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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp.

DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE

ZOONOSIS”

Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de

Médico Veterinario Zootecnista

AUTOR:

Jenny Soraya Carrillo Toro

TUTOR:

Dr. Richar Iván Rodríguez Hidalgo Ph.D.

Quito, Mayo, 2015

ii

DEDICATORIA

A mis padres y abuelos por su esfuerzo, sacrificio e incondicional apoyo, han

sido un ejemplo de superación y lucha en mi vida; además con su templanza

han sabido mostrarme el camino para alcanzar una meta; también a mi

hermano Fernando y a mi compañero Roberto quienes a pesar de las

circunstancias adversas han estado ahí durante mi carrera profesional.

Jenny

iii

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento Al Dr. Richar Rodríguez por

brindarme la oportunidad de formar parte de su Proyecto y, a la vez, ser tutor

de esta investigación.

A todos mis profesores que, de una u otra forma, me brindaron sus

conocimientos y experiencias para mi formación a lo largo de esta carrera.

Agradezco al personal científico del Centro Internacional de Zoonosis,

especialmente al Ing. Gustavo Echeverría, Dr. Juan Carlos Navarro y a la

MSc. Sandra Enríquez, cuyos conocimientos me han enriquecido y han

permitido concluir este proyecto.

A mis padres, hermano y a mi compañero Diego Cushicóndor, quienes

contribuyeron, directa e indirectamente, para la materialización y finalización

de este proyecto de tesis.

iv

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

v

INFORME DEL TUTOR

vi

APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL



ZOONOSIS”

vii

ÍNDICE GENERAL

pp.

DEDICATORIA .......................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL .................................................. iv

INFORME DEL TUTOR ............................................................................................ v

APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL .............................................................. vi

“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA

COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS” ........ vi

ÍNDICE GENERAL .................................................................................................. vii

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. ix

LISTA DE TABLAS ................................................................................................... x

RESUMEN ................................................................................................................ xi

ABSTRACT ............................................................................................................. xii

CAPÍTULO I .............................................................................................................. 1

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1

CAPÍTULO II ............................................................................................................. 4

REVISIÓN DE LITERATURA.................................................................................... 4

Antecedentes ........................................................................................................ 4

Generalidades ....................................................................................................... 5

Cochliomyia hominivorax ...................................................................................... 6

Ciclo de vida de C. hominivorax- GBG .................................................................. 7

Distribución Geográfica ......................................................................................... 8

Cochliomyia macellaria ......................................................................................... 9

Ciclo Biológico de Cochliomyia macellaria ............................................................ 9

Distribución Geográfica ......................................................................................... 9

Morfología diferencial entre C. hominivorax y C. macellaria ................................ 10

Epidemiología ..................................................................................................... 14

Impacto Económico ............................................................................................. 17

Erradicación del GBG – Cochliomyia hominivorax .............................................. 18

Biología Molecular en la Identificación de Insectos ............................................. 19

ADN Mitocondrial ................................................................................................ 20

Estudios Moleculares realizados en Cochliomyia ................................................ 21

Filogenia ............................................................................................................. 21

viii

CAPÍTULO III .......................................................................................................... 23

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 23

Fase de Laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada .......................................... 24

Identificación y cultivo de larvas .......................................................................... 24

Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp .................................. 25

Fase de laboratorio: Biología Molecular .................................................................. 25

Extracción y cuantificación de ADN ..................................................................... 25

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .................................................... 27

Análisis de Datos ................................................................................................ 30

CAPÍTULO IV ......................................................................................................... 31

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................... 31

Identificación Morfológica .................................................................................... 31

Identificación Molecular ....................................................................................... 40

Análisis Filogenéticos .......................................................................................... 41

Citocromo Oxidasa subunidad I (COI) ............................................................. 41

ARN ribosomal (12S) ....................................................................................... 44

Genes combinados COI y 12S......................................................................... 46

CAPÍTULO V .......................................................................................................... 50

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 50

Conclusiones ...................................................................................................... 50

Recomendaciones .............................................................................................. 51

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 52

Anexos ................................................................................................................... 65

ix

LISTA DE FIGURAS

pp.

Figura 1. Ciclo de vida de C. hominivorax ............................................................... 8

Figura 2. Características del estadío larvario 3 de C. hominivorax. ....................... 11

Figura 3. Características del estadío larvario 3 de C. macellaria ........................... 11

Figura 4. Características morfológicas diferenciales entre adultos de C. hominivorax

y C. macellaria. ....................................................................................................... 12

Figura 5. Mapa de distribución de los países libres del GBG ................................. 14

Figura 6. Mapa de distribución de miasis por C. hominivorax ................................ 15

Figura 7. Genoma mitocondrial de Insectos ........................................................... 20

Figura 8. Adultos de C. hominivorax (izq) y C. macellaria (dcha). .......................... 34

Figura 9. Larvas y Adultos de C. hominivorax y C. macellaria ................................ 39

Figura 10. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del

gen COI. ................................................................................................................. 43


gen 12S. ................................................................................................................. 45


gen COI y 12S. ....................................................................................................... 47

../../../Users/User/Dropbox/JENNY%2088/TESIS%20JENNY/Tesis%20Jenny%2024-02-2015/Tesis%20JC%20FINAL.docx#_Toc417465346



x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Características morfológicas diferenciales entre las larvas en estadío 3 de

C. hominivorax y C. macellaria ............................................................................... 10

Tabla 2. Características morfológicas diferenciales entre los adultos de C.

hominivorax y C. macellaria .................................................................................... 12

Tabla 3. Esquema de selección de individuos para la Identificación morfológica y

molecular ................................................................................................................ 24

Tabla 4. Secuencia de cebadores para el COI y 12S ............................................. 27

Tabla 5. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la

amplificación del gen COI ....................................................................................... 28


amplificación del gen 12S ARNr ............................................................................. 28

Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares .............................. 31

xi



ZOONOSIS”

Autor: Jenny Soraya Carrillo Toro

Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D

Fecha: mayo, 2015

RESUMEN:

Cochliomyia hominivorax es una mosca (Diptera: Calliphoridae) que, en su fase larvaria, es un parásito obligado que se lo conoce comúnmente como Gusano Barrenador del Ganado (GBG). La miasis causada por la mosca se encuentra en la lista de enfermedades de declaración obligatoria y ha sido considerada como un problema en la industria pecuaria y de salud pública. En el Ecuador, no existen estudios que permitan determinar la importancia de la mosca del gusano barrenador del ganado (GBG) ni su relación con otras especies; es por esto que, la finalidad de este estudio fue identificar morfológicamente y molecularmente a las poblaciones de Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar las relaciones evolutivas entre las especies de moscas Cochliomyia hominivorax y Cochliomyia macellaria utilizando la extracción, amplificación y secuenciación del ADN de los genes mitocondriales (COI y 12S -ADNmt). Para este estudio se utilizaron 48 ejemplares de la Colección Entomológica del Centro Internacional de Zoonosis. Los resultados permitieron identificar morfológicamente dos especies de Cochliomyia: C. macellaria con el 66,67% (32/48) y el 33.33% (16/48) de C. hominivorax. De la secuenciación se obtuvo 33 y 30 secuencias útiles para el COI y 12S, respectivamente. Los árboles filogenéticos, resultantes del análisis de COI, 12S y COI-12S (secuencias unidas), mediante el método de parsimonia máxima, mostraron la misma topología, identificando tres clados definidos, uno correspondiente a C. macellaria, el otro a C. hominivorax y el tercer clado correspondió a las muestras de grupos externos obtenidos del Genbank. En conclusión, el estudio permitió diferenciar morfológicamente dos especies de Cochliomyia las cuales fueron corroboradas con el estudio filogenético. Finalmente, se evidenció que existe una fuerte relación del lugar de origen de las larvas o moscas y su comportamiento, con la especie a la que pertenecen.

PALABRAS CLAVES: MIASIS /Cochliomyia/ FILOGENÉTICA

xii

“MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF Cochliomyia

spp. OF THE SCIENTIFIC COLLECTION OF THE ZOONOSIS INTERNATIONAL CENTER”

Author: Jenny Soraya Carrillo Toro Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D

Date: May, 2015

ABSTRACT

Cochliomyia hominivorax is a fly (Diptera: Calliphoridae) that in its larvae phase, is an obliged parasite commonly known as Screwworm. Miasis by such fly is in the list of mandatory report diseases and has been considered as a problem in the livestock industry and public health. In Ecuador, no studies have been made to determine the relevance of the Screwworm, or its relation with other species. The purpose of the current study was morphologically and molecularly identified Cochliomyia spp. populations, by using dichotomy keys and analyzing evolutionary relations between Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria species of flies, by using extraction, magnification and DNA sequence of mitochondrial gens (COI and 12S - DNAmt). For the study, 48 samples of the Entomologic Collection of the Zoonosis International Center were used. Results allowed morphologically identifying two species of Cochliomyia: C. macellaria with 66.67% (32/48) and 33.33% (16/48) of C. hominivorax. From the sequence, 33 and 30 useful sequences were obtained for COI and 12S, respectively. Phylogenetic trees, resulting from analysis of COI, 12S and COI-12S (united sequences), by using maximum parsimony method, showed the same topology, identifying three strains clearly defined, C. macellaria, C. hominivorax and the third correspondent to samples of external groups obtained from Genbank. It has been concluded that the study allowed a morphologic differentiation of two species of Cochliomyia, which were confirmed with the phylogenetic study. Finally, a strong relation was found between the origin place of larvae or flies and behavior, with species to which they belong.

KEYWORDS: MIASIS / Cochliomyia / PHYLOGENETIC

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

La mosca del gusano barrenador del ganado (GBG), conocida como

Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), en su fase larvaria, es un

parásito obligado, debido a que se alimenta únicamente de tejido vivo

(biontófaga). Este parásito causa graves daños en animales homeotermos,

incluido el hombre, desarrollando una enfermedad parasitaria y zoonósica,

conocida como miasis traumática (Moya, 2003; Forero et al., 2008). La

Cochliomiasis está incluida en la lista de enfermedades, infecciones e

infestaciones comunes a varias especies, y su presencia es de declaración

obligatoria (OIE, 2014); además, es considerada como parte de las

Enfermedades Transfronterizas en las Américas (ENTRAS) prioritarias para

el Continente Americano (GF-TADs, 2007).

Las pérdidas anuales por infestación de C. hominivorax, fueron

considerables en Estados Unidos, México y Centro América; mientras que,

en algunas Islas del Caribe y Sudamérica continúan siendo un problema

latente; por esta razón, se ha considerado más un problema para la industria

pecuaria que de salud pública; no obstante, los daños que causa a los seres

humanos son importantes en regiones donde prevalece este parásito

(Rodríguez et al., 2011).

Existen programas para la erradicación del GBG, dentro de los que la

Técnica del insecto estéril (TIE) ha alcanzado mejores resultados logrando la

eliminación de este parásito de los Estados Unidos, México, Puerto Rico, las

Islas Vírgenes, Curaçao y otros países de Centro América (CFSPH, 2007).

2

Sin embargo, una de las actividades importantes para llevar a cabo un

programa de erradicación del GBG es establecer una correcta identificación,

ya que en estudios previos se han encontrado diferencias morfológicas entre

individuos de distintas poblaciones del gusano barrenador, además del alto

parecido morfológico entre los adultos y larvas de C. hominivorax y

Cochliomyia macellaria (Figarola, 2001; Skoda et al., 2002; Toledo, 2007).

Debido a los impedimentos taxonómicos que existen para una correcta

identificación de especies, el desarrollo de métodos moleculares ha permitido

abordar estos problemas empleando marcadores génicos como el uso de

regiones codificantes, no codificantes, conservadas y de alta variabilidad del

ADN mitocondrial. Las principales regiones de ADN mitocondrial que más

han sido utilizadas en estudios evolutivos corresponden los genes de ARNs,

12S, 28S, 16S, y las subunidades I y II del citocromo oxidasa c y b (Fresia et

al., 2007; Fresia et al., 2013 (Lyra et al., 2005; Lyra et al., 2009; Litjens et al.,

2001; McDonagh et al., 2009; Taylor et al., 1996); así como, la región control

y las subunidades del complejo NADH (Lessinger et al., 2000; Palumbi, 1996

citado por Lessinger, 1998; Toledo, 2007).

El ADN mitocondrial ha demostrado ser útil en los análisis evolutivos a partir

de genes (filogenética) debido a su herencia materna, rápida tasa de

divergencia y falta de recombinación (Simon et al., 1994; Kress & Erickson,

2012).

La falta de información del Gusano Barrenador del Ganado o la confusión

generada con otros agentes causantes de miasis de aparente importancia en

las zonas cálidas de Ecuador, establece que es necesario investigar la

situación real del parasito en el país; es por eso, que esta investigación se

realizó como parte del proyecto “Epidemiología molecular de parásitos y

microorganismos de interés zoonósico y de Salud Pública: Gusano

Barrenador del Ganado, Garrapatas y Fiebre Aftosa, financiado por la

Universidad Central del Ecuador - Núcleo de Investigadores, en colaboración

con el Centro Internacional de Zoonosis. Por lo anterior, el presente estudio

3

tuvo como objetivo identificar morfológicamente a las poblaciones de

Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar los genes

mitocondriales mediante herramientas bioinformáticas.

4

CAPÍTULO II

REVISIÓN DE LITERATURA

Antecedentes

En el Ecuador, la larva de la mosca C. hominivorax fue descrita por primera

vez en un estudio realizado por Arteaga et al. (2012), aunque la mosca ha

sido conocida desde mucho tiempo antes, como causante de miasis

traumática, sin haber sido identificada. Miño et al. (2005), realizaron un

sondeo utilizando una encuesta epidemiológica para orientar la presencia del

parásito en el Ecuador sin demostrar físicamente su presencia. Del mismo

modo, varios estudios realizados por Lyra (2008) y McDonagh et al. (2009)

reportaron larvas de moscas colectadas en el Ecuador, las cuales fueron

identificadas como C. hominivorax mediante análisis de variabilidad genética

y filogenia. La importancia dada a C. hominivorax en la producción animal y

en la Salud Pública, además de la dificultad en la identificación de algunos

ejemplares, ha permitido el desarrollo de estudios basados en el análisis de

genes (Fresia et al., 2007; Griffiths et al., 2009; Infante, 1994; Infante, 1999;

Lyra et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Narang & Degrugillier, 1995; Taylor

& Peterson, 1994; Torres & Azeredo, 2009); mientras que los trabajos de

Alamalakala et al. (2009), Taylor et al., 1996, Toledo, (2007), Skoda et al.

(2002) y Skoda et al. (2012) se han enfocado en la diferenciación de C.

hominivorax de C. macellaria. La falta de estudios en el Ecuador sobre C.

hominivorax y su diferenciación con C. macellaria hace importante la

presente investigación y, además, permite evaluar la importancia de

Cochliomyia spp., tanto a nivel productivo como en Salud Pública.

5

Generalidades

El género Cochliomyia (Diptera: Calliphoridae) posee 4 especies: C.

hominivorax (Coquerel 1858), C. macellaria (Fabrícius 1775), C. aldrichi (Del

Ponte 1938) y C. minima (Shannon 1926) (Dear, 1985). Las dos primeras

especies son las que están comúnmente relacionadas con casos de miasis, y

la semejanza morfológica entre estas dos especies ha ocasionado

identificaciones erróneas; mientras que, las otras dos especies casi no se

reportan como causantes de miasis (FAO, 1993b). La larva de la mosca C.

hominivorax es considerada como la plaga de mayor importancia económica

por su impacto sanitario en animales de sangre caliente y los seres humanos

(Forero et al., 2008).

Clasificación Taxonómica de Cochliomyia spp. ( Según Wall et al., 2001;

COMEXA, 2008; FAO, 1993a; COPEG, 2014, NCBI, 2014)

Reino: Animal

Phylum: Arthropoda

Clase: Insecta

Orden: Diptera

Suborden: Brachycera

Familia: Calliphoridae

Género: Cochliomyia

Especies: C. hominivorax

C. macellaria

6

Cochliomyia hominivorax

El Gusano barrenador del ganado del nuevo mundo, C. hominivorax, se ha

descrito a partir de casos humanos de miasis observados por el Dr. Charles

Coquerel, en 1858, en una prisión francesa de Guyana (Isla Diablo), quien

encontró las larvas del díptero en los conductos nasales de cinco hombres

(Touré, 1994), por lo que se le conoce vulgarmente como la “devoradora de

hombres” apelativo que procede del nombre de la especie, hominivorax.

La mosca del GBG pertenece al orden de los dípteros, cuya nomenclatura

fue nominada por múltiples ocasiones en diversos géneros y especies, lo que

ha provocado algunas confusiones. Inicialmente, Coquerel la llamo Lucilia

hominivorax y, posteriormente, otros autores la designaron como Calliphora

infesta, Calliphora antrophophaga, Somomyia fulvobarbata, Cochliomyia

americana y su nombre oficial actual es Cochliomyia hominivorax (del latin,

Cochlio= en forma de espiral o tornillo y Myia= mosca), muy conocida

comúnmente como gusano barrenador primario, gusano barrenador del

Nuevo Mundo, gusano tornillo, Screwworm en inglés y Bicheira en portugués

(FAO, 1993a; Bajatta, 2007; Forero et al., 2008).

Dada la gran similitud morfológica de C. hominivorax con C. macellaria, se

suponía que eran la misma especie y que las pocas diferencias que

presentaban se debían al medio alimenticio y ecología. Durante mucho

tiempo C. hominivorax fue considerada sinónimo de C. macellaria (Rocha,

1956 citado por Lyra; Alavez, 1975). Posteriormente, el Dr. Emory Cushing y

el Dr. Walter Patton, en 1933, establecieron la diferencia entre estas dos

moscas (Bajatta, 2007).

7

Ciclo de vida de C. hominivorax- GBG

El ciclo de vida del gusano barrenador del ganado es holometábolo, es decir

su etapa de metamorfosis es completa, pasando por fases de huevo, larva,

pupa y adulto (Rodríguez et al., 2011). La hembra es monógama; mientras

que, la mosca macho es polígamo (Alavez, 1975; COMEXA, 2008); una vez

que es fecundada, la hembra deposita sus huevos en los bordes de heridas,

en mucosas lesionadas principalmente de aberturas naturales del cuerpo e

incluso en

aquellas lesiones causadas por garrapatas (Rodríguez, 2011). Las moscas

depositan una masa de huevos superpuestos como tejas, todos orientados

en una misma dirección; cada hembra puede ovipositar, durante su vida,

entre 200 a 500 huevecillos, en aproximadamente 4 posturas en varios días;

la temperatura óptima para ovipositar es de 21 a 29°C (Bárcenas, 2010;

Quiroz, 2003).

Luego de 12 a 24 horas los huevecillos eclosionan y las larvas se introducen

en el tejido del hospedador. La forma de la herida se asemeja a un túnel o

bolsillo; esto debido a que las larvas laceran el tejido para alimentarse con

los fluidos corporales (Quiroz, 2003). A medida que las larvas se alimentan

van aumentando de tamaño, pasando por tres estadíos larvales. Después de

4 a 8 días las larvas abandonan la herida para caer al suelo y se entierran

para transformarse en pupas. Finalmente, luego de 7 a 54 días, dependiendo

de la temperatura ambiental, emerge la mosca adulta. El periodo de vida, en

condiciones normales, desde huevo hasta adulto es de 3 a 4 semanas y en

condiciones adversas su periodo puede prolongarse por 2 a 3 meses

(Guimarães et al., 1983; Bajatta, 2007).

La hembra alcanza su madurez sexual, después de 2 a 4 días de haber

emergido de la pupa y a partir del quinto día está lista para ovipositar; se

alimenta de proteínas de las heridas animales antes o después de su

oviposición y de hidratos de carbono (néctar de las flores) y agua. Estas

moscas pueden llegar a vivir hasta 30 días. Por el contrario, el macho

alcanza su madurez sexual a las 24 horas de nacido, se alimenta

8

principalmente de néctar de flores y puede llegar a vivir hasta 14 días (FAO,

1993a; CFSPH, 2007). En caso de no encontrar una herida, una mosca

puede viajar de 10 a 20 Km en climas tropicales ó 290 km en menos de dos

semanas en ambientes áridos (OIE, 2013; Spradbery, 1994).

Figura 1. Ciclo de vida de C. hominivorax

Fuente: CIZ (2015)

Distribución Geográfica

El GBG del nuevo mundo es originario de las regiones tropicales y

subtropicales del continente Americano; históricamente estuvo distribuido

desde el Centro y Sureste de los Estados Unidos, México, Centro América,

Panamá, Islas del Caribe y toda Sudamérica. En la actualidad, el GBG se

encuentra presente de forma endémica en América del Sur, a excepción de

Chile, y en algunos países del Caribe (Cuba, República Dominicana, Haití,

Trinidad-Tobago y Jamaica que se encuentra en proceso de erradicación)

(Bajjata, 2007; Robinson et al., 2009; Rodríguez, 2011). No es común

encontrarlo sobre los 2100 msnm (CFSPH, 2007). El gusano barrenador del

nuevo mundo fue detectado en Libia en 1988; sin embargo, por la oportuna

intervención epidemiológica fue erradicado en 1991(Ortiz, 2005).

9

Cochliomyia macellaria

La mosca C. macellaria, conocida como gusano barrenador secundario, fue

descubierta por Fabricius en 1775 quien la denominó Musca macellaria;

posteriormente, su nomenclatura ha ido cambiando a Callitroga macellaria y

actualmente se la conoce como Cochliomyia macellaria (Dear, 1985; Maes et

al., 1994; Whitworth, 2010)

Ciclo Biológico de Cochliomyia macellaria

El ciclo de vida incluye 4 etapas: huevo, larva, pupa y adulto. Las larvas de

C. macellaria se alimentan solo de tejido necrótico (necrófaga) de cadáveres

(Quiroz, 2003), aunque, se ha observado en tejido necrótico de heridas en

animales vivos, por lo que se les considera invasoras secundarias. Las

hembras pueden depositar hasta 1000 huevecillos en lotes de 40 a 250

huevos y, es frecuente que varias hembras se reúnan para la postura (do

Valle, 1997). En condiciones favorables, la eclosión se presenta dos horas

después de la oviposición y las larvas alcanzan su estadío 3 en un periodo

de 6 a 20 días. Posteriormente, abandonan el tejido para empezar a pupar

en un transcurso de 3 a 27 días. El periodo de vida desde huevo hasta adulto

puede durar entre 9 a 39 días (FAO, 1993b).

Los especímenes adultos de C. macellaria pueden vivir de 2 a 6 semanas,

alimentándose de los líquidos presentes en la materia orgánica en

descomposición, que también lo utilizan para su oviposición (Guimarães et

al., 1983).

Distribución Geográfica

Se encuentra ampliamente distribuidos en América desde el Sur de Canadá

hasta la Patagonia, incluido las Islas Galápagos y el Oeste de la India (Dear,

1985; Koller et al., 2011).

10

Morfología diferencial entre C. hominivorax y C. macellaria

Las principales características morfológicas que se utilizan en la

diferenciación de estas dos especies se las observan en larva estadío 3

según las claves de la FAO (1993a); COMEXA (2008) y Florez & Wolff (2009)

y, en adultos según Cushing & Hall (1937, citado por Barcellos, 1980); James

(1970 citado por Guimarães et al., 1983); Dear (1985); Spradbery (2002) y

Whitworth (2010), quienes describen las principales características

morfológicas empleadas para su diferenciación, las cuales se detallan en la

Tabla 1 y 2.

Tabla 1. Características morfológicas diferenciales entre las larvas en estadío 3 de

C. hominivorax y C. macellaria

Adaptado de: FAO,1993a; COMEXA, 2008 Florez & Wolff, 2009

Descripción C. hominivorax C. macellaria

Banda de espinas Espinas de 1 a 3 puntas, siendo más a

menudo 1 ó 2 puntas. Fig.2ª

Espinas pequeñas con 1 a 3 puntas,

siendo más a menudo 2 puntas. Fig. 3A

Espiráculos anteriores

Espiráculos anteriores, los cuales

presentan una prolongación (forma de

mano) cada uno de 6 a 11 lóbulos o

papilas. Usualmente de 7 a 9 lóbulos.

Fig.2ª

Espiráculos anteriores cortos con lóbulos

ó papilas cortas, que varían de 8 a 12.

Usualmente 9 a 11 lóbulos. Fig.3A

Troncos Traqueales

Los dos troncos traqueales presentan

una pigmentación oscura que va

desde el espiráculo posterior que se

encuentra en el doceavo segmento

hasta el décimo o incluso el noveno

segmento. Fig. 2ª

Los dos troncos traqueales pigmentados

de color oscuro solo hasta un tercio del

último segmento (doceavo). Fig.3C

Localización en el hospedador Barrenan o profundizan dentro del

tejido (lesión en forma de bolsillo) Se encuentran superficialmente.

11

Figura 2. Características del estadío larvario 3 de C. hominivorax: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: Laake et al., 1936 citado por OIE, 2013; COMEXA, 2008.

Figura 3. Características del estadío larvario 3 de C. macellaria: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: COMEXA, 2008; Florez & Wolff, 2009; Mendes, 2009

12

Tabla 2. Características morfológicas diferenciales entre los adultos de C.

hominivorax y C. macellaria

Adaptado de: (FAO, 1993b; OIE, 2013; Spradbery, 2002; Withworth, 2006; Withworth, 2010)

Figura 4. Características morfológicas diferenciales entre adultos de C. hominivorax y C. macellaria; p = placa fronto - orbital, vista desde arriba y lateralmente en la cabeza; b = basicosta; tx = Tórax con las bandas longitudinales; ab= abdomen dividido en tergos) Adaptado de: OIE, 2013; Spradbery, 2002.

Morfología C. hominivorax C. macellaria

CABEZA – Región Frontal

Placas fronto - orbitales con setas

de color negro u oscuro, fuera de las

setas frontales. Fig.3p

Tercio inferior a la mitad de las

Placas fronto – orbitales solo con

setas de color pálido o amarillo

fuera de las setas frontales, (pero

en algunos casos sus inserciones

aparecen con puntos negros).

Fig.3p

ALA

En las hembras la basicosta es de

color marrón oscuro a casi negro.

Fig.3b

En las hembras la basicosta es de

color amarillo. Fig.3b

TÓRAX

La banda central en el tórax apenas

se extiende hacia delante de la

sutura mesonotal, es decir la banda

central es más corta que las 2

bandas laterales. Fig.3tx

La banda central en el tórax se

extiende mucho más adelante de la

sutura mesonotal, es decir las tres

bandas son del mismo tamaño.

Fig.3tx

ABDOMEN

Quinto tergito (cuarto visible)

lateralmente sin microtomentum

plateado. Fig.3ab

Quinto tergito (cuarto visible)

lateralmente con microtomentum

plateado pronunciado que parecen

manchas muy visibles. Fig.3ab

13

En la fase adulta, las moscas del género Cochliomyia se las puede distinguir

de otros géneros, que se encuentran relacionados en miasis de heridas, por

la coloración del cuerpo que varía entre verde y azul metálico o púrpura

azulado y la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax

(FAO, 1993a; OIE, 2013). Su cabeza presenta pelos de color amarillo o

dorado y sus ojos son ocre rojizos; los machos se distinguen de las hembras

porque tienen sus ojos casi juntos, es decir son holópticos, mientras que, en

las hembras los ojos son más separados o dicópticos (Quiroz, 2003; Mendes,

2009). El color y la longitud del cuerpo no son características útiles para

establecer una distinción clara entre especies; C. hominivorax puede llegar a

medir de 8 a 10mm y C. macellaria de 6 a 9mm (FAO, 1993a). Según los

reportes, una especie de mosca denominada Compsomyiops callipes es

muy similar en apariencia a la mosca del género Cochliomyia, la cual se la

puede diferenciar por sus palpos clavados y calípter oscuro (café) (Byrd &

Castner, 2010; Withworth, 2006).

14

Epidemiología

Situación en América

El GBG del nuevo mundo es endémico en climas tropicales y subtropicales

del Continente Americano; su distribución está determinada por las

condiciones climáticas, debido a la incapacidad para sobrevivir a bajas

temperaturas (FAO 1993ª, Bajatta, 2007). En la actualidad, existen países

declarados libres de C. hominivorax entre los cuales se encuentran Estados

Unidos, México, Libia, Puerto Rico, las Islas Vírgenes, Curaçao y Centro

América (CFSPH, 2007; Rodríguez et al., 2011). Por el contrario, la mosca

del GBG sigue siendo prevalente en la República Dominicana, Haíti, Trinidad

y Tobago, Cuba, Jamaica y en todos los países de Sudamérica a excepción

de Chile. En Sudamérica, se estima una población ganadera de 463,392

millones entre bovinos, ovinos, equinos y caprinos y una población humana

de 330,750 millones, en riesgo de ser afectado por el GBG (Bajatta, 2007;

Rodríguez et al., 2011).

Figura 5. Mapa de distribución de los países libres del GBG

Fuente: Bajatta, 2007

15

Situación en el Ecuador

Para el periodo de Enero a Junio del 2014, La Organización Mundial de la

Sanidad Animal determinó la distribución de miasis causada por C.

hominivorax en animales, donde en algunos países de Centroamérica y

Sudamérica esta miasis representa una enfermedad clínica; no obstante,

para el Ecuador ha sido reportada como no observada en este periodo (OIE,

2015).

Figura 6. Mapa de distribución de miasis por C. hominivorax

Fuente: OIE (2015)

En este contexto, en los años 80, el Dr. Gonzalo Moya Borja, mientras

realizaba un estudio de Dermatobia hominis en Santo Domingo de los

Tsáchilas, identificó la presencia de larvas de C. hominivorax en animales

(Miño et al., 2005). Del mismo modo, en enero del 2005 el Servicio

Ecuatoriano de Sanidad Agropecuaria (SESA), actual AGROCALIDAD, con

la participación de la Comisión México – Americana para la erradicación del

GBG plantean la necesidad de conocer la situación de esta parasitosis en las

ganaderías ecuatorianas; por lo cual, se realizó una encuesta epidemiológica

con el fin de determinar la presencia de la larva del GBG obteniendo como

resultado, que de un total de 1255 predios encuestados, 522 fincas

reportaron su presencia, alcanzando un total de 4132 animales infestados

(Miño et al., 2005).

16

Para el año 2012, durante un estudio del comportamiento de C. hominivorax

en una región de Manabí, se registró un porcentaje de animales infestados

por esta larva de: bovinos (73.4%), porcinos (13.7%), ovinos (8.8%), equinos

(5.3%), caprinos (1.8%) y caninos (0.4%); además, se observó a C.

macellaria en casos de miasis en tres especies de animales (bovinos,

porcinos y ovinos) (Arteaga et al., 2012). Por otro lado, en una investigación

realizada en el 2014 sobre la Dinámica Poblacional del GBG en el Cantón

San Miguel de los Bancos Provincia de Pichincha, se encontró 52 moscas de

C. hominivorax y 23 moscas de C. macellaria, que fueron identificadas

morfológicamente usando claves dicotómicas, las cuales fueron colectadas

por medio de trampas aéreas a base de hígado en putrefacción (Jervis,

2014).

Según la OIE para el año 2005 en el Ecuador se reporta la presencia de

miasis por C. hominivorax en humanos, pero no hay información sobre el

número de casos (OIE, 2015).

El GBG es un importante agente de zoonosis, en especial en zonas

marginadas con condiciones sanitarias deficientes; el principal grupo de

riesgo son ancianos, niños y discapacitados (Bajatta, 2007; Forero et al.,

2007); es así que, se ha reportado 3 casos de miasis por C. hominivorax: un

caso de infestación en una paciente de 7 años proveniente de Esmeraldas

en 1994, quien presentó lesiones a nivel del pabellón auricular (Chico et al.,

1994); en el año 2014, se reporta un caso de Infestación maxilar por larvas

de C. hominivorax en una mujer de 24 años originaria del Cantón Santa

Isabel – Provincia del Azuay, a la cual le extrajeron 100 larvas que formaban

túneles larvarios en paladar duro, labio superior y mucosa del vestíbulo

superior de la cavidad bucal (Alemán & Reinoso, 2014) y, de igual manera,

para el año 2014, se presenta un caso de miasis orbital severa, causada por

C. hominivorax en una anciana Kichwa de 91 años de edad proveniente de la

Comunidad Tunipamba – Imbabura; la paciente tenía una lesión tumoral

17

ulcerada en el ojo derecho y de la cual se extrajo más de 100 larvas

(Dominguez et al., en prensa)

Impacto Económico

En 1933, los investigadores del Departamento de Agricultura de los Estados

Unidos de América revelaron que, el origen de las pérdidas económicas

causadas por miasis en las ganaderías no se debían al díptero C.

macellaria, sino a una especie diferente denominada C. hominivorax que

afectaba tanto a la industria ganadera y a los animales silvestres, así como

también causaba lesiones en los seres humanos (Rodríguez et al., 2011;

Forero et al., 2007)

La larva del GBG – C. hominivorax, ha afectado enormemente la ganadería

en el Continente Americano; no obstante, los factores de riesgo en los

animales están relacionados, principalmente, con las prácticas de manejo

(Forero et al., 2007). Rodríguez et al. (2011) mencionan que, en gran parte

de América, la larva de C. hominivorax es considerada como la principal

plaga de insectos del ganado debido a las infestaciones múltiples que

pueden llegar a ocasionar, mutilaciones y la muerte de los animales,

especialmente de terneros; los animales que no reciben tratamiento pueden

morir entre 7 y 14 días por las toxinas segregadas por las larvas y por la

presencia de infecciones secundarias, principalmente por bacterias

oportunistas como Escherichia coli y Proteus spp. (Anziani, 2011; CFSPH,

2007).

Las pérdidas anuales por costos de mano de obra para prevención y control,

tratamiento del ganado y costos de productos utilizados pueden llegar a ser

altos, sin considerar la muerte de los animales (Rodríguez et al., 2011). Las

pérdidas anuales reportadas para los Estados Unidos fueron de $870

millones de dólares, para México $319 millones, para Centro América $85.1

millones, el Caribe (Jamaica, República Dominicana, Haití, Trinidad y

Tobago, Cuba) $128.67 millones, y para los países de Sudamérica $3591.17

millones (Rodríguez et al., 2011). En este sentido, se calcula que el promedio

18

anual de gastos en varios países, por inspección y tratamiento, es de 7.76$

por animal, por lo que sus pérdidas económicas en conjunto resultarían ser

cuantiosas (Bajatta, 2007).

Erradicación del GBG – Cochliomyia hominivorax

En 1936, el Dr. Raymond Bushland desarrolló una técnica para criar

considerables cantidades de insectos en forma artificial, usando una dieta a

base de carne molida, sangre de bovino, agua y formol como conservante;

sin embargo, en el año de 1937, el Dr. Edward Knipling fue el primero en

establecer la teoría del control biológico de la mosca mediante la Técnica del

Insecto estéril, la cual establece la introducción de grandes cantidades de

machos sexualmente estériles en las poblaciones de insectos silvestres, con

el propósito de que los huevos ovipositados por las hembras fértiles

apareadas con dichos machos fueran infértiles y, por lo tanto, no exista

descendencia. Por el contrario, Bushland y Hopkins, en 1951, realizaron la

primera esterilización de moscas del GBG y demostraron que ambos sexos

quedaban estériles (Krafsur, 1998; Baumhover, 2002; Quiroz, 2003).

La técnica del insecto estéril implica la producción masiva de moscas del

GBG y su esterilización en la fase de pupa por medio de radiación de rayos

Gamma (Cesium 137); después, los insectos estériles son dispersados en

una proporción de 10 moscas machos estériles por cada mosca hembra

silvestre (Rodríguez et al., 2011).

En Estados Unidos, se crearon plantas productoras de moscas estériles del

GBG que permitieron la erradicación en dicho país; sin embargo, debido a la

migración de moscas de México a Estados Unidos, en 1972, se formó la

Comisión México Americana para la Erradicación del Gusano Barrenador del

Ganado (CMAEGBG), cuyo objetivo fue erradicar el gusano en el territorio

mexicano, desde la frontera con Estados Unidos hasta la región del Istmo de

Tehuantepec- México; por esta razón, la comisión desarrolló una planta

productora de moscas estériles en Chiapa de Corzo, cuya capacidad de

19

producción era de 500 millones de moscas por semana; no obstante, esta

planta en México desapareció una vez que se logró la erradicación de esta

plaga en dicho país (Quiroz, 2003; Bajatta, 2007).

En la actualidad, la Comisión Panamá - Estados Unidos para la Erradicación

y Prevención del Gusano Barrenador del Ganado (COPEG) posee la Planta

productora de moscas estériles, cuya finalidad es la de proveer insectos

estériles para el mantenimiento de la última Barrera biológica, cuyo objetivo

es evitar el ingreso de esta plaga a la región Norte y Centro de América,

siendo su capacidad de producción de 100 millones de moscas semanales

(COPEG, 2014).

Biología Molecular en la Identificación de Insectos

La biología molecular juega un rol muy importante en la identificación de

insectos mediante la utilización del ADN; los insectos contienen material

genético (ADN nuclear y mitocondrial) que ha sido utilizado con el fin de

identificar las distintas etapas de vida de los insectos (Gennard, 2007).

20

ADN Mitocondrial

El uso de ADN mitocondrial (ADNmt) ha demostrado ser eficiente para

muchos grupos de animales como un marcador genético para estudios

evolutivos y poblacionales, debido al predominio de la línea materna, la falta

de recombinación y la rápida sustitución de nucleótidos (Fresia et al., 2007;

Simon et al., 1994; Sperling et al., 1994).

Lessinger et al., (2000), determinaron la secuencia del genoma mitocondrial

de C. hominivorax la cual es una molécula circular de 16022 pares de bases

(pb); en su genoma se encontró un gen que contiene 13 proteínas

codificables, 22 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 2 genes de ARN

ribosomal (ARNr).

Figura 7. Insect mitochondrial genome

Fuente: Gennard, 2012

21

Estudios Moleculares realizados en Cochliomyia

Los análisis moleculares con califóridos se ha concentrado en tres temas:

genética de poblaciones, identificación de especies y filogenia o análisis

evolutivos (Azeredo-Espin & Lessinger, 2006)

Dentro de las diferentes técnicas empleadas para el análisis del ADNmt

destacan el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP por

sus siglas en inglés), utilizando ADNmt para el análisis de poblaciones de

C.hominivorax (Infante & Azeredo-Espin, 1995; Roehrdanz, 1989; Lyra et al.,

2005) además de permitir la identificación y caracterización de especies del

GBG (Taylor et al., 1996; Litjens et al., 2011). Con la técnica de amplificación

aleatoria de ADN polifórmico (RAPD por sus siglas en ingles), Skoda et al.

(2002), realizaron estudios comparativos con C. hominivorax y C. macellaria;

no obstante, Alamalakala et al., (2009) utilizaron la técnica de Polimorfismo

en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP por sus siglas en inglés)

para la diferenciación de C. hominivorax de C. macellaria.

Las técnicas de fingerprinting (AFLP, RAPD) se han utilizado ampliamente en

todo el mundo, permitiendo obtener resultados adecuados en la

diferenciación de especies, pero ha presentado varios problemas en la

interpretación de las bandas obtenidas después del corte por enzimas; es así

que en la búsqueda de un mejor análisis de las secuencias se ha optado por

la secuenciación y el análisis bioinformático de las mismas.

Filogenia

La filogenia determina la historia evolutiva de un grupo de organismos,

utilizando matrices de información de moléculas de ADN y de morfología; con

esta información se establecen árboles filogenéticos que representan la

historia evolutiva de las especies, poblaciones y genes (Sadava et al., 2009).

La misión de la filogenética molecular es la construcción de árboles

22

filogenéticos a partir de la inferencia de las relaciones evolutivas existentes

entre las secuencias a estudiar (Page & Holmes, 2009).

La máxima parsimonia es uno de los métodos más utilizados en la

reconstrucción de árboles filogenéticos basado en caracteres, que tiene

como principal fundamento escoger el árbol filogenético que explica la

filogenia de un grupo con el menor número de pasos o eventos evolutivos

(Vaca & Larralde, 2009).

Debido a su condición de parásitos del ganado y su papel como especie

indicadora primaria en entomología forense, la familia Calliphoridae se

encuentra entre lo filogenéticamente más estudiado de las moscas

causantes de miasis (Steven, 2003; Wallman, J.F. et al., 2005); es así que

los estudios filogenéticos, de varios autores como McDonagh et al., (2009) y

Fresia, (2013), se han realizado en el sur, centro y norte de América.

Teniendo como punto de inicio los aspectos evolutivos, las miasis se pueden

agrupar en dos raíces filogenéticas distintas, considerando el

comportamiento y hábitos de vida de los organismos que lo causan. En la

raíz saprófaga, estos organismos estaban adaptados a la alimentación de

materia orgánica en descomposición, luego pasaron a alimentarse de

carcasas de animales y posteriormente de tejidos necrosados de vertebrados

en descomposición; mientras que, en la raíz sanguinívora, las larvas son

capaces de perforar el tegumento de otras larvas y alimentarse de su

contenido corpóreo. Posteriormente, estas larvas pasaron a perforar la piel

de hospedadores vertebrados y alimentarse de su sangre, haciéndose de

esa forma parásitos obligados (Guimarães & Papavero, 1999; Zumpt, 1965

citado por Grella, 2011).

23

CAPÍTULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación fue de tipo descriptiva, por medio de la que se detallaron los

procesos utilizados y por ende sus resultados.

El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en dos etapas en los

laboratorios del Centro Internacional de Zoonosis-Universidad Central del

Ecuador (CIZ-UCE); una en la Unidad de Entomología Aplicada (UEA),

donde se realizó los estudios de identificación morfológica y, la otra, en el

área de Biología Molecular, en donde se procedió a la extracción,

amplificación del ADN, visualización de las bandas; posteriormente, se envió

a secuenciar. Los especímenes adultos utilizados en este estudio pertenecen

a la colección del CIZ-UCE, los que han sido colectados durante el año 2013

y 2014.

El origen de las muestras colectadas proviene de San Miguel de los Bancos,

Saloya, Tumbaco y Quito (Valles), pertenecientes a la Provincia de

Pichincha. Para el estudio se utilizaron ejemplares en estadíos juveniles

(larvas) colectadas en miasis de bovinos y caninos y, moscas adultas

obtenidas de trampas y cadáveres de bovinos y armadillo. Cabe señalar que

los estadíos juveniles (larvas) fueron cultivadas en el laboratorio hasta la

obtención de adultos mismos que fueron utilizados en los estudios

moleculares.

El esquema para la selección de los individuos analizados se realizó en base

a los registros del CIZ, considerando el origen, la procedencia y el estado de

desarrollo de los ejemplares (Ver tabla 3).

24

Tabla 3. Esquema de selección de individuos para la Identificación morfológica y molecular

Origen Estadío # de ejemplares Procedencia (#)***

Animal vivo

Adultos* 3

Los Bancos (2)

Durán (1)

Larvas** 16

Los Bancos (3)

Saloya (7)

Tumbaco (3)

Quito (Valles) (3)

Trampa Adultos 8

Los Bancos (7)

Saloya (1)

Cadáver

Adultos***** 14

Los Bancos (8)

Saloya (6)

Huevos**** 7 Los Bancos (7)

Total = 48 ejemplatres

*Ejemplares adultos colectados directamente del animal vivo; **Larvas criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, ***Cantidad de ejemplares por localidad, **** Huevos criados hasta obtener moscas adultos, ***** Ejemplares adultos colectados directamente del cadáver.

Fase de Laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada

Identificación y cultivo de larvas:

Las larvas obtenidas de las heridas de animales fueron identificadas

morfológicamente utilizando un estereomicroscopio y las claves para larvas

del género Cochliomyia, publicadas por el COMEXA (2008), FAO

(1993a,1993b), Florez & Wolff (2009) y Spradbery (2002); posteriormente,

fueron criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, según el Manual de

FAO (1993a), las cuales se utilizaron para la investigación; este

procedimiento fue desarrollado por el personal del CIZ y no forma parte de

este trabajo.

25

Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp:

Todos los adultos (capturados o procedentes de miasis) fueron identificados

utilizando un estereomicroscopio y claves dicotómicas de la FAO

(1993a,1993b), Spradbery (2002), Whitworth (2010) (ver Anexo A).

Una vez identificado el ejemplar adulto, se separaron dos patas en un vial de

1,5ml para la extracción del ADN.

Fase de laboratorio: Biología Molecular

Las actividades realizadas fueron detalladas en este orden:

Extracción y cuantificación de ADN

El procesamiento se llevó a cabo según el protocolo de Chelex, reportado

por Echeverria et al. (2015).

Materiales

Cabina de bioseguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY ENCLOSURE).

Micro – Tijeras entomológicas

Micro mortero a batería (Kontes, Vineland, NJ).

Centrífuga (Force Micro 1624).

Pipetas calibradas (Med Plus).

Vórtex (Labnet Vx 100).

Shaking Micro Incubator(Provocell TM )

Tubos de 1.5ml (Axygen® )

NanoDrop 2000(Thermo Scientific)

Reactivos

Ultra-PURE Distilled Water DNAse, RNAse Free ( Invitrogen®)

Buffer de hidratación (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS, 200mM sacarosa)

Proteinasa K (Promega®)

Buffer TEX (10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1% Triton x-100) con Chelex®100 al 10%

26

Procedimiento

Pretratamiento – Hidratación de la muestra: Se suspendieron dos patas

del espécimen en 250ul de buffer de hidratación (100mM Tris-HCl, 50mM

EDTA, 100mM NaCl, 0.5% SDS, 200mM sacarosa) (Golczer & Arrivillaga,

2008) por 2 días, a temperatura ambiente.

Homogenización de la muestra: la lisis mecánica se dividió en tres etapas:

a) trituración de la muestra con tijeras; b) homogenización con micromortero

a batería (Kontes, Vineland, NJ); y c) centrifugación por 10 minutos a 13000

rpm.

Lisis química y recuperación de DNA: se descartó el sobrenadante y

añadió 200μl de buffer TEX (10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1% Triton x-

100) con Chelex®100 al 10%. Se agregó 35μl de proteinasa K (20mg/ml – en

PK buffer – 50mM Tris-HCl pH 7.4, 10mM CaCl2). La solución se incubó por

1 hora a 60°C con 1300 rpm, seguida por 10 minutos a 100°C con 1000 rpm.

Recuperación de DNA: finalmente, se centrifugó por 5 minutos a 13000

rpm y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo.

Cuantificación: Se realizó una medición de 2μl de cada muestra con

espectrofotometría, según especificaciones del programa del equipo

Nanodrop 2000c y almacenó a -20°C, hasta su amplificación.

27

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Los oligonucleótidos y el programa de amplificación se tomaron de

Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994) con las modificaciones

reportadas en Echeverria et al. (2015)

Materiales

Tubos de 1.5ml (Axygen®)

Tubos de 0.2ml (Bioplastics)

Cabina de seguridad (LABCONCO, PURIFIED® CLASS I SAFETY ENCLOSURE).

Vortex (HEIDOLPH, Reax top)

Juego de Pipetas calibradas (BioPette)

Termociclador Biorad (C1000 Touch Thermal Cycler)

Reactivos

Ultra-PURE Distilled Water DNAse, RNAse Free ( Invitrogen®)

Cebadores CIJ1632, CIN2191, 12SBI, 12SAI (tabla 4) tomados de Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994)

Flexi Buffer 5X Promega®

MgCl2 25um Promega®

dNTP Promega®

GoTaq® G2 Flexi DNA Kit Promega®

Tabla 4. Secuencia de cebadores para el COI y 12S

Gen Cebadores Secuencia* Pb

COI CIJ1632

CIN2191

5' - TGATCAAATTTATAAT- 3' 5' -GGTAAAATTAAAATATAAACTTC- 3'

≈540pb

12S 12SBI

12SAI

5' -TACTATGTTACGACTTAT- 3'

5' -AAACTAGGATTAGATACCC- 3'

≈400pb

* Tomado de Arrivillaga et al. (2003) y Simon, et al. (1994)

28

Procedimiento

Se preparó el master mix en un tubo de 1.5 ml. Previamente se realizaron los

cálculos para un volumen de reacción final de 25 µl/tubo (Por cada reacción

se incluyó un control positivo y control negativo) y se añadieron los reactivos

en el orden que señala la Tabla 5 y 6.


amplificación del gen COI

Reactivo Concentración final 1X [µl]

Agua 13.9

Flexi Buffer 5X Promega® 1X 5

MgCl2 25um Promega® 4Mm 4

dNTP Promega® 0.2mM 0.5

Cebador C1N2191 0.6mM 0.15

Cebador C1J1632 0.6mM 0.15

GoTaq® G2 Flexi DNA Promega® 0.07U/µl 0.35


amplificación del gen 12S ARNr

Reactivo Concentración final 1X [µl]

Agua 14

Flexi Buffer 5X Promega® 1X 5

MgCl2 25um Promega® 4mM 4

dNTP Promega® 0.2mM 0.5

Cebador 12SAI 0.3mM 0.08

Cebador 12SBI 0.3mM 0.08

GoTaq® G2 Flexi DNA Promega® 0.065U/µl 0.33

29

- Se dispensó 20µl del mix en tubos de 0.2ml, colocados con

anticipación a 0°C.

- Una vez en el termociclador, a cada tubo de 0.2ml se le agregó 5 µl de

muestra. Para el control positivo se agregó 5µl de una muestra que

presentó amplicones adecuados con COI y 12SARNr.

- Se amplificaron las muestras para el COI en el equipo según los

parámetros: Desnaturalización inicial a 95°C durante 3 minutos, 35

ciclos de 95°C durante 30 segundos, 45°C un minuto y 72°C un

minuto y una extensión final de 72°C por 7 minutos.

- Se amplificaron las muestras para el 12S ARNr en el equipo según los

parámetros: Desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, 35

ciclos de 95°C durante 30 segundos, 48°C un minuto y 72°C un

minuto y una extensión final de 72°C por 10 minutos.

- Las bandas se visualizaron en gel con agarosa al 2% (w/v) TBE 0.5X;

se utilizó SYBR® SAFE como intercalante de ADN; las muestras se

colocaron en los pocillos y, finalmente, se observó y documentó las

bandas con luz UV en el foto documentador (Bio- Imaging Systems

Mini Lumi).

- Las bandas que presentaron una correcta amplificación en calidad y

nitidez del amplicón se enviaron a secuenciar.

Secuenciación.- Para el trabajo de secuenciación de los amplicones a ser

analizados, las muestras fueron enviadas a “EUROFINS GENOMICS en

Estados Unidos.

30

Análisis de Datos

Los cromatogramas recibidos por la empresa Eurofins Genomics, encargada

de secuenciar, se analizaron en el Software Sequencher 4.2 (Gene Codes,

Ann Arbor, MI) cuya finalidad fue la de contrastar las secuencias “forward” y

“reverse” para obtener una secuencia consenso libre de ruido y

ambigüedades; estas últimas se reportan en el cromatograma con la letra “N”

lo que significa que no existe correspondencia con alguna base específica.

Posteriormente, las secuencias consenso se alinearon empleando el

programa Clustal W (en MacVector versión 7.2; Accelrys, Madison, WI). El

uso del programa MacVector consiste en la comparación lineal de las

secuencias de aminoácidos o nucleótidos buscando resaltar zonas de

homología posicional que permitan indicar las relaciones evolutivas.

Del mismo modo, se verificó la identidad de las secuencias al analizar en

línea con el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool,

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, determinando la homología con

secuencias publicadas en su base de datos.

La matriz final se introdujo en el software PAUP 4.0a142 (Swofford, 2002)

para los análisis filogenéticos, el que realizó una reconstrucción filogenética,

utilizando el algoritmo de Parsimonia Máxima (Maximun Parsimony) con un

método de búsqueda heurística; posterior repesado de caracteres homólogos

y finalmente se realizó un consenso de mayoría de las soluciones hipotéticas

resultantes.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

31

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación Morfológica

Para la identificación morfológica se utilizaron 48 ejemplares adultos; mismos

que se detallan en la Tabla 7.

Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares

N° Código Procedencia Dato de Captura Estadío

de vida

Fecha de

Captura

1 1C San Miguel de los

Bancos Animal Vivo-oreja A 7-nov-2013


Bancos Animal Vivo A 20-ene-2014

3 3C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014

4 4C Quito(Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013

5 5C Quito(Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013


Bancos Trampa A 7-nov-2013






Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013



11 31C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013

12 32C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013




Bancos Trampa A 27-sep-2013

32














Bancos Cadáver armadillo A 24-ene-2014


Bancos Cadáver.armadillo A 24-ene-2014



24 46C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013

25 47C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013

26 48C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014

27 49C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014


Bancos Cadáver A 7-nov-2013

29 51C Saloya Trampa A 25-oct-2013









34 57C Saloya Cadáver A 27-nov-2013





Bancos Animal Vivo- oreja A 7-nov-2013

33

A, ejemplar adulto

Fuente: CIZ (2015)

Las moscas del género Cochliomyia fueron diferenciadas de otros géneros

causantes de miasis en heridas, principalmente por la coloración del cuerpo y

la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax. Estas

condiciones, en términos generales, no son compartidas por otras especies

que hayan sido implicadas en las miasis de las heridas, como parásito

obligatorio. Las principales características observadas en las moscas de este

estudio, para discriminar entre C. hominivorax de C. macellaria, se detallan

en la Figura 8.







43 66C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013

44 67C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013





48 100C Guayaquil/Guayas Animal Vivo A 5-jun-2013

34

Figura 8. Adultos de C. hominivorax (izq) y C. macellaria (dcha). (a y b) Cabeza - Vista Frontal. (c y d) Tórax -Vista dorsal. (e y f) Ala – Vista lateral. (g y h) Abdomen – Vista lateral. Fuente: CIZ (2015)

a. C. hominivorax - Placas fronto - orbitales con setas de color negro

b. C. macellaria - Placas fronto - orbitales con setas de color amarillo y las inserciones de las setas aparecen como puntos negros

c. C. hominivorax - Tres bandas longitudinales, la del centro es más corta.

d. C. macellaria - Tiene tres bandas longitudinales negras de igual longitud.

e. C. hominivorax - En hembras las basicosta es de color marrón oscuro o negro.

f. C. macellaria - En hembras las basicosta es de color amarillo.

g. C. hominivorax - Quinto tergito (cuarto visible) lateralmente sin microtomentum plateado.

h. C. macellaria - Quinto tergito (cuarto visible) lateralmente con microtomentum plateado.

35

La identificación por claves morfológicas, en los ejemplares adultos, hasta la

fecha ha presentado falencias, entre autores, que han dificultado la

diferenciación certera de algunos individuos que comparten características

similares. No obstante, las claves dicotómicas, reportadas en la literatura,

presentan pocos caracteres únicos que permiten diferenciar entre especies;

los que, en la literatura científica no muestran un consenso (Figarola, 2001;

Skoda et al., 2002; Toledo, 2007). Es por esto que, las características

morfológicas que se detallan en la Fig. 8, por si solas no aportaron

información clara para diferenciar a estas dos especies. Dos ejemplos claros

son la descripción de colores y las bandas del tórax las que, en este estudio,

resultaron ser muy subjetivas y sin valor diagnóstico, ya que no concuerdan

con la descripción de los ejemplares reportados en las claves dicotómicas.

Del mismo modo, la coloración de la basicosta es característica para

diferenciar entre hembras de estas dos especies lo que coincide con la

literatura reportada (Spradbery, 2002); sin embargo, la principal limitante de

esta característica es que no diferencia a los machos entre especies;

consecuentemente, se necesitan otras estructuras (genitalia del macho) para

su diferenciación. La observación de los genitales requiere de una

especialización y de protocolos complejos que no fueron utilizados en este

estudio.

Los registros del CIZ-UCE, respecto al origen de los especímenes, incluidos

en este estudio, fueron importantes ya que permitieron, en base de la

procedencia, establecer la especie de mosca adulta; es decir, los casos de

miasis recuperados en animales vivos correspondieron a C. hominivorax y

los que fueron colectados en cadáveres pertenecieron a C. macellaria, ya

que la identificación de ejemplares en estadío larval 3 es más fácil de

diferenciar que los ejemplares adultos (FAO, 1993a; Rodríguez, et al., 2011;

OIE, 2013); además, el comportamiento de las larvas es muy marcado y ha

permitido diferenciarlas por sus hábitos alimenticios.

36

Por todo lo anteriormente expuesto, de acuerdo con la identificación de las

claves morfológicas del COMEXA (2008); FAO (1993a,1993b); Florez & Wolff

(2009); Spradbery (2002) y Withworth (2010) para larvas, moscas del género

Cochliomyia, y los datos obtenidos del origen de colecta, del total de

ejemplares analizados, se identificaron dos especies; el 66,67% (32/48)

correspondió a ejemplares de Cochliomyia macellaria y, el 33,33% (16/48) a

Cochliomyia hominivorax.

Según los registros del CIZ-UCE (datos no publicados), se obtuvieron 19

ejemplares, 3 moscas adultas y 16 larvas, capturados o colectados en

animales vivos. De este grupo, los 3 ejemplares adultos, capturados en la

cercanías de una herida en los animales vivos, correspondieron a la especie

C. macellaria; 2 de estas moscas fueron colectadas en San Miguel de los

Bancos - Pichincha y una en Durán - Guayas. Es importante señalar que se

evidenció la presencia de cadáveres cerca de los animales vivos que

presentaban la herida; consecuentemente, es muy probable que las moscas

colectadas, y que corresponden a C. macellaria, estaban buscando el

ambiente adecuado para copular ya que, todos los ejemplares fueron

machos en busca de hembras; según Benedito, (1992), los tejidos

necrosados de la heridas simulan la presencia de un cadáver y las

condiciones ideales para la reproducción.

Las restantes 16 moscas adultas (originalmente colectadas como larvas)

provenían de casos de miasis en bovinos originarios de Saloya y de San

Miguel de los Bancos, y en caninos en la Ciudad de Quito, del sector los

valles y Tumbaco (Ver tabla 7), las que fueron identificadas como C.

hominivorax.

Del mismo modo, los 21 ejemplares, 14 moscas adultas capturadas en

cadáveres y 7 moscas adultas cultivadas en el CIZ-UCE a partir de huevos

ovipositados (Ver tabla 3), correspondieron a la especie C. macellaria. De los

21 ejemplares, 14 adultos fueron colectados de San Miguel de los Bancos y

37

Saloya, y 7 adultos cultivados (a partir de huevos ovipositados) de San

Miguel de los Bancos.

Finalmente, 8 ejemplares adultos colectados en trampas (7 moscas

provenientes de San Miguel de los Bancos y una colectada en Saloya),

confirmaron ser de la especie C. macellaria.

El origen de las muestras juega un papel muy importante para la

discriminación de las dos especies; es así que, se identificó la presencia de

C. hominivorax solo en los 16 casos de miasis de bovinos y de caninos;

mientras que, todas las muestras colectadas fuera de una miasis resultaron

ser C. macellaria; es decir, aquellas colectadas en trampas, cadáveres o

simplemente capturadas en los alrededores de las heridas de los bovinos.

Andrade et al., (2005) y Toledo, (2007) identificaron a C. macellaria en

cadáveres y trampas, respectivamente lo que está en concordancia con este

estudio. Por otra parte, Arteaga et al., (2007) y Valviesse et al., (2014), en

sus investigaciones, identificaron a las dos especies asociadas en casos de

miasis; la razón de este hallazgo fue que C. macellaria interviene como un

invasor secundario de la herida; esto puede ser debido a la preferencia

alimenticia de cada una de estas especies, lo cual concuerda con lo afirmado

por Cushing & Patton, (1933), citado por Azeredo, (1982), quienes fueron los

primeros en establecer la distinción entre las dos especies por sus hábitos

alimenticios. Del mismo modo, Byrd & Castner, (2010), COMEXA, (2008),

FAO, (1993b), Hall, (1991) y Quiroz, (2003), mencionan que el

comportamiento principal de la larva de C. hominivorax es alimentarse de

tejido vivo (parásito obligado en los casos de miasis); mientras que, la larva

de C. macellaria se desarrolla en cadáveres o restos de carcasas. C.

macellaria solo participa como un eventual invasor secundario de miasis,

alimentándose de los bordes del tejido necrosado de las heridas; por esta

razón, esta especie, ha ganado reconocimiento en la entomología forense

como una especie principal para basar estimaciones de intervalos post

mortem del fallecimiento de la víctima. En este estudio, el comportamiento de

38

estas dos especies también fue considerada como un aspecto importante

para su diferenciación, gracias a los registros de colecta del CIZ-UCE (datos

no publicados).

Según la afirmación de Fresia et al., (2007) quienes indican que C.

hominivorax es la especie más frecuente en procesos miásicos en Uruguay,

este estudio desacuerda con los autores debido a que, la miasis más

frecuente del área de estudio es Dermatobia hominis (observaciones

personales). En Uruguay, la presencia de Dermatobia hominis es igual de

importante que en el Ecuador (Conti, 2001). Del mismo modo, es importante

recalcar que en el Ecuador, las especies reportadas como obligatorias,

causantes de miasis, en el ganado bovino son C. hominivorax y Dermatobia

hominis; hasta la fecha, no se ha reportado una especie diferente a las

mencionadas.

Según los registros del CIZ, las larvas colectadas de las miasis de los

animales corresponden al tercer estadio de desarrollo de Cochliomyia (datos

no publicados); mismas que presentan un cuerpo liso dividido en 12

segmentos, cada uno cubierto por bandas de espinas de 1 a 3 puntas. En el

borde posterior del segundo segmento, a ambos lados se encuentran los

espiráculos anteriores, los cuales presentan lóbulos o papilas; mientras que,

los espiráculos posteriores no se encuentran en cavidad sino expuestos en el

último segmento (12 segmento), y el peritrema del espiráculo posterior es

incompleto por lo que no rodea completamente a las aberturas respiratorias;

sin embargo, la principal característica que se observó para diferenciar a las

dos especies fueron los troncos traqueales. En este sentido, los resultados

de identificación morfológica del CIZ-UCE (datos no publicados)

determinaron que las larvas, colectadas en miasis de los animales,

corresponden a C. hominivorax; mientras que, las larvas provenientes de

huevos, ovipositados en los tubos de ensayo, pertenecen a C. macellaria.

Este resultado, previamente expresado por el CIZ-UCE, confirma la

39

identificación morfológica de las moscas adultas en este estudio, como se

expresa en la Fig. 9

Figura 9. Larvas y Adultos de C. hominivorax y C. macellaria

(A) Larva de C. hominivorax (B) Larva de C. macellaria (C) Mosca de C. hominivorax (D) Mosca de C. macellaria. Fuente: CIZ (2015)

Algunos autores como Toledo, (2007) y Fonseca, (1999), se basaron en los

caracteres detallados anteriormente en la Figura. 8 para diferenciar a las dos

especies. Sin embargo, Toledo, (2007) señala que se han encontrado

diferencias morfológicas entre ejemplares adultos de distintas poblaciones

del GBG como la variación del color del cuerpo y los ojos, así como

anormalidades en la venación de las alas, lo que es corroborado por el

Servicio de Investigación agrícola del Ministerio de Agricultura de los Estados

Unidos, quienes poseen 6 poblaciones del GBG (moscas adultas)

provenientes de México, Costa Rica y Panamá, las mismas que presentan

diferencias morfológicas.

40

Otro factor importante es que durante mucho tiempo las miasis han sido

tratadas con insecticidas y esto, probablemente, ha llevado a una resistencia

producto de mutaciones, como lo afirma Lachance & Hopkins, (1962)

quienes encontraron 9 mutaciones en la mosca C. hominivorax que

afectaban a la coloración del cuerpo, venación de las alas y otras estaban

ligadas al sexo.

Por los antecedentes mencionados, estas variaciones morfológicas pueden

influir en una correcta identificación; razón por la cual, estudios basados en

análisis de regiones del ADNmt se han venido desarrollando, con el fin de

facilitar un acercamiento para la identificación taxonómica y de relaciones

entre poblaciones estudiadas de C. macellaria y C. hominivorax (Taylor et al,

1996; Litjens et al., 2001; Skoda et al., 2002; Skoda et al., 2012;

Alamalakala et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Toledo, 2007).

Identificación Molecular

La extracción de ADN y la amplificación según los protocolos publicados por

Echeverría et al. (2015), permitieron obtener un ADN en buen estado. La

secuenciación de los productos amplificados de las regiones COI y 12S de

48 ejemplares adultos (96 reacciones) se realizó en Eurofins Genomics.

De las 48 muestras analizadas morfológicamente, realizadas la extracción,

cuantificación (Ver anexo B), amplificación de ADN y enviadas a

secuenciación, solo 33 y 30 muestras presentaron cromatogramas

adecuados para el análisis filogenético para el gen COI y 12S ARNr

respectivamente. Las muestras que presentaron problemas son 15 las cuales

pertenecen a: 6 ejemplares de casos de miasis en caninos, 4 ejemplares de

miasis en bovinos y 2 ejemplares adultos capturados en heridas; del mismo

modo, una muestra colectada en trampa y dos muestras obtenidas en

cadáveres, por lo tanto no fueron incluidas en este análisis. Probablemente,

esto se debe a que presentaban exceso de ruido, es decir problemas en la

41

diferenciación de las bases nitrogenadas posiblemente por errores en el

almacenamiento, extracción, secuenciación y manipulación durante el

procesamiento de la muestra en los laboratorios (Ver anexo C).

Para la identificación molecular de las secuencias, se editaron las

secuencias con ayuda de los cromatogramas en el programa Sequencher 4.2

y fueron introducidos en la herramienta BLAST de Pubmed; los resultados de

este análisis son presentados en el Anexo D.

Análisis Filogenéticos

Las secuencias consenso de los genes citocromo oxidasa subunidad I (COI)

y 12S de las muestras de estudio, como resultado dieron secuencias de una

longitud de 467 pb (COI), 322 pb (12S) y al unir la información de los dos

genes una longitud de 944 pb. Posteriormente, estas secuencias fueron

analizadas mediante el software de alineamiento MacVector en donde se

incluyó secuencias externas desde la base de datos Pubmed (Ver anexo E)

y se realizó un alineamiento mediante ClustalW. Por último, mediante PAUP

se realizó análisis de máxima parsimonia para obtener las relaciones

filogenéticas.

Citocromo Oxidasa subunidad I (COI)

Los análisis de parsimonia máxima de los 56 taxa arrojaron como resultado 9

árboles óptimos, con un valor de longitud (L) de 387.17, Índice de

consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.89.

En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 10, se pueden

observar 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del

genbank, pertenecientes a los grupos externos o de referencia; un segundo

grupo en la parte interna conformado por secuencias de C. macellaria del

genbank asociadas con las secuencias provenientes de muestras de trampas

42

y cadáveres. Este grupo presentó una politomía (nodos no resueltos), con un

valor de apoyo del 100%; sin embargo, las muestras 10C, 36C y 37C se

encuentran muy emparentadas ya que provienen de ejemplares

(originalmente colectados como huevos) en cadáveres; así mismo, las

secuencias 33C, 50C, y 68C se encuentran emparentadas proviniendo de

trampa y cadáveres respectivamente.

Adicionalmente, la secuencia de Compsomyiops fulvicrura obtenida del

genbank, muestra una relación basal y hermana con el grupo de C.

macellaria. Un tercer grupo, conformado por secuencias de C. hominivorax

del genbank con secuencias provenientes de muestras de miasis, presentó

un valor de apoyo del 100%.

43

Figura 10. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI.

-

C. macellaria

Grupo externo

Grupo externo

C. h

om

iniv

ora

x

44

ARN ribosomal (12S)

Los análisis de máxima parsimonia de los 33 taxa utilizadas arrojaron como

resultado 9 árboles igualmente óptimos, con un valor de longitud (L) de 55.1,

Índice de consistencia (IC) de 0.87 e Índice de retención (IR) de 0.80.

En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 11 se observan 3

grupos definidos, un primer grupo conformado por secuencias del genbank,

pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo grupo, en la

parte interna conformado por secuencias de C. macellaria provenientes de

muestras de trampas y cadáveres; este grupo presentó una politomía, la

misma que coincide con la observada en el árbol del gen citocromo oxidasa I

y presenta un valor de apoyo del 100%. Y un tercer grupo conformado por

secuencias provenientes de muestras de miasis con un valor de apoyo del

100%. Por otra parte, la secuencia de Calliphora vomitora, obtenida del

genbank, manifiesta alguna relación con dos de los grupos definidos.

Para este análisis, no se incluyó secuencias del genbank de C. macellaria

porque no hay datos para este gen publicadas y, en el caso C. hominivorax

hay secuencias (FM867729, FM867727, FM867728) que presentan

problemas y se sospecha de una mala identificación ya que en los

alineamientos se muestran muy distintas a las secuencias del estudio.

45

Figura 11. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen 12S.

C. macellaria

C. hominivorax

Grupo externo

46

Genes combinados COI y 12S

Los análisis de máxima parsimonia de los 35 taxa utilizados arrojaron como

resultado 110 árboles igualmente óptimos con un valor de longitud de 577.4,

Índice de consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.92.

En el árbol de consenso de mayoría que se muestra en la Fig.12 se

observan 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del

genbank, pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo

grupo, en la parte interna, conformado por C. hominivorax de secuencias

provenientes de muestras de miasis que manifiestan alguna relación con

Phormia regina del genbank; este grupo tiene un valor de apoyo del 100%. Y

un tercer grupo, conformado por C. macellaria de secuencias provenientes

de muestras de cadáveres y trampas, presentó un valor de apoyo del 100%.

De forma similar a lo obtenido en el árbol del gen COI. La secuencia de

Compsomyiops fulvicrura sigue manifestando relación cercana y basal con el

grupo de C. macellaria

47

Figura 12. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI y 12S.

C. m

ac

ella

ria

C. h

om

iniv

ora

x

Grupo

externo

48

La topología de los árboles filogenéticos obtenidos para los genes COI y 12S

y la combinación de los 2 genes, no revelan mayores cambios en la

agrupación interna. Se puede observar la formación de tres grupos,

correspondientes a las secuencias de C. macellaria, C. hominivorax y

secuencias externas o de referencia; cada grupo tenía un valor de apoyo del

100%, lo que indica que el gen COI y 12S permitieron diferenciar a estas dos

especies, contrario de lo reportado por McDonagh et al., (2009), quien

establece que el gen COI revela un mayor grado de diferenciación que el gen

12S, el que presentó una falta de resolución en los árboles, lo que sugiere

que algunas regiones del ADNmt están experimentando tasas más rápidas

de evolución que otras regiones.

En la distribución interna del grupo de C. macellaria se observa politomías

en los tres árboles, lo que sugiere que las muestras están muy cercanamente

emparentadas; sin embargo, estas relaciones filogenéticas poco resueltas,

indican la necesidad de estudiar más genes del ADNmt que aporten con

más información con fines de estructura poblacional.

En el grupo de C. hominivorax, de alguna manera las muestras de miasis en

el árbol del gen COI se presentan en un solo clado, cercano a las muestras

de C. hominivorax del genbank, pero en una porción génica más conservada

como 12s lo está asociando con grupos más lejanos, lo que nos indica que

las muestras de miasis presentan alguna diferencia con las Cochliomyias

hominivorax del genbank provenientes de varios lugares. Cabe mencionar

que las muestras de miasis en la amplificación presentaron doble banda, por

esta razón se asume la diferencia entre las C. hominivorax de miasis con las

del genbank; sin embargo, no se descarta que el ambiente en el que se

desenvuelven cada uno de estos grupos son diferentes y esto ha ocasionado

diferencias genéticas que han dado a lugar a la divergencia evolutiva, como

lo menciona Fresia et al., (2011), quienes señalan que existe variabilidad

genética en las poblaciones de C. hominivorax, de la región del caribe y en

Sudamérica (Norte y sur de la Amazonia), por lo que las considera

49

poblaciones independientes; por consiguiente, algunos autores como

Roerhdanz (1989) y Taylor et al. (1996) señalan que las poblaciones de C.

hominivorax del Norte y Centro América, en relación con las poblaciones de

América del Sur, presentan un cierto grado de diferenciación.

Por lo anteriormente expuesto, Lyra et al., (2009) establecen que en la

especie C. hominivorax el aislamiento geográfico puede ser la principal

causa de la gran diferenciación poblacional. Por esta razón, es importante

conocer las diferencias poblacionales de la especie C. hominivorax; mismas

que representan un aspecto importante para el diseño de futuros programas

basados en la TIE en las diferentes regiones. Del mismo modo, el requisito

indispensable para la eficiencia del programa de erradicación del GBG es la

correcta identificación de las especies en los sitios muestreados. La falta de

este requisito podría ocasionar un serio error en la liberación de moscas

estériles innecesarias, lo cual representaría un alto costo para el programa

de control y erradicación de una región. Por otro lado, para declarar una zona

libre, una zona infestada o una zona re infestada de GBG, dependerá de la

correcta identificación de C. hominivorax.

Finalmente, la identificación morfológica de los ejemplares concuerda con los

resultados obtenidos en los árboles filogenéticos; las muestras procedentes

de miasis fueron identificadas morfológicamente como C. hominivorax y las

muestras provenientes de cadáveres, trampas y de moscas posándose en

heridas fueron identificadas como C. macellaria; esto concuerda con los

datos obtenidos en los tres árboles, en los que se observan dos grupos

claramente definidos, uno correspondiente a C. macellaria donde están las

muestras de trampas, cadáveres y moscas capturadas en animales vivos y,

el otro grupo corresponde a C. hominivorax donde están las muestras de

miasis.

50

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones

En base a las características morfológicas de las claves dicotómicas, y

los datos de origen de colecta de los ejemplares, se identificaron dos

especies de Cochliomyia; C. hominivorax presente en el 33.33%

(16/48) de muestras colectadas de casos de miasis, y C. macellaria

presente en el 66,67% (32/48) de muestras colectadas de trampas,

cadáveres y adultos capturados en animales vivos.

La información aportada por el gen mitocondrial Citocromo oxidasa

subunidad I (COI) y el gen ribosomal (12S) del ADN mitocondrial

permitió diferenciar a dos grupos de especies del género Cochliomyia,

provenientes de distintos orígenes de muestreo y localidades, debido

a su alta conservación y variabilidad.

51

Recomendaciones

Utilizar marcadores con evidencia de mayor variabilidad como el COI

subunidad II, el 28S, que permita resolver las politomías de los

árboles.

Realizar la identificación morfológica de la genitalia de los machos

como una característica adicional para diferenciar las especies de

Cochliomyia.

Reestructurar las claves morfológicas para larvas y moscas del

Género Cochliomyia.

Subir la información de las secuencias obtenidas del gen COI y 12S al

genbank con la finalidad de aportar información para otros estudios y

contribuir a incrementar la información del genoma de cada una de las

especies de Cochliomyia.

Plantear un estudio similar, pero con un número muestral mayor, de

diferentes localidades, para verificar la variabilidad genética de C.

hominivorax a nivel nacional, con la finalidad de implementar un

programa de control basado en la mosca estéril.

52

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65

Anexos

Anexo A: Claves dicotómicas

Clave de identificación de las larvas en las especies de Cochliomyia (FAO,1993)

1. Larva pequeña (1,2-3,6 mm); estigmas posteriores (Fig. 15) con dos orificios

pequeños, más o menos ovales, que con frecuencia se unen en el borde

ventral interno en forma de V; peritrema no manifiesto; sin estigmas

anteriores. Larva de la primera etapa, 2

- Larva más grande ( > 3,5 mm); estigmas posteriores (Fig. 1 5) con dos o tres

hendiduras diferenciales, no unidas, rodeadas en parte por un peritreina;

estigmas anteriores presentes, uno a cada lado del borde posterior del

segundo segmento. Larva de la segunda o la tercera etapa, 3

2. Esqueleto cefalofáringeo no robusto, con un esclerito dorsofaríngeo

pequeño; espinas más largas de unas 20,a de longitud, y en general con una

Pigmentación intensa (Figs. 6, 7a) hominivorax

- Esqueleto cefalofaríngeo más robusto, con un esclerito dorsofaríngeo

prominente; espinas más largas de unas 6 µ de longitud, y en general poco

pigmentados (Fig. 7b) macellaria

3. Estigmas posteriores con dos hendiduras (Fig. 15). Larva de la segunda

etapa, 4

- Estigma posteriores con tres hendiduras (Fig. 15). Larva de la tercera

etapa, 5

4. Troncos traqueales dorsales que salen de los estigmas posteriores con una

pigmentación oscura desde la unión con los estigmas hacia adelante hasta

66

llegar a un punto entre la mitad y los dos tercios del último segmento;

espinas más largas de unas 55µ de longitud; estigmas anteriores

normalmente con 7-9 ramas; margen posterior del segmento 11 con una

banda de espinas formando un círculo completo, y margen posterior del

segmento 10 con espinas en las superficies lateral y ventral solamente (Figs.

8, 9a, 10a). hominivorax

- Troncos traqueales dorsales no tan pigmentados; espinas más largas de

unas 20µ de longitud; estigmas anteriores normalmente con 9-11 ramas;

margen posterior de los segmentos sin espinas, excepto en las superficies

venérales (Figs. 9b, 10b). macellaria

5. Troncos traqueales dorsales que salen de los estigmas posteriores con una

pigmentación oscura desde la unión con los estigmas hacia adelante hasta el

segmento 10 o el 9; espinas comparativamente grandes (las más largas de

130µ de longitud), con 1 a 3 puntas, normalmente 1 ó 2; cuando las espinas

tienen dos puntas, están próximas entre sí y tienen los extremos más

puntiagudos; estigmas anteriores con 6-11 (normalmente 7-9) ramas (Figs.

11, 12a,13a). hominivorax

- Troncos traqueales dorsales sólo pigmentados en el punto de unión con los

estigmas posteriores, en la cuarta parte de atrás del último segmento;

espinas comparativamente pequeñas (las más largas de 80,u de longitud),

con 1-4 dientes, normalmente 2; cuando Lu espinas tienen 2 dientes, están

bastante separados entre sí y tienen el extremo redondeado; estigmas

anteriores con 8-12 (normalmente 9-1 1) ramas (Figs. 12b, 13b). macellaria

67

Clave de identificación de los adultos de las especies de Cochliomyia (FAO,1993)

1. Parte anterior superior de las genas con pocas o numerosas sedas negras

cortas; quinto tergo de color cobrizo, al contrario de los anteriores; líneas

torácicas prolongadas sobre el scutellum (Figs. 17, 18). 2

Genas con sedas totalmente amarillas; quinto tergo del mismo color que los

anteriores; líneas torácicas no prolongadas sobre el scutellum (Figs. 17,18). 3

2. Quinto tergo de coloración uniforme; parafaciales de coloración amarilla;

occipucio solo con pelos de color claro; machos con un par de sedas orbitales

inclinadas hacia adelante al nivel del ocelo anterior (Figs. 17, 18). mínima

Quinto tergo con un par de manchas dorsales plateadas; parafaciales de color

plateado; occipucio con pocas o numerosas sedas encima; macho sin sedas

orbitales (Figs. 17, 18). aldrichi

3. Placas fronto-orbitales con sedas negras; sedas postgenales (barba) de color

amarillo dorado; quinto tergo (= cuarto visible) sólo con una coloración lateral

muy ligera; basicosta de la hembra de color entre pardo oscuro y casi negro; en

las hembras, región postvértex del occipucio normalmente de color entre

anaranjado rojizo y pardo; línea oscura central del tórax prolongada sólo hasta

ligeramente por delante de la sutura mesonotal (Figs. 17,18). hominivorax

Placas fronto-orbitales con pelos de color claro (pero las inserciones aparecen

con puntos negros); sedas postgenales (barba) amarillas, no de color amarillo

dorado; quinto tergo (= cuarto visible) con una coloración blanca densa y un par

de manchas plateadas laterales diferenciadas; basocosta de la hembra de color

amarillos en la hembra; línea oscura central del tórax prolongada hasta muy por

delante de la sutura mesonotal (Figs. 17, 18). macellaria

68

Figura 6. Vista lateral de una larva de la primera etapa de Cochliomyia hominivorax

(según Laake et al., 1936).

Figura 7. Esqueleto cefalofaríngeo de la larvas de la primera etapa de Cochliomyia:

a C.hominivorax; b - C. macellayia (según Laake et aL, 1936); (d, esclerito

dorsofaríngeo).

Figura 8. Vista lateral de una larva de la segunda etapa de Cochliomyia

hominivorax

(según Laake et al., 1936)

Figura 9. Esqueleto cefalofaríngeo de larva de la segunda etapa de Cochliomyia: a

- C.hominivorax; b - C. macellaria (según Laake et aL,,1936).

69

Figura 10. Aspecto dorsal de los segmentos posteriores de las larvas de la segunda

etapa de Cochlíomyia: a - C. hominivorax, mostrando la pigmentación de los troncos

traqueales dorsales a través de la cutícula de un ejemplar conservado en alcohol; b

- C. macellaria, mostrando la ausencia de dicha pigmentación.

Figura 11. Vista lateral de una larva de la tercera etapa de Cochliomyia hominivorax

(a, estigmas anteriores; 1, zona fusiforme lateral; m, gancho oral; s, espinas; 1-12,

segmentos). (Según Laake et al., 1936).

Figura 12. Esqueleto cefalofaríngeo de larvas de la tercera etapa de Cochliomyia: a

- C. hominivorax; b – C. macellaria (según Laake et al., 1936).

70

Figura 13. Aspecto dorsal de los segmentos posteriores de las larvas de la tercera

etapa de Cochliomya: a - C. hominivorax, mostrando los troncos traqueales dorsales

con una pigmentación oscura visible a través de la cutícula (puede ser necesaria la

disección de larvas conservadas para separar el tejido graso opaco); b C.

macellaria, mostrando la pigmentación sólo en el punto de unión de los troncos

traqueales con los estigmas posteriores (según Laakee et al., 1936).

Figura 17. Vista lateral y frontal de la cabeza de una mosca calif6rida típica (f, placa

frontoorbital; g, gena; oc, ocelo; op, occipucio; pg, postgena; pf, parafacial; v,

vértex).

Figura 18. Detalles de un adulto de Cohliomyia: a - adulto de C. hominivorax y

detalle de la base del ala (b, basicosta; m, sutura mesonotal; s, scutellum); b - adulto

de C. macellaria, mostrando las franjas torácicas (según Laake et al., 1936 y

Spradbery, 1991).

71

Anexo B: Cuantificación del ADN

25 47C 144,7

26 48C 128,7

27 49C 126,6

28 50C 153,9

29 51C 194,9

30 52C 213,4

31 54C 175,3

32 55C 174,2

33 56C 202,9

34 57C 199,5

35 58C 201,2

36 59C 156,2

37 60C 164,3

38 61C 167

39 62C 131,6

40 63C 120,1

41 64C 138

42 65C 147,5

43 66C 150,5

44 67C 155,5

45 68C 155,7

46 69C 151,2

47 70C 183,1

48 100C 158

N° Código Concentración

ng/ul

1 1C 204,5

2 2C 162,8

3 3C 156

4 4C 120,7

5 5C 141,9

6 6C 184,8

7 7C 240,1

8 8C 217,7

9 9C 140,3

10 10C 100,5

11 31C 154

12 32C 190,9

13 33C 223,7

14 34C 162,9

15 35C 218,7

16 36C 160,2

17 37C 169,1

18 38C 131,6

19 39C 144

20 40C 125,8

21 41C 186,7

22 42C 188,8

23 45C 187,9

24 46C 207,5

72

Anexo C: Listado de las muestras utilizadas para realizar los árboles

filogenéticos

N° Código Procedencia Dato de

Captura

Secuenciación

COI 12S


Bancos

Animal

Vivo- oreja SNU SNU


Bancos Animal Vivo SNU SNU

3 3C Saloya Animal Vivo SNU SNU

4 4C Quito(Valles) Animal Vivo SNU SNU

5 5C Quito(Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU


Bancos Trampa SU SU


Bancos Trampa SU SNU


Bancos Trampa SU SU


Bancos

Cadáver

lab. SU SU


Bancos

Cadáver

lab. SU SU

11 31C Quito (Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU

12 32C Quito (Tumbaco) Animal Vivo SNU SNU


Bancos Trampa SU SU


Bancos Trampa SNU SNU


Bancos Trampa SU SU

16 36C San Miguel de los Cadáver

SU SU

73

Bancos lab.


Bancos

Cadáver

lab. SU SU


Bancos

Cadáver

lab. SU SU


Bancos

Cadáver

lab. SU SU


Bancos

Cadáver

lab. SU SU


Bancos

Cadáver-

armadillo SU SU


Bancos

Cadáver-

armadillo SU SU


Bancos Trampa SU SU

24 46C Saloya Animal Vivo SNU SNU

25 47C Saloya Animal Vivo SU SU




Bancos Cadáver SU SU

29 51C Saloya Trampa SU SU


Bancos Cadáver SNU SNU


Bancos Cadáver SU SNU




Bancos Cadáver SU SNU

34 57C Saloya Cadáver SU SU

74

SNU, secuencia no utilizada; SU, secuencia utilizada





Bancos

Animal

Vivo- oreja SU SU


Bancos Animal Vivo SNU SNU


Bancos Animal Vivo SU SU



43 66C Quito (Valles) Animal Vivo SNU SNU

44 67C Quito (Valles) Animal Vivo SNU SNU





48 100C Guayaquil/Guayas Animal Vivo SNU SNU

75

Anexo D: Identificación de secuencias de COI y 12S ARNr mediante BLAST.

BLASTn COI BLASTn 12S

Código de muestra

AC Secuencia Identidad (%) AC Secuencia Identidad (%)

6C JQ246666 C. macellaria mitocondrial cox I

98% FM867739

C. hominivorax 12S rRNA

99%

HM639978 Paralucilia paraensis mitocondrial cox I

94% FM867741

C.hominivorax 12S rRNA

99%

AF295549 Compsomyiops callipes mitocondrial cox I

93% FJ025369

Compsomyiops fulvicrura 12S rRNA

98%

7C KC602452 C. macellaria mitocondrial cox I

99% - - -


95% - - -

HM185549 C. hominivorax haplotype COI 56 94% - - -

8C KC602453 C. macellaria haplotype COI 99% FM867739


99%


95% FM866404


99%


93% FJ025366

Chrysomya megacephala 12S

rRNA

98 %

9C, 10C,36C,37C,38C,39C,40

C

KC617815 C. macellaria mitocondrial cox I 96% FM866404


95%


92% FM867741


95%


91% FM867738


95%

33C KC617815 C. macellaria mitocondrial cox I 99% FM867741


99%


94% FM867739


98%


92% GQ409060

Chrysomya rufifacies 12S

rRNA

97%



99%


94% FM867734


99%


93% FJ025366


rRNA

98 %



99%


93% FM866404


99%


92% FJ025365

Calliphora vomitoria 12S

rRNA

97%


96% FM867739


99%


93% FM867734


99%


92% FJ025366


rRNA

98 %

47C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 88% FM867739


99%

KC602448 C. hominivorax haplotype COI 90 88% FM867740


99%

HM185565 C. hominivorax haplotype COI 74 87% FJ025369

Compsomyiops fulvicrura 12S

rRNA

98 %

76

48C,49C HM185513 C. hominivorax haplotype COI 16 89% FM867741


100%


89% FM867738


100%

JN571556 Chrysomya megacephala COI

88% FM867739


99%



97%


95% FM867739


97%


94% FJ025366


rRNA

95 %


96% FM867739


99%


93% FM867740


99%


92% FJ025369


rRNA

98 %


99% No amplific

o


95% No amplific

o


94% No amplific

o


99% FM867709


95%


95% FM867718


95%


94% FJ025369


rRNA

92 %


96% No amplific

o


93% No amplific

o


91% No amplific

o


99% FM867739


99%


96% FM867740


99%


95% FJ025369


rRNA

96 %


99% FM867739


99%


96% FM866404


99%


94% FJ025366


rRNA

98 %


99% FM867739


99%


96% FM867741


99%


94% FJ025369


rRNA

96 %

60C JQ246666 C. macellaria mitocondrial 97% FM8677 C. hominivorax 99%

77

cox I 39 12S rRNA


94% FM866404


99%


92% FJ025366


rRNA

98 %



99%


97% FM867741


99%



rRNA

98 %

63 C HM185533 C. hominivorax haplotype COI 40 91% FM867739


99%


91% FM866404


99%



rRNA

98 %



99%


90% FM866404


99%



rRNA

98 %



99%


91% FM867741


99%

KC602448 C. hominivorax haplotype COI 90 90% FJ025369


rRNA

98 %


98% FM867739


98%


94% FM867741


98%


93% GQ409060

Chrysomya rufifacies 12S

rRNA

97%


97% FM867739


99%


94% FM867741


99%


93% FJ025366


rRNA

98 %


97% FM867734


99%


94% FM867739


99%


93% FJ025369


rRNA

98% %

78

Anexo E: Secuencias externas tomadas de NCBI utilizadas en filogenia.

Calliphoridae Origen Número de acceso a NCBI

COI 12S

Chrysomya rufifacies - DQ647357 GQ409060

Chrysomya albiceps - HE814061 -

Chrysomya bezziana - JQ246660 -

Paralucilia pseudolyrcea - HM639978 -

Phormia Regina - KF908078 AF262957

Protophormia terranovae - KF919047 -

Lucilia sericata - JX295738 -

Hemypirellia fergusoni - DQ647329 -

Calliphora vomitora - KF919010 FJ025365

Hemilucilia segmentaria - JQ246667 -

Compsomyios fulvicrura - FJ025607 FJ025369

Cochliomyia hominivorax Colimes HM185551 -

Cochliomyia hominivorax Atacames HM185569 -

Cochliomyia hominivorax Venezuela - Colombia HM185515 -

Cochliomyia hominivorax Brasil- Paraguay- Uruguay HM185564 -

Cochliomyia hominivorax Chone HM185499 -

Cochliomyia hominivorax Guayas - FM867728

Cochliomyia hominivorax Esmeraldas - FM867727

Cochliomyia macellaria - KC602452


Cochliomyia macellaria Colombia KC568262

Cochliomyia macellaria Colombia KC568263


Cochliomyia macellaria - JQ246666


Cochliomyia macellaria - -

“identificaciÓn morfolÓgica y molecular de … · identificación y cultivo de larvas ..... 24...

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