Cultivo de Protoplastos

Cultivo de Protoplastos 2014

UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA

Facultad de Ciencias

Departamento de Biologa

Curso:

CULTIVOS DE CLULAS

Y TEJIDOS VEGETALES

Tema:

Cultivo de Protoplastos: Aislamiento, cultivo e importancia en el mejoramiento vegetal.

Profesora:

Dra. Antonietta Gutirrez Rosati

-8 de mayo del 2014-TABLA DE CONTENIDO10I.GLOSARIO

10II.INTRODUCCIN

11III.DEFINICIN

12IV.CARACTERSTICAS DE LOS PROTOPLASTOS

12V.AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

121.Mtodo Mecnico

132.Mtodo enzimtico

19VI.PURIFICACIN DE LOS PROTOPLASTOS

191.Remocin de debris y enzimas

192.La eliminacin de protoplastos rotos

193.Pruebas de viabilidad de protoplastos y de la formacin de pared

194.Viabilidad de protoplastos

20VII.TCNICAS DE CULTIVO PARA PROTOPLASTOS AISLADOS

201.Medio de cultivo

202.Reguladores

213.Fuentes carbonadas.

214.Sistemas experimentales para el cultivo de protoplastos aislados

215.Densidad de protoplastos y crecimiento del protoplasto en el medio de cultivo

226.Avances innovativos para los cultivos de protoplastos.

22Estimulacion elctrica de los protoplastos

22Suplementacin del medio de cultivo con surfactantes, antibiticos y poliamidas

23VIII.TRANSFORMACIN GENTICA CON PROTOPLASTOS

231.Transformacin mediada por Agrobacterium

232.Transformacin por medio qumico policatinico

243.Transformacin por medio-electroporacin

244.Sonificacin, liposoma, micro-inyeccin, optoporacin, y transformacin por medio-laser

25IX.APLICACIN DE LA FUSIN DE PROTOPLASTOS

29X.AVANCES EN LA INVESTIGACIN DE PROTOPLASTOS DE PLANTAS

291.Racionalizacin de la regeneracin

322.Avances en la fusin y fragmentacin de protoplastos

323.Caracterizacin de hbridos somticos

32Constitucin cromosmica y establidad

32Cribado de genoma, citoplasmoma, transcriptoma y proteoma

324.Valorizacin agrcola

33XI.BIBLIOGRAFA

I. GLOSARIO

Protoplasto: Componentes vivos de las clulas vegetales que estn rodeados slo por la membrana plasmtica, constituyen las clulas desnudas de una planta. Suspensiones celulares: clulas libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Clulas del mesfilo: son clulas de parnquima, entre la epidermis del haz y el envs, que poseen una gran cantidad de cloroplastos, relativamente desorganizados y con muchos espacios de aire entre las clulas, lo cual facilita el intercambio de gases.

Nurse cells: clulas que ayudan a estimular al crecimiento a protoplastos aislados de inters. Estos pueden ser de la misma o de diferente especie Protoplast-to-plant systems: Sistema para el establecimiento del cultivo e induccin de la regeneracin de la planta a partir de protoplastos aislados.

Poligalacturonasa: Enzima hidrolasa, endo o exoglucanasa, que inicia el corte hidroltico por el extremo no reductor del polmero de pectina.

Pectina: Conjunto complejo de polmeros ramificados del tipo de los carbohidratos. La pectina no solo est presente en la pared celular primaria, sino tambin en la lmina media entre las clulas de la planta, donde ayuda a las clulas a mantenerse juntas.

Debris: Clulas no digeridas durante el proceso de aislamiento de protoplastos o protoplastos rotos. Material de desecho durante la purificacin.

Osmoticum: Estabilizador o regulador osmtico del medio.

Lymphoprep: Medio de gradiente de densidad recomendado para el aislamiento de clulas mononucleares mediante la explotacin de las diferencias en la densidad celular.II. INTRODUCCINUna diferencia fundamental entre las clulas de plantas y animales es la presencia de una pared celular en plantas. Esta, a pesar de jugar un papel clave en los procesos relacionados con la estructura y funcin de la planta, es un obstculo importante en la explotacin de la transferencia directa de ADN a las clulas individuales y la produccin de hbridos somticos por fusin celular (Compton et al., 2000); es decir, la pared celular constituye un serio impedimento en los programas de mejoramiento de cultivos a travs de la hibridacin (Tomar and Dantu, 2008).

Afortunadamente, la pared celular se puede retirar temporalmente de clulas de la planta sin una prdida significativa de viabilidad. Las clulas vegetales a las cuales se les ha quitado la pared celular son llamadas protoplastos. Los protoplastos son algo nico en cultivo de clulas vegetales ya que existen como clulas separadas y sin continuidad citoplasmtica con las clulas vecinas (Compton et al., 2000).

Los protoplastos de planta primero se aislaron por Klercker en 1892 por corte de las escalas de bulbo de cebolla con un cuchillo fino en una solucin plasmolyzing, lo que result en la liberacin de protoplastos cuando las clulas fueron cortadas a travs de la pared (Bhojwani y Razdan, 1983). El rendimiento de protoplastos fue bajo y el procedimiento se limitaba a clulas muy vacuoladas, clulas no-meristemticas. El aislamiento de protoplastos se hizo ms ampliamente practicado en la dcada de 1960 con la extraccin y purificacin de las enzimas que podran ser utilizadas para degradar la pared celular de la planta. Cocking (1960) descubri que los protoplastos intactos fcilmente podran ser obtenidos mediante la incubacin de los tejidos vegetales en una solucin concentrada de celulasa preparada a partir del hongo Myrothecium verruatria (Compton et al., 2000).

El aislamiento de protoplastos es ahora de rutina en una amplia gama de especies; los protoplastos viables son potencialmente totipotentes. Por lo tanto, cuando se les da los estmulos qumicos y fsicos correctos, cada uno es capaz, tericamente, de la regeneracin de una nueva pared y de someterse a la divisin mittica para producir clulas hijas de la que las plantas frtiles se pueden regenerar mediante el proceso de cultivo de tejidos (Davey et al., 2004). No slo los protoplastos aislados, pero su producto de fusin, un hbrido somtico, tambin se pueden regenerar en plantas enteras. Asimismo pueden captar ADN extranjero, a travs de su membrana plasmtica desnuda, bajo tratamientos especficos. Proporcionan adems un sistema experimental para una amplia gama de estudios bioqumicos y moleculares que van desde las investigaciones en las propiedades de crecimiento de las clulas individuales hasta el transporte de membrana (Tomar and Dantu, 2008). Sistemas de protoplastos-a-planta (Protoplast-to-plant systems) estn disponibles para muchas especies con una extensa literatura; sin embargo, los procedimientos bsicos para su aislamiento han sufrido pocos cambios desde la primera vez que fueron reportados (Davey et al., 2004). Es as que la presente monografa tiene como objetivo general revisar los aspectos clave acerca del cultivo de protoplastos, incluyendo desde su definicin, aislamiento, purificacin, cultivo, hasta sus aplicaciones en el mejoramiento gentico vegetal. Se mantendr una visin global del tema, de manera que pueda ser til para diversos tipos de plantas; aunque tambin se expondrn casos especficos de inters que servirn para ilustrar el uso de protoplastos actualmente.III. DEFINICINLos protoplastos son clulas de plantas, hongos o bacterias en las que la pared celular se ha eliminado, pero la membrana plasmtica est intacta. Sin embargo, esta revisin de literatura se centrar especficamente en los protoplastos de origen vegetal.El protoplasto vegetal aislado es una sola clula, limitada por el plasmalema y, cuando recin se forma, contiene todos los componentes de las clulas normales, a pesar de ser separado completamente de su pared celular. Desde un punto de vista fisiolgico, sin embargo, los protoplastos no pueden considerarse simplemente como una clula que carece de pared, ya que la mecnica del aislamiento, junto con factores ambientales, sin duda influyen en su metabolismo y suscitan cambios ultraestructurales sutiles. La ausencia de una pared celular funcional puede afectar a la permeabilidad de la membrana celular y dar lugar a una fuga general de solutos del protoplasto. El protoplasma es tambin en un estado transitorio ya que la mayora de protoplastos, independientemente de su entorno inmediato, iniciar la sntesis de una nueva pared celular algunas horas despus de la liberacin, y, finalmente, volver a ser una clula con pared (Smith H. 1978).

Debido a la ausencia de la pared celular, los protoplastos son adecuados para diversas y diferentes manipulaciones genticas que no seran posibles con plantas o clulas intactas. Los protoplastos sirven adems como herramientas experimentales nicas para muchas investigaciones fisiolgicas, biofsicas y bioqumicas (Szabados, L. 1991).IV. CARACTERSTICAS DE LOS PROTOPLASTOSLas caractersticas especficas de los protoplastos dependen de su origen de extraccin, ya sea la especie o clula especializada; y el resultado obtenido despus de ser cultivado, del mtodo usado. En muchos casos (Eeckhaut et al, 2013), de acuerdo a la especie, se controla el tipo de resultado para un fin especial como regeneracin, mejoramiento de plantas, etc. En el siguiente cuadro se mencionan algunas caractersticas que se deben tomar en consideracin para el propsito del estudio a realizar.PROTOPLASTOCARACTERSTICA

MesfiloContienen cloroplastos verdes y en luz muestran actividad fotosinttica

Suspensiones celularesContienen granos de almidnSe pueden usar para aislamiento de ncleos celulares, as como cromosomas mitticos y meiticos.

Aleurona de semillas de avenaSecretan amilasa y RNAsa en presencia de cido giberlico

Ndulos de races de leguminosasPueden reducir el acetileno

LibresEl choque osmtico ocasiona cambios en el patrn de RNA y sntesis de protenas (protenas de choque osmtico).

Facilidad de aislar y purificar orgnulos.

Fuente: Protoplastos. Aislamiento, cultivo y regeneracin de plantas (Szabados, L. 1991)V. AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

Antes de entrar en los detalles sobre el cultivo de protoplastos, es importante aislar lo ms suavemente y ms rpidamente posible los protoplastos viables y no lesionados. Los dos mtodos para el aislamiento de protoplastos son: mtodo mecnico y mtodo enzimtico.

1. Mtodo Mecnico

El mtodo mecnico tiene, ante todo, un inters histrico, ya que su rendimiento es bajo, su procedimiento tedioso y su aplicabilidad limitada (Szabados, L. 1991). Klercker (1982) fue el primero en aislar protoplastos a partir de tejidos de bulbos de cebolla. Las capas fueron sumergidas en sacarosa al 1.0 M hasta que el protoplasto se contraiga de su pared celular, y luego el tejido plasmolisado fue cortado con un cuchillo afilado tan delgado que solamente las paredes celulares sean cortadas sin daar los protoplastos. Estos finalmente son liberados mediante el restablecimiento de su nivel osmtico cuando se colocan en una solucin hipotnica (baja concentracin de sacarosa) (Tomar and Dantu, 2008).Figura 1 Tejido cortado en la lnea punteada (A), algunas clulas liberan protoplastos completos y el resto de clulas producen protoplastos rotos muertos como se muestra en (B) marcado con asteriscos.

2. Mtodo enzimticoEste mtodo implica el uso de enzimas para disolver la pared celular para la liberacin de protoplastos. Se llevaron a cabo estudios iniciales sobre el aislamiento de protoplastos de clulas de levadura mediante la digestin de la pared celular utilizando los jugos gstricos obtenidos del caracol, Halix poneatia. Sin embargo, el crdito de desarrollo de la tcnica de aislamiento de protoplastos de alto rendimiento a partir de protoplastos de plantas superiores es de Cocking (1960). Se emple una preparacin cruda de celulasa a partir del hongo Myrotheaum verrucaria para disolver la pared celular y liberar los protoplastos a partir de races de tomate. Despus este mtodo con las modificaciones adecuadas y utilizando enzimas purificadas ha sido utilizado ampliamente por otro grupo de trabajadores (Tomar and Dantu, 2008). Los principales factores que se deben considerar para el xito de este mtodo son:

El tipo de enzimas que se usarn

La composicin del medio en que ellas actuarn

Material de origen de los protoplastos.

Enzimas para el aislamiento de protoplastos

Hay dos enfoques bsicos para el aislamiento enzimtico de protoplastos: (a) el tratamiento de un tejido vegetal con una mezcla de pectinasa y celulasa as al mismo tiempo se separan las clulas y degradan sus paredes (Potencia y Cocking, 1970); y (b) el mtodo secuencial (en dos pasos) que implica la produccin de clulas aisladas, a partir del callo o tejido mediante el uso de pectinasa (Tomar and Dantu, 2008), las cuales a su vez se convierten en protoplastos por un tratamiento con celulasa que digiere la pared celular (Nagata y Takebe, 1970; citado por Smith, 1978).

Las enzimas utilizadas para el aislamiento de protoplastos son extractos crudos de origen fngico. Las pectinasas son ricas en actividad poligalacturonidasa mientras que las celulasas contienen hemicelulosa, -1,4- glucanasa, quitinasa, lipasa, nucleasas y pectinasa (Smith, 1978). Para utilizar las preparaciones enzimticas comerciales (Tabla 1) en algunos tejidos, se aconseja eliminar las sales que contienen; esto se puede hacer filtrndolas con una columna de Biogel o de Sephadex G25 o G50 (Szabados, L. 1991). Tabla 1 Enzimas que se utilizan para el aislamiento de protoplastos (Fuente: Szabados, L. 1991)

El medio de incubacin

Dado que la eliminacin de la pared celular resulta en la prdida de presin de la clula, los protoplastos son aislados y mantenidos en un medio hipertnico plasmoltico proporcionado por una sal inorgnica equilibrada o una solucin de azcar monosacrido (Smith, 1978).

As, el material de incubacin que se utiliza para el aislamiento de protoplastos consta de los siguientes elementos: enzimas disueltas en una solucin que contenga algunas sales (como CaCl3, KH2PO4, MgCl2), un medio de cultivo, un amortiguador (solucin tampn), y un estabilizador o regulador osmtico. El calcio (1 a 10mM) es un ingrediente esencial y el ion fosfato (0.5 a 2.0 mM) es benfico para conservar la viabilidad de los protoplastos.

A menudo la solucin contiene como amortiguadores (buffer) fosfato o MES [cido 2(N-morfolino)-etanosulfnico] a una concentracin de 3 mM. Los estabilizadores osmticos ms comunes son el manitol, el sorbitol, la glucosa y la sacarosa (Szabados, L. 1991). El manitol, por ejemplo, no es transportado fcilmente a travs de la membrana plasmtica y, por tanto, proporciona un entorno osmtico estable para los protoplastos (Smith, 1978). Generalmente, el potencial osmtico se ajusta de tal manera que las clulas sean levemente plasmolizadas durante la digestin de la pared. La osmolaridad ptima vara de 0.3 a 0.7 M. Un pH cido en el rango de 5.0-6.0 es el ptimo.a) Fuentes para la obtencin de protoplastos

En teora, es posible aislar protoplastos de cualquier tipo de planta, rgano o tejido, pero las fuentes que se usan corrientemente son mesfilo foliar y tejidos cultivados in vitro como clulas en suspensin, callos, y pices de plntulas generadas in vitro (Figura 2) (Ruesink, 1980; Vasil et al., 1980; extrado de Szabados, L. 1991). Se utilizan en la fase de crecimiento, ya que la composicin de la pared celular primaria vara a productos secundarios, tales como lignina, mientras ms maduro es el cultivo; hacindolo menos susceptible a la degradacin completa de celulasa (Smith, 1978).

El mesfilo como fuente de protoplastos. El estado fisiolgico del tejido foliar influye sustancialmente en el rendimiento y viabilidad de los protoplastos. Para liberar protoplastos de buena calidad, las plantas se deben cultivar en condiciones controladas (invernadero, cmara de crecimiento), donde se puedan optimizar la luz, la temperatura, la fertilidad del suelo y la humedad. Usualmente se utiliza una luz de 10,000 a 30,000 lux y un fotoperiodo de 18 16 h. Es esencial contar con un buen suministro de agua y con fertilizacin regular (Szabados, L. 1991).

Algunas veces los protoplastos aislados resultan ms estables si las plantas se conservan previamente en la oscuridad durante algunos das. En ciertos casos, para mejorar la viabilidad de los protoplastos aislados, es aconsejable el pretratamiento del tejido foliar en un medio con hormonas de crecimiento, en diferentes condiciones de luz y temperatura (Szabados, L. 1991).

Las suspensiones celulares como fuente de protoplastos. Debido a que las suspensiones son heterogneas y a menudo estn compuestas de agregados de diferentes tamaos y de clulas libres, no todas las clulas estn en condiciones ptimas para la liberacin de protoplastos; la liberacin en este caso depende tambin de las condiciones de crecimiento de las clulas cultivadas.

Se ha encontrado que cuando se cultivan protoplastos derivados de suspensiones, el xito depende claramente de la calidad de la suspensin celular que se ha utilizado. Los protoplastos de suspensiones celulares que estn en crecimiento logartmico comienzan a dividirse muy rpidamente, mientras que los derivados de suspensiones ms viejas por ejemplo, en la fase de expansin celular regeneran la pared celular y se dividen con menor frecuencia (Potrykus et al., 1979b; Tewes et al., 1984).

Los protoplastos se deberan aislar de agregados de clulas de tipo meristmico; en estas clulas en activa divisin, el rendimiento puede elevarse a casi el 100% mediante la manipulacin del perodo de subcultivo y de la tasa de dilucin. Antes del aislamiento de los protoplastos la suspensin celular debera subcultivarse con una frecuencia de 1 a 4 das (Potrykus et al., 1979b, citado por Szabados, L. 1991). Por ejemplo en el centeno, Ma et al. (2003) utiliz un callo de crecimiento rpido, disgregable iniciado a partir de inflorescencias inmaduras para establecer suspensiones de clulas embriognicas como una fuente de protoplastos totipotentes. De manera similar, en otras monocotiledneas tales como pltano, suspensiones de clulas fueron el material fuente preferida debido a su totipotencia, ya que los de la hoja de mesfilo y callos eran recalcitrantes en cultivo (Davey et al., 2004). Por otra parte, tambin se ha encontrado que los protoplastos de las gramneas son extremadamente recalcitrantes al cultivo; con la nica excepcin de los protoplastos provenientes de tallos de maz (Potrykus et al., 1977), no se han podido cultivar exitosamente protoplastos de cereales aislados de plantas enteras. Los resultados negativos de numerosos experimentos han llevado a la conclusin de que las clulas diferenciadas de los cereales deben haber perdido el potencial de divisin y la totipotencialidad (Potrykus, 1980); en cambio, los protoplastos aislados de suspensiones celulares embriognicas se han cultivado con xito (Szabados, L. 1991); especialmente en el caso del arroz (Tang et al., 2001; citado por Davey et al., 2004).Tras el informe de que las clulas guardianas son una fuente nica de protoplastos totipotentes en la remolacha azucarera (Hall et al., 1996), otros investigadores han realizado experimentos. Por ejemplo, Pandey et al. (2002) informaron de los procedimientos para aislar protoplastos de clulas guardianas de A. thaliana para su uso en estudios fisiolgicos. Otras clulas especializadas de la que han sido preparados protoplastos incluyen las del tejido central de ndulos de la raz de Vicia faba, donde las clulas infectadas con bacteroides de Rhizobium se producen junto con las clulas no infectadas (Peiter et al., 2003). El aislamiento involucra la diseccin de ndulos luego la digestin de la pared en solucin hipertnica, la liberacin de protoplastos en solucin ligeramente hipotnica, y la separacin de las fracciones de protoplastos por centrifugacin isopcnica en gradiente de densidad. Tales protoplastos son tiles en las investigaciones fisiolgicas de transporte de la membrana plasmtica. (Davey et al., 2004).Esquema de aplicacin para aislamiento de protoplastos

Un esquema de aplicacin general para la produccin de protoplastos, utilizando el procedimiento de mixed-enzyme, se muestra en la figura 2. Para que las enzimas ganen acceso a los tejidos de la planta, como en el caso de la hoja de empalizada y clulas mesoflicas, la epidermis inferior debe ser removida mediante descamacin o digestin parcial con cutinasa. Ciertos tipos de hojas, en particular de los cereales, deben ser cortadas antes de la incubacin de la enzima, ya que la epidermis no puede ser fcilmente removida. La mayora de los tejidos de las plantas y rganos (races, ndulos de las races, coleptilo, epidermis de la hoja, ptalos, la germinacin de los granos de polen, la placenta de frutas, ttradas y microsporocitos) producirn protoplastos despus de un ajuste adecuado de la mezcla de enzimas y plasmolyticum. Por ejemplo, la pared ttrada polen consta de calosa y as slo una enzima rica en -1,3 - glucanasa (enzima del jugo digestivo del caracol) liberar protoplastos.

Despus de la incubacin de la enzima, los protoplastos esfricos (Figura 3) deben separarse de los desechos celulares, subprotoplastos y vacuolas. Subprotoplastos se forman durante plasmlisis temprana cuando la protoplastos se divide en dos o ms subunidades, algunos de los cuales sern anucleados y por lo tanto no viables. La separacin se puede conseguir fcilmente en una variedad de maneras: repetida resuspensin y centrifugacin de protoplastos en un medio de lavado; de flotacin de protoplastos en una solucin de sacarosa hipertnica (Figura 3); paso de la mezcla de incubacin a travs de un tamiz de nylon de tamao de poro adecuado que permite slo protoplastos para pasar a travs ; o por el uso de un sistema de dos fases, tal como dextrano - PEG (polietilenglicol), que se basa en una diferencia de densidad entre los protoplastos y clulas (Kanai y Edwards , 1973; referido en Smith, 1978).

Congelar los protoplastos, recogerlos despus del lavado y examinarlos en el microscopio electrnico o tratarlos con abrillantadores fluorescentes que se unen especficamente a la celulosa, revela la ausencia total de fibras de celulosa en la superficie de la plasmalema.

Figura 2 Esquema de aplicacin general para el aislamiento, el lavado y el recuento de protoplastos de mesfilo de la hoja. Los protoplastos aislados a partir de callos o suspensiones de clulas se manejan de la misma manera. Fuente Smith, 1978

Figura 3 (a) Protoplastos de mesfilo recin aislados (40 micras diam.) en medio lquido (Petunia hybrida). (b) Los protoplastos (60 micras diam.) liberadas por las clulas cultivadas. El ncleo en posicin central est rodeada por cordones citoplasmticos (Parthenocissus tricuspidata). (c) Fusin inducida por nitrato de sodio entre un protoplasto del mesfilo (m), que contiene cloroplastos, y un protoplasto incoloro (c) aislado a partir de una suspensin de clulas. Los plastidios son vistos entrando en el citoplasma del protoplasto incoloro. (d) Microfotografa electrnica de un protoplasto mesfilo recin aislada (n = ncleo; ch = cloroplasto; cv = vacuola central, p = plasmalema). (e) La captacin de Rhizobium (R) en vesculas en el citoplasma de un protoplasto (p = plasmalema). (Microscopio electrnico proporcionadas por el Dr. MR Davey.)

VI. PURIFICACIN DE LOS PROTOPLASTOSEl xito del cultivo de protoplastos requiere una poblacin pura de protoplastos intactos y viables con un alto rendimiento. As los protoplastos deben ser purificados retirando el material no digerido (debris), protoplastos reventados y enzimas.

3. Remocin de debris y enzimas

Los debris pueden ser retirados de la suspensin de protoplastos mediante el filtrado de la preparacin a travs de una malla de acero o Nylone de 100 de tamao de poro. Las enzimas se eliminan por centrifugacin de la suspensin de protoplastos a 600 rpm durante 5 minutos. Los protoplastos se sedimentan en el fondo del tubo de centrfuga mientras que el sobrenadante se elimina con la ayuda de una pipeta. Los protoplastos se resuspenden en un medio de lavado que contiene slo un osmoticum u osmoticum con medio nutritivo o cloruro de calcio hidratado. La suspensin se centrifuga de nuevo para resolver los protoplastos y el medio de lavado se decanta. Las huellas de la enzima se eliminan por lavado de los protoplastos dos o tres veces con el medio.

4. La eliminacin de protoplastos rotos

Los protoplastos intactos se separan de los protoplastos rotos mediante la suspensin de la preparacin de protoplastos en solucin de sacarosa al 20-40 % y la centrifugacin a 350 rpm durante tres minutos. Protoplastos intactos se acumulan en la parte superior de la solucin de sacarosa y se retiran cuidadosamente con una pipeta (Gregory y Cocking, 1965; energa y Cocking, 1970; Evans et al, 1972).

Schenk y Hilderbrandt (1971) utilizaron solucin de Ficoll mientras Larkin (1976) utiliz buffer de densidad para la purificacin de protoplastos. En este mtodo de 0,5-3,0 volmenes de preparacin de protoplastos bruto despus de la filtracin a travs de tela muselina estril se colocan sobre Iymphoprep en el tubo de centrfuga y se centrifuga a 50-200 g durante aproximadamente 10 minutos. Los protoplastos se quedan como un anillo entre la solucin de enzima y Iymphoprep; y los desechos se asientan en la parte inferior (fig. 4). Los protoplastos se eliminan de la interfase con una pipeta pasteur.

5. Pruebas de viabilidad de protoplastos y de la formacin de paredPara un pequeo volumen de la suspensin de protoplastos aadir un volumen igual de solucin calcofluor al 0,1 %, incubar durante 5 minutos y luego observar bajo el microscopio fluorescente. La pared ser fluorescente y protoplastos seguirn siendo oscuros.

6. Viabilidad de protoplastos

Diacetato de fluorescena (FDA) de solucin en acetona (5 mg/l) se aade a la suspensin de protoplastos para dar una concentracin final de 0,01 %. Despus de 5 minutos a temperatura ambiente, los protoplastos se examinaron usando un microscopio fluorescente. Solamente los protoplastos viables pueden ser vistos (Tomar and Dantu, 2008).Figura 4 Formacin de anillo de purificacin de protoplastos y el material de desecho (roto o clulas intactas) se asientan en el fondo. Fuente Tomar and Dantu, 2008

VII. TCNICAS DE CULTIVO PARA PROTOPLASTOS AISLADOS

1. Medio de cultivo

Para poder plantear medios de cultivo eficientes para protoplastos, lo primero que se debe tener en cuenta es la presion osmotica. Por lo general, los protoplastos comienzan a regenerar la pared celular en minutos, pero este proceso requiere cuidados en la presin osmtica hasta que la pared celular primaria pueda contrarrestar la presin de turgencia ejercida sobre el citoplasma. Por otro lado, se ha comprobado que la presin osmtica tambin influye en la mitosis. Esta ltima se mantiene cuando se diluye el medio de cultivo con una solucin de composicin similar pero con menos presin osmtica.

Protoplastos de una misma especie pero de diferentes tejidos y de diferentes especies tendrn requerimientos nutricionales diferentes. En consecuencia, los medios de cultivo a largo plazo se determinaran empricamente. Universalmente, y como hemos desarrollado en las practicas, el medio de cultivo base es del MS (Murashige y Skogg, 1962) y B5 (Gamborg et al, 1968), con la adicion de un azcar alcoholizado osmtico, generalmente que no sea metabolizable, como el manitol, o ms soluble como el sorbitol. Idealmente, el medio debe ser simple y definido para ser reproducido en otros laboratorios, sin embargo, esto no siempre se cumple, como en el caso del cultivo de coconut-milk (Kao y Michayluk, 1975) usado para sembrar protoplastos a bajas densidades2. Reguladores

La auxina y citoquinina son esenciales para sostener el crecimiento del protoplasto, con algunas excepciones como en Daucus carota y Arabidopsis thaliana, en la que solo la auxina es requerida. En contraste, los reguladores mencionados pueden ser perjudiciales para el crecimiento de ctricos.

Los requerimientos para el crecimiento de protoplastos cambian continuamente durante la siembra, necesitando la modificacin de la composicin del medio, y por lo general requiere una reduccin de: auxina, derivados de la fenil-urea y brasinosteroides, que son similares estructuralmente a los esteroides animales y que pueden promover la divisin de las clulas derivadas de protoplastos. Se ha mostrado evidencia que la ciclofilin inmunofilinas pueden tener un rol importante en el crecimiento activo de las clulas dervidadas de protoplastos y en plantas intactas, particularmente en la poca temprana de la formacin de la flor. Para futuras investigaciones, se requiere investigar el rol a nivel fisiolgico de estas protenas ubicuas, ya que no se tiene clara del todo su funcin3. Fuentes carbonadas.

La sucrosa y la glucosa suelen ser las opciones de fuentes carbonadas en la mayora de medios de cultivo. A pesar de ello, la sucrosa puede ser cambiada por maltosa para promover la regeneracin del brote de clulas derivadas de protoplastos en cereales.4. Sistemas experimentales para el cultivo de protoplastos aislados

La mayora de los sistemas experimentales estn basados en medios liquidos, semi-solidos o la combinacin de ambos. Dispensar suspensiones de protoplasto en placas Petri es la opcin mas simple, ya que el medio puede ser fcilmente reemplazado para graduar la osmolaridad y por tanto, mantener el crecimiento del protoplasto. Suspensiones de gotas de protoplastos son tiles cuando hay un numero reducido de protoplastos disponibles, mientras que las tcnicas de droplet-array han facilitado las combinaciones de concentraciones de los reguladores de crecimiento.

Los protoplastos aislados pueden resistir estar embebidos en medios semislidos. Estos emplean, por lo general, agar como agente de soporte, sin embargo, se reconoce que la agarosa tiene ms eficiencia como agente de soporte por su neutralidad. Estos medios, conteniendo a los protoplastos, pueden ser dispensados como capas o gotas, con el posterior incremento de 250 ul en volumen en placas petri. Seccionar las capas en sectores, seguidas de banhos de estos o de gotas en medio liquido de la misma composicin, promueve el crecimiento protoplasmtico. Ese mtodo tambin se emplea para cambiar la osmolaridad.

El alginato tambin se puede usar para solidificar el medio, exponindolo a iones calcio, con la salvedad de que las colonias deben ser liberadas por la despolimerizacin del alginato con tratamiento de citrato de sodio para remover los iones de calcio. Suspender protoplastos en una capa delgada de liquido semislido ayuda a estimular la formacin de colonias, particularmente cuando un papel filtro se coloca en el limite de la fase semislida-liquida. Dicho papel filtro puede ser reemplazado con filtro para membranas bacterianas (poros de 0.2 Am) para producir un efecto similar, por ejemplo, en el arroz; papel celofan, para protoplastos de musgo en Physcomitrella patens; malla de nylon tanto para medios liquidos como semislidos. La remocin de cualquiera de estos materiales facilita la transferencia de las nuevas clulas en un nuevo medio.

Existe un nuevo mtodo que combina el aislamiento de protoplastos con su induccin dentro de un cultivo involucrando la suspensin de clulas en gel de aginato con estroncio seguido del vertido de la mezcla en solucin de cloruro de estroncio conteniendo enzimas digestivas de membrana celular. En este sentido, el aislamiento del protoplasto y la solidificacin del gel proceden simultneamente y se estima que la viabilidad de estos protoplastos sea mayor que en los mtodos convencionales, sin embargo, se debe comprobar su generalidad. 5. Densidad de protoplastos y crecimiento del protoplasto en el medio de cultivo

La densidad final de los protoplastos en el medio es crucial para maximizar la regeneracin de la pared celular y, por ende, la formacin de las clulas hijas. Generalmente, la densidad optima esta entre los rangos de 5x10^4 10^6.

En el caso de que hubiera una densidad excesiva los nutrientes se acabaran rpidamente y las clulas no podran sostener una divisin celular continua. En la contra parte, si hay un una cantidad de inoculo insuficiente, las clulas no podran sostener la divisin celular, debido a que habra una falta de factores estimuladores del crecimiento (excretadas de celula a celula) incluyendo aminocidos, este proceso lleva por nombre medio condicionante o nurse culture. Previamente se puede tratar el medio de cultivo para que pueda fomentar el crecimiento activo de los nuevos protoplastos aislados mediante el cultivo de clulas enfermeras que pueden ser de diferente o de la misma especie de los protoplastos aislados, como por ejemplo, Lolium multiflorum puede estimular a las clulas embrionarias del arroz. Aquellas clulas que han sido tratadas con rayos X para inhibir la divisin celular pueden producir ese efecto en las otros protoplastos, actuando tambin como nurse cells. Estas clulas reparadoras o inductoras pueden ser usadas en el mismo medio o en membranas.6. Avances innovativos para los cultivos de protoplastos.

Todos estos avances tienen como objetivo maximizar el crecimiento celular y la diferenciacin, particularmente en clulas en las que ha habido manipulacin gentica. Sin embargo, cabe resaltar que no existen parametros fsicos ni en cuanto a la composicin del cultivo, por lo que los protocolos deben ser determinados empricamente. Existen algunos avances ya comprobados para tejidos animales que han sido comprobados, con eficiencia, para plantas, tales como son el tratamiento elctrico de clulas y la manipulacin del ambiente gaseoso.

Estimulacion elctrica de los protoplastos

Algunas clulas detectan gradientes de voltaje y densidades de corriente de menos de 0.5 uV/ m^-1 y 5 nA/c m ^-2 respectivamente, con corrientes elctricas dbiles de prologanda duracin durante la estimulacin del crecimiento, regenerando rganos y reparando clulas en el caso de los animales. Segn los autores de esta estimulacin, en las plantas no solo ayuda a plantas completos, sino tambin a los protoplastos, como por ejemplo a Medicago sativa. Estas corrientes elctricas no solo alteran la polaridad de la celula, sino tambin el sistema de transporte de auxinas. Para otros propsitos, se utilizan altos voltajes en cortos tiempos (250-2000V, 10-50 us) para electroporar ADN en protoplastos aislados.

Los efectos elctricos son influenciados por muchas variables, entre las mas importantes tenemos al voltaje, la duracin a la que se expone a voltaje al protoplasto y el tamao del protoplasto. La efectividad de este tratamiento ha sido comprobada en especies maderables, las cuales acelaran la mitosis (ya que los impulsos elctricos estimulan la sntesis de ADN) hasta en 10 dias mas que en protoplastos no tratados. Este tratamiento se da, de preferencia en el estado de callo, el cual, luego estimulara a la regeneracin del brote. Estas plantas regeneradas son, incluso, mas vigorosas que las control.

Suplementacin del medio de cultivo con surfactantes, antibiticos y poliamidas

Un nuevo mtodo que promete incrementar la divisin mittica es el uso de surfactantes no inicos, especialmente de pluronicos. Se sugiere, en el caso del Pluronico R F-68, adems de promover la mitosis, ejerce la diferenciacin, promoviendo la toma de nutrientes, reguladores del crecimiento y oxgeno.

Algunos antibiticos estimulan la divisin de clulas derivadas de protoplastos. Por ejemplo, la cefalosporina, cefotaxima promueven en Passiflora edulis, cuando se le agrega 250 ul/mL. En ambos casos el modo de accin es desconocido, pero se sospecha que la cefotaxima podra ser metabolizada para formar parte de componentes reguladores del crecimiento.

Las poliaminas regulan la replicacin, transcripcin y traduccin del ADN; son tratados como una nueva clase de reguladores en plantas y son una reserva de carbono y nitrgeno en los cultivos de tejidos. En el caso de la avena, actua como un estimulante de sntesis de ADN y en almendra, la argininga estimula la divisin de protoplastos.Todos estos avances tienen como objetivo maximizar el crecimiento celular y la diferenciacin, particularmente en clulas en las que ha habido manipulacin gentica. Sin embargo, cabe resaltar que no existen parmetros fsicos ni en cuanto a la composicin del cultivo, por lo que los protocolos deben ser determinados empricamente. Existen algunos avances ya comprobados para tejidos animales que han sido comprobados, con eficiencia, para plantas, tales como son el tratamiento elctrico de clulas y la manipulacin del ambiente gaseoso.

VIII. TRANSFORMACIN GENTICA CON PROTOPLASTOSLa transformacin gentica de clulas individuales ha sido alcanzada a travs del co-cultivo de protoplastos con Agrobacterium tumefaciens o por transferencia direcata de ADN usando qumicos policatinicos, electroporacin, liposomas, microinyeccin, o sonificacin (Sawahel y Cove 1992; Fish y Dandekar, 1993). La transformacin de protoplastos de plantas usando qumicos policatinicos y/o electroporacin ha sido reportada muy a menudo.

1. Transformacin mediada por Agrobacterium

Para la transferencia del gen Agrobacterium-mediado, los protoplastos son aislados y cultivados por 2 a 3 das previo al co-cultivo con clulas Agrobacterium. Los protoplastos son mezclados con Agrobacterium a una tasa de 10^4 a 20^6 clulas de plantas contra 10^6 a 10^8 clulas bacterianas por mililitro e incubadas juntas por 24 a 30 horas. Despus de la co-cultivacin, los antibiticos que inhiben el crecimiento de las bacterias son aadidos al medio cultivo. A Las plantas tratadas se les permite crecer a un estado multicelular antes de la adicin selectiva de antibiticos (kanamicina, higromicina, etc.) que inhiben el crecimiento de clulas no transformadas. Las clulas transformadas que crecen en un medio selectivo son capaces de regenerar plantas con el gen introducido. La frecuencia de transformacin usualmente flucta entre 0.26 a 15.3%. el uso de Agrobacterium para transformar los protoplastos de planta ha perdido el favor en aos recientes porque no todas las especies, en especial cereales y pastos, son sensibles a la transformacin por medio-Agrobacterium y a veces es difcil inhibir el crecimiento de Agrobacterium que sigue en el co-cultivo. Adicionalmente, el uso de sistemas de cultivos regenerativos ms simples ha eliminado la necesidad de usar protoplastos para transformacin .

2. Transformacin por medio qumico policatinico

El qumico policatinico usado ms comnmente para transformacin de ADN es el polietilen glicol (PEG). Ha sido utilizado para transformar protoplastos para una gran variedad de especies de plantas. La frecuencia de transformaciones vara desde 0.8x10^6 hasta 6x10^-3 dependiendo en la especie de planta.

Para transformar clulas de plantas utilizando PEG, los protoplastos son aislados y ajustados a la densidad celular apropiada antes de aadir ADN transformador y PEG. Esta mexcla es incubada por 10 a 30 minutos antes de dilucin con medio cultivo. Con algunas especies es beneficioso someter a los protoplastos a un tratamiento de choques trmicos (-45C) previo a la adicin de ADN. No se sabe completamente como el PEG promueve la abosorcin de ADN. Se piensa que la carga policatinica de PEG interacta negativamente con la carga de ADN para formar una carga positiva compleja que enlaza con el plasmalemma aninico. La absorcin de ADN en las clulas ocurre a travs de endocitosis o absorcin activa. La transformacin por medio-PEG es un mtodo popular para transformar protoplastos de plantas porque tiene baja toxicidad celular, promueve altas tasas de transformacin, incrementa la permeabilidad de la membrana, protege el ADN contra la degradacin por nucleolisis, es independiente de la estructura del ADN (super enrollado, circular, o linear), permite la integracin de ADN en el genoma del husped sin un portador, y no tiene un rango limitado de huspedes.

La bromidio hexademetrina (Polibreno) acta de manera similar al PEG en cuanto a que promueve la transferencia de genes a travs de la interaccin con la plasmalemma aninica para desarrollar regiones de carga positiva que reaccionen con la carga negativa de ADN. El medio-polibrene que dirige la absorcin de ADN es un mtodo prometedor para la transformacin de protoplastos de plantas porque tiene baja toxicidad celular, promueve altas tasas de transformacin, y no est limitado por el tamao o estructura del ADN.

3. Transformacin por medio-electroporacin

En la electroporacin, un pulso elctrico es utilizado para inducir la absorcin de ADN por los protoplastos de plantas, es a travs de esta absorcin de ADN que ocurre a travs de los poros en la membrana generada en respuesta al pulso elctrico. En general, el ADN transformable es mezclado con un protoplastos de una planta antes de uno o ms pulsos elctricos de 200 a 1000 V/cm y 16 a 1000 F de capacitancia. Pulsos cortos (tpicamente microsegundos) son tpicamente menos letales a los protoplastos que los pulsos largos (milisegundos). Los parmetros ptimos de electroporacin varan y deben ser probados para nuevas especies.

Las frecuencias de transformacin y la viabilidad celular son generalmente menores para electroporacin que para los mtodos qumicos de policationes pero pueden ser mejorados al aadir PEG (4 a 8%) al medio-electroporacin. Transformaciones estables utilizando electroporacin con o sin PEG han sido obtenidas en protoplastos de muchas especies de plantas. La electroporacin es un medio rpido y eficiente para entregar ADN a clulas de plantas y protoplastos, y no est limitado al tamao o estrucutra del AND transformado, y no tiene un lmite de rango de husped. Sin embargo, la electroporacin es a menudo letal para los protoplastos, resultando en baja variabiliad.

4. Sonificacin, liposoma, micro-inyeccin, optoporacin, y transformacin por medio-laser

Otros mtodos para incorporar ADN extranjero en protoplastos de plantas se muestran considerablemente prometedores. Durante la sonificacin, los protoplastos mezclados con ADN y dado los pulsos snicos (500 a 900 msec a 0.65 a 1.6 V/cm) que interrumpen la membrana celular y permiten al ADN entrar en las clulas a travs de los poros y creados en respuesta a los pulsos elctricos. Los liposomas son fosfolpidos hidrogenerados en los cuales el ADN o ARN es encapsulado y enviado directamente hacia las clulas de plantas a travs de endocitosis o absorcin. La micro inyeccin utiliza una fina aguja capilar para introducir el ADN, cromosomas, o ncleos directamente en las clulas de plantas en una manera que preserva la integridad celular y viabilidad. La optoporacin trabaja de manera similar a la micro-inyeccin. Un micro-rayo lser (355 nm) puede ser utilizado para perforar agujeros en la pared celular y membrana y la diferencia entre el potencial osmtico del interior y exterior de las clulas tratadas osmticamente facilita el movimiento de plsmidos de ADN a travs de las aperturas en la membrana. El beneficio de la optoporacin sobre la micro-inyeccin es que los agujeros hechos por el lser son ms pequeos y poseen menor riesgo a la supervivencia de la clula. Los lseres no pueden ser utilizados para cortar, partir, y mover fragmentos grandes de ADN cromosmico entre las clulas. Las tijeras de lser han sido utilizadas para hacer cortes especficos en cromosomas para extirpar grandes fragmentos de ADN celular. Las pinzas lser han sido desarrolladas para remover fragmentos de ADN desde clulas y empalmar las piezas de cromosomas remanentes. Esta tecnologa tiene el potencial para aplicaciones de transformacin de protoplastos de plantas desde que las tijeras y las pinzas pudieron ser utilizadas para insertar grandes fragmentos de ADN en regiones especficas de cromosomas de plantas.

IX. APLICACIN DE LA FUSIN DE PROTOPLASTOSLa hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementado as el flujo de genes en los cultivos. Un gran nmero de trabajos han descrito la generacin de plantas nicas a travs del proceso de hibridacin somtica por fusin de protoplastos. La poblacin de clulas resultantes de estos procesos de fusin va a ser una mezcla de protoplastos parentales, homocariontes y heterocariontes con dos o ms ncleos.

La fusin de clulas somticas puede aplicarse para:

1) La superacin de la incompatibilidad en cruces interespecficos

2) Un mejor aprovechamiento de la variacin intraespecfica y extraespecfica en cruces interespecficos compatibles, al ser los hbridos somticos distintos y superiores a los sexuales, posiblemente por la combinacin de genomas extranucleares (Moreno, 1984)

3) La obtencin de hbridos citoplasmticos o cbridos, al transferirse genes extracromosmicos, que confieren caractersticas especiales al hbrido (ej. androesterilidad citoplsmica).

En un inicio se esperaba la obtencin de hbridos simtricos, pero la experiencia mostr que difcilmente pueden lograrse. Debindose dirigir entonces hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridacin asimtrica o cibridacin, manteniendo las caractersticas generales del cultivo.

Uno de los factores que dificulta la obtencin de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los parentales, que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de protoplastos permite sortear las barreras precigticas, siguen existiendo barreras genmicas que resultan en la eliminacin espontanea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene un ciclo celular ms corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad genmica es el estado de diferenciacin de los tipos celulares involucrados en la fusin. Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en fase de crecimiento activo con clulas del mesfilo, que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas ltimas.

Aunque la fusin de protoplastos ha sido utilizada con xito para solventar problemas de incompatibilidad entre especies con los que tropezaba la mejora gentica tradicional, y ha permitido obtener hbridos somticos interespecficos e intergenricos, con especiales combinaciones genticas nucleares y citoplsmicas, quiz la aplicacin ms interesante de la fusin somtica sea la transferencia de una cantidad limitada de informacin gentica de una especie a otra, de forma poco controlada. As, mediante tratamientos fsico-qumicos es posible inactivar o destruir total o parcialmente los ncleos de las clulas parentales, con lo que solo una parte desconocida de la informacin gentica va a ser transferida al hbrido, que suele ser estril. En determinados casos es posible mediante sucesivas retrofusiones eliminar casi todo el genoma de uno de los parentales (ej. el hbrido resistente a atrazina entre Solanum nigrum y Lycopersicon esculentum; Jain et al., 1988). Otro caso modelo de cibridacin es el Brassica-Raphanus (Pelletier et al., 1983): el heterocarionte contiene el ncleo de Brassica napus, los cloroplastos resistentes a atrazina de Brassica campestris y las mitocondrias de Raphanus sativa que confieren androesterilidad.

Tabla. Ejemplos de hbridos somticos que exhiben algn carcter de inters agronmico

1. CITRUS

Se ha realizado una considerable cantidad de investigacin bsica y aplicada en Citrus, un cultivo de gran importancia comercial mundial. La hibridacin sexual es obstaculizada por poliembrona, esterilidad polen ovulo, incompatibilidades sexuales y de injerto, juventud extendida. (Guo and Deng, 2001).

Una caracterstica resaltante de Citrus es: Facilidad para producir Hbridos somticos interespecficos e intergenricos. La gran cantidad de variedades de ctricos silvestres cultivados representa una an no explorada reserva de genes para generar nuevas plantas, por hibridacin somtica y cibridacin. Entre algunos ejemplos tenemos:

Se report la produccin de hbridos citoplasmticos involucrando protoplastos irradiados de Valencia sweet orange (Citrus sinensis) y por protoplastos tratados con iodo-acetato de Murcott tangor (C. reticulata x C. sinensis). Injertos in vitro fueron necesarios para mantener la regeneracin de meristemos. (Liu and Deng, 2000)

Protoplastos electrofusionados de clulas suspendidas de Bonnaza navel orange (C. sinensis) con protoplastos del mesfilo de Red Blush grapefruit (C. paradisi) sin semillas para generar plantas tetraploides y diploides. (Guo et al., 2000) Algunos de los tetraploides mostraron floracin precoz. Guo et al. propone que los hbridos somticos pueden ser excelentes donadores de polen para la mejora de cultivares de pomelo (toronjas) mediante la generacin de hbridos triploides sin semilla.

Otras combinaciones interespecficas incluyen Hamlin sweet orange (C. sinensis) con rough lemon (C. jambhiri),

2. BRASSICA

Hibridacin somtica en Brassicaceae:

Hbridos somticos entre Brassica napus y B.rapa. Se report que la fuente del material parental influy en las caractersticas resultantes de los hbridos somticos. En este sentido, se prefiri B. rapa de China en comparacin con germoplasma de otros lugares del mundo para la transferencia de genes para el rendimiento en B. napus. (Qian et al.,2003)

En estudios relacionados, protoplastos fusionados de hoja de Moricandia arvensis (2n = 28) con protoplastos de hipocotilo de B. oleracea (2n = 18) para generar nuevos hbridos (2n = 46) que fueron confirmados por el anlisis con RAPD (random amplified polymorphic DNA). Se obtuvo a partir de ADNs de cloroplastos y mitocondrias de M. arvensis, con la anatoma de las hojas tienen una caracterstica C3 C4, rasgo intermedio tpico de M. arvensis (Ishikawa et al., 2003). Tales hbridos somticos sern material de siembra til para introducir el rasgo C3-C4 en cultivos de brasicas. Se han reportado otras combinaciones intergenricas.

Por ejemplo, hbridos somticos frtiles producidos entre B. napus y Sinapsis arvensis (mostaza silvestre) con el fin de enriquecer el acervo gentico de semillas oleosas. Simtricos y asimtricos hbridos se identificaron por anlisis de RAPD y contenido de ADN nuclear, con una mejora de la resistencia a enfermedades a Leptosphaeria maculans, estan presentes en los hbridos de S. arvensis. Una vez ms, este nuevo material tiene el potencial no slo como un puente para introducir rasgos agronmicamente tiles en los cultivos de Brassica, sino tambin en la obtencin de nuevas variedades resistentes a las enfermedades, como el carbunco sintomtico. (Hu et al., 2002)

3. SOLANACEAS

Especies de Solanum, en especial la papa (Solanum tuberosum), han sido caracterizadas extensamente en programas de hibridacin somtica para ampliar el acervo gentico y para aumentar la diversidad gentica a disposicin de los criadores de este importante cultivo tuberosa.

De hecho, la papa representa uno de los primeros cultivos agrcolas que se cultivan in vitro y explotados para generar hbridos somticos, con una contribucin significativa en este campo de investigacin durante un perodo extenso como resultado una excelente labor. Hassanein et al. (1998) utilizaron cbridos con el genoma de S. nigrum y el citoplasma de S. tuberosum, para estudiar las interacciones nucleo / cloroplastos, mientras Jansky et al. (1999) evaluaron los productos de fusin de especies de Solanum diploides por su resistencia al escarabajo de la patata.

4. CEREALES

Se ha intentado hibridacin intergenrica en los cereales, con hbridos somticos generados entre el arroz (Oryza sativa) y cebada (Hordeum vulgare;. Kisaka et al, 1998), y el arroz con Zizania latifolia (Liu et al, 1999.). Es de destacar que slo una planta hbrida asimtrica fue generada en estos experimentos, entre O. sativa y Z. latifolia.

Al menos otros tres estudios han aprovechado al trigo (Triticum aestivum) como socio, generando material hbrido somtico con Haynaldia villosa (Zhou et al., 2001), resistente al fro, la sequa, y tolerante a la enfermedad Bromus inermis (Xiang et al., 1999), y Agropyron elongatum (Xia et al., 1999).X. AVANCES EN LA INVESTIGACIN DE PROTOPLASTOS DE PLANTASEntre las muchas tcnicas en las que se utilizan los protoplastos, tenemos a la fusin de protoplastos a partir de especies diferentes, por lo cual, proporciona una herramienta para la reproduccin prctica y evita la hibridizacin sexual relacionados con barreras precigoticas o postcigticas. Se puede crear diferentes tipos de heterocariontes y homocariontes, as como hbridos alloplsmicos (cbridos).

La regeneracin es, a menudo, el que provoca el efecto cuello de botella a este proceso de hibridacin somtica; por ello, ha obligado a los investigadores a buscar mtodos innovadores como estimulacin elctrica, surfactantes no inicos y portadores artificiales de gas.Los avances descritos en esta revisin se han determinado a partir de los problemas observados en cada experimento, desde el medio de cultivo, hasta los aditivos y formacin de especies no benficas para el desarrollo de protoplastos. Como se menciona anteriormente en las tcnicas, algunos parmetros son importantes para la obtencin del resultado propuesto e impedir el crecimiento de contaminantes (bacterias u hongos). Es as, que en esta revisin se proporciona una visin general de la evolucin y las ideas ms innovadoras en el tema, as como se analiza crticamente los logros recientes para enfocarlos de manera multidisciplinaria y mejorar su aplicacin.1. Racionalizacin de la regeneracin

En los ltimos 10 aos se han documentado diferentes avances sobre el cultivo de protoplastos, como se observa en la Tabla 2, el tipo de material de los donantes ha sido decisivo para el xito de la regeneracin. Por ejemplo, las clulas en suspensin contienen ms mitocondrias que las clulas del mesfilo, es por eso, que las plantas monocotiledneas representan el material donador ms adecuado.La variabilidad de estos protoplastos, dentro de un mismo genotipo, puede deberse no slo a la variacin somaclonal, sino tambin a los diferentes antioxidantes y concentraciones fitoqumicas; esta variacin debera usarse para regenerar protoplastos en cultivos recalcitrantes; sin embargo, son pocos los esfuerzos para promover la variabilidad, es ms, se realizan pre tratamientos que reducen el uso de fitohormonas.Los estudios recientes han contribuido a una mejor comprensin de la importancia de los sistemas de cultivo, como lo demuestra la baja formacin de colonias en el medio lquido, que es causada por la poca aireacin, luz y liberacin de compuestos txicos. Un avance en este campo se encuentra en las membranas semipermeables que mejoran el paso del oxgeno o los canales microfludicos de polidimetilsiloxano con microtubos para el suministro de medio continuo; pero, un hallazgo general de mejor eficiencia son las agarose or alginate embedded (incrustaciones de agarosa o alginato), as tambin, las perlas, discos, capas delgadas o extra delgadas que permiten el fcil refresco de los cultivos y reduce al mnimo los posibles efectos negativos hacia el desarrollo de las microcolonias y contaminacin microbiana.Otro punto a tener en cuenta, son los suplementos adicionados a los medios originales, tales como en Beta vulgaris, el aumento drstico de la eficiencia en las clulas del mesfilo despus de la adicin de 100 nM fitosulfoquina, un factor de crecimiento peptdico, que tiene propiedades antioxidantes pero, posiblemente, tambin genera un efecto de nurse cells. El suministro de extractos ricos en protenas arabinogalactanos exgenos mejor significativamente la organognesis de los protoplastos derivados de callos, asimismo, los oligosacridos derivados de galactoglucomananos son molculas de sealizacin de elongacin y diferenciacin en la clula vegetal, los cuales influenciaron positivamente la viabilidad y regeneracin.

Debido a que las poliaminas estn involucradas en el crecimiento, desarrollo y respuestas al estrs; y el aislamiento incrementa los niveles de putrescina, mayormente, en protoplastos no totipotentes, esto conlleva a una relacin entre los niveles de poliaminas intracelulares y metabolismo con la totipotencia celular. Es por eso que Rakosy-Tican et al. (2007) proponen espermidina para estimular la mitosis y reducir el impacto del estrs. El perfil mltiple de los niveles hormonales interno durante las diferentes fases de regeneracin con herramientas cromatogrficas (LC-HRMS y LC- MS / MS) permitir compararlos genotipos recalcitrantes y regenerativos, para administrar hormonas exgenas en el momento adecuado y para controlar su metabolismo de cerca. Adems, se hacen esfuerzos importantes en la actualidad para establecer bioensayos de alto rendimiento para descubrir nuevas molculas con actividad potencial de citoquinina, como se ejemplifica por Motte et al. ( 2013 ) para la adenina fenilo. Estos podran contribuir a organognesis en los cultivos donde citoquininas tradicionales no han inducido la formacin de shoots.Tabla2: Avances en la regeneracin de protoplastos en diferentes plantas en el periodo 2004-2013.

La formacin de protoplastos recalcitrantes es dada por el estrs oxidativo que se genera en las etapas de aislamiento y cultivo de las clulas. En Arabidopsis, los estudios han comprobado que la adicin de ascorbato puede ayudar a disminuir el dao; sin embargo, este estrs oxidativo y auzxinas tambin actan como agente complementario en el crecimiento y diferenciacin, como se muestra en el caso de Nicotiana tabacum,

2. Avances en la fusin y fragmentacin de protoplastos

3. Caracterizacin de hbridos somticos

Constitucin cromosmica y establidad

Cribado de genoma, citoplasmoma, transcriptoma y proteoma

4. Valorizacin agrcolaLa variacin genmica es de gran inters en la agricultura o cultivos industriales para la calidad de la planta y la mejora del rendimiento. La tolerancia a la sal, la mejora de calidad, esterilidad masculina citoplasmtica (CMS)..

XI. CONCLUSIONES

Las plantas con caractersticas mejoradas han sido obtenidas a travs de variaciones somaclonales e hidratacin somtica. Debido al rango limitado de huspedes de Agrobacterium, la transformacin directa de genes utilizando protoplastos puede ser utilizada para insertar genes beneficiosos en cultivos, especialmente en cereales y pastos, que no son sensibles a transformaciones por medios-Agrobacterium. Estos mtodos pueden ser utilizados para crear plantas con caractersticas agronmicas y horticulturales mejoradas as como tambin de mayor resistencia contra insectos y enfermedades para el uso de criaderos para desarrollar cultivos mejorados.XII. BIBLIOGRAFA

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