patógenos de relevancia en los envíos cuarentenarios de...

Patógenos de relevancia en los envíos cuarentenarios de los cítricos.

El control de las cepas resistentes

Nuestro compromiso con la sostenibilidad y con el concepto de Economía Circular.

CITROSOL: Nuestras señas de identidad

Nuestra voluntad de cerrar la brecha entre los resultados de laboratorio, generalmente muy buenos, con los resultados industriales. Para reducir la variabilidad industrial y obtener la máxima eficacia y homogeneidad en nuestros tratamientos, desarrollamos equipos de precisión.

La postcosecha de precisión es nuestra seña de identidad.

Nuestro objetivo es obtener resultados excelentes junto al cliente

Información confidencial. Todos los derechos de PI son propiedad de Productos Citrosol S.A.

Creemos en el I+D+i (Investigación + Desarrollo + Innovación)

El I+D+i está en nuestra sangre, siempre intentamos aportar soluciones de confianza a través del I+D+i:


EL PODRIDO EN POSTCOSECHA

El podrido es la principal causa de reclamaciones, y de pérdida de ventas y clientes.

5-10% de la

producción se pierde

por patologías

fúngicas postcosecha

El podrido postcosecha en cítricos es

una patología causada por hongos.


Proceso postcosecha típico en cítricos

+

Inicio esporulación

Incipiente

Micelio blanco

Fruto Esporulado

Totalmente esporulado -

Dificultad

de

detección

Recolección Drencher

Desverdizado

(4-8 días/20ºC)

Volcador

Tratamiento en línea

Transporte

Destino

Confección

Podrido %

Destrío

TRIA

Almacenamiento Frigorífico (TºC frío)

% Podrido


El podrido que encontramos en el volcador

Tiempo desde la inoculación(1)

Nivel de desarrollo del podrido

Nivel de detección

48 horas Maceración

Lesión: 6 mm Muy difícil

3 días Micelio blanco Lesión: 1-3 cm

Difícil

4 días Inicio esporulación

Lesión: 4-8 cm Fácil

5 días Fruto esporulado

Lesión: 5-8 cm Fácil

7-8 días Completamente

esporulado Muy fácil

Con independencia del tipo de podrido podemos encontrar en el volcador distintos niveles de desarrollo del podrido

(1) TºC de desverdizado ≈ 20ºC Información confidencial. Todos los derechos de PI son propiedad de Productos Citrosol S.A.

No todos los frutos heridos pudren al mismo tiempo

Los frutos al igual que los hongos son organismos vivos.

Nivel de inóculo depositado sobre la herida.

Tamaño y profundidad de la herida.

“EFICACIA” y homogeneidad del tratamiento.

4 días desde inoc.

7-8 días desde inoc.

5 días desde inoc.

3 días desde inoc.

48 horas desde inoc.

Niveles de desarrollo del podrido en fruta (‘mal’) tratada con IMZ en drencher:


PODRIDO Conclusiones

La mejor estrategia para que no ocurra podrido en postcosecha es:

EVITAR EL PODRIDO EN EL VOLCADOR

El mayor esfuerzo para evitar podridos en destino debe

realizarse en el 1er tratamiento, inmediatamente después

de la recolección, tratamiento que se realiza en drencher

o en la línea de precalibrado.


96,9

3.1

Campaña 2017-2018

Penicillium spp: P. citrinum, P. solitum, P. brevicompactum, P. ulaiense Otros hongos: Botrytis cinerea, Alternaria sp., Rhizopus sp., Cladosporium sp., Geotrichum sp.,

97,3

2.9

Campaña 2015-2016

P. digitatum

P. italicum

Penicillium spp

Otros Hongosn= 209

95,1

4.9

Campaña 2016-2017

n= 346 n= 685

Patógenos causantes de podrido en cítricos: Datos de Citrosol


Patógenos causantes de podrido en el ALMACENAMIENTO/TRANSPORTE FRIGORIFICO

Las bajas temperaturas reducen la germinación de esporas y el crecimiento de

patógenos, aunque a 0ºC todavía puede observarse crecimiento significativo de algunos

patógenos.

PATÓGENO Penicillium digitatum

Penicillium italicum

Geotrichum sp. Botrytis cinerea

Tª mínima de crecimiento

6-7°C Hasta 0°C 10°C 0-5°C

PATÓGENO Alternaria sp. Cladosporium sp. Rhizopus sp. Colletotrichum

sp.

Tª mínima de crecimiento

0-10°C Hasta 0°C 10°C 5-10°C


Los patógenos fúngicos más importantes durante el almacenamiento

y/o transporte frigorífico son: Penicillium italicum, Alternaria sp.,

Botrytis sp. y Cladosporium sp.

Posibles causas del fracaso en la frigoconservación y transporte frigorífico

1. Mala aplicación del tratamiento, que aumenta la variabilidad de los resultados en el control del podrido.

2. Transmisión de la infección durante la conservación/transporte frigorífico.

3. Aparición de cepas de hongos resistentes a los fungicidas.

4. Mal manejo del frio que puede dar lugar a que la temperatura dentro de la cámara/contenedor no sea la deseada. Riesgo de Chilling injury.


Podredumbre azul (blue mold)

Las infecciones se producen exclusivamente a través de heridas, microheridas o roturas de la cutícula → Se produce cuando las esporas llegan a la herida, o, en menor medida, por contacto entre fruta infectada y fruta dañada

La infección por contacto entre fruta es mucho más habitual que en P. digitatum

P. italicum es capaz de crecer a temperaturas bajas. Al crecer más rápidamente que P. digitatum por debajo de los 10ºC, la podredumbre azul puede problemas importantes cuando la fruta se almacena durante largos periodos a Tª bajas y durante el transporte. Puede crecer hasta los 0ºC

Producida por Penicillium italicum

Inicio de la infección Infección por la zona estilar Desarrollo de la parte

esporígena de color azul

La parte central está rodeada de una banda muy estrecha de micelio blanco, limitado por una banda ancha de tejido blando y acuoso


Transmisión por contacto

+IMZ

+PCL

P. italicum, y otros patógenos, pueden extenderse en infecciones secundarias por contacto, sin necesidad de herida.

P. italicum se extiende por contacto a frutos sanos con mucha mayor frecuencia que P. digitatum.

Esto puede causar importantes problemas durante el almacenamiento, dando lugar a la formación de nidos de varios frutos podridos.


Importancia comercial

P. digitatum es, con diferencia, el principal hongo causante de la podredumbre en cítricos, sobre todo al principio y mitad de la campaña → Incidencia del 60-80% del total de los podridos

La podredumbre verde generalmente produce mayores pérdidas durante la comercialización ya que es predominante a temperatura ambiente

P. italicum es el segundo hongo en importancia en podrido de cítricos → Incidencia del 20-30% del total de los podridos

Supone un problema mayor en frigoconservación o durante el transporte frigorífico y en partidas con frutos mal seleccionados (piel envejecida, con heridas y fisuras, etc.)

La incidencia de estos dos patógenos de herida es muy alta, ya que se reproducen rápidamente y sus esporas se dispersan con mucha facilidad: ALTA ESPECIALIZACIÓN EN CÍTRICOS

La fuente de inóculo en el campo, en el almacén y en los cajones es continua → NECESIDAD CRÍTICA DE MEDIDAS DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN


Podredumbre gris (Gray mold)

Producida por Botrytis cinerea (Sin: Sclerotinia fuckeliana)

Las infecciones pueden originarse en el campo, y permanecer latentes hasta el almacenamiento, en tránsito o en el mercado.

En cajas se puede transmitir por contacto, formando nidos

El hongo se desarrolla a Tª de 15-20ºC y HR alta, pero puede crecer, más lentamente, hasta 0-5ºC.

4) Ataque completo con fructificación; con HR y Tª alta

2) Ablandamiento y crecimiento miceliar

(color marrón)

3) Desarrollo de esporas

1) Desarrollo inicial, en áreas debilitadas: área oscura, circular

y firme


FUNGICIDA Penicillium sp. Control de la esporulación

Control Penicillium IMZ-R

Botrytis sp.

IMAZALIL +++ +++ 0 +

PIRIMETANIL +++ + +++ ++

ORTOFENILFENOL ++ - ++ 0

FLUDIOXONIL ++ + ++ ++

PROCLORAZ +++ ++ 0 +

TIABENDAZOL ++ + + ++

PROPICONAZOL +++ + 0 ++

EFICACIA: 0 = Nula + = Moderada ++ = Buena +++ = Excelente

Fuentes: G.E. Brown. 1988. Decay control/Fungicide applications; Smilanick et al., 2006. Postharvest Citrus Diseases and their control; J.E. Adaskaveg. 2014. Management of postharvest fungal decay in California citrus production. Datos internos Productos Citrosol S.A.

Fungicidas para el control de patógenos en frigoconservación


Mancha marrón por Cladosporium sp.

Las esporas del hongo, transportadas por el viento en condiciones ambientales secas, penetran a través de zonas de la corteza debilitadas. Estas esporas germinan en condiciones de almacenamiento con humedades altas.

Afecta principalmente a las zonas peduncular y estilar, y únicamente a la corteza del fruto

Puede crecer a Tº próximas a 0ºC

Es una podredumbre seca, firme y flexible. Las zonas atacadas se oscurecen rápidamente y hay crecimiento miceliar de color verde-grisáceo

Si los frutos están muy maduros, puede penetrar en los tejidos del pedúnculo y provocar una podredumbre seca del eje central.


Envíos frigoríficos a

China y a EEUU

CAMPAÑA 2017-2018


Japón, 2006. Satsuma


Mandarinas;

W. Murcott

Nadorcott

Tango


Identificación molecular de los aislados

El género Cladosporium comprende unas 300

especies.

El género se divide en 3 complejos de

especies;

- Complejo C. cladosporioides

- Complejo C. herbarum

- Complejo C. sphaerospermum

Taxonomía molecular del género Cladosporium basado en distintos genes


Cladosporium ramotenellum

Identificación en el laboratorio:

Aspecto Macroscópico: En PDA, crece como una colonia de aspecto algodonoso de color verde-gris, y color verde-negro por el reverso.

Aspecto Microscópico: Los conidióforos se forman en las hifas, lateralmente o terminalmente.

Las esporas son abundantes de color marrón o marrón pálido, de forma ovalada o limoniforme.

Presentan, en uno o en los dos extremos, pequeñas protuberancias que son las marcas de las inserciones en la cadena.

Pertenece al complejo herbarum.

Esta especie se aisló por primera vez en 2007 en una muestra de agua hipersalina en Eslovenia.

No se había descrito en cítricos previamente.


Estudios moleculares recientes han mostrado que esta especie es un hongo saprófito muy común, encontrándose en diferentes sustratos y hospedadores y con una amplia distribución geográfica.


Microorganismo Saprófito:

microorganismo que vive sobre materia orgánica en descomposición

Tipos de microorganismos patógenos:

• Patógeno primario: Capaz de vencer los mecanismos de defensa del hospedador sano y producir enfermedad

• Patógeno oportunista: Microorganismo normalmente no patógeno y que solo produce una infección cuando las defensas del hospedador están disminuidas o debilitadas (Ej. daños en la corteza) → Cladosporium sp.

Tratamientos fungicidas

Sensibilidad in vitro de Cladosporium ramotenellum a fungicidas postcosecha

Control – sin fungicida

Ortofenilfenol Tiabendazol

Imazalil Pirimetanil

El Ortofenilfenol es eficaz in vitro frente a esta especie de

Cladosporium

* Las dosis de fungicida empleadas fueron en todos los casos 400ppm


Recomendaciones

La infección por Cladosporium sp. se produce cuando la fruta presenta

alteraciones de la corteza, debidas principalmente a daño por frío.

Se ha demostrado que la fruta recolectada de forma tardía es más susceptible a

sufrir daño por frío:

Hay que tener en cuenta que la

fruta recolectada al final de la campaña tiene más riesgos de sufrir daño por frio durante el

transporte frigorífico, y por tanto incrementa el riesgo de infección por Cladosporium sp.

Purvis AC, Kawada K & Grierson W (1979)


Reservorios de contaminación:

Cámaras de desverdizado/conservación

Volcador y línea

CAJONES DE CAMPO: importante reservorio de inóculo y cepas Resistentes

Recomendaciones

Reforzar los protocolos de Limpieza y Desinfección durante toda la campaña tanto

en las líneas como en las cámaras, pero especialmente ANTES de empezar a

trabajar con variedades susceptibles.

Limpieza y desinfección de las jabas de campo, para evitar la transmisión de

Cladosporium del campo al almacén, y viceversa → Utilizar el drencher con

Citrocide Plus para la limpieza de cajones


Recomendaciones

Reforzar la dosis de Citrocide en el lavado de la fruta (Sistema Citrocide online)

Reforzar el tratamiento drencher con Ortofenilfenol (Ortosol 6500 a 1200 ppm) y

Citrocide Plus, ya que son eficaces in vitro frente a Cladosporium ramotenellum.

Reforzar el tratamiento en cera con Ortofenilfenol (Ortosol 6500 a 3575 ppm). Se

ha comprobado que este fungicida es eficaz para el tratamiento del moho

peduncular causado por Cladosporium sp., por lo que podría ayudar a controlar la

infección por C. ramotenellum.


El control de cepas

resistentes

RESISTENCIAS A LOS FUNGICIDAS POSTCOSECHA

pérdida de sensibilidad de poblaciones de hongos a la acción de los fungicidas

RESISTENCIAS

CLASES Insensibilidad natural Por ej.: Geotrichum al PCL; Alternaria al PPZ

Insensibilidad ADQUIRIDA

IMZ-Sensible IMZ-Resistente IMZ-Resistente

Adaptación genética

Mutaciones simples

(individuos)

Incremento de subpoblaciones

Resistentes


MECANISMOS DE RESISTENCIAS

1. Reducción de la concentración intracelular del compuesto tóxico (transportadores).

2. Alteraciones en la diana de unión que provoca la reducción de la afinidad al compuesto fungicida (mutaciones puntuales).

3. Compensación de los efectos tóxicos del fungicida por alteraciones de la ruta biosintética o la ruta metabólica (rutas metabólicas alternativas).

4. Sobreexpresión de la diana de unión que ejerce un efecto de titulación del compuesto.

En un único paso: por ejemplo TBZ-R

NO se incrementa con el tiempo (ON-OFF).

Multigénica: por ejemplo IMZ-R

SÍ se incrementa con el tiempo (diferentes grados de R).


FACTORES DE APARICIÓN DE RESISTENCIAS

1. Tipo de fungicida: Los fungicidas con mecanismo de acción específico es más fácil que den lugar a la aparición de resistencias por mutación y posterior selección del hongo que los de acción multisitio.

2. Tipo de hongo: Ocurre con mayor frecuencia en hongos como Penicillium spp de gran capacidad de esporulación.

3. El hecho que los almacenes sean recintos cerrados hace más fácil la aparición de resistencias por la acumulación y permanencia del inóculo.

4. Tratamientos aplicados inadecuadamente: bajas dosis, malas aplicaciones, acumulación inóculo en el caldo drencher y malas prácticas de desinfección.


Resistencia cruzada: Grupos de fungicidas según su modo de acción

Inhibición de la síntesis de

ergosterol en la membrana

Imazalil

Procloraz

Propiconazol

Miclobutanil

Inhibición del ensamblaje de ß-tubulin en la division celular

Tiabendazol

Metil-tiofanato

Carbendazima

Inhibición de la biosíntesis de

metioninia

Pirimetanil

Acción multi-sitio

Orto-fenilfenol

La Resistencia cruzada ocurre cuando el uso de un fungicida produce el desarrollo de resistencias a otro fungicida con su mismo modo de acción

Para evitar problemas de resistencia cruzada NO hay que usar fungicidas con el mismo modo de acción


Resistencia cruzada

Ensayos de eficacia con cepas de P. digitatum resistentes a IMZ


Retraso Permisible en cepas IMZ-R

(Foster, Kanetis & Adaskaveg 2007)

Tiempo retraso permisible (h)

P. digitatum IMZ-S

P. digitatum IMZ-R

En cepas de P. digitatum

resistentes a IMZ, se reduce significativamente

el tiempo de retraso

permisible


1

EL ORIGEN DE LAS RESISTENCIAS EN Penicillium sp.

En campo, las cepas

son mayoritariamente

SENSIBLES (S) a

fungicidas

ALMACEN

Aparecen algunas cepas Resistentes (R) a fungicidas por:

Acumulación y permanencia del inóculo en los cajones y el almacén (recinto cerrado)

Tratamientos aplicados inadecuadamente: bajas dosis, malas aplicaciones, acumulación inóculo en el caldo drencher y malas prácticas de desinfección

2 Si NO hay buenos protocolos

de Limpieza y Desinfección en el almacén, las cepas R se

convierten en las cepas DOMINANTES

4

↑ Penicillium sp. - S

↓ Penicillium sp. - R

Situación inicial en el almacén

3 Los fungicidas eliminan las cepas Sensibles

pero no eliminan las cepas Resistentes

FUNGICIDAS

↑ Penicillium sp. - R ↓ Penicillium sp. - S

Situación final en el almacén

Si NO hay L+D, las cepas R se acumulan en los cajones, y pueden

llegar a campo

5


ES CRUCIAL CONTROLAR LA APARICIÓN DE RESISTENCIAS

Es necesario identificar correctamente la existencia o no de aislados Resistentes con el fin de aplicar el tratamiento más adecuado y eficaz, y evitar así agravar el problema.

Programa de monitorización de resistencias en CITROSOL:

- Realizamos muestreos en los almacenes de nuestros clientes; Son muestreos programados y sistemáticos, y adicionalmente cuando hay problemas de podrido

- Evaluamos la resistencia a fungicidas en los aislados de P. digitatum y P. italicum

- Nos permite anticiparnos al problema y ‘cortar’ las resistencias de forma temprana

0100

200300400500

600700800

13-14 14-15 15-16 16-17 17-18

70

221 203

329

687

Nº de muestras analizadas


Técnicas moleculares

1. Extracción del DNA de la muestra: Desde esporas o desde fruta con podrido incipiente

2. PCR (Reacción en cadena de la polimerasa): Amplificación del gen marcador

3. Electroforesis del DNA: Para separar el DNA por tamaño y visualizar el resultado

M1: P. digitatum

M2: P. italicum

M3: Están presentes los dos

M4: No hay P. digitatum ni

P. italicum en la muestra

P. digitatum

P. italicum

M1 M2 M3 M4

PCR-múltiple para la identificación simultánea de P. digitatum y P. italicum

Utilizamos técnicas de biología molecular y técnicas de microbiología clásica

1º. Identificación del patógeno causante del podrido


También utilizamos técnicas de biología molecular y técnicas de microbiología clásica

• Mediante técnicas moleculares evaluamos la resistencia a IMZ de los aislados de P. digitatum

• Mediante técnicas de microbiología evaluamos:

- La resistencia de P. digitatum a otros fungicidas

- La resistencia de P. italicum a IMZ y a otros fungicidas

2º. Determinación de la resistencia a fungicidas

Resistencia a imazalil en P. digitatum

El imazalil, como el procloraz y el propiconazol, pertenece al grupo de fungicidas inhibidores de la desmetilación (DMI)

Modo de acción; actúan sobre la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa, enzima que forma parte de la vía de síntesis del ergosterol.

El ergosterol un componente esencial de las membranas celulares fúngicas. La ausencia de ergosterol en las membranas de las células animales (tienen colesterol) hacen que sea una excelente diana para fungicidas.


Genes CYP51A y CYP51B: Codifican la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa (P45014αdm).

3 tipos de cepas IMZ-resistentes según la mutación que presentan:

• R1 → Sobreexpresión del gen CYP51A debido a la inserción extra de 4 repeticiones en tándem de un activador transcripcional de 126pb en la región del promotor del gen CYP51A[1]

• R2 → Incremento de la expresión del gen CYP51A debido a la inserción de una secuencia de 199pb dentro del activador transcripcional de 126pb [2]

• R3 → Sobreexpresión de CYP51B debido a la inserción de una secuencia de 199pb en la región del promotor del gen CYP51B [3]

[1] Hamamoto H, et al. Appl Environ Microbiol. 2000. 66: 3421-26

[2] Ghosoph JM, et al. Postharvest Biol Technol. 2007. 44: 9–18

[3] Sun X, et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2011. 91:1107–19

Cepa IMZ-R2

Cepa IMZ-R1

Cepa sensible

Cepa IMZ-R3

Bases genéticas de la resistencia a IMZ en P. digitatum


Detección en el laboratorio

Usan dos parejas de cebadores en la misma reacción

- CYP51A1/CYP51A2 → amplifica la región del promotor del gen CYP51A; detecta los genotipos R1 y R2

- B1/B2 → amplifica la región del promotor del gen CYP51B; detecta el genotipo R3

Resultado:

Cepas sensibles: 401pb (CYP51B) y 506pb (CYP51A)

Cepas IMZ-R1: 401pb y 1010pb



Sun et al., desarrollan una PCR-múltiple para la detección simultánea de las tres mutaciones que confieren resistencia a IMZ:

El tiempo necesario para la identificación del patógeno y

la evaluación de la resistencia a IMZ se reduce a 1-2 días.


Para determinar la resistencia a pirimetanil y a otros fungicidas en P. digitatum

Para determinar las resistencias a fungicidas en P. italicum

Técnicas microbiológicas para la evaluación de resistencias

Se utilizan placas con medio de cultivo fortificadas con distintas concentraciones del fungicida a evaluar. Tras la incubación de los aislados a testar a 22ºC, durante 5-6 días, Se calcula el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, comparando el diámetro de crecimiento del hongo en la placa de medio control sin fortificar y en la placa de medio fortificado a una determinada concentración


Nuevo protocolo de resistencias a fungicidas

Mismo principio que el método clásico; Cálculo del % inhibición del crecimiento del hongo, comparando su crecimiento en medio control y en medio con fungicida

UTILIZAMOS PLACAS MULTIPOCILLOS

medio 1 2 5 control ppm ppm ppm

IMZ

PYR

IMZ + PYR

Cepa sensible

IMZ

PYR

IMZ + PYR


Cepa resistente a un fungicida

Cepa resistente a dos fungicidas

IMZ

PYR

IMZ + PYR


Somos capaces de procesar más muestras y en menos tiempo


BIBLIOGRAFÍA

Bautista-Baños S. (Editor). Postharvest Decay. Control Strategies. 2014. San Diego, California. Elsevier, Inc

Wardowski WF, Miller WM, Hall J, Grierson W. Fresh Citrus Fruits: 2nd Edition. 2006. Longboat Key, Florida. Florida Science Source, Inc.

Tuset JJ (Editor). Podredumbres de los frutos cítricos. 1987. Valencia, España. Generalitat Valenciana, Conselleria d’Agricultura i Pesca

Roger Amat S. Defectos y alteraciones de los frutos cítricos en su comercialización. 1991. Valencia, España

Frisvad JC & Samson RA. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium. A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins. Studies in Mycology. 49: 1-174

Brown GE. Decay control/fungicides applications. In: Bronw GE (Ed.) Fresh citrus quality short course proceedings. Fort Pierce: AREC, 1988. p.1-24.

Adaskaveg JE. 2014. Management of postharvest fungal decay in California citrus production.

http://www.frac.info/home

Hamamoto H, et al. Tandem repeat of a transcriptional enhancer upstream of the sterol 14α-demethylase gene (CYP51) in Penicillium digitatum. Appl Environ Microbiol. 2000. 66: 3421-26

Ghosoph JM, et al. Imazalil resistance linked to a unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region of Penicillium digitatum. Postharvest Biol Technol. 2007. 44: 9–18

Sun X, et al. PdCYP51B, a new putative sterol 14α-demethylase gene of Penicillium digitatum involved in resistance to imazalil and other fungicides inhibiting ergosterol synthesis. Appl Microbiol Biotechnol. 2011. 91:1107–19

Bensch K, et al. The Genus Cladosporium. 2012. Studies in Mycology 72: 1–401

Bensch K, et al. Cladosporium species in indoor environments. 2018. Studies in Mycology 89: 177–301

Samson RA. New insights into the biodiversity and ecology of the indoor mycobiota. 2014

Imágenes:

Productos Citrosol S.A.; http://microbialfoods.org/geotrichum-candidum-mold-transition;

http://www.tecnicoagricola.es; http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com.es/


Muchas gracias por su atención

¿Preguntas?

Penicillium digitatum

Alta especialización en la infección de cítricos

Es un hongo mesófilo; puede crecer desde 6–7ºC hasta 30-35ºC, siendo 22-25ºC su Tª óptima


P. digitatum es una especie única dentro del género Penicillium

Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento rápido en PDA.

De color verde-oliváceo en el anverso, e incoloras o de color amarillo-cremoso en el reverso

Aspecto Microscópico: Se diferencia del resto de Penicillium sp., ya que presenta una ramificación de conidióforos diferente; son cortos, biverticilados y asimétricos.

Las esporas son grandes, de elipsoidales a cilíndricas o globosas

Penicillium italicum

Alta especialización en la infección de cítricos, como P. digitatum

Es también un hongo mesófilo, pero es capaz de crecer a Tª bajas (hasta 0ºC)


Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento rápido en PDA.

De color azul en el anverso, desde marrón-amarillento a naranja o marrón-rojizo en el reverso (dependiendo del medio de cultivo). Las colonias pueden parecer granulosas debido a la presencia de manojos de conidioforos.

Aspecto Microscópico: Los conidióforos son rectos, dispuestos en pequeños manojos. Los penicilos (pinceles), son habitualmente asimétricos y portadores de 1 a 3 brazos simples o ramificados

Las esporas, al igual que P. digitatum, son desde elipsoidales a cilíndricas o globosas

2. Podredumbre por Alternaria (Black rot, Black spot)

Producida por Alternaria alternata y Alternaria citri

Las esporas llegan a las flores y al fruto en el campo y, en condiciones de HR alta y Tª suave, germinan y penetran en el interior de los frutos a través de la zona estilar y peduncular. Pero también pueden penetrar a través de heridas o lenticelas

En campo puede producir la caída prematura de los frutos jóvenes infectados

En el almacenamiento a Tª baja, en la fruta infectada se produce una decoloración de la piel que cambia a marrón

En mandarinas (Satsuma) se pueden ver amplias zonas que toman coloración negra debido a formación de masas de micelio debajo de la epidermis sin causar rotura

1. Manchas iniciales; podredumbre firme. Pueden aparecer en la zona peduncular o estilar, o manchas por toda la superficie

2. Amplias zonas con coloración negra

3. A Tº de 18-20ºC y HR alta se desarrolla un micelio negro-olivaceo


La podredumbre por Alternaria sp. puede alcanzar el 8-16% del total, aunque en

la conservación frigorífica y para partidas de frutos recogidos tarde, se pueden

alcanzar tasas de podridos del 25-30% a los dos meses de almacenaje

Está muy presente en estratos vegetales y las esporas, muy abundantes, son

transportadas por el viento hasta el fruto. Las condiciones secas incrementan la

incidencia

Suele infectar solo a frutos jóvenes, poco lignificados, o a frutos muy maduros.

Cuando la infección se produce a través de la zona estilar, suele permanece latente

en el interior de los tejidos hasta el almacenamiento

Alternaria sp.

Distribución mundial y amplio rango de hospedadores

La diferenciación entre A. alternata y A. citri es compleja: Algunos consideran que son la misma especie (A. alternata pv citri)

Identificación en el laboratorio (Alternaria sp.):

Aspecto Macroscópico: colonias no compactas pero densas. Al principio blanquecinas, que pasan a marrón oliváceo o grisáceo, que llega a ser negro

Aspecto Microscópico: Los conidióforos son erectos y septados y pueden ser simples o ramificados, y de color marrón oliváceo.

Las esporas son muy características:

• Forma variable pero abundan las claviformes, oviodes y elipsoidales

• Color desde marrón claro a marrón-oliváceo

• Cuando son maduras presentan varios tabiques transversales y varios longitudinales u oblicuos

Botrytis cinerea

Distribución mundial

Tiene un amplio rango de hospedadores


Aspecto Macroscópico: El micelio es de color grisáceo o verde-gris

Aspecto Microscópico: Produce un micelio ramificado y septado, que al principio es hialino, pero rápidamente adquieren coloración marrón.

Los conidióforos tienen un largo pie que en su parte superior porta las ramificaciones que terminan en células redondeadas.

Las esporas son elipsoidales, hialinas o ligeramente coloreados

3. Podredumbre amarga (Sour rot)

Producida por Geotrichum candidum var. citri-aurantii

Las infecciones por este hongo se originan a través de heridas producidas por insectos o heridas mecánicas durante el manejo postcosecha.

Generalmente no infecta a través de heridas pequeñas o superficiales

Se suele producir en fruta madura con defectos y almacenada durante algún tiempo

En atmósfera húmeda y con Tª superiores a 10-12ºC, aparece micelio blanquecino

Causa una podredumbre amarga o ácida de consistencia blanda, que se transforma rápidamente en acuosa y con un fuerte olor. Porciones de esta fruta gotean en las frutas inferiores o se dispersan por insectos, propagando la enfermedad.

Geotrichum candidum

Distribución mundial

Se encuentra en el suelo, de forma saprófita, desde donde puede llegar a la fruta


Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento relativamente rápido a 22-25ºC, y de color blanquecino-cremoso y de aspecto aterciopelado o mate.

Aspecto Microscópico: Produce un micelio hialino (transparente), con hifas septadas, y portador de cadenas de conidios. Estas cadenas de se fragmentan en células individuales (esporas) de tamaño variable.

Las esporas pueden ser cilíndricas o con forma de barril y son portadoras de gotas de grasa


El hongo necesita temperaturas relativamente altas para infectar; Tª menores de 10ºC inhiben casi completamente el desarrollo del hongo.

El drencher siempre es el principal foco de contaminación y el origen de casi todos los

problemas de podrido que este hongo origina en postcosecha. Puede supone un problema en frigoconservación durante largos periodos y en partidas con

frutos mal seleccionados (piel envejecida, con heridas y fisuras, etc.)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Penicilliumdigitatum

Penicilliumitalicum

Alternaria spp. Botrytiscinerea

Geotrichumcandidum

Rhizopusstolonifer

% In

cid

enci

a

INCIDENCIA:

020406080

100

13-14 14-15 15-16 16-17

% G

eotr

ich

um

sp

p.

Muestras de podrido en fruta

0.0

1.0

2.0

3.0

13-14 14-15 15-16 16-17

% G

eotr

ich

um

sp

p.

0

20

40

60

80

100

Peru España Egipto Sudáfrica % G

eotr

ich

um

sp

p.

Aislamientos en Drencher – 16/17

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Peru España Egipto Sudáfrica%

Ge

otr

ich

um

sp

p.

Aislamientos en caldos Drencher - 16/17

Datos de Citrosol

CYP51 (ERG11): Codifica para la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa (P45014αDM)

• Comparan el gen CYP51 de 3 cepas sensibles y 3 cepas resistentes a IMZ:

• Ven que hay diferencias en la región del promotor:

- Las cepas Resistentes: 5 copias de una secuencia de 126pb, repetidas en tándem

- Las cepas Sensibles: una sola copia

El mayor número de copias de la secuencia de 126pb hace que el gen se transcriba más (100X)

la secuencia sería un potenciador de la transcripción

Sensibles

Resistentes

Genotipo R1

Información confidencial. Todos los derechos de PI son titularidad exclusiva de Productos Citrosol S.A.

Bases genéticas de la resistencia a IMZ

• Estudian también la región del promotor de CYP51

• Secuencian este gen en un número mucho mayor de

cepas sensibles y resistentes: encuentran un inserto

de 199pb en el promotor del gen de cepas

resistentes

El inserto de 199pb provoca un aumento en la transcripción del gen (10X)

el inserto sería también un potenciador de la transcripción

Genotipo R2

Sensibles

Resistentes


Genotipo R3

• Estudian 2 genes homólogos a CYP51; CYP51B y CYP51C

• No encuentran cambios en CYP51C

• Encuentran, en cepas resistentes, un inserto de 199 pb

en la región del promotor del gen CYP51B

El inserto también provoca un aumento en la transcripción del gen (7-14X)

el inserto sería un potenciador de la transcripción del gen CYP51B

Sensibles

Resistentes


Somos capaces de procesar más muestras y en menos tiempo

VENTAJAS:

- Utilizamos menos material; Ahorro económico, y la preparación y manipulación del material es más sencilla

- Reducción del espacio necesario para la incubación de las placas

- Reducción del tiempo de incubación: de 6 días a 4 días

% Inhibición crecimiento radial

= (Crec. radial, mm) control – (Crec. radial, mm) X ppm

(Crec. radial, mm) control X 100

Resultado INTERPRETACIÓN GLOBAL

Sensible a 1 ppm SENSIBLE (S) Resistente a 1 ppm LIGERA RESISTENCIA (LR) Resistente a 2 ppm RESISTENCIA (R) Resistente a 5 ppm ALTA RESISTENCIA (AR)

- Si el % de inhibición del crecimiento es mayor al 50%, se considera que el hongo es SENSIBLE a esa concentración de fungicida. - Si el % de inhibición del crecimiento es menor del 50%, se considerará RESISTENTE a esa concentración de fungicida.

El % de inhibición del crecimiento radial se calcula según la siguiente fórmula:

Finalmente, el resultado global de la resistencia se estima de la siguiente forma:

patógenos de relevancia en los envíos cuarentenarios de...

Documents