nombre del proyecto: identificaciÓn morfolÓgica y genÉtica …

Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social

IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE LACTOBACILLUS SP. CON POTENCIAL PROBIÓTICO.

Dra. Maribel Jiménez Edeza

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NOMBRE DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y GENÉTICA

DE LACTOBACILLUS SP. CON POTENCIAL PROBIÓTICO

CICLO: 2021-2022-1A

MODALIDAD UNIDISCIPLINARIA

BRIGADISTA (S): CASAREZ VELAZQUEZ HEBERTH ALAN

ASESOR(A) DE PROYECTO: DRA. MARIBEL JIMÉNEZ EDEZA

Fecha de autorización 23/07/2021




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I. Título del proyecto de servicio social

Identificación morfológica y genética de Lactobacillus sp. con potencial

probiótico.

II. Antecedentes

El intestino humano es el hábitat natural de una población numerosa,

diversa y dinámica de microorganismos, principalmente bacterias, que se han

adaptado a la vida en las superficies de mucosas o en la luz del intestino. El

ecosistema microbiano del intestino incluye especies nativas que colonizan

permanentemente el tracto gastrointestinal (GI), se adquieren al nacer y durante

el primer año de vida; por otro lado, también incluye una serie variable de

microorganismos vivos que transitan temporalmente por el tubo digestivo

obtenidas a través de los alimentos (Guarner, 2007). La asociación entre el

hospedero humano y su microbiota asociada otorga a ambos una ventaja en el

ambiente, lo que permite el éxito de su sobrevivencia como organismos

simbiontes. Dada la diversidad de microorganismos presentes en el tracto GI, las

funciones primarias que puede desempeñar la microbiota intestinal (MI) incluyen

funciones de protección, metabólicas y tróficas (Icaza-Chávez, 2013; García-

Mazcorro y col., 2015).

La MI está modulada principalmente por una combinación de factores,

tales como la edad, la dieta, el parto, el uso de antibióticos, el estilo de vida, la

higiene y la genética del hospedero. Adicionalmente, factores dentro del modo de

parto, el tipo de lactancia y la edad gestacional generan importancia ya que

modulan la MI durante los primeros estadios de la vida; cuando la MI alcanza la

madurez es más estable, pero siguen existiendo factores que influyen en su

capacidad de sobrevivencia a condiciones inadecuadas de crecimiento

(Domínguez-Bello y col., 2010; Rothschild y col., 2018). La aparición y

diseminación de enfermedades infecciosas causadas por bacterias patógenas en




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poblaciones humanas es un problema en todo el mundo. Las enfermedades

transmitidas por alimentos (ETA) se encuentran ampliamente extendidas y

constituyen un problema prioritario de salud pública, tanto en países

desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo.

Estas enfermedades se caracterizan por producir síntomas como diarrea,

dolores abdominales, vómito, dolor de cabeza, fiebre, alteraciones neurológicas

y otros. Entre los principales enteropatógenos bacterianos están una gran

variedad de serotipos de Salmonella spp., incluyendo S. enterica serovar

Typhimurium y especies como Staphylococcus aureus (Sarrionandia y col., 2011,

Kadariya y col.,2014).

Los organismos de Salmonella spp. pueden aislarse de alimentos o agua

contaminada. Este género bacteriano ha sido considerado un patógeno de los

productos cárnicos y avícolas, y recientemente de productos frescos y

manufacturados. Por otra parte, Staphylococcus aureus se encuentra presente

en el aire, la leche, el agua potable, aguas residuales y, desde luego, la comida

o en el equipo donde los alimentos han sido elaborados (Nataro y col., 2011).

El tracto GI constantemente se encuentra expuesto a compuestos

oxidados. El hierro proveniente de la dieta no se absorbe en gran medida en el

intestino, y su conjunción con ciertas bacterias participa en reacciones de Haber-

Weiss y tipo Fenton generando peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo en la

superficie de la mucosa, comprometiendo la integridad epitelial. El hierro es un

factor de crecimiento importante para muchas bacterias intestinales, y el aumento

de este induce al crecimiento patogénico, volviendo más susceptible al

hospedero a enfermedades intestinales (Babbs, 1990; Ashrafian, 2003).

La composición de la MI tiene gran importancia médica ya que pueden

influir de forma beneficiosa o dañina sobre la salud del hospedero. En condiciones

normales el ecosistema intestinal está en equilibrio y los microorganismos

perjudiciales no ejercen su poder patógeno. Sin embargo, en determinadas




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situaciones, éstos pueden dar lugar a infecciones si se establecen en regiones

del cuerpo en las que no son residentes habituales o cuando su número se

incrementa de forma excesiva debido a perturbaciones del ecosistema intestinal

(Delgado, 2005; García-Mazcorro y col., 2015). La administración de probióticos

en cantidades adecuadas confiere un efecto beneficioso a la salud del hospedero.

Estas bacterias tienen numerosas influencias en el hospedero, ya sea en el

entorno luminal intestinal, en la función de la barrera epitelial y de la mucosa y en

el sistema inmunológico.

Existen algunas características deseables para la implementación de

bacterias probióticas, estas deben estar identificadas, carecer de factores de

virulencia, no producir metabolitos indeseables, adaptación a las condiciones de

la actividad diana, buena adherencia al epitelio del hospedero, capacidad

antioxidante, producción de sustancias antimicrobianas y ausencia de capacidad

de transmisión de resistencia a antibióticos. Aunque los probióticos no sean

colonizadores a largo plazo del tracto GI, sí es relevante que puedan mantenerse

funcionalmente activos en el intestino (Ng y col., 2009; Guarner y col., 2010;

Suárez, 2015 Plaza-Díaz y col., 2019).

Los probióticos de las heces de adultos humanos sanos y lactantes han

sido de al menos dos géneros: Lactobacillus y Bifidobacterium. La mayoría de las

especies de Lactobacillus son habitantes normales y no patógenos en el intestino

humano y su presencia es importante para el mantenimiento del ecosistema

microbiano intestinal. Se ha demostrado que el género Lactobacillus posee

actividad inhibitoria hacia la multiplicación de enteropatógenos y son altamente

competitivos en gran medida debido a su producción de varios compuestos

antimicrobianos (Vernedelli y col., 2009).

Tradicionalmente el estudio de la MI se ha abordado a través del cultivo

de los microorganismos y en su identificación mediante pruebas fenotípicas

clásicas: morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. El cultivo de la MI en medios




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selectivos y diferenciales es en apariencia el método más simple y directo, sin

embargo, no posee una alta fiabilidad debido a la existencia de bacterias no

cultivables. Se sabe que sólo una pequeña proporción de los microorganismos

del tracto GI se pueden cultivar in vitro. Esto se debe principalmente a la

incapacidad de simular con precisión las condiciones de vida de los

microorganismos en su hábitat natural. Entre las desventajas de las técnicas de

cultivo se encuentra la imposibilidad de asegurar que el comportamiento

fenotípico de un microorganismo en el laboratorio sea idéntico a su

comportamiento in vivo, por lo que, el uso de técnicas moleculares permite

caracterizar de manera más comprensiva a las comunidades microbianas en el

tracto GI (Delgado, 2005; Lagier y col., 2012; Dubourg y col., 2013).

Los métodos moleculares buscan la identificación de los organismos en

base a sus similitudes genéticas, en el gen que codifica para la subunidad 16S

del RNA ribosomal. Con la identificación del gen de referencia, las técnicas de

secuenciación masiva y las herramientas bioinformáticas para el tratamiento de

datos, se ha podido conseguir una información sobre el microbioma humano, con

un nivel de detalle sin precedente en cuanto a taxonomía y función de los

microorganismos, lo que ha supuesto una auténtica revolución no solo en su

conocimiento sino también en su implicación en la salud o de enfermedad del ser

humano (Baker y col., 2003; Guarner, 2011; Moya, 2017).

La identificación molecular y su potencial fenotípico son completamente

necesarias para determinar similitudes y capacidades de sobrevivencia propias

de las bacterias aisladas. La exploración de factores implicados como

patogenicidad, ruta de transmisión, estabilidad del agente, dosis infecciosa,

concentración y origen pueden proporcionar estrategias biotecnológicas para

que este microorganismo sea considerado como probiótico (CDC, 2002).




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III. Justificación del proyecto

El proyecto “Identificación morfológica y genética de Lactobacillus sp. con

potencial probiótico” se realiza con el fin de aplicar los conocimientos adquiridos

durante la licenciatura en ingeniería bioquímica, desde realizar la preparación del

material que será utilizado hasta lograr llevar a cabo el aislamiento de las

bacterias y su identificación tanto fenotípica como molecular para probar el

potencial de los lactobacillus como probióticos.

IV. Objetivos

- General

Evaluar consorcios bacterianos de Lactobacillus spp. provenientes de la

microbiota intestinal de seres humanos sanos a través del uso de técnicas

microscópicas y moleculares para establecer su uso como probióticos.

- Específicos

1. Identificar los procedimientos de laboratorio básicos en el área de

Microbiología Clínica.

2. Consultar las metodologías estándar para el análisis de muestras

clínicas de humanos.

3. Realizar una revisión bibliográfica acerca de los métodos de

identificación microbiana que están disponibles en el mercado o para

fines de investigación.

4. Hacer un análisis comparativo de las ventajas y desventajas del uso de

métodos de identificación de microorganismos.

5. Aislar cepas presuntivas de Lactobacillus sp. de la microbiota intestinal

de seres humanos sanos mediante técnicas de cultivo convencionales.

6. Identificar morfológica y genéticamente las cepas de Lactobacillus sp.

mediante observación microscópica, y amplificación y secuenciación

de la región 16S del gen ribosomal, respectivamente.




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V. Metas

La principal meta es que los brigadistas de Servicio Social identifiquen las

oportunidades de aplicación de los conocimientos adquiridos durante sus

estudios en la carrera de Químico Farmacéutico Biólogo, con lo que podrán

abordar su ámbito profesional con mejores elementos formativos. Esta propuesta

de investigación permitirá determinar el potencial probiótico de Lactobacillus spp.

aislado de la microbiota intestinal de seres humanos.

VI. Localización geográfica del proyecto

El proyecto se desarrollará en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad

de Ciencias Químico-Biológicas de la Universidad Autónoma de Sinaloa, con

dirección en Blvd. de las Américas y Av. Universitarios S/N Ciudad Universitaria,

80040, Culiacán, Sinaloa, México (Figura 1).

Figura 1. Localización geográfica del laboratorio.

VII. Actividades a realizar

1. Inducción al laboratorio

2. Preparación de material y esterilizado

3. Preparación de medios de cultivo




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4. Estandarización de sembrado en placa por cuadrante

5. Toma y procesamiento de muestras

6. Aislamiento de bacterias

7. Identificación fenotípica

8. Identificación molecular

VIII. Recursos

Tanto en los recursos económicos como recursos humanos, se contará con

la colaboración de la Dra. Maribel Jiménez Edeza, el prestador del servicio y

personal administrativo.

IX. Financiamiento

Este proyecto será solventado por los recursos aportados de la Facultad de

Ciencias Químico-Biológicas.

X. Metodología

Revisión bibliográfica

Los brigadistas de Servicio Social deberán realizar una revisión

bibliográfica exhaustiva acerca de los objetivos planteados. Para ello, utilizarán

como referencia las Normas Oficiales Mexicanas, así como las Normas

Internacionales establecidas por Organizaciones Regulatorias como la OMS,

FAO, entre otras.

Toma y procesado de muestras

Se llevarán a cabo entrevistas personales y una encuesta de hábitos

alimenticios. Los individuos por seleccionar deberán pertenecer a un grupo con

edad entre 18 y 28 años con hábitos alimenticios normales y sin historial de

tratamiento con antibióticos reciente. Se excluyeron los individuos con hábitos




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L

dietéticos especiales, incluidos vegetarianos y veganos o una alergia alimentaria

conocida, así como a las personas con antecedentes de tabaquismo en los

últimos 5 años, antecedentes de trastornos hemorrágicos, enfermedades

gastrointestinales, enfermedades cardiovasculares e inflamatorias del intestino

(colitis ulcerativa/de Crohn), síndrome del intestino irritable, hipertensión,

enfermedades cardiovasculares, individuos sometidos a cirugía gastrointestinal

en los últimos 2 años, y a atletas con entrenamiento físico intensivo. Una vez

cumplidos los criterios para la selección de individuos se les solicitará una

muestra de heces fecales, la cual será transportada en un contenedor con

temperatura controlada de 4ºC al Laboratorio y procesadas dentro de las 2 horas

siguientes a su deposición.

Aislamiento de bacterias

Para el aislamiento de bacterias a partir de heces se pesará 1 g de la

muestra en 9 mL de PBS 1X estéril (1:10 p/v) y se realizarán diluciones seriadas

(Rodríguez, 2009). Posteriormente se inocularán en agar de Man, Rogosa y

Sharpe (MRS) mediante la técnica de spot, se tomarán 10 de la muestra

homogeneizada de las diluciones seriadas y posteriormente se colocará sobre el

agar MRS hasta su absorción completa. Las cajas inoculadas se incubarán a 37°

C durante 24 h para llevar a cabo su conteo por goteo siguiendo la fórmula:

"UFC/mL=" ("No.de colonias por placa" )"(Factor de dilución)" /"mL de la muestra

sembrada"

Se seleccionarán las colonias pequeñas (2-5 mm) con aspecto circular,

ligera elevación, convexas y de borde entero. Posteriormente, se someterán a un

proceso de purificación mediante el estriado en agar MRS, y se incubarán a 37°

C durante 24 h. Todas las cepas serán conservadas a -80°C en el medio de

cultivo fresco correspondiente con un 50% de glicerol (Ramos-Izquierdo y col.,

2009).




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Identificación morfológica de las cepas aisladas

La identificación fenotípica de las cepas aisladas se realizará mediante el

sistema estandarizado API 50 CH (BIOMÉRIUX). Se tomarán en cuenta sólo

aquellas pruebas que se identifiquen con un 90% o más de probabilidad de

identificación. Las cepas aisladas se cultivarán en placas de agar MRS durante

48 h, se usará un hisopo estéril de algodón para recoger las colonias y

resuspenderlas en 2 mL de medio de suspensión. Posteriormente se tomarán

300 - 500 L de la suspensión en 5 mL de agua destilada estéril hasta la turbidez

equivalente a 3 en la escala de McFarland. Se tomará una alícuota de 0.6 - 1 mL

del medio de suspensión y se agregarán en 10 mL de medio 50 CH. Las cápsulas

de 50 CH se llenarán con la suspensión, para simular un ambiente anaeróbico se

colocarán unas gotas de aceite de parafina, posteriormente se taparán y se

incubarán a 37 ºC durante 48 h. Los resultados se analizarán usando el Índice de

Perfil Analítico (sistema API, BioMérieux).

Identificación molecular de las cepas aisladas

La identificación molecular se realizará amplificando el gen 16s ribosomal.

Para la extracción del DNA se usará el kit de tejido DNeasy de QIAGEN siguiendo

las instrucciones del fabricante y los primers universales dentro del dominio de

las bacterias ácido láctica. Los primers a utilizar serán. Forward: GCG GAT GGG

TGA GTA ACA C, Reverse: ACG GCT ACC TTG TTA GCA CTT. La amplificación

de la PCR se realizará en un termociclador (C100 Thermo Scientific, EEUU),

usando Taq polimerasa (Invitrogen) de la siguiente manera, desnaturalización

inicial a 95ºC por dos minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización de 94ºC

a 30 s, anillamiento a 52ºC, elongación 72ºC durante 45 s y una elongación final

para la Taq polimerasa de 5 minutos a 72ºC. Los productos se conservarán a

4ºC. La evidencia de los fragmentos de DNA amplificados se realizará en gel de

agarosa 1.5% p/v, aplicando 90 V por 5 minutos seguido de 70 V por 40 minutos,

los geles se visualizarán en un transiluminador. Los productos amplificados serán




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comparados con el patrón de pesos moleculares de 1Kb Plus DNA Ladder. Los

fragmentos de DNA se enviarán a secuenciar. Las secuencias se analizarán con

las secuencias homólogas más cercanas del GenBank utilizando el programa

BLAST.

XI. Supervisión y asesoría

La supervisión de este proyecto será de carácter operativo y descriptivo en el

laboratorio de Microbiología, y estará supervisado por la Dra. Maribel Jiménez

Edeza como asesora del servicio social con el objetivo de brindar al prestador de

servicio asesoría académica y aprobación de las funciones y actividades que se

realizaran por el prestador de servicio a lo largo de este estudio.

XII. Evaluación

La evaluación del desempeño del prestador de servicio social se realizará por

medio de reuniones vía zoom mensualmente con la asesora para la entrega de

un informe de los resultados obtenidos a lo largo de la revisión bibliográfica, así

como también reforzar los conocimientos adquiridos y resolver dudas, donde se

evaluará el estado actualizado de progreso y evolución del proyecto.

XIII. Resultados esperados

Con el proyecto antes mencionado se espera determinar las características

moleculares y fenotípicas que puedan presentar los lactobacillus y así obtener

información sobre el potencial que tienen los mismos como probióticos.

XIV. Fuentes

Bello, M. G., Knight, R., Gilbert, J. A., & Blaser, M. J. (2018). Preserving microbial

diversity. Science, 33-34.




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Guarner, F. (2007). Papel de la flora intestinal en la salud y en la enfermedad.

Nutrición hospitalaria, 14-19.

Icaza Chávez, M. E. (2013). Microbiota intestinal en la salud y la enfermedad.

Revista de gastroenterología de México, 240-248.

Kadariya, J., Smith, T. C., & Thapaliya, D. (2014). Staphylococcus aureus and

staphylococcal food-borne disease: an ongoing challenge in public health.

BioMed research international.

Rodríguez, H., Curiel, J. A., Landete, J. M., De las Rivas, B., De Felipe, F. L.,

Gómez Cordovés, C., & Muñoz, R. (2009). Food phenolics and lactic acid

bacteria. International journal of food microbiology, 79-90.

XV. Cronograma de actividades (descarga el anexo 2b)

OBJETIVO ESPECIFICO

ACTIVIDAD

META

AVANCE DE META % RESPONSABLE (S) MESES

1 2 3 4 5 6

1. Introducción al X X

Heberth Alan Casarez Velazquez

1. Identificar los

procedimientos de

laboratorio básicos

laboratorio 2. Preparación de material y esterilizado

X X


3. Preparación de medios X

Heberth Alan Casarez Velazquez de cultivo

2. Consultar las

metodologías

4. Estandarización de

sembrado en placa por

cuadrante

Identificar las

oportunidades de

aplicación de los

X


3. Realizar una 5. Toma y procesamiento conocimientos adquiridos X X

Heberth Alan Casarez Velazquez revisión bibliográfica de muestras durante los estudios de la

4. Hacer un análisis 6. Aislamiento de carrera de Ingeniería X X Heberth Alan Casarez Velazquez

comparativo bacterias Buioquímica

5. Aislar cepas

presuntivas de Lactobacillus sp.

7. Identificación

fenotípica

X


6. Identificar las cepas

de Lactobacillus sp.

8. Identificación

molecular

X





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XVI. Programa de actividades/carta descriptiva

Objetivo específico Actividades

1. Identificar los procedimientos de laboratorio básicos en el área de

Microbiología Clínica.

1. Inducción al laboratorio

2. Consultar las metodologías estándar para el análisis de muestras clínicas de

humanos.

2. Preparación de material y esterilizado

3. Realizar una revisión bibliográfica acerca de los métodos de identificación microbiana que están disponibles en el mercado o para

fines de investigación.

3. Preparación de medios de cultivo

4. Hacer un análisis comparativo de las

ventajas y desventajas del uso de métodos de identificación de microorganismos.

4. Estandarización de sembrado en placa por cuadrante

5. Aislar cepas presuntivas de Lactobacillus

sp. de la microbiota intestinal de seres humanos sanos mediante técnicas de

cultivo convencionales.

5. Toma y procesamiento de muestras

6. Identificar bioquímica y genéticamente

las cepas de Lactobacillus sp. mediante tiras reactivas API 50CH, y amplificación y

secuenciación de la región 16S del gen ribosomal, respectivamente.

6. Aislamiento de bacterias

7. Identificación fenotípica

8. Identificación molecular




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Firmado

digitalmente por

Dra. Maribel

Jiménez Edeza

Fecha: 2021.07.23

17:49:38 -06'00'

Brigadista

XVII. Nombre y firma de responsables

Heberth Alan Casarez Velázquez

Asesor

DRA. MARIBEL JIMÉNEZ EDEZA

nombre del proyecto: identificaciÓn morfolÓgica y genÉtica …

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