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“Principios de Genética Toxicológica” Marta A. Carballo y Marta Mudry ( Eds.)
“Inestabilidad Cromosómica” por
Enrique Zamorano – Ponce, D.Sc.
Laboratorio de Genética Toxicológica (GENETOX), Departamento de Ciencias Básicas,
Facultad de Ciencias, Universidad del Bío-Bío, casilla 447 Chillán-CHILE .
Teléfono: 56-42-203075
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e-mail: [email protected]
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La idea que en estos momentos se tiene de la célula es muy distinta de la que se
concebía hasta hace algún un tiempo atrás. Hoy, la unidad morfológica y fisiológica de
organización de los seres vivos se nos muestra como una estructura dinámica, en la que
simultáneamente se llevan a cabo decenas de procesos en distintos lugares dentro de ella, los
que regulados por complejos mecanismos de control, permiten el funcionamiento equilibrado de
la misma: “Cuando se observa una célula bajo el microscopio, parece sosegada. Pero debajo
de esa quietud externa se esconde una frenética actividad bioquímica”. (Lau y Bartel, 2003)
Efectivamente, mientras en el citoplasma, una compleja maquinaria molecular puede -
por ejemplo- estar traduciendo los mensajeros para la síntesis de proteínas como Ku70, Ku80,
Artemisa y Xrcc4, involucradas tanto en fenómenos de reparación de fracturas de ADN de
hebra doble, como en la protección (capping) de telómeros (Bailey y Goodwin, 2004); en el
interior del núcleo estarán probablemente ocurriendo -en simultáneo- otros procesos
complejísimos como la interacción de condensina II con el ADN para contribuir con los primeros
pasos en el ensamblaje cromosómico (Ono, et al., 2004), o el secuestro de un ARNm por ADN
no codificador para promover una regulación epigenética de la expresión de la información
genética (Wayt Gibbs, 2004). Es decir, la célula es un todo coordinada y evoca en su diseño
estructural y funcional los conceptos de unidad, ya que es un todo y el de unicidad ya que es
única.
Sin embargo, diversos factores alteran el patrón normal de regulación de señales
internas e inducen a la célula a expresar un fenotipo inestable, que se evidencia desde un punto
de vista citogenético como anomalías en la estructura o en el número de cromosomas del
individuo. A este fenómeno se lo ha denominado colectivamente como inestabilidad
cromosómica CIN (del inglés: Chromosome INstability), un apartado de importancia dentro del
gran tema de la inestabilidad genómica.
A casi 30 años desde que Nowell (1976) acuñara el término tras analizar células
neoplásicas en las que el fenotipo CIN es un biomarcador frecuente, el cúmulo de
descubrimientos en torno a las bases biológicas que explican el fenómeno avanza rápidamente
y las causas, que hace algunos años se veían como inconexas, en estos momentos empiezan a
relacionarse entre sí (Gollin, 2004).
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Toda causa, por definición lleva a su efecto. La causa inmediata del fenotipo CIN debe
encontrarse en algún accidente o conjunto de ellos que inducen a la célula a expresar
anomalías cromosómicas de tipo estructural o numérica. En este capítulo se analizan algunas
de esas causas y en torno a ello se relevan las publicaciones más recientes y significativas
entorno al tema.
¿Qué es la inestabilidad cromosómica?
Puede ser definida como un estado de formación continua de nuevas mutaciones
cromosómicas, a un grado más elevado que en células normales (Gisselsson, 2003). Entre las
causas que han sido involucradas en la aparición de fenotipo CIN, en este capítulo se describen
las siguientes: i fallos en puntos de control del ciclo celular, ii anomalías centrosómicas
numéricas o estructurales, iii defectos en la segregación, iv malfuncionamiento de telómeros y
v recombinación homóloga vinculada a reparación de roturas de ADN de hebra doble.
A. Fallos en los puntos de control del ciclo celular:
Los notables cambios que acontecen en la célula, particularmente en el núcleo durante
las diferentes etapas del ciclo celular proliferativo, son ejemplos notables de la gran precisión
arquitectónica y de geometría biológica subyacente a la organización espacial del genoma.
En el proceso de cuatro etapas por las que atraviesa un cromosoma durante el ciclo
celular, incluyendo: duplicación, condensación, segregación y descondensación; cada una de
ellas representa un factor determinante de igual importancia a la hora de entender los delicados
mecanismos que controlan el tránsito a través de las diversas etapas del ciclo celular, así como
las causas que pueden explicar el fenómeno de descontrol que afecta –bajo determinadas
circunstancias- el normal desarrollo del proceso, expresándose durante la mitosis siguiente
como alteraciones cromosómicas de tipo estructural o numéricas.
Tradicionalmente las diversas manifestaciones del fenotipo CIN de tipo numérico se ha
atribuido a fallos en el punto de control entre Metafase y Anafase, sin embargo un número
importante de evidencias indican que puede no ser esa la única causa y que fallos en los puntos
de control G1-S y G2-M pueden explicar un fenotipo CIN de índole numérico (aneuploidía), cosa
que recién empieza a entenderse gracias al aislamiento e identificación de nuevas proteínas
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que hasta hace poco eran desconocidas y que de alguna manera se las está relacionando a la
etiología del fenotipo CIN.
Se sabe que el avance a través de las diversas etapas del ciclo celular es regulado de
manera muy estricta. La división celular normal es un proceso que avanza coordinado con el
crecimiento celular, mientras que la iniciación de la síntesis de ADN o fase “S” se ordena de tal
manera de prevenir una amplificación inapropiada del ADN que pueda ocasionar inestabilidad
en el genoma. Para asegurarse de que se cumple con esos importantes requerimientos
divisionales, las células han desarrollado un mecanismo de supervivencia basado en una
intrincada red de vías de señalización por quinasas, que conducen a estos “puntos de control”
durante el desarrollo del ciclo celular proliferativo. Se ha identificado tres puntos de control en
las transiciones siguientes: i G1 – S, ii G2 – M y iii Metafase y Anafase.
i. G1 – S
El punto de transición G1-S ha sido muy bien estudiado en levaduras en las que se ha
identificado un punto de inicio denominado START (o Punto de Restricción en células de
mamíferos) que requiere de un Factor Promotor de S (FPS), constituido por el producto del
gen CDC28 (S. cerevisiae) o cdc2 (S. pombe); una quinasa dependiente de ciclina y ciclina. El
FPS es entonces análogo al Factor Promotor de Mitosis (FPM) que, como veremos más
adelante, controla el ingreso en M. En levaduras existe una sola quinasa que participa en los
dos puntos de control, en tanto que en células de mamíferos se ha identificado a dos distintas:
una para cada punto. En START una ciclina G1 se une a CDC28/cdc2quinasa y forma el FPS
activo. La Cdk entonces fosforila proteínas claves que se necesitan para el progreso dentro de
S. Una vez que las ciclinas han activado a Cdk, el nivel de ciclinas decrece como resultado de
una proteolisis dependiente de ubiquitina 1. (Fig 1)
Hay que decir, sin embargo que las células en un organismo multicelular se enfrentan a
un conjunto distinto de problemas que una levadura o una célula huevo fertilizada. En un
organismo multicelular, algunas células se reproducen rápido, otras lo hacen lento y la salud 1 Proteolisis dependiente de ubiquitina. La ubiquitinación de una proteína es una herramienta muy versátil que poseen las células eucariontes para controlar la estabilidad, funciones y localización subcelular de proteínas específicas. La proteolisis dependiente de ubiquitina es la inactivación de una proteína por unión a ella de ubiquitina (ub), una pequeña molécula que actúa como una etiqueta que es reconocida por una maquinaria proteica que transporta la proteína ubiquitinada hacia un proteosoma para su degradación.
Figura 1. Modelo General de Regulación del ciclo celular. Los punto de control G1 – S y G2 -M se lleva a cabo por activación de complejos proteicos constituidos por Ciclina y Cdk. Para la activación de Cdk se requiere de unión a ciclina cuya disponibilidad (niveles intracelulares) se controla por regulación transcripcional y/o por proteolisis específica. Las ciclinas son blanco de degradación dependiente de ubiquitina por la vía de proteosomas. SCF reconoce ciclinas como substrato cuando ellas están fosforiladas, mientras que APC agrega ubiquitina a ciclinas cuando factores específicos son activados por fosfatasas.
Degradación mediada por ubiquitina
G0
S
FPS
FPM
G2
M
G1
Ciclo Celular
Cdc20
Profase
Prometafase
Metafase
Anafase
Ciclina mitótica
Cdk-G1
Punto de control G1 -S
Punto de control G2 -M
Punto de control M - A
APCinactivo
Securina
Ubiquitina
APCactivo
Complejo Cohesina
Securina degradada
Ciclina G1 Cromátidas hermanas
Cdk mitótico
Ciclina mitótica degradada
Ciclina G1 degradada
(a) APC une ubiquitina a securina del complejo cohesina (b) Securina ubiquitinada es degradada por separasa (c) procede separación de las cromátidas
Complejo Cohesina. Mantiene unidas las hebras de ADN tras su síntesis en “S”.
Cdh1
Cdh1
APC/Cdh1activo
Skp2
Skp2 degradado
Cdc25
No se ingresa en “S”
a b
c
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general del organismo requiere que ninguno de esos tipos celulares predomine. Ello hace que
las células deban no sólo responder a señales internas, sino también a señales que provienen
del entorno y que tienen que ver con el contacto entre las células, factores de crecimiento,
hormonas, etc., de tal forma que si bien, el entramado regulatorio del ciclo celular en
organismos multicelulares sigue vías muy parecidas a las que conocemos en levaduras, no
cabe duda de que el nivel de complejidad y de regulación es significativamente mayor. Existen
ejemplos claros de proteínas regulatorias que participan directa o indirectamente en la
regulación del tránsito por el ciclo celular en células de mamíferos y que se las ha relacionado
con algunos tipos de fallos que conducen a la aparición de fenotipo CIN.
Dado que la adquisición de un volumen determinado y la expresión de una organización
interna precisa, son cruciales como conditio sine qua non para que la célula ingrese en “S”,
adquieren relevancia especial la familia de genes que codifican para GTPasas Rho, incluyendo
a Cdc42 además de Rho y Rac, involucradas todas en la morfogénesis celular, al inducir ciertos
tipos de actinas citoesqueletales y regular el correcto alineamiento y estabilización de
microtúbulos durante la interfase del ciclo celular (Kamai et al., 2004). Se ha demostrado
recientemente que Cdc42 y su efector Mdia3 están involucrados también en la bi-orientación y
estabilización de la unión de microtúbulos al cinetócoro del cromosoma (Yasuda et al., 2004),
así como en la alineación y segregación de los cromosomas. De tal forma que fallos en su
regulación, induce a la aparición de fenotipo CIN que puede conducir ya sea a tumorogénesis o
apoptosis (Narumiya et al., 2004; Nojima, 2004). Es decir, se inicia la identificación de genes,
cuyos productos tienen que ver con la morfogénesis celular durante G1 e involucrados en
procesos de unión de los microtúbulos a los cinetócoros de los cromosomas, de tal forma que
su mal funcionamiento puede traer consigo para la célula problemas no sólo de índole
morfológica, sino además funcionales que impedirán un normal proceso de segregación
cromosómica durante la anafase de la mitosis siguiente.
Se sabe que las transiciones en el ciclo celular son conducidas por ondas de
degradación de reguladores del ciclo dependiente de ubiquitina. Los complejos SCF (del inglés:
Skp1-Cullin-F-box) y APC/C (Complejo Promotor de Anafase, del inglés APC por: Anaphase
Promoting Complex) o también llamado Ciclosoma, representan dos clases de ligasas de
ubiquitina cuyas actividades regulan primariamente las transiciones G1-S y Metafase-Anafase
respectivamente. Los blancos principales del complejo SCF son: p21 y p27, dos inhibidores de
Cdk (quinasa dependiente de ciclina) durante la fase S; mientras que el blanco principal -pero
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no único- del complejo APC/C es Securina, una subunidad del denominado complejo cohesina
cuya ubiquitinación por APC/C lo hace blanco de Separasa o Separina que la degrada
catalíticamente permitiendo la separación de las cromátidas hermanas durante la anafase. APC
en este caso se une a un activador específico, Cdc20, para poder llevar a cabo su función. Sin
embargo, si bien la función de APC/C-Cdc20 en la transición metafase-anafase es
relativamente clara, existe un número creciente de evidencias que señalan que APC/C
conteniendo a un segundo activador llamado Cdh1, (APC/C-Cdh1), también juega un rol
importante en la fase G1 del ciclo celular (Ang et al., 2004; Sudo et al., 2004).
Se ha demostrado que la oncoproteína Skp2 (un activador de S ubicado en la caja F)
promueve la transición G1-S actuando como factor de especificidad para SCF de tal forma que
actúe sobre reguladores claves para que éstos sean degradados por proteosomas. Skp2 es una
proteína lábil cuyos niveles oscila de una manera dependiente del ciclo celular. La acumulación
de Skp2 se presenta desregulada a menudo en células cancerosas.. Se ha demostrado además
que la acumulación de SCF-Skp2 precisa una inactivación previa de APC/C-Cdh1 (Wei et al.,
2004) lo que se ha confirmado a través del silenciamiento de Cdh1 por ARNi2 (Bashir et al.,
2004). (fig 1). Estos dos últimos estudios ponen en evidencia nuevos mecanismos de control en
los cuales la maquinaria mitótica se comunica con proteínas que regulan el tránsito a través de
la fase G1 del ciclo celular Papin et al., 2004).
Otras líneas de evidencias indican que el correcto inicio de la duplicación de los
centrosomas, que comienza precisamente durante la transición G1-S, es un factor determinante
para lograr el ingreso en S. Se ha visto que fallos en este punto de control que lleva a
fenómenos de amplificación de centrosomas, induce la aparición de fenotipo CIN (Farrugia et
al., 2004). Elegantes experimentos realizados en el laboratorio del profesor Hinchcliffe, en la
Universidad de Notre Dame (USA), han demostrado que la extracción de los centrosomas a
partir de células de mamíferos en cultivo mediante microcirugía, induce la aparición de
carioplastos, que son incapaces de ingresar en S. Ello parece indicar la importancia de la
presencia de centrosomas en el inicio de la fase S (Hinchcliffe, 2003) y es una evidencia 2 El ARNi o ARN de interferencia constituye un nivel de regulación génica descubierto hace pocos años en células eucarióticas. Se basa en que la presencia de ARN de doble hebra en la célula, elimina la expresión de un gen que posee la misma secuencia. Se trata de una vía altamente conservada de silenciamiento génico postranscripcional (Scherr et al., 2004) en la cual la nucleasa “Dicer” corta RNA de doble hebra en pequeñas piezas de RNA de interferencia o RNAi (Fukagawa et al., 2004) Descrito sólo en el año 1998, hoy a este proceso se lo considera como una herramienta importante para estudiar la función génica en células vivas (Kent et al., 2004, terapia génica (Ichim et al.,2004), expresión génica durante el desarrollo (Maine, 2004).
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adicional de la compleja orquestación de actividades que se lleva a cabo durante el progreso a
través de las etapas del ciclo celular, particularmente en la transición G1-S que recién empiezan
a entenderse Gollin (2004) y cuyos fallos en su regulación pueden explicar fenotipos de
inestabilidad cromosómica al interferir con el normal proceso de detención que experimenta
cualquier célula al detectarse fallos en procesos claves que tienen relación con la transmisión
fidedigna de la información genética a la descendencia que es –diríamos- uno de los propósitos
claves en la mantención de una delicada homeostasis en el proceso de reproducción celular .
ii. G2 - M
Otro intrincado sistema bioquímico de control ha sido descrito en la transición G2 / M (Fig 1). El clásico modelo de control en este punto indica que también se trata de una proteína
quinasa Cdk que se une a ciclina B para formar un complejo denominado como “Factor
Promotor de Mitosis”. La activación del FPM depende de Cdc25, una fosfatasa que elimina
grupos fosfatos inhibidores unidos a aminoácidos ubicados en el sitio clave para el
funcionamiento de la Cdk como es su sitio activo. De esa forma, se activa el complejo que va a
fosforilar una serie de substratos como la histona H1 involucrada en la condensación
cromosómica, laminina ubicada en la lámina nuclear y cuya fosforilación gatilla la disolución de
la envoltura nuclear, entre otros. Sin embargo, hoy ya se sabe que el punto de control gatilla la
señal de ingreso, sólo si el funcionamiento de otros genes es el adecuado.
Investigaciones orientadas a encontrar reguladores de estos puntos de control han
permitido identificar al gen de control CHFR (del inglés: checkpoint with forkhead-associated
and ring finger) que coordina los primeros estadíos de la mitosis, deteniendo la condensación
cromosómica en respuesta a un estrés mitótico e interactuando con Plk-1 (polo- like kinase)
para cumplir su trabajo (Erson, 2004). Plk-1 realiza múltiples funciones esenciales durante el
ciclo celular. Se ha visto que aquellas células deficientes en Plk-1 son incapaces de separar sus
centrosomas, fallan en formar un huso bipolar y experimentan detención en prometafase
procesos dependientes de Mad-2 / BubR1 (Van Vugt et al., 2004). (para revisión de Plks el
lector puede ir a: Barr et al., 2004). Por otro lado, el silenciamiento de CHFR ha sido asociado
con metilación aberrante en su sitio promotor y desacetilación de histonas, dos modificaciones
epigenéticas que lo inactivan y pueden originar fenotipos de inestabilidad cromosómica (Kang et
al., 2004).
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Estudios muy recientes han permitido identificar además a otras proteínas que también
participan en el punto de control de tránsito G2/M como: Aurora-A y Nek2. Las quinasas
Aurora, de las cuales se han identificado tres familias Aur A, Aur B y Aur C, corresponden a una
nueva familia de quinasas de serina y treonina que poseen un sitio catalítico altamente
conservado. Se encuentran localizadas en los centrosomas de células interfásicas, en los polos
del huso mitótico y en el cuerpo medio el aparato mitótico. Los substratos identificados para
aurora quinasa A y B son: la proteína motora parecida a la kinesina (involucrada en el
movimiento cromosómico), proteínas del huso mitótico, histona H3, proteínas cinetocóricas y la
proteína supresora de tumores p53. Se ha demostrado que estas proteínas aseguran la
formación de un huso bipolar, correcta segregación de cromosomas y la completación de la
citocinesis (Crane et al., 2004). Su regulación se lleva a cabo ya sea por fosforilación, por unión
de moléculas específicas o por proteolisis dependiente de ubiquitina. La desregulación de las
quinasas Aurora induce fallos en el ensamblaje del huso bipolar, en la función de control G2/M y
en la división celular originando malsegregación de cromosomas individuales o poliploidización
acompañado por amplificación centrosómica (Meraldi et al., 2004 a). Estas evidencias sugieren
fuertemente que la regulación eficiente de ciertas proteínas importantes por su implicación en
los mecanismos de control de ciclo celular, están de alguna manera involucradas también en la
correcta segregación de los cromosomas durante anafase y que la desregulación de su
expresión puede inducir a la célula a mostrar fallos en los procesos que aseguran la
segregación equitativa de los cromosomas entre las células hijas y con ello, a originar
desbalances numéricos muy comunes por lo demás en células tumorogénicas. En los próximos
años seguramente se identificarán otras proteínas involucradas en estos procesos y se
empezará a armar un puzzle hasta ahora no terminado sobre las complejas causas que inducen
a la célula a expresar inestabilidad cromosómica (Patel et al., 2004).
iii. Metafase-Anafase
Durante la división celular en eucariontes, la célula primero duplica su ADN en la fase S
y después empaca el ADN en cromátidas hermanas en mitosis y entonces segrega los
cromosomas entre las células hijas. La correcta separación de las cromátidas hermanas
descansa en un delicado equilibrio de dos procesos opuestos: la cohesión entre las cromátidas
hermanas y las fuerzas de separación que promueven las fibras del huso mitótico. La cohesión
entre las cromátidas hermanas es establecida por un complejo proteico de Cohesina, durante la
duplicación del ADN y persiste hasta la segregación cromosómica (Fig 1). En la mitosis, las
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cromátidas hermanas se unen a las fibras del huso mitótico a través de los cinetócoros;
complejos proteináceos asociados con ADN centromérico. Es vital para las cromátidas
hermanas unir a los microtúbulos que emanan desde los dos polos de la célula (bi-orientación),
estableciéndose un fenómeno de tensión a lo largo de los dos cinetócoros de un par de
cromátidas hermanas. Después de que todas las cromátidas hermanas se encuentran bi-
orientadas y sus cinetócoros se encuentran en tensión, una gran ligasa de ubiquitina E3
llamado el Complejo Promotor de Anafase o Ciclosoma (Melloy y Holloway, 2004), parecido
a FPS pero con un conjunto específico de subunidades (Fig 2), en asociación con uno de sus
cofactores de unión a substrato Cdc20 que se activa a fines de metafase, adiciona ubiquitina a
la proteína Securina. La destrucción catalítica de la subunidad Scc1 del complejo cohesina por
la separasa, destruye la cohesión entre las cromátidas hermanas y gatilla la etapa de anafase. (Fig 3). Los microtúbulos del huso ayudados por proteínas motoras de localización
cinetocórica como CENP-E, una proteína parecida a kinesina, tiran los dos conjuntos de
cromátidas hacia polos opuestos de la célula y como resultado cada célula hija recibe
información genética idéntica (Amon, 2001; Uhlman, 2004; Hagstrom y Meyer, 2004).
Recientemente se ha demostrado que en levaduras Ipl1, una proteína quinasa parecida
a proteínas de la familia Aurora, se requiere para establecer la tensión y la biorientación de las
cromátidas hermanas. Interesante resulta el hecho que esta misma proteína también está
implicada en el punto de chequeo del huso. En particular IpI1 puede detectar falta de tensión en
los cinetócoros. Intriga el hecho que la misma proteína requerida para el proceso de bi-
orientación sea también responsable de controlar el estado de esa biorientación en estados
posteriores del ciclo celular. Recientemente se ha demostrado que Aurora B de mamíferos,
análogo a IpI1 de levaduras, está involucrada en la unión bipolar de los cromosomas y en una
correcta función del punto de control del huso mitótico, aunque hasta hoy no se ha dilucidado
cómo puede ello ser controlado. Se piensa que el mecanismo de detección de tensión a nivel
cinetocórico debe involucrar a CENP-E. Además, la falta de tensión puede también ser
detectada por un subconjunto específico de proteínas de chequeo como IpI1/ AuroraB y Mps1.
No se sabe cómo estas proteínas podrían estar interactuando con las otras proteínas de control
que se sitúan río debajo de este mecanismo propuesto (Fig.3)
Los componentes moleculares de este punto de control mitótico fueron identificados
inicialmente en S. cerevisiae y posteriormente se encontraron proteínas de control homólogas
en otros organismos, incluidos mamíferos. Esas incluyen a proteínas de la familia Mad (del
Figura 2. Constitución multimérica de los complejos SCF (Skp1.Cullin-F-box) regulador del tránsito G1 –S en comparación a APC (Anaphase Promoting Complex). SCF reconoce a ciclina como substrato, mientras que APC ubiquitina ciclinas cuando se activan factores específicos.(tomado de Tyers and Jorgenson, 2000). Skp (del inglés S-phase kinase associated Proteins): corresponden a una familia de proteínas estructuralmente relacionadas que fueron identificadas por primera vez debido a su habilidad de unirse a ciclinas, que comparten un dominio en común que se une específicamente a proteínas de la caja F (F-box). Cullin corresponden a un dominio de proteínas estructuralmente relacionadas que fueron descubiertas por su habilidad de unirse a ciclinas, juegan un rol importante en la regulación del ciclo celular formando parte del complejo SKp1-Cullin-F-box (SCF). Las proteínas del dominio F-box, corresponden a una familia de proteínas que comparten el dominio F box en común, involucradas en interacciones proteína-proteína, juega un rol importante en la ubiquitinación de proteínas vía unión a proteínas del dominio Skp.
Cul1
Cdc4p
Skp1
substrato
Cdc34
Roc1
SCF
Apc11
Apc2
Apc1
Cdc20 Ubc10
Substrato Cdh1
Apc4,5,7,10 Cdc16,23,27
Cdc20 Se une a blancos tempranos Cdhl1 se une a blancos tardíos
APC
Cdc4p
Figura 3. Vía del control de huso. Esta vía es activada por la inexistencia de microtúbulos y de tensión en el cinetócoro cromosómicos. El mecanismo de detección del defecto es desconocido pero puede involucrar a Aurora B y CENP-E. Este último interactúa con BubR1 pero se desconoce cómo afecta la función de BubR1. En levaduras Aurora B puede actuar río arriba de Mps1 en la detección de la tensión. Se desconoce si es CENP-E o Aurora B la que regula Bub1-Bub3. En humanos Bub1 fosforila in vitro a la proteína humana Mad1. Así Mps1 y Bub1-Bub3 deben estar localizadas en su acción río arriba en relación a Mad1-Mad2. Bajo la activación del punto de control ambos, esto es BubR1-.Bub3 y Mad2 interactúan con Cdc20 directamente inhibiendo su capacidad de activar a APC/C. La interacción pasajera entre BubR1-Bub3-Cdc20 y Mad2-Cdc20 lleva a la formación del complejo BubR1-Bub3-Mad2-Cdc20 (Complejo MMC) que es un inhibidor más eficiente de APC/C. Cuando todos los cinetócoros están unidos bipolarmente el punto de control es inactivado y APC ubiquitina a securina. La degradación de securina permite la activación de separasa o separina que rompe a Scc1, una subunidad del complejo cohesina que mantiene unida a las cromátidas hermanas. Con ello se gatilla la segregación de los cromosomas y con ello se inicia la anafase. (Tomado de Yu, 2002)
cohe
Degradación vía proteosoma
Cinetócoro sin tensión de ocupación
CENP-E Aurora B / lpl 1 Rod - Zw 10
Bud R1(Mad3 )- Bub3 Mps1 Bub1-Bub3
Mad1 - Mad2
P
BubR1- Bub3 - Cdc20 MCC Mad2- Cdc20
APC-Cdc20
Ub
Ub
Ub Securina
Separasa
sin
Separación de cromátidas hermanas
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inglés: Mitotic arrest deficient), como: Mad1, Mad2, Mad3 / BubR1, Bub1, Bub 2, Bub3 y Mps1
(Chang y Yen, 2003). Con excepción de Bub2, esas proteínas forman una compleja red de
señalización para bloquear la actividad de APC/C-Cdc20 de unirse a proteínas claves para su
degradación mediada por ubiquitina (Sudakin y Yen, 2004), previniendo de esa forma una
segregación cromosómica precoz y asegurando así una repartición segura del material genético
(Bharadwaj y Yu, 2004). En levaduras, Bub2 parece no estar involucrado en la regulación de
APC/C-Cdc20 y en la segregación cromosómica. En vez de ello, esta proteína regula
negativamente las funciones de la red de salida de mitosis (Mitotic Exit Network o MEN)
inhibiendo a APC/C-Cdh1 que media la degradación de ciclinas mitóticas y otros importantes
reguladores del ciclo celular.
Un único cinetócoro no unido a microtúbulo dentro de una célula es suficiente para
activar el punto de control del huso. Así, debe producir una señal inhibitoria que difunde para
bloquear la actividad del APC/C en la célula. Recientes estudios genéticos, bioquímicos y
estructurales han iluminado la naturaleza de esta señal difusible que inhibe al APC/C. En la
visión actual plasmada en dos modelos, el APC/C es inhibido a través de unión estequiométrica
directa al complejo de control mitótico (MCC) que contiene BubR1, Bub3, Mad2 y Cdc20.
Pudiese el MMC estar organizado en dos subcomplejos: BubR1-Bub3-Cdc20 y Mad2-Cdc20.
Los dos modelos difieren en el mecanismo de ensamblaje del MCC. En el primer modelo (Fig 4), un cinetócoro no unido cataliza la formación de los complejos inhibidores de control que
pueden difundir para inhibir al APC/C. La señal difusible puede ser MMC o bien alguno de sus
dos subcomplejos. En el segundo modelo, el MCC está presente a través del ciclo celular y su
formación no ocurre en los cinetócoros. Bajo la influencia de la activación del punto de control,
una señal aún no identificada, llega al cinetócoro y sensibiliza al APC/C para permanecer
inhibido por MCC.
Se ha encontrado efectivamente que el complejo APC/C es inhibido por Mad2 cuando
los cromosomas aún no están unidos a las fibras del huso, actuando como un supresor génico
ya que las células MAD2 +/- entran en anafase y muestran inestabilidad cromosómica (Michel et
al., 2004).
Empleando ARNi para MAD2, se ha encontrado una severa reducción de los niveles de
esta proteína, lo que resulta en fallos mitóticos, y muerte celular significativa por la formación
defectuosa del huso mitótico, condensación cromosómica incompleta y salida prematura de
Mad2
Mad2
Cin
etóc
oro
no-
uni
do
Bub3
Bub1
Mad1
Mad1
P
CEN
P-E
Bub3 BubR1
Cdc20
Mad2
Cdc2
Mad2
Cdc20
APC
Bub3
MCC
Bub3
Bub1
CEN
P-E
Bub3
BubR1
Cdc20
Mad1
Mad2
Mad1
Mad2
Cdc20
APC +
Bub
BubR1 + Mad2 ?
Prometafase Metafase Anafase
Activo C
inet
ócor
o un
ido
BubR1
M i c r o t ú b u lo
P
APC Inactivo
Figura 4. Un modelo para la formación de los complejos inhibidores de APC en el cinetócoro. En este modelo Mad2 es reclutada en el cinetócoro por Mad1 y Cdc20 es separadadel cinetócoro por Bubr1-Bub3. Mad 1 también gatilla cambios de conformación en Mad2. Aún no se ha determinado el mecanismo por el cual Mad2 se disocia de Mad1. La fosforilaciónde Mad1 por Bub1 o Mps 1, podría jugar algún papel en este proceso. Mad2 disociado de Mad1 podría retener alguna conformación de unión más afín con Cdc20 que se ha unido aBubr1-Bub3 conformando el MMC. Este complejo de control mitótico o sus subcomplejos podrían difundir lejos del cinetócoro para asociarse con APC/C e inhibir su actividad. Cuando Loscinetócoros son capturados en su totalidad por los microtúbulos del huso Mad1 y Mad ya dejan de localizarse en los cinetócoros. Las concentraciones de BubR1-Bub3 y otras proteínas decontrol también disminuyen en su localización cinetocórica. El rompimiento de MMC conduce a la activación de APC/C, degradación de securina y separación de las cromátidas hermanas(Tomado de Yu 2002)
11
mitosis conduciendo a multinucleación. Se sabe que la ciclina B es degradada prematuramente
en células tratadas por breve período con RNA de MAD2 pero no en células MAD +/-, lo que
sugiere una explicación a la malformación de huso y catástrofe mitótica que se observa en
células knockout para MAD2. (Michel et al, 2004).
Otro inhibidor del complejo APC/C ha sido recientemente descrito en células HeLa y se
ha llamado Emi1 (del inglés Early Mitotic Inhibitor 1) que interfiere con el funcionamiento del
complejo APC/C. Los niveles de Emi1 oscilan en el ciclo celular. Se acumula en fase “S” y es
rápidamente degradado en prometafase (Moshe et al., 2004). Se ha evidenciado que Emi1
secuestra a Mad2 y evita así la activación del APC/C La degradación de Emi1 en mitosis
temprana, llevada a cabo por el complejo ubiquitin-ligasa o SCF , es necesaria para la
activación del complejo APC/C. Plk1 que se acumula durante la mitosis estimula marcadamente
la unión de Emi1 a APC/C.
Por otro lado, el complejo APC/C es activado por dos proteínas regulatorias: Cdc20 y
Cdh1. Al respecto, se ha visto que la activación del complejo APC-Cdh1 juega un rol crucial
tanto en la detención de G1 dependiente del inhibidor Cdk y en la detención en G2 inducida por
daño en el ADN (Sudo et al., 2004). Hallazgos muy recientes indican que bajo ciertas
circunstancias Mad2 adopta dos conformaciones de plegamiento en equilibrio (llamadas N1-
Mad2 y N2-Mad2). N2-Mad2 es un inhibidor más potente del complejo APC/C. Se ha visto que
la sobreexpresión de un mutante de Mad 2 que específicamente secuestra N2-Mad2, bloquea
parcialmente las señales de control en células vivas. Por otro lado las dos conformaciones de
mad2 se interconvierten lentamente in vitro. Aparentemente este doble estado conformacional
es crítico para el punto control del huso (Luo, 2004).
B. Anomalías centrosómicas
El centrosoma es un organelo esencial en las células animales constituido por una
pareja de centríolos y el denominado “Material PeriCentriolar (MPC) que involucra a diversas
proteínas, algunas de las cuales ya empiezan a ser identificadas y caracterizadas en: C.
elegans (Pelletier et al., 2004), en Drosophila (Martínez-Campos et al., 2004) y humanos (Kim et
al., 2004; Thompson et al., 2004). El MPC ha sido descrito ya sea como una nube de material
que rodea a todo el centrosoma o como un racimo de proteínas dividido en dos subconjuntos,
unas que adhieren a la superficie lateral de los centriolos y otro que se extiende hacia fuera de
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esta región a modo de una nube de material. Investigaciones recientes indican un tercer modo
de organización que corresponde a un subconjunto de proteínas del MPC que se integran entre
ellas para organizar un tubo (PCM tube) con un extremo abierto y otro cerrado y que se duplica
en coordinación con la duplicación del centrosoma. Respecto a este último tipo de organización
del MPC, se ha documentado que: i el tubo de MPC representa una porción del MPC asociada
directamente con el centriolo, ii el tubo de MPC tiene una asociación específica y reproducible
con la estructura polar del centriolo, iii el tubo es un sitio de organización microtubular
citoplasmático y posee una estructura que influencia el patrón de ensamblaje inicial de
microtúbulos dentro de la región yuxta-centriolar y iv el tubo de MPC posee una relación
estructural con el centriolo, lo que permite la expresión simultánea de las funciones de éste y
del MPC; por ejemplo ciliogénesis, organización de microtúbulos citoplasmáticos (Ou et al.,
2003).
Al centrosoma se lo ha denominado como el Centro Organizador de Microtúbulos
(COMt), ya que desde ese lugar se produce la nucleación de microtúbulos para organizar el
citoesqueleto en células interfásicas y, el huso bipolar divisional. Se duplican sólo una vez por
célula en cada ciclo celular de una manera semiconservativa (Fig 5 ) , de tal modo que errores
en este proceso pueden conducir a la aparición de fenotipo CIN reflejado en la formación de
husos aberrantes o en la segregación errónea de cromosomas (Nigg, 2003).
Se ha demostrado que la amplificación anormal de los centrosomas es una causa
principal de defectos mitóticos en células cancerosas (D’Assoro et al, 2002). La presencia de
más de dos centrosomas (amplificación centrosómica) induce defectos en la formación de un
huso bipolar normal con un consiguiente incremento en la frecuencia de errores en la
transmisión cromosómica. (Fukasawa, 2002). Existen varios mecanismos responsables de la
amplificación centrosómica, incluyendo duplicación descontrolada de los centrosomas y bloqueo
de citocinesis seguido por el tránsito hacia el próximo ciclo celular (Fukasawa, 2002). El efecto
de agentes genotóxicos como la irradiación y la exposición a ciertos agentes quimioterapéuticos
inducen amplificación centrosómica tanto directamente o induciendo alteraciones genéticas de
ciertos genes cuyos productos están involucrados en la homeostasis numérica de los
centrosomas. Uno de esos genes es p53; la pérdida o la inactivación mutacional de p53
conduce a amplificación centrosómica (Tarapore y Fukasawa, 2002). Sin embargo, así como
las anomalías numéricas y estructurales de los centrosomas han sido implicadas en la
formación de husos multipolares, mal segregación cromosómica e inestabilidad cromosómica,
El ciclo del centrosoma
Duplicación Centriolar
Elongación Centriolar
Maduración centrosómica
Separación centrosómica
M
G1
S
G2
Figura 5. El Ciclo del Centrosoma. El ciclo de duplicación centrosómica puede ser subdividido en varios pasos discretos. Durante la mitosis el centrosoma en cada polocontiene un par de centriolos. Esos dos centriolos muestran usualmente una conspicua conformación ortogonal. Al final de la mitosis esta asociación ortogonal se pierde (lo que seconoce como desorientación centriolar. La duplicación centriolar ocurre durante la fase S del ciclo celular. A nivel morfológico esto se caracteriza por la formación de procentriolos en elextremo proximal de cada centriolo parental, de tal forma que la duplicación centriolar es semiconservativa desde el punto de vista del centrosoma pero conservativa desde el punto devista del centriolo. Los procentriolos se elongan hasta que alcanzan la máxima longitud. En el límite G2 –M se produce la maduración centrosómica. Esta maduración implica elintercambio de muchos componentes y culmina con el reclutamiento de complejos anillos de tubulina gama, un requisito para la actividad de nucleación microtubular. En respuesta a laactivación de proteínas motoras dependiente de microtúbulo los centrosomas se separan entre ellos e instruyen la formación del huso bipolar.( Tomado Nigg, 2002)
13
debe decirse que la causalidad no ha sido definitivamente establecida. Se ha dado a conocer
que las anomalías centrosómicas no necesariamente correlacionan con inestabilidad
cromosómica numérica y que incluso la presencia de metafases multipolares no es suficiente
para predecir si una célula o un tumor es cromosómicamente inestable (Duensing et al., 2003).
En células de ratón se puede inducir amplificación centrosómica tras la inactivación
mutacional de p53. Sin embargo, en células humanas, el sólo silenciamiento de p53 no es
causa suficiente para inducir la amplificación centrosómica (D’Assoro et al., 2004). Ello indica
claramente que en células humanas deben estar involucrados otros mecanismos igualmente
importantes, que aseguran la integridad numérica de los centrosomas y con ello la integridad
genómica. La ciclina E, una subunidad regulatoria de Cdk2 que juega un rol fundamental en la
duplicación centrosómica, se ha encontrado frecuentemente sobreexpresada en algunos
cánceres humanos. Recientemente se ha demostrado que la sobreexpresión de ciclina E, junto
a inactivación de p53 induce efectivamente amplificación centrosómica, no así cada uno por sí
solo. Debido a que las ciclinas en células humanas son proteínas tremendamente reguladas,
estos hallazgos indican que ese patrón de regulación de la expresión de ciclina E, juega un rol
adicional en la homeostasis numérica de los centrosoma en células humanas y que la
deregulación de ciclina E, junto con la inactivación de p53 resulta en amplificación centrosómica
e inducción de fenotipo CIN (Kawamura, 2004). Líneas paralelas de evidencias refuerzan la
idea que el centrosoma es un integrador funcional de las vías que disparan el inicio de la mitosis
proceden de estudios realizados en células tumorales mediante el empleo de la técnica de
inhibición por ARNi en los que se demuestra que la fosforilación de Cdc25-B en Serina 353
(S353) -en el centrosoma- depende de Aurora quinasa A (producto de un oncogen necesario
para el ensamblaje de un aparato mitótico funcional y la regulación de la ploidía celular) y es
fundamental en el control de ingreso en mitosis. Experimentos de microinyección de anticuerpos
anti-S353 inducen a retraso mitótico, mientras que la sobreexpresión de un mutante
fosfomimético de S353 potencia el efecto inductor de mitosis de Cdc25-B (Dutertre et al., 2004).
Además, la estructura y función de los centrosomas son parámetros regulados de una
manera dependiente de ciclo celular. Primero, los centrosomas se duplican
semiconservativamente. Posteriormente, una vez en mitosis los centrosomas duplicados son
objeto de un cambio dramático en la capacidad de nuclear microtúbulos y se separan
físicamente hacia los polos opuestos del núcleo donde ellos organizan el huso bipolar en
conjunto con los cromosomas condensados. Hasta el momento los mecanismos que controlan
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esos procesos permanecen desconocidos. Sin embargo, mediante técnicas que utilizan
anticuerpos específicos se ha evidenciado que la fosforilación de proteínas centrosómicas juega
un rol fundamental en esos procesos. Un de esas proteínas es Nek2, integrante de una nueva
familia de proteínas quinasas muy relacionada a NIMA (del inglés: Never in mitosis gene A) una proteína quinasa aislada a partir de Aspergilus nidulans, el hongo filamentoso. En este
hongo, NIMA coopera con Cdk1 una proteina quinasa que promueve la entrada en mitosis y la
sobreexpresión de NIMA en una variedad de especies heterólogas promueve una
condensación prematura de los cromosomas y en algunos casos la formación del huso. Esto
sugiere una conservación evolutiva de las vías que involucran a las quinasas relacionadas a
NIMA. La familia de proteínas Nek humanas incluye a 11 miembros a la fecha (Bowers y
Boylan, 2004), sin embargo, las relaciones funcionales entre las proteínas quinasas Nek en
vertebrados en general y las NIMA de aspergillus permanecen sin descifrarse hasta el
momento. Nek2 experimenta cambios a través del ciclo en abundancia y actividad. Es
altamente expresada en células germinales y existen algunos datos que señalan su
participación en la condensación del cromosoma meiótico. Sin embargo, la sobreexpresión de
Nek 2 en células somáticas no tiene efecto sobre la condensación cromosómica, sino que
induce una separación prematura de los centrosomas que recuerda la separación de
centrosomas que ocurre en el límite G2-M. Ensayos de inmunofluorescencia y de
fraccionamiento celular, evidencian una localización asociada a centrosoma para esta proteína,
lo que sugiere que -en general- este tipo de quinasas está involucrada en el ciclo centrosómico.
Estos resultados han permitido sugerir que la separación de los centrosomas es un fenómeno
dependiente de fosforilación de proteínas aún no identificadas por Nek2 que induce la pérdida
de cohesión de los centrosomas duplicados y que ello podría representar los primeros pasos en
la separación efectiva de los centrosomas durante las etapas tempranas de la mitosis. Como
sustento de esta hipótesis se ha identificado la proteína C-Nap1 (del ingles: centrosome Nek2-
associated protein 1) que corresponde a un péptido de 281 Kda que se sitúa en el extremo
proximal de los centriolos. Todo indica que la fosforilación de esta proteína por parte de Nek 2
es la señal que induce la separación de centrosomas (fig 6).. Anomalías en este proceso
naturalmente conllevan a fenómenos de amplificación centrosómica, lo que genera
desbalances numéricos en la distribución de cromosomas debido a un mal funcionamiento
centrosómico.
Figura 6. Modelo de separación de centrosoma. La fosforilación de la proteína C-nap1 por Nek dos sería un paso crucial que gatillaría la separación de los centrosomas durante la profase mitótica
Modelo de Separación Centrosómica
G2 Mitosis Proteínas Motoras
C-Nap1
Nek2
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C. Defectos en Segregación
Cada una de nuestras células hereda su información en la forma de cromosomas a partir
de una célula madre. Con el objeto de que ambas hijas obtengan una cantidad equitativa de esa
información, las células necesitan asegurarse que los cromosomas replicados son separados y
distribuidos durante la división celular. Como se decía previamente errores en el proceso
conducen a aneuplodías, células con cromosomas de menos o supernumerarios. Se sabe que
la duplicación del ADN está relacionada a la segregación de las cromátidas hermanas en la
mitosis por el fenómeno denominado como Cohesión de Cromátidas Hermanas (CCH). Se ha
identificado un complejo, cohesina, que mantiene juntas las hebras de ADN duplicadas después
de su síntesis formando un anillo proteináceo que abarca a ambas cromátidas hermanas (Fig. 7). En la anafase una proteasa, separasa, destruye a cohesina, lo que gatilla el funcionamiento
de la maquinaria de separación. Cohesina es un complejo proteico de 4 subunidades que se
requiere –como se decía- para mantener unidas las cromátidas de cromosomas replicados.
Contiene un heterodímero de proteínas de mantenimiento cromosómico SMC (del inglés
Structural Mantenaince of Chromosomes, de las cuales ya se han identificado 6 en células de
mamíferos con un peso molecular que varía entre los 110 y los 170 kDa y que juegan un rol
crucial en numerosos eventos nucleares incluyendo la propia organización de los cromosomas
durante la mitosis. Son conservadas en eucariontes: Smc1 y Smc3 forman un heterodímero
requerido para la progresión de la metafase en células mitóticas. Se sabe que estas dos
proteínas se encuentran en vertebrados formando un complejo con Scc1 y Scc3 pertenecientes
a otra familia de proteínas. Cohesina posee una localización en la cromatina dependiente de la
fase del ciclo celular que se analice, lo que era esperable para un factor de cohesión. En
organismos superiores gran parte de la cohesina disocia en profase aunque persisten algunas
cantidades importantes en centrómeros que disocia en Anafase. Esta liberación profásica de la
cohesina es necesaria para la resolver la separación de las cromátidas. Si la cohesina no se
remueve, las cromátidas son incapaces de separarse. Experimentos de inmunoprecipitación e
inmunoflourescencia en cromatina revelan que la cohesina se ubica a través de los brazos
cromosómicos y que se concentra en el centrómero que es el sitio de cohesión más fuerte, algo
esperable para un complejo que conecta las cromátidas hermanas y las mantiene unidas. (Fig. 8).
La disociación de cohesina en la anafase se gatilla mediante la degradación catalítica de
su subunidad Scc1 por Separasa. El rompimiento de Scc1 es necesario para la separación de
Figura 7. Modelo de cohesión de cromátidas hermanas por el complejo cohesina. Los modelos actuales plantean la idea de que el compleo “abraza ambas cromátidas rodeándolas. Scc1 (Securina) es el blanco de ataque por separasa lo que determina la separación de las cromátidas. (Tomado de Hagstrom y Meyer, 2003)
Scc3
Scc1 Smc3
Smc1
Profase Metafase Anafase
Securina
Separasa
Securina
Separasa
Dis
ocia
ción
de
mas
a de
Coh
esin
a C
onde
nsac
ión
Cro
mos
ómic
a
Figura 8. Control de cohesión entre cromátidas hermanas. En vertebrados el cúmulo de cohesinadisocia durante la profase. Una pequeña cantidad de cohesina permanece sobre los cromosomaspredominantemente a nivel del centrómero. Esta cohesina es finalmente atacada por separasa en latransición metafase-anafase. La activación de separasa en este punto es llevado a cabo por la destrucciónde securina por APC/C (Tomado de Amon,2001)
16
las cromátidas hermanas y es una entrada en anafase sin posibilidad retorno. Separasa es
inhibida por Securina hasta que el APC le une ubiquitina y la destruye. El APC en cambio, es
incapaz de llevar a cabo su acción hasta que el punto de control del huso permita apagar la
señal de “anafase en espera”. Ese y otros mecanismos aseguran que cohesina permanezca en
su sitio hasta que la célula esté lista para ingresar en Anafase. Se deduce entonces que
defectos en el complejo cohesina conduce a una separación de cromátidas prematura, mal
funcionamiento cinetocórico y del punto de control del huso mitótico y consecuentemente a la
aparición de fenotipo CIN (Hoque e Ishikawa, 2002; Yu, 2002).
Sin embargo, la segregación defectuosa de los cromosomas que conducen a fenotipo
CIN puede originarse por la desregulación de una serie de otras proteínas que según se van
identificando y caracterizando se descubre que están involucradas también en la posible
etiología de inestabilidad cromosómica. Veamos algunos casos.
Usando la técnica de interferencia con ARNi en células humanas en cultivo se ha
demostrado que la proteína H2A.Z, una variante de H2A presente desde metazoos hasta
humanos, es también esencial en la transmisión fidedigna de los cromosomas. En ausencia de
H2A.Z el genoma se torna inestable y esta inestabilidad es originada por defectos en el proceso
de segregación cromosómica. Los estudios de localización de H2A.Z revelan que en esas
células esta proteína se ubica en sectores heterocromáticos ricos en HP1α que existen a lo
largo de los brazos cromosómicos pero no en la región centromérica. Recordemos que HP1α
es una proteína no histónica muy conservada que localiza en regiones heterocromáticas del
cromosoma. Si se elimina H2A.Z, se rompen las interacciones normales que se establecen entre
la cromatina y HP1α en la región de los brazos y notablemente también en las regiones
pericéntricas. De esta forma se sugiere que H2A.Z controla la localización de HP1α y
consecuentemente H2A.Z es esencial para la segura y correcta transmisión de los cromosomas
(Rangasamy et al., 2004).
Por otra parte se ha evidenciado que la iniciación de la duplicación del ADN requiere del
ensamblaje de un complejo preduplicativo (ORC) en la cromatina durante G1 del ciclo celular.
En células humanas, la subunidad Orc-2 localiza dentro del núcleo y en centrosomas a través
de todo el ciclo celular. Además Orc-2 se localiza unida fuertemente a la proteína de
heterocromatina Hp1α . La eliminación de Orc-2 causa fenotipos múltiples. Un subconjunto de
células que evidencian una fase S defectuosa con poco antígeno nuclear de proliferación
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nuclear (PCNA, del inglés Proliferating Cell Nuclear Antigen). Otro subconjunto de células,
muestra cambios en la localización de Hp1α y otro que muestra detención en fase S con
cromosomas anormalmente condensados, proceso anómalo de congresión y múltiples
centrosomas. Esos resultados indican que Orc-2 está involucrada en la duplicación
cromosómica, estructura cromosómica, en el control del número de centrosomas, lo que sugiere
que esta proteína coordina todos los estados del ciclo de herencia cromosómica. Anomalías en
la regulación de esta proteína se asocia a la aparición de fenotipo CIN numérico por fallos en la
segregación (Prasanth et al., 2004).
En esta compleja maquinaria proteica involucrada directa o indirectamente en la correcta
segregación de los cromosomas durante los procesos divisionales no debe dejar de
mencionarse nuevamente a las Quinasas Aurora, implicadas en el ciclo del centrosoma,
ensamblaje del huso, condensación cromosómica, punto de control del huso y citocinesis. Se ha
evidenciado que una desregulación de estas proteínas induce a fallos en el ensamblaje del
huso mitótico, en el punto de control del huso y en la división celular originando segregación
defectuosa de cromosomas individuales o poliploidización acompañada de amplificación
centrosómica. (Meraldi et al., 2004b)
La segura alineación de cromosomas en la metafase así como la subsecuente
segregación hacia los polos –como se ve- es un proceso complejo que implica una maquinaria
molecular muy elaborada y caracterizada parcialmente. Las kinesinas, proteínas motoras que
hidrolizan ATP según se mueven a lo largo de los microtúbulos, incluyen a 155 proteínas
aisladas a partir de 11 especies distintas distribuidas en tres grupos. Un grupo de ellas juega un
rol importante en la movilización de estructuras a través del citoplasma (vesículas –organelos);
otro funciona directamente en la movilización de cromosomas y un tercero que participa en
ambos procesos (Dagenbach y Endow, 2004). Avances recientes en la identificación y
caracterización de proteínas motoras involucradas en la segregación indican que la
cromoquinesina humana Hkif4A, una proteína de 140 kDa que incluye en su estructura un
dominio motor parecido a kinesina, juega un rol esencial en este proceso. Esta proteína se
localiza en el nucleoplasma durante la interfase y sobre los cromosomas condensados durante
la mitosis. Se acumula en la zona media durante anafase y en el anillo de clivaje durante la
citocinesis. La eliminación de esta proteína mediada por ARNi resulta en una organización
prometafásica defectuosa, mal alineación de los cromosomas en metafase, defectos en el huso
y segregación cromosómica también defectuosa. Se ha demostrado también que Hkif4A
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interactúa con los complejos de condensina I y II, de tal forma que la eliminación de Hkif4A
conlleva a una hipercondensación cromosómica, lo que sugiere además que esta proteína es
requerida para la mantención de la arquitectura cromosómica. (Mazumdar et al., 2004).
Como se observa los defectos segregacionales pueden observarse tras la desregulación
de varias proteínas que empiezan a caracterizarse, no obstante el mecanismo subyacente
permanece sin conocerse hasta el momento aunque es evidente que la segregación errónea de
los cromosomas hijos hacia los polos es un proceso complejo en el que las fallas en el
funcionamiento del huso o en el cinetócoro no son las únicas causalidades que explican el
fenómeno en general. La interferencia con ARNi demuestra que hay varias proteínas
involucradas a través del ciclo celular, cuya desregulación es un factor desencadenante del
fenómeno CIN.
D. Malfuncionamiento de telómeros
La naturaleza lineal del cromosoma eucariótico impone algunos desafíos a la célula ya
que la presencia de extremos precisa de estructuras especializadas para prevenir su
degradación o fusión, fenómenos que conducen a inestabilidad cromosómica que es a menudo
asociada con el desarrollo del cáncer. Los complejos de ADN y proteínas que cubren los
extremos de los cromosomas de esos fenómenos se denominan telómeros (Rodees et al.,
2002). Su principal función es prevenir que los extremos del cromosoma sean reconocidos y
procesados como fracturas en el ADN lo que normalmente conduce a una detención en el ciclo
celular así como a reacciones de fusión para reunir los extremos rotos. La unión de los
cromosomas a través de sus extremos conduce a la formación de cromosomas dicéntricos que
irremediablemente expresan una distribución aberrante de la información genética entre las
células hijas, así como a la formación de nuevos extremos no protegidos que generan otros
ciclos de inestabilidad cromosómica. Los telómeros también son críticos para prevenir el
gradual acortamiento cromosómico que se origina por el clásico problema de la “duplicación de
los extremos del ADN”, es decir la imposibilidad de las ADN polimerasas convencionales para
duplicar el extremo de un ADN linear. El ADN telomérico consiste de repeticiones in tandem a
menudo cortas que contienen grupos de tres o cuatro guaninas. A continuación se muestran las
secuencias mejor caracterizadas de secuencias teloméricas terminales.
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ORGANISMO SECUENCIA Tetrahymena TTGGGG Oxytricha TTTTGGGG Giardia TAGGG Physarum TTAGGG
Kluyveromyces TCGGATTTGATTAGGTATGTGGTGT
Neurospora TTAGGG
Caenorphabditis TTAGGG
Vertebrados TTAGGG
En casi todos los eucariontes estudiados, el ADN telomérico (ADNt) consiste en repeticiones in
tandem de pequeñas secuencias nucleotídicas con una distribución asimétrica de los pares
G:C, pues las G se acumulan en una de las hebras (hebra G) y se encuentran agrupadas. La
hebra G está orientada de 5' a 3' hacia el extremo del telómero y forma el extremo 3' del ADN
cromosómico. En la zona más extrema no está apareada formando un segmento final de hebra
simple o monofibrilar con una longitud que varía según la especie. La longitud del telómero es
variable, en Oxytricha y Euplotes (microorganismos ciliados) es apenas de 38 pb mientras en
ratones alcanza 150 kb. Cada organismo posee una longitud media característica.
Un telómero funcional requiere un mínimo de longitud de ADN y la presencia de una
caperuza (capping) protectora constituida de proteínas muchas de las cuales ya han sido
identificadas y caracterizadas. Esas proteínas se expresan constitutivamente y son necesarias
para la protección estabilidad, replicación y/o elongación de los telómeros. En ausencia de
telomerasa, los telómeros se acortan gradualmente. La longitud de los telómeros en humanos
es parcialmente controlada por un mecanismo de retroalimentación en el cual la elongación del
telómero por la Telomerasa es limitada por al acumulación del complejo TRF1 (del inglés
Telomere Repeat Factors) en el extremo del cromosoma. Uno de los constituyentes de TRF1
es una tanquirasa denominada como Tin2 que modula a poliADP ribosa polimerasa y regula así
la longitud del telómero (Ye y de Lange, 2004). Existe un cúmulo de evidencias que indican que
el mal funcionamiento de los telómeros cromosómicos conducen a la manifestación de fenotipo
CIN (Yan y Cao, 2004; Mathieu et al., 2004; Plug-De Maggio et al.,2004; Gollin, 2004).
Por otra parte TRF1 y TRF2 reclutan en el telómero una serie de otras proteínas
involucradas en la reparación de fracturas en el ADN como Ku y el complejo Mre11, Rad50,
Nbs1 (Zhu et al, 2000) (Fig 9) .
Figura 9. El complejo telomérico humano consiste de ADN y proteínas asociadas. Los telómeros humanos consisten en aproximadamente 7000 -10.000 pares de bases de ADN de hebra doble. La mayor parte de este ADN está empaquetado en nucleosomas, sin embargo en el extremo de cada cromosoma existe un ADN telomérico de unas 100 pares de bases que se une a dos proteínas teloméricas TRF1 y TRF2. TRF1 forma un complejo con otras dos proteínas Tin2 y Tanquirasa que contiene PARP (PoliADP ribosa polimerasa). TRF2 recluta a Rap1. Además de los complejos que se muestran en la figura, otras proteínas como Ku y el complejo Mre11-Rad50-Nbs1, implicado en el proceso de reparación de ADN de hebra doble también, están localizadas en el telómero. El segmento ADN de hebra simple rico en Guanina que sobra (100 nucleótidos de largo) une a Pot1. (Tomado de Rhodes et al., 2002).
Tanquirasa
Nucleosomas
20
Recientemente, mediante el uso de imágenes 3D combinado a FISH y análisis cuantitativo, se
ha estudiado la localización de los telómeros durante el ciclo celular. Se ha observado que los
telómeros se organizan en una manera dependiente de la etapa del ciclo celular. Notablemente,
en G2 tardío los telómeros se asocian a un disco telomérico, que no se había descrito hasta
hoy. Estos discos teloméricos se desorganizan en células tumorales observándose agregados
teloméricos, que causan aberraciones cromosómicas irreversibles. Ello plantea la posibilidad de
analizar estos agregados teloméricos como signos de inestabilidad cromosómica en núcleos
interfásicos (Chuang et al., 2004).
Estudios citogenéticos y moleculares han indicado que aquellos cromosomas con
incluso un extremo desprotegido son genéticamente inestables en tanto no se restituya la
integridad del telómero afectado. Durante este periodo de inestabilidad cromosómica ocurren
ciclos de fractura y fusión (BFB del inglés: Breakage_Fusion_Breakage) que culminan en
aneuplodías.
Los ciclos BFB y la inestabilidad cromosómica promueven fusiones entre cromátidas a través
del fenómeno de unión de extremos no homólogos. Durante la mitosis, la separación de los
centrómeros en cromosomas dicéntricos produce un puente ana-telofásico, seguido por fractura
cromosómica y la eventual fusión de extremos dañados lo que promueve ciclos BFB
adicionales. Durante la adquisición de nuevos telómeros se pueden originar ciclos recurrentes
de amplificación génica en esos cromosomas reordenados lo que sugiere que las fracturas de
ADN de hebra doble cercanas al punto de fractura son importantes a la hora de promover
amplificación génica.
E. Recombinación homóloga vinculada a Reparación de Fracturas de ADN de hebra
doble .
La inducción de fracturas de ADN de hebra doble por exposición a agentes dañinos, o
como intermediarios en procesos celulares normales, constituyen un riesgo para la integridad
del genoma. Si no se reparan apropiadamente, estas fracturas pueden traducirse en
aberraciones cromosómicas las cuales a su vez pueden conducir a la muerte celular o
crecimiento celular descontrolado. Para mantener la integridad del genoma, a través del curso
de la evolución se han desarrollado múltiples vías de reparación de fracturas de hebra doble:
21
Recombinación Homóloga (RH), Unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reunión de hebras
simples (SSA).
Las fracturas de hebra doble pueden originarse en el ADN por varios mecanismos, a
saber: Conversión de una fractura de hebra simple en fractura de hebra doble, radiación
ionizante (rayos X, rayos gamma), por fuerzas mecánicas durante la mitosis que tiran moléculas
de ADN enredadas, por acción incompleta de topoisomerasas, por la acción de endonucleasas
en horquillas de replicación estancadas o en otros sitios específicos.
En el propósito de entender los mecanismos que explican el fenotipo CIN estructural
expresado como deleción, conversión génica, duplicaciones in tandem o Intercambio entre
cromátidas hermanas ICH) este apartado se focaliza en el análisis de los procesos
involucrados en el origen de cada una de esas alteraciones en la estructura cromosómica.
Se han descrito dos formas importantes de reparación recombinacional que tienen que ver
con fracturas de hebra doble. i. Recombinación no-homóloga (NHEJ: non homologous end
joining) que requiere de poca o ninguna secuencia de homología y es mediada por una unión
directa de los extremos rotos y prevalece durante G1. (Vía rápida) (Fig 10 a) y ii. recombinación
homóloga que se lleva a cabo durante S y G2 del ciclo celular y se sustenta en una
complementariedad entre la cromátida intacta y la dañada como base de intercambio de hebras
y reparación (Vía lenta)
La fractura de hebra doble origina dos extremos “sucios”, esto es, que contienen no sólo
una interrupción del eje azúcar–fosfato, sino posiblemente bases nitrogenadas rotas, e incluso
enlaces cruzados en la zona de la rotura. Estas anomalías deben ser corregidas antes de que
ellos sean procesados. Al parecer esta labor de limpieza la realiza un complejo proteico Mre11
en el que participan Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) localizado precisamente en los sitios de fractura
doble, con actividad endo y exonucleasa (D’Amours y Jackson, 2002). El componente Rad50
del MRN posee dos colas intramoleculares sobreenrrolladas y altamente flexibles que funcionan
como dos brazos que sugieren un rol adicional para el complejo MRN, como es facilitar el
proceso de encuentro entre los dos extremos rotos. Se ha estimado que el hecho de aumentar
por esta vía (brazos de Rad50) el radio de búsqueda de extremos rotos incrementa la
posibilidad de que dos extremos rotos se encuentren en 16 veces (Helleday, 2003).
Recientemente se ha implicado a este complejo (Mre11) en el mantenimiento de telómeros y en
(h) 2° invasión
3’
3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
(i) Entrecruzamiento
(j) sin entrecruzamiento
(a) NHEJ
(b) ataque DNAss 5’- 3’
(c) Unión de hebras simples
(d) Primera invasión
(e) migración de ramas
(f) Unión de hebras simples
(g) NHEJ
Duplicación in tandem
Figura 10. Reparación por recombinación de una fractura de ADN de hebra doble. (a) La unión de extremos no homólogos(NHEJ) está involucrada en una rápida pero a menudo inexacta reparación de una fractura de hebra doble que puede resultar endeleción. (b) Los extremos del ADN pueden ser blanco de exonucleasas que dejan extremos 3’ sobrantes (c) Regiones repetidaspueden permanecer descubiertas las que pueden usarse para reunir hebras simples que conducen a deleción de ADN que separa lasrepeticiones. (d) Uno de los extremos de hebra simple del ADNss puede iniciar un proceso de invasión de una secuencia homóloga deADN (roja). La hebra invasora se alarga pasado el sitio de fractura. (e) La migración de las ramas de la unión holliday (HJ) puedeliberar a la hebra invasora desvelando secuencias homólogas de ADNss que sobran en el extremo opuesto del ADN. (f) Síntesisdependiente de reunión de hebras simples (SSA) puede usar esta homología en reparación lo que resulta en conversión génica sindeleción. (g) Síntesis dependiente de unión de extremos no homólogos une el extremo de ADN extendido sin usar la secuencia dehomología. Ello resultará en duplicación in tandem . (h) Si las ramas de la Unión Holliday (HJ) no migran puede ocurrir invasión dehebra por el segundo extremo de ADNss originando una HJ doble. En células de mamíferos, esas HJ no se resuelven porentrecruzamiento (i, puntas de flechas llenas) . En vez de ello las HJ pueden resolverse sin entrecruzamiento (j; puntas de flechasvacías) causando un evento de conversión génica. (Tomado de Helleday, 2003)
22
la activación del punto de control de daño en el ADN. Este complejo posee una nucleasa
estimulada por ATP para procesar extremos de ADN heterogéneos en el proceso de unión
(Assenmacher y Hopfner, 2004). Pudiese este complejo actuar como un sensor de fracturas y
actuar en la activación y propagación de las vías de señalización que gobiernan los puntos de
control del ciclo celular en respuesta a un daño en el ADN. Además el complejo Mre11 influye
en la reparación recombinacional entre las cromátidas hermanas (Stracker et al., 2004). En
sustento de las ideas anteriores se ha demostrado recientemente que en respuesta a estrés
duplicativo, las células relocalizan y activan proteínas de reparación de ADN y las involucradas
en la detención del ciclo como la Proteína de Duplicación A, (PDA); un complejo de tres
subunidades requerido para la duplicación del ADN y para la reparación de roturas (Robison et
al., 2004).
La unión de extremos no homólogos o NHEJ en fracturas de ADNds se inicia con la unión
del heterodímero constituido por las proteínas Ku70 y K80 las cuales a modo de un verdadero
anillo, se sitúan alrededor de los extremos rotos del ADN cumpliendo una función estructural
que facilita la reunión de esos extremos. (Walker et al 2004). Para unir los extremos la
subunidad catalítica DNA-PK (proteína Quinasa dependiente de ADN) se une al heterodímero
Ku70-Ku80 y cataliza la unión de los extremos del ADN usando inositol-6-fosfato como cofactor.
Nuevamente los extremos del ADN pueden necesitar un ajuste, una reacción catalizada por
Ligasa IV o Artemisa que se une a DNA-PK y exhibe actividad exonucleasa que abre horquillas
y otras estructuras que no pueden ser reunidas fácilmente (Ma et al., 2002). Si existen
pequeñas zonas de homología en los extremos del ADN ellas pueden además ayudar en la
alineación de las hebras. Cuando los extremos están alineados, se deben producir grupos
terminales 3’OH y 5’-fosfato unibles por una polinucleótido Quinasa. Los extremos son
finalmente unidos por la ligasa IV o Artemisa que existe asociada con Xrcc4.
La recombinación homóloga (RH) es el intercambio (Crossing over) o reemplazo
(conversión génica) de una región de ADN por su secuencia de ADN homóloga a partir de un
cromosoma homólogo o de una cromátida hermana. La RH ocurre ocasionalmente entre
secuencias de ADN similares o dentro de un mismo cromosoma.
El paso inicial de la RH se piensa que es el ataque exonucleásico 5’ a 3’ del extremo del
ADN roto para producir un ADN de hebra simple (ADNss). (Fig 10b). Aquí pueden ocurrir dos
23
cosas: i. Reparación por re-unión de extremos de hebra simple o ii. Invasión de hebras en la
reparación de los dos extremos
i. Reparación por reunión de extremos de hebra simple
Si no se cubren las secuencias repetidas dentro del ADNss que sobresale originado por
acción exonucleásica, RAD52 y la Proteína de Replicación A (PRA) pueden iniciar un proceso
de reparación entre las secuencias repetidas. RAD52 se une a los extremos 3’ de los ADNss,
en tanto que PRA se une a todo el filamento de hebra simple que sobresale. Cuando esas
secuencias repetidas se unen, las regiones adyacentes quedan fuera formando un sustrato para
XRCC1/XPF que aparentemente juega un rol importante en la unión de hebras simples. En
mamíferos la reunión de extremos de ADNss es frecuente entre secuencias repetidas. El
producto que resulta de la reunión de extremos de ADNss es una deleción haciendo de éste un
mecanismo proclive a errores. (Fig 10c)
ii. Invasión de hebras en la reparación de dos extremos
En este caso la proteína clave para lograr ello es RAD51, el homólogo eucariótico de
RecA en E.coli. RAD51 al igual que RecA forma un filamento nucleoproteico en regiones de
ADNss y cataliza la búsqueda de secuencias homólogas, apareamiento de hebras e
intercambio de éstas. Se ha comprobado que los ratones knockout para RAD52 viven y son
saludables, mientras que los ratones knockout para RAD51 son inviables. De la misma forma
ratones knockout para otros genes involucrados en RH, tales como: XRCC2, RAD51B,
RAD51D, RAD50, Mre11 o Nbs1 son letales, lo que indica que es vital contar con las vías de
RH intactas para poder llevar a buen término el proceso.
Una secuencia de ADN homóloga es necesaria para la invasión de hebras dependiente
de RAD51 (fig 10d). Las cromátidas hermanas que están presentes durante S y G2 participan
en este evento al menos 100 veces más frecuentemente que los cromosomas homólogos. Para
que ocurra la invasión de hebras es necesario que RAD51 disponga de PRA en el ADNss que
sobresale. Siguiendo la invasión de moléculas de ADN homólogas por RH se inicia la síntesis
de ADN en el extremo 3’ por una ADN polimerasa. La síntesis avanza más allá del sitio original
de fractura de doble hebra. Se deja una unión Holliday (HJ del inglés Holliday Junction) en el
sitio de la invasión, que puede migrar en ambas direcciones. Si la migración se produce en la
24
dirección de la replicación (fig 10e). puede revertirse la invasión dejando un extremo de ADN
que ha sido alargado más allá de la fractura original. Este ADNss compartirá homología con el
otro extremo y puede ser reparado por unión de hebras simples (Fig 10 f) El producto final que
resulta de la reunión de extremos de hebra simple no contiene deleción en tanto que la forma
regular de reparación por reunión de extremos de hebra simple rotos que utiliza secuencias
repetidas, sí. Sin embargo, la síntesis dependiente de unión de hebras simples resulta en
conversión génica que corresponde a una vía de reparación libre de errores aunque puede
resultar en pérdida de heterocigosidad.
Alternativamente, puede ocurrir que el extremo de ADN alargado sea reparado por
unión de extremos no homólogos (fig 10g). El resultado de este proceso es una duplicación in
tandem en el sitio de la fractura de doble hebra.
Como una alternativa para la liberación del extremo invasor, el segundo extremo roto
puede invadir la misma molécula de ADN homóloga (Fig 10h). Esto resultará en la formación
de una HJ doble que puede ser resuelta ya sea por crossing over (fig 10i) o sin crossing over ( fig 10j). Los fenómenos de entrecruzamiento en mamíferos son poco frecuentes y no se ha
descrito nunca un ICH cuando se analizan los productos de la reparación por recombinación
homóloga de fracturas de doble hebra. Como quiera que sea, el producto formado por la
resolución de HJ dobles por un mecanismo que no implica entrecruzamiento, es una conversión
génica.
En pocas palabras, los productos que se obtienen de la recombinación de extremos
rotos son deleciones, conversiones génica o duplicaciones in tandem.
La explicación más probable de este solapamiento entre la reparación de fracturas de hebra
doble ya sea por unión de extremos no homólogos y RH, debe darse en el contexto en el cual
las fracturas ocurren. RH es favorecida muy probablemente a fines de fase S y durante G2
cuando están presentes las cromátidas hermanas, mientras que la unión de extremos no
homólogos es favorecida durante G1 cuando los cromosomas homólogos están distantes y
conduciría a una irremediable pérdida de heterocigocidad.
25
La RH ha demostrado ser de suma importancia en la reparación de daño durante la replicación
desde la levadura hasta el hombre. Las fracturas de hebra doble se pueden generar después
de la duplicación, por conversión de fracturas de hebra simple en fracturas de hebra doble.
La diferencia más importante entre la fractura de hebra doble clásica y una fractura de
hebra doble asociada a duplicación es que -en esta última- existe sólo un extremo para iniciar
la RH (Fig 11a ). Después que el gap de ADNss ha sido rellenado (Fig 11b) el extremo de
ADN libre puede invadir esta molécula intacta de ADN (Fig 11c y d ) y retomar la duplicación
(fig 11e). Siguiendo este evento de recombinación, la hebra líder se posicionará en el lado
opuesto y dejará atrás de la horquilla una HJ. Un evento de intercambio entre cromátidas
hermanas (ICH) ocurrirá subsecuentemente sin conversión génica. (Fig 11f) Este ICH es
visualizado gracias a que el ADN sintetizado de novo permanece unido a su templado
(cohesina) y después de la segunda mitosis este sitio de fractura puede ser visualizado
elegantemente mediante la técnica citológica para visualizar los ICH. (Fig 11g). Evidencias
adicionales sustentan la idea de que los ICH se originan por fracturas de hebra simple que
persisten proviene de experimentos con células defectivas en la reparación de fracturas de
hebra simple, por ejemplo células deficientes en XRCC1 o PARP1 (PoliADP ribosa
polimerasa1) que muestran altos niveles de ICH espontáneos.
Es evidente que la RH también juega un rol importante en la reparación de horquillas de
duplicación atascadas (Stalled Replication Forks). Se han descrito varias causas de
estancamiento de la horquilla de duplicación, por ejemplo, el normal proceso de avance de la
maquinaria de duplicación puede encontrarse con secuencias especiales complementarias de
ADN que son susceptibles de formar horquillas en la región de hebra única simple de la hebra
retrasada según las hebras bifurcadas de ADN van abriéndose. Este fenómeno puede explicar
la inestabilidad de la secuencia repetidas CTG que muestra cambios dramáticos en el número
de copias en enfermedades neurológicas como la enfermedad de Huntington. Otra causa de
estancamiento en el avance de la maquinaria de duplicación es la presencia de lesiones de
ADN no reparadas como los fotodímeros originados por luz UV. La horquilla atascada puede
ser cortada por alguna endonucleasa de hebra simple, y rescatada por recombinación.
Para evitar que las endonucleasas rompan la horquilla de hebra simple, hay necesidad
de que exista una forma de recomenzar la duplicación y saltarse la lesión. Una forma ha sido
propuesta por Michel en la cual la hebra de ADN sintetizado de novo se desenrrolla de su
Segunda Mitosis
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
(a) Horquilla de duplicación asociada a fractura de doble
(b) Ataque exonucleásico 5’a 3’ ( c ) Formación de un templado cromatídico i t t
(d) Invasión de hebra (e) Horquilla de duplicación restituida (f) Resolución de HJ
I C H
Figura 11. Reparación por Recombinación Homóloga (RHH) de una horquilla de duplicación colapsada. (a) Una horquilla de duplicación asociada a una fractura de hebra doble posee un extremo libre parainiciar un ataque exonucleásico (b) el extremo 3’ del ADNss que sobra es cubierto con Rad51 y otras proteínas de recombinación homóloga implicadas en la invasión de hebras. (c) El espacio de hebra simple sobre eltemplado de ADN es llenado antes (d) de la invasión de hebras. La síntesis de la hebra líder puede continuar en el templado invadido de ADN de tal forma que se restablece la horquilla de duplicación (e). (f) una HJsimple queda por detrás de la horquilla de duplicación lo que se resuelve probablemente sin entrecruzamiento. Ya que el templado y el ADN sintetizado de novo se han fusionado (seguir líneas en f), se visualizaráICH en la segunda mitosis (g). Las flechas indican las direcciones de la síntesis de ADN. Las líneas negras corresponden al templado y las rojas al ADn sintetizado de novo. Las flechas llenas indicanentrecruzamiento y las vacías indican no entrecruzamiento. (Tomado de Helleday, 2003).
26
templado (quizás después que ha pasado la ADN polimerasa y se ha disociado). Este proceso
requiere al menos de una helicasa. Las dos nuevas hebras se podrían aparear entre ellas
formando el típico estructura de cuatro brazos que se ha denominado como Unión Holliday (UH)
(del inglés: Holliday junction) en honor a quien las describióy cuya formación da lugar a las
recientemente denominadas como estructuras en “pie de pollo” (Helleday, 2003). La formación
de este tipo de estructuras seguramente es facilitada por otras proteínas (Fig 12).
Un gran número de evidencias en bacterias indica que las horquillas de replicación
atascadas pueden ponerse en reversa para formar estas estructuras en pie de pollo que pueden
ser reparadas por síntesis translesión o por recombinación. Es posible que esto mismo pueda
ocurrir en células de mamíferos pero no existen hasta el momento evidencias directas de que
ello sea así, sin embargo el hecho de que la RH sea eficazmente inducida a nivel de horquillas
estancadas en células de mamíferos en ausencia de fracturas dobles sustenta el modelo
bacteriano indicando que las estructuras en pie de pollo son también substrato para la RH en
células de mamíferos.
El modelo actual de salto (bypass) y restauración de la horquilla de duplicación
estancada implica reversión de la horquilla causada posiblemente por un fenómeno torsional
positivo en el ADN o bien por acción enzimática. (Fig 13a ).
Primero, una hebra se devolverá para formar una estructura en pie de pollo (Fig 13b ). Esta y otras estructuras intermediarias son substrato del complejo endonucleasa humano
Mus81-Eme1 que es inducido cuando las células son tratadas con inhibidores de la duplicación.
El rompimiento de estas estructura produce una doble fractura idéntica a la producida en una
horquilla de duplicación colapsada (Fig 13c). Este evento de reparación por recombinación
homóloga resulta en un ICH (Fig 13d). Sin embargo, la horquilla de duplicación puede
continuar en reversa y producir una estructura en pie de pollo que incluye una HJ en la unión
de cuatro ramas (Fig 13e). Tras la síntesis y/o reparación de este extremo de ADN que
sobresale, esta HJ puede migrar hacia atrás y resumir la duplicación sin recombinación. Sin
embargo la HJ puede ser blanco de una actividad resolvasa (Fig 13f) y formar una fractura de
doble hebra. La RH podría de esta forma podría reparar esta fractura por el mismo mecanismo
en la reparación de un extremo y de esta forma restituir el proceso de duplicación (Fig 13g). Alternativamente, la RH puede activarse en el extremo de ADN que emerge antes de que la HJ
(a) Fractura ds clásica 2- Extremos de la fractura
(b) horquilla colapsada 1- extremo de hebra doble
(c) horquilla estancada Pie de Pollo
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
Figura 12. Estructura de los substratos para recombinación en células demamíferos. (a) Una fractura de doble hebra clásica deja dos extremos libres quepueden iniciar recombinación. (b) Una fractura de hebra simple puede convertirseen fractura de hebra doble durante la duplicación lo que colapsa la horquilla dejandoun extremo de ADN libre que puede ser usado para recombinación. (c) La horquillade duplicación puede toparse con un bloqueo (T-T) en su camino lo que conduce aun atascamiento de la horquilla. Bajo esas condiciones la horquilla puede ponerseen reversa originando estructura con forma de “pie de pollo” que pueden servircomo substrato para recombinación, (Tomado de Helleday, 2003).
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’ 5’
3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
a) Horquilla estancada b) Medio pie de pollo e) Pie de pollo j) Union Holliday con 4 brazos de ADN
c) Horquilla colapsada f) Formación DSB
Resolución de HJ
h) Duplicación restituida
HR HR
d) Reparación de un extremo/SCE g) Duplicación restituida i) Conversión génica
Figura 13. Reparación por recombinación homóloga en una horquilla atascada. (a) una horquilla de duplicación se atasca por un obstáculo en el templado de ADN. (b) Lahorquilla se puede poner en reversa facilitado por una torsión positiva en el ADN o por acción enzimática. Se forma un intermediario mitad de un pie de pollo. (c) Esta y otrasestructuras intermediarias pueden ser atacados por endonucleasas originando una horquilla colapsada con un extremo libre. (d) esta puede ser reparada por recombinaciónhomóloga como se muestra en la figura 12 y resultará en un ICH. (e) La horquilla de duplicación también puede ponerse en reversa para formar un pie de pollo completo con unaHJ. Aquí, el pie de pollo es representado como una horquilla en reversa o como un intermediario de recombinación que son idénticos. (f) La HJ puede ser cortada para formar unextremo de ADNds que puede ser reparado por recombinación homóloga para restaurar la duplicación (g). Alternativamente, el extremo libre de ADN que sale fuera del pie de pollopuede ser usado directamente en recombinación homóloga para restituir la duplicación (h). Esto evita la formación de una fractura de hebra doble. (i) Resolución de la HJ sinentrecruzamiento que conduce a conversión génica. Las flechas señalan la dirección de la síntesis de ADN, las líneas negras corresponden al templado y las líneas rojas a ADNsintetizado de novo. Las puntas de flechas vacías indican sin entrecruzamiento. No se muestra el proceso que implica entrecruzamiento. (Tomado de Helledey, 2003).
27
se destruya y restitutir la duplicación (Fig 13h). Todo indica que el resultado de la reparación
por recombinación homóloga es siempre un evento de conversión génica.
Importa que analicemos brevemente algunas propiedades generales de la HJ:
a. Se pueden armar todos los pares de bases
b. El punto de entrecruzamiento puede “desplazarse” rompiendo un conjunto de
puentes de hidrógeno y simultáneamente armando otros(recordemos que este
proceso no requiere de energía y así las HJ pueden desplazarse en ausencia de
cualquier “ayuda” de proteínas.
c. Así, la HJ puede desplazarse todo el recorrido y resolver esta situación.
Se sabe que en procariontes existe un complejo set de proteínas que facilitan el
desplazamiento de la UH. Un ejemplo de ello es catalizado por las proteínas bacterianas RuvA
y RuvB. RuvA reconoce la forma de la HJ. Ruv B se une a RuvA y forma un anillo alrededor de
una de los brazos del ADN. RuvB es una helicasa que puede tirar el ADN a través de su centro.
Dos hexámeros de RuvB sobre ambos lados de la HJ promoverán así un rápido desplazamiento
de ella. Se ha demostrado que el complejo RuvAB se comporta como un verdadero complejo
proteico motor, capaz de conducir la migración de las HJ a una velocidad promedio de 43 pares
de bases/segundo a lo largo de muchos kilobases de secuencias homólogas (Dawid et al.,
2004)
Mientras RuvA y Ruv B promueven el desplazamiento de la HJ y su disolución, otra forma
alternativa de solucionar este tipo de estructura es –como se mencionaba- mediante la actividad
de una resolvasa. La proteína bacteriana RuvC, es una resolvasa que corta en posiciones
simétricas en los dos segmentos de ADN homólogos.
El corte de la HJ puede originar dos productos alternativos dependiendo de cuál par de
hebras es atacada por la enzima. En el caso de las horquillas de duplicación atascadas en
ambos casos origina una molécula de ADN intacta y un extremo roto.
La proteína RecA ha sido un modelo de estudio para el entendimiento de cómo una proteína
cataliza la recombinación genética homóloga. Algunas proteínas parecidas a RecA, incluyendo
a Rad51 humana parecen funcionar como filamentos helicoidales formados sobre el ADN.
28
Recientemente se ha visto que p53 posee un efecto inhibitorio de intercambio de hebras, así
como sobre el proceso de puesta en reversa de horquillas estancadas. Se postula que p53
podría así cumplir una función importante en la estabilización genómica previniendo el
reordenamientos genéticos promovidos por Rad51, lo que sustenta la hipótesis que p53
contribuye a la estabilidad genómica por una modulación independiente de transcripción de
recombinación homóloga. (Yu et al.,2004; Yoo et al., 2004 ; Kumari et al., 2004) Se ha
comprobado además que Rad51 esta involucrada en mantenimiento de telómeros (Tarsounas
et al., 2004) y que su actividad ATPásica asociada es modulada por Ca++ (Brugreev y Mazin,
2004). Recientes análisis del filamento cristalizado de Rad51 muestra 6 ejes de simetría y la
alternancia de interfases proteína –proteína es levemente distinta lo que sugiere que la unidad
funcional de esta proteína puede ser un dímero (Conway et al., 2004).
Recientes hallazgos también demuestran que Rad51 se requiere para el procesamiento
de las UH en células de mamíferos. Ello se ha visto en células que portan mutación para los
genes de recombinación Rad51C o XRCC3 las cuales poseen bajos niveles de actividad
resolvasa. Además la eliminación de Rad51C de extractos humanos fraccionados causa
pérdida de actividad de desplazamiento y actividad resolutiva pero esas funciones pueden
restaurarse por complementación con una variedad de complejos parálogos de Rad51 que
contienen Rad51C (Liu et al., 2004). Además se ha demostrado que la sobreexpresión de
Rad51 promueve aneuplodía y múltiples reordenamientos cromosómicos (Richardson et al.,
2004) y produce fallos en el tránsito por el ciclo celular y conduce a apoptosis (Yoo y McKee,
2004)
Como se observa, la recombinación homóloga (RH) es esencial para la supervivencia
celular en mamíferos. Los productos de la RH pueden ser: Intercambios entre Cromátidas
Hermanas (ICH), conversión génica, deleciones o duplicaciones in tandem. La RH está
involucrada en la reparación de fracturas de hebra doble y lesiones que ocurren en el ADN en la
horquilla de replicación. Una fractura de hebra doble puede resultar en deleción, duplicación in
tandem o conversión génica después de reparación por recombinación de los dos extremos.
Por el contrario los ICH pueden ser el resultado de reparación por recombinación de un extremo
en la horquilla de duplicación estancada, es decir, una fractura de hebra simple se convierte en
fractura de hebra doble en la horquilla de duplicación puede ocurrir en ausencia de un
intermediario y puede resultar ya sea en ICH o conversión génica.(Helleday, 2003)
29
El proceso de reiniciar la duplicación de la información genética por recombinación, proceso en
el que está involucrada PARP1 (Poli ADP ribosa polimerasa (Yang et al, 2004) puede dejar
atrás una UH lo cual puede resolverse de dos maneras. Una de ellas origina entrecruzamiento
entre cromátidas hermanas replicadas. Ello es genéticamente invisible ya que ambas copias
poseen la misma información genética, sin embargo –como se decía previamente- pueden
ponerse en evidencia a través del ensayo de Intercambio de Cromátidas Hermanas (ICH). Para
ello las células son marcadas con el análogo de timina, BrdU. Después ellas son trasladadas a
un medio libre de BrdU por dos generaciones. Bajo esas circunstancias, una de las hebras del
ADN de las cuatro en un par de cromátidas hermanas deberían marcarse con BrdU. Los ICH
se evidencian por modificaciones en ese patrón uniforme de tal forma que parte de cada
cromátida hermana posee BrdU.
Recientemente se han presentado evidencias que indican que el complejo Mre11
(Mre11, Rad50, Nbs1) juega un rol fundamental en cada uno de los punto del metabolismo de
fracturas cromosómicas. El complejo actúa como sensor de fracturas e interviene directamente
en la activación y propagación de señales que gobiernan las funciones de los puntos de control
en respuesta a daño en el ADN. Además, Mre11 influencia la reparación recombinacional del
ADN promoviendo la recombinación entre cromátidas hermanas (Stracker, 2004).
Conclusión finales.
Desde que Novell hace poco más de un cuarto de siglo describiera el fenómeno de inestabilidad
cromosómica, se han realizado ingentes estudios para determinar sus posibles causas.
Actualmente se piensa que el fenotipo de inestabilidad cromosómica se origina por un fallo o un
conjunto de ellos que conducen a una pérdida en la regulación de ciertas proteínas asociadas
con: puntos de control del ciclo celular, segregación de cromosomas, ciclo del centrosoma,
integridad de telómeros y reparación recombinacional. En este capítulo se han soslayado
además algunos factores de naturaleza epigenética que también puede afectar la regulación
normal de la expresión de proteínas y con ello originar fenotipos de inestabilidad. Procesos de
hiper o hipoacetilación, metilación, y fosforilación de histonas juegan un rol importante a través
del denominado “Código Histona” (Momparler, 2003; Oligny, 2003; Hake et al., 2004; Honda et
al., 2004; Takay et al., 2004; Wang et al., 2004). Sin embargo a pesar del progreso
experimentado en los últimos años, los mecanismos involucrados aún no se esclarecen del todo
30
y persisten muchas interrogantes que hacen del tema de inestabilidad cromosómica un tópico
de mucho interés para dilucidar las bases cromosómica ligadas a la progresión tumorogénica.
Agradecimiento El autor expresa su gratitud al Sr. Gerardo Quezada Silva por su excelente colaboración en la
gráfica del presente capítulo. El autor agradece además, el financiamiento para actualización
bibliográfica asignado al proyecto de investigación 012407-2 de la Universidad del Bío-Bío.
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