGCC GG
CC GG
CC GGCC GG
5’ GGCC 3’
Cambios en el sitio de restricción
A B C
A B C
A B+C
ADN NORMAL
ADN MUTADO
C
A
B
A
B+C
ADN
NORMAL
ADN
SILVESTRE
PCR en tiempo real (RT-PCR)
La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de
los productos en un solo tubo.
“Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van
generando
Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo
real utilizando tecnologías fluorescentes
UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA)
Retrotranscripción
Componentes RT-PCR
Target Segmento de ADN que se ha seleccionado para amplificar. Es el molde (Muestra).
DNA Polimerasa Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde una hebra simple de ADN (produce una hebra complementaria).
Primer Segmentos cortos de ADN de cadena simple específico para un segmento de DNA. Los primers son usados como punto inicial de la actividad de la DNA polimerasa.
Nucleótidos Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto biológico (A, T, C, G).
Solución Buffer Solución que reúne las condiciones necesarias para que la reacción de amplificación se de.
Sonda Segmento corto de ADN complementario al target (marcadores fluorescentes)
Termociclador Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de detectar sondas)
PCR
tradicional
PCR en
Tiempo Real
Preparación de la
MuestraAmplificación Detección
Preparación de la
Muestra Amplificación y Detección
PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real
Sistemas de Detección
Uso de moléculas fluorescentes
No-Específico
SYBR Green I
Molecular fluorescente que se unen
a ADN
Emisión a 520nm
DESVENTAJAS
Inespecífico
Curva de Melting
PRODUCTOS ESPECIFICOS
Curva de melting
PRODUCTOS ESPECÍFICOS TIENE UN MAYOR °TM
Sistema de Detección Específico
TaqMan
Actividad 5’ nucleasa
Separación reportero-quencher
Uso de “secuencia especifica
de oligonucleotidos”
- Reportero 5’: Emite
fluorescencia
- Quencher 3’: Bloquea emisión
de fluorescencia
Secuencia de la
sonda
Stem
Fluoroforo
Quencher
Sistema de Detección EspecíficoMolecular Beacon Probes
Molecular Beacon Probes
Sistema de Detección Específico
Scorpions probe
Loop
Stem
Fluoroforo
Quencher
Bloqueador
Primer
1. Hibridación del primer a una
secuencia target
2. Extensión de la
polimerasa formando un
producto de PCR
4. Fase de anillaje Cambio conformacional
del loop
5. Hibridación
Cinética de
la PCR
Exponencial: Duplicación
exacta del producto se
acumula en cada ciclo.
Lineal: Componentes
consumidos, productos
empiezan a degradarse.
Plateau: Reacción se
consume y no se generan
más productos.
• Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR
Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente
por el instrumento).
• CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el
umbral.
Número de ciclos
Fase logarítmica
Plateau
CT (CP)UMBRAL
Flu
ore
scen
cia
…El CT depende de la concentración inicial de ADN!
A > CT < [ ADN inicial ]
A < CT > [ ADN inicial ]
1. 10 ng = CT 18
2. 1 ng = CT 21
3. 100 pg = CT 25
4. 10 pg = CT 28
5. Blanco
12
3
4
5
mRNA
cDNA
PCR
RT-PCR (Retro-transcripción)Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT
Enzima Taq polimerasa
Métodos moleculares PCR
Ventajas
• Método “Gold standard”
• Se independizan del transporte.
• Alta sensibilidad y especificidad
• Se pueden utilizar sondas
• Se puede utilizar en muestras no invasivas
Desventajas:
• Se necesita cierta información de la secuencia enestudio para poder diseñar los primers.
• Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar
• Errores de la replicación.
• Contaminación (se reduce considerablemente tomandolas precauciones necesarias y en manosexperimentadas).
SECUENCIACIÓN
Mezcla de reacción
Secuenciación de Sanger
• Reacción de PCR
• Uso de:
– Dideoxinucleotidos
– Deoxinucleotidos dNTPs
La Reacción con ddATP
5’TTATCGTA3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’5’TTATCGTACCA5’TTATCGTACCATGA5’TTATCGTACCATGACTA5’TTATCGTACCATGACTAGA5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA5’TTATCGTACCATGA5’TTATCGTACCATGACTA5’TTATCGTACCATGACTAGA5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
8pb
11pb
14pb
17pb
19pb
25pb
Separación de Fragmentos
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Le
ctu
ra 5
’ a 3
’ de
sde la
ba
sa a
l to
pe
INTERPRETACION
DEL GEL
AGTACTTATGCAGGTC
ACGTGCA
Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
Marca fluorescente en cada uno de los diferentes
nucleótidos: A, T, G y C.
Emisión de luz a una longitud de onda especifica
Laser de iones de argón
Electroforesis
Capilar
Lecturas automatizadas de las
secuencias de ADN
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
Cromatograma o electrofenograma
Secuenciación de Sanger
Conclusiones
• Aunque en biología molecular existen muchas
técnicas para detección de cambios tanto a nivel
del ADN como a nivel cromosómico, el secreto esta
en seleccionar la mas adecuada dependiendo de
los requerimientos y la disponibilidad