mmaya guia genotoxicidad

8/17/2019 Mmaya Guia Genotoxicidad

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Ministerio de Medio Ambiente y Agua Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego

Ministerio de Medio Ambiente y AguaEstado Plurinacional de Bolivia

Ministerio de Medio Ambiente y AguaViceministerio de Recursos Hídricos y Riego

Calle: Héroes del Acre esquina Conchitas Nº 1778Telf. (591-2) 2124484 – 2117391

Con el apoyo de:


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Guía para la Evaluación Genotóxica en Cuerpos de Agua Utilizando Células de Raíces de Cebollines

Autor Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA)

Edición y diseño Viceministerio de Recursos Hidricos y Riego (VRHR)

Texto:Gloria Rodrigo Lira

El presente documento fue elaborado en el marco del Programa Plurianual de Gestión Integrada de Recursos Hídricos y Manejo

Integral de Cuencas 2013 – 2017 y su impresión fue posible gracias al apoyo de la Cooperación Suiza en Bolivia a través deHELVETAS Swiss Intercooperation, programa CONCERTAR miembro de GESTOR.

Está permitida la reproducción del presente documento, siempre que se cite la fuente..

La Paz –Bolivia2014


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Contenido

1 Recordando la división celular 1

2 ¿Qué es genotoxicidad ? 5

3 ¿Cómo se evalúa genotoxicidad en cuerpos de agua? 11

4 Protocolo de evaluación 15 4.1 Reactivos y material 18

4.2 Procedimiento de muestreo 19

4.3 Medición de micronúcleos 22

4.4 Datos y cálculos 26

4.5 Interpretación de resultados 28

5 Glosario 30

6 Bibliografía consultada 31


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Con el objetivo de facilitar la labor de vigilancia, control y monitoreo de la calidad de los cuerposde agua, en cumplimiento con los artículos 9, 10 y 11 del Reglamento en Materia de ContaminaciónHídrica, de la ley del Medio Ambiente (Ley 1333), el Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA),a través del Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego (VRHR), elaboró la presente cartilla que seespera pueda ser difundida y aplicada de manera efectiva y concreta por técnicos de medio ambientede los gobiernos municipales y departamentales, monitores comunales, empresas y cooperativasprestadoras de servicios de agua potable y saneamiento básico e instituciones u organizacionesinvolucradas y comprometidas con este tema.

Como resultado de su aplicación, se espera que se pueda mejorar y ampliar el presente documento,por lo que será de mucho valor toda observación, sugerencia y comentario que se pueda hacer llegaral VRHR para su incorporación en sus próximas ediciones con los reconocimientos que correspondan.

Presentación

Ing. Carlos Ortuño Yáñez VICEMINISTRO DE RECURSOS HÍDRICOS Y RIEGO


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Recordando la división celular

nes de nuevas células cada segundo simplemente para

mantener su estado de equilibrio. Si la división celular se

detiene el individuo moriría en pocos días.

Las plantas y los animales están formados por miles de

millones de células individuales organizadas en tejidos

y órganos que cumplen diferentes funciones especícasy que se reproducen duplicando tanto su contenido nu-

clear como el citoplasmático para luego dividirse en dos

nuevas células.

En especies unicelulares, como las bacterias, hongos,

algas, protozoos y las levaduras (Figura 1), cada división

de la célula única produce un nuevo organismo.

En especies pluricelulares se requieren muchas secuen-

cias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo.

En cuerpos adultos, la división celular es también necesa-ria para reemplazar las células perdidas por su desgaste,

deterioro o por muerte celular programada o envejeci-

miento. Un humano adulto debe producir muchos millo- Figura 1. Organismos unicelulares

Alga

Protozoo

Bacterias

Hongos


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El ciclo celular comprende el conjunto de procesos que

una célula debe realizar para replicar de manera exacta

el ADN1 y separar o dividir los cromosomas replicados

en dos nuevas células distintas.

La gran mayoría de las células también doblan su masa

y duplican todos sus orgánulos citoplasmáticos en cada

ciclo o división celular. De este modo, durante el ciclo

celular un conjunto complejo de procesos citoplasmáti-

cos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros.

Dependiendo del tipo de célula, existen dos variantesen la división celular: la mitosis y la meiosis.

Mitosis. La mitosis es la división celular asociada a las

células somáticas. Las células somáticas representan la

totalidad de las células del organismo excepto las célu-

las germinales o sexuales y las células embrionarias, que

1 La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) tiene la estructura de una escalera formadapor azúcares, fosfatos y cuatro bases nucleotídicas llamadas adenina (A), timina (T), citosina (C) yguanina (G). El código genético queda determinado por el orden de estas bases, y cada gen tieneuna secuencia única de pares de bases. Los cientícos utilizan estas secuencias para localizar laposición de los genes en los cromosomas y elaborar el mapa del genoma humano. En casi todoslos organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleode la célula.

son el origen de los gametos. Por lo tanto, se encuentran

en los huesos, la piel, los tejidos, los órganos y la sangre.

Se componen de 23 pares de cromosomas2. Las células

somáticas pueden mutar sin transmitir sus modicacio-nes a los futuros descendientes. Las células somáticas

que mutan pueden, sin embargo, ser la causa de dife-

rentes tipos de cáncer.

La mitosis, entonces, es el proceso de división o repro-

ducción nuclear de cualquier célula que no sea germinal.

Meiosis. Se debe recordar que los organismos superio-res que se reproducen de forma sexual se forman a partir

de la unión de dos células germinales o sexuales espe-

ciales denominadas gametos. Cada célula germinal es

diferente genéticamente por la recombinación genética

que se da durante la meiosis.

Las células germinales son las responsables de la forma-ción de las células reproductoras o gametos, los esper-2 Dentro del núcleo, una de las estructuras más importantes son los cromosomas, formados por elADN y las proteínas presentes en el núcleo. Los cromosomas son semejantes a dos bra zos, unidospor el centrómero, donde se ordena el ADN.


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matozoides en los hombres y los óvulos en las mujeres.

Las células germinales contienen toda la información

genética de un individuo y la transmiten al embrión, in-

cluyendo eventuales mutaciones genéticas.

Estas células están situadas en las gónadas de los apa-

ratos reproductores femenino y masculino. Los gametos

contienen la mitad de la información genética de un in-

dividuo, es decir 23 cromosomas, por lo que se dicen

que son células haploides. Estas células necesitan unirse

al gameto complementario, que ocurre en el proceso defecundación, para completar así la información para dar

lugar a un individuo humano completo.

Los gametos se originan mediante meiosis, proceso ex-

clusivo de división de las células germinales o también lla-

madas células sexuales. La meiosis es un mecanismo de

división celular que, a partir de una célula diploide (2n),permite la obtención de cuatro células haploides (n) con

diferentes combinaciones de genes. La meiosis consta de

dos divisiones sucesivas de la célula con una única réplica

del ADN. El producto fnal son cuatro células con n cro -

mosomas.

En la meiosis, a diferencia de la mitosis, sólo se trans-

mite a cada célula nueva un cromosoma de cada una

de las parejas de la célula original. Por esta razón, cada

gameto contiene la mitad del número de cromosomas

que tienen el resto de las células del cuerpo, es decir, 23

cromosomas.Cuando en la fecundación se unen dos gametos, la célu-

la resultante, llamada cigoto, contiene toda la dotación

doble de cromosomas. Es decir, 46 cromosomas. La mi-

tad de estos cromosomas proceden de un progenitor y la

otra mitad del otro. La meiosis, entonces, consiste en dos

divisiones sucesivas de una célula diploide acompañadaspor una sola división de sus cromosomas (Figura 2).


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Tabla 1. Diferencias entre la mitosis y la meiosis

Figura 2. Procesos de división del núcleo en célulassomáticas (mitosis) y células germinales o sexuales

(meiosis).

Mitosis Meiosis

A nivel genético

A nivel celular

A nivel orgánico

Reparto exacto del materialgenético

Como consecuencia de lo an-terior se forman células genéti-camente iguales.

Se da este tipo de división en

los organismos unicelularespara su reproducción asexual yen pluricelulares para su desa-rrollo, crecimiento y la repara-ción y regeneración de tejidosy órganos.

Segregación al azar de los cro-mosomas homólogos y entre-cruzamiento como fuente devariabilidad genética.

Produce una reducción del jue-go de cromosomas a la mitadexacta de los cromosomas ho-mólogos.

Sirve para la formación de las

células reproductoras sexuales.

2n

2n

2n 2n 1n 1n 1n 1n

1n1n

2n

2n

Mitosis Meiosis I

Meiosis II


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Genotoxicidad es la capacidad relativa que tiene un

agente físico, químico o biológico de ocasionar un daño

en el material genético, originando efectos biológicos

adversos en los seres vivos.

De acuerdo a su modo de acción o efectos que puede

ocasionar se clasican en mutágenos3, carcinógenos4 yteratógenos5 , dando lugar a los procesos de mutagéne-

sis, carcinogénesis y teratogénesis respectivamente.

El daño en el material genético se da en el ADN y en to-

dos aquellos componentes celulares que se encuentran

relacionados con la funcionalidad y comportamiento de

los cromosomas dentro de la célula, como son las pro-

teínas y el ARN6.3 Agente químico, físico o biológico capaz de causar daño al ADN4 Agente químico, físico o biológico qué actúa sobre los tejidos vivos, causando cáncer.5 Agente o sustancia que actúa sobre el embrión en desarrollo causando alteraciones morfo-siológicas.6 Ácido ribonucleico, es la molécula que dirige la síntesis de proteínas a partir de la informacióncontenida en el ADN.

A objeto de sistematizar e interpretar estos fenómenos,

se desarrolló la Genética Toxicológica, que se constituye

como una de las ramas de las ciencias biológicas encar-

gada de evaluar el daño causado en el ADN (Figura 3)

por distintos tipos de exposición a potenciales agentes

genotóxicos y que se evalúa a partir del monitoreo am-

biental y humano.

Los primeros estudios llevados a cabo por Ames7, en

bacterias que presentaban mutaciones en genes espe-

cícos y el desarrollo de la fracción S98 para activación

7 La prueba de Ames se utiliza en la evaluación de mutagenicidad de muestras problema (agua,aire, lixiviados de residuos sólidos, extractos acuosos, etc.). Es considerada parte esencial de laspruebas toxicológicas para la detección y localización de fuentes que generen un daño potencial

por la presencia de compuestos genotóxicos.8 Fracción sobrenadante obtenido del hígado de rata a partir de un homogeneizado por centrifu-gación a 9000 g durante 20 minutos en un medio adecuado; esta fracción contiene citosol y micro-somas. Las ratas utilizadas son de las líneas Sprague-Dawley y Wistar. La fracción S9 se utiliza enconjunción con la prueba de Ames para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicosdebido a que permite predecir el posible comportamiento del compuesto a evaluar en su paso porla vía hepática.

¿Qué es genotoxicidad?


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metabólica, permitió demostrar, en experimentos con

animales de laboratorio, que entre el 60 y el 90% de lassustancias carcinogénicas fueron mutagénicas.

En la década de los 80’s se conrma la función de las mu-taciones en el desarrollo del cáncer con el descubrimien-

to de los oncogenes por activación de protooncogenes.

Ahora se sabe que además de las sustancias denomi-

nadas carcinógenos genotóxicos, existen también otros

carcinógenos no genotóxicos o epigenéticos que actúan

por otros mecanismos.

Figura 3. Esquema del proceso de mutación en lacadena del ADN.

Copia mutada

Adenina

Timina

Citosina

Guanina

Cadenaazúcar - fosfato


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El descubrimiento de la relación entre mutagénesis y el

desarrollo de tumores permitió establecer la necesidad

de evaluar el riesgo de carcinogenicidad por exposición

a sustancias químicas mediante la evaluación de muta-

genicidad.

Por tanto, las pruebas para la detección de mutágenos

adquirieron su importancia debido a que estos com-

puestos tienen la capacidad de alterar el material ge-

nético en los organismos y producir: malformaciones en

el embrión o feto, mutaciones en las células germinales

reduciendo la fertilidad, enfermedades cardíacas, arte-

rioesclerosis, inuir en los procesos de envejecimiento yprovocar mutaciones que pueden generar cáncer (Majer

et al., 2005).

Según Fiskesjo (1985), los organismos biológicos tienenla capacidad de detectar cambios en la calidad del agua

y expresar las alteraciones más sutiles que operan duran-

te cierto tiempo en un ecosistema mediante respuestas

individuales o de conjunto. En este sentido, los ensayos

o test biológicos se están transformando en herramien-

tas valiosas para la evaluación del impacto ambiental ge-

nerado por los compuestos mutágenos.


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Mitocondria CitoesqueletoNúcleo

Retículoendoplasmático

Peroxisoma

NucleóloAparato de Golgi

Citoplasma

Membranaplasmática

Centriolo

Ribosomas

Figura 4. Célula eucariota animal


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Citoesqueleto

ReticuloEndoplasmático

Cloroplasto

Nucleolo

Vacuola

Pared celular

MembranaPlasmática

Citoplasma

Mitocondria

Ribosomas

Núcleo

Aparato de Golgi

Figura 5. Célula eucariota vegetal


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Telofase

Metafase

Profase

Interfase

Anafase

Células de raiz de cebollin en diferentes estadios de división


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¿Cómo se evalúa genotoxicidad encuerpos de agua?

Los ensayos de genotoxicidad están diseñados para de-

tectar compuestos que inducen directa o indirectamente

a daños genéticos por diferentes mecanismos. General-

mente, se considera que este daño produce efectos he-

redables y provocan la formación de tumores.

Actualmente, se dispone de pruebas con las que se

puede determinar un daño genético y así detectar com-

puestos genotóxicos. Muchas de estas pruebas son

bioquímicas, in vivo o in vitro, con micro o macro orga-

nismos. Mediante estos ensayos se pueden determinar

daños microscópicos o moleculares, o bien la formación

de aductos, es decir, complejos que se forman cuandoun compuesto químico se une a una molécula biológica,

como el ADN o a ciertas proteínas.

Para detectar con exactitud o predecir conablementelos efectos genotóxicos de una sustancia en el ser hu-

mano no es suciente una sola prueba, sino que se debedisponer de por lo menos dos o más alternativas.

La correlación entre mutagenicidad y carcinogenicidad

es cada día más evidente. Se ha demostrado que 157

de los 175 carcinógenos conocidos también son mutá-

genos. De ahí la conveniencia de saber con precisión

el posible daño que un compuesto puede tener sobre

nuestro organismo o sobre otros seres vivos.

El monitoreo de los contaminantes por análisis directo

requiere conocer el agente químico a vericar, y su eva-luación está limitada por la sensibilidad y especicidaddel método utilizado


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Ante esto, los bioensayos ofrecen ventajas considera-

bles debido a que un organismo puede metabolizar un

compuesto cualquiera y convertirlo en otro que puede

ser aún más tóxico que el original.

Actualmente, a nivel mundial, las agencias reguladoras

de medio ambiente exigen una batería o conjunto es-

tándar de estudios de genotoxicidad antes de dar au-

torización para liberar productos de consumo humano,

entre ellos el agua potable debido a que el proceso de

potabilización requiere de cloro, el mismo que ha mos-

trado ser mutagénico en diferentes ensayos.

La batería estándar para determinar genotoxicidad inclu-

ye el llamado test de Ames, que es un ensayo biológico

rápido utilizado para determinar el potencial mutagénico

y cancerígeno de compuestos químicos9. El procedimien-

to se describe en una serie de documentos de principios

de 1970, escritos por Bruce Ames y su grupo de investi-gación de la Universidad de California, Berkeley. En este

9 Las pruebas estándar para la carcinogenicidad hechas sobre roedores toman años para comple-tarse y son caras de realizar.

sentido, el test de Ames es utilizado mundialmente como

un ensayo inicial para discriminar nuevos químicos y fár-

macos por su potencial mutagénico.

En varios estudios, las aguas contaminadas han mostra-do que pueden inducir daño genético en mamíferos y

organismos acuáticos (Minissi y Lombardi, 1997). El efec-to mutagénico de estas aguas y sus sedimentos puede

ser evaluado bajo condiciones de laboratorio usando

sistemas biológicos como bacterias, levaduras, plantas y

peces (Minissi et al., 1996).

El protocolo mejorado para micronúcleos en raíces de

Vicia y Allium (raíces de habas y cebollas) fue establecido

como un ensayo estándar internacional por el Interna-

tional Program on Plant Bioassays bajo el auspicio delPrograma Ambiental de las Naciones Unidas (Ji et al.,

1999; Majer et al., 1999)

Entre los diferentes ensayos citogenéticos en plantas,

el test de micronúcleos (MCN) en raíces de Vicia faba

(haba) es el más sensible para agentes aneugénicos y


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clastogénicos, además de ser simple, barato y requerir

condiciones mínimas de laboratorio (Minassi y Lombardi,

1997). En China el test de MCN en Vicia faba (haba) esun método estándar en monitoreo ambiental (Kong et

al., 1998).

Sin embargo, en este tipo de ensayos con MCN también

puede utilizarse raíces de Tradescantia paludosa (purpu-

rina o amor de hombre) y Allium cepa (cebolla) debido

a que resultaron ser bioindicadores altamente sensibles,

fáciles de aplicar en diferentes situaciones empleando

procedimientos y protocolos sencillos y de bajo costo.

Figura 6. Plantines de purpurina (Tradescantiapaludosa)

Figura 7. Cebollines (Allium cepa)


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Figura 8. Cebollines en proceso de ensayo


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Protocolo de evaluación

Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cro-mosomas completos que, espontáneamente o por cau-

sa de agentes que rompen cromosomas o que alteran

el huso10 de división, quedan fuera del núcleo durante

la mitosis11. Entre estos agentes están las radiaciones,

sustancias químicas, plaguicidas, fármacos y otros conta-

minantes ambientales.Los micronúcleos son conocidos, en el campo de la he-

matología, como cuerpos de Howell-Jolly. Su forma es

generalmente redonda u ovalada, con un diámetro que

varía desde 0,4 a 1,6 micras. Su formación ocurre en la

anafase de la mitosis12 donde el fragmento cromosó-10 Durante la división celular se forma una estructura especial para desplazar a los cromosomasque recibe el nombre de huso acromático. Después de la división, el huso se desmonta porqueno es necesario.11 La mitosis es la división de la célula en la que, previa duplicación del material genético, cadacélula hija recibe una dotación completa de cromosomas.12 Durante la anafase, los centrómeros se dividen, lo que permite que cada una de las cromátidasidénticas que formaban el par se separen (cromosomas hijos) y se dirijan a los dos polos de lacélula arrastradas por los microtúbulos del huso mitótico.

mico que no posea centrómero o el cromosoma des-orientado no podrá integrarse a un núcleo por carecer

del elemento indispensable para orientarse en el huso

acromático.

Luego, en la telofase, los cromosomas normales, así

como los fragmentos que posean centrómeros, dan ori-

gen a los núcleos de las células hijas. Sin embargo, loselementos rezagados, que pueden ser fragmentos o cro-

mosomas completos, quedan incluidos en el citoplasma

de las células hijas y una proporción de ellos se transfor-

ma en uno o varios núcleos secundarios. Tales núcleos

son mucho más pequeños que el núcleo principal, de

ahí su nombre de micronúcleos (Figura 9, Figura 10). Siel compuesto estudiado es un clastógeno, se formarán

micronúcleos pequeños, pero si es un aneuploidógeno,

lo que se observará será la formación de micronúcleos

grandes (Terradaset. al. 2010).


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Figura 9. Formación de núcleos y micronúcleos a partirde una célula madre

Los micronúcleos son núcleos citoplasmáticos redondos

y de tamaños variables con las mismas características his-

toquímicas que el núcleo principal, pero están envueltos

dentro de un pedazo separado de membrana nuclear.

Para la realización de esta prueba es indispensable utili-

zar un tejido en constante división, pero debe conside-

rarse que en las células con poco citoplasma los micro-

núcleos no son fácilmente distinguibles de los lóbulos o

proyecciones del núcleo normal.

La prueba se realiza en diferentes tipos celulares como:

eritrocitos policromáticos de la médula ósea, cultivos

de linfocitos de sangre periférica, células de la mucosa

bucal, hepatocitos de rata, eritrocitos en peces y aves.

Como se indicó antes, en células vegetales, las más utili-

zadas son las células meióticas de la purpurina ó amor de

hombre y las células meristemáticas de cebolla y haba.

Como ventajas de la técnica de micronúcleos están:

- La posibilidad de probar un sólo agente osustancia química sin otros compuestos,

- La posibilidad de probar mezclas omuestras complejas en su composición,

- La abundancia de células analizables endiferentes periodos del ciclo celular y elque los micronúcleos formados durante ladivisión celular persisten al menos durantela siguiente interfase.

Adicionalmente, la prueba no deja lugar a dudas sobre

el daño producido, pues lo que se observa como micro-

núcleos es claramente una pérdida de ADN.


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Entre las principales desventajas están:

- La prueba no detecta agentes que noproducen pérdidas de material genético orezagos anafásicos, y

Figura 10. Formación de micronúcleos en raíces dehabas (Vicia faba) que fueron germinados en aguas

con arsénico.

- Tampoco es útil en poblaciones celularesque no se dividen.


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Tabla 3. Material requerido

Material CantidadBisturí o gillete 3 u

Copas de coctel de 100 mL 24 u*

Cubreobjetos 1 caja 100 u

Gradilla para tubos largos 1 u

Jarra plástica de 1 L 1 u

Lápiz negro con goma 1 u

Marcador indeleble 1 u

Masking de 1 pulgada 1 u

Microscopio con objetivos 4x a 120x 1 u

Pinza metálica de punta na 1 u

Piseta para agua de 500 mL 1 u

Portaobjetos 1 caja 50 u

Probeta de 100 mL 3 u

Recipiente plástico de 5 L 1 u*

Servilletas de papel o papel ltro rápido 1 u

Tubos de ensayo de boca ancha 40 u Vaso de precipitados de 250 mL 7 u

Viales o frascos de 5 mL con tapa 10 u

Contómetro o contador de células 1 u

*Material requerido por muestra a ensayar

Los reactivos y material requeridos para el ensayo de unamuestra se presentan en las Tablas 2 y 3. Sin embargo,

éstos pueden ser utilizados hasta para 10 muestras, con

excepción de los recipientes para la toma de muestras y

las copas de coctel.

Tabla 2. Reactivos requeridos para uno a diez ensayos

Reactivos Cantidad Ácido acético 99% 100 mL

Solución de ácido clorhídrico 1 N 50 mL

Etanol 70% 500 mL

Solución Etanol: ácido acético (3:1) 100 mL

H2O hervida de grifo 1 000 mL

H2O destilada 1 000 mL

Solución de orceína13

acética 45% 50 mL

13 Colorante de color rojo violáceo, extraído de líquenes y que tiñe con preferencia núcleos y cro-mosomas.

Reactivos y material


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Procedimiento de muestreo

Durante el muestreo de agua se recomienda tomar las

siguientes precauciones14:

a) Las muestras no deben incluir partículasgrandes, desechos, hojas u otro tipo dematerial accidental, salvo cuando se tratede muestras de sedimentos. Además,

deben ser ltradas para la realización de losensayos o determinaciones. Si no hubierapapel ltro, se puede usar servilletas depapel.

b) Para minimizar la contaminación de lamuestra, conviene recogerla con la bocadel frasco en la misma dirección de la

corriente (Figura 11).

c) Se debe tomar un volumen sucientede muestra, se recomienda entre 2 a 3

14 Litter et al., 2009.

litros para eventuales necesidades derepeticiones.

d) Se debe realizar todas las determinacionesposibles de campo, como las medicionesde pH, temperatura y conductividad. Paraevitar riesgos de contaminación, estasdeterminaciones deben realizarse enalícuotas de muestras separadas de las queserán enviadas al laboratorio.

e) Se deben limpiar muy bien los frascosy demás materiales de recolección. Esimportante recordar que en gran parte delos casos la contaminación de los frascosno es visible ni siquiera al microscopio.

f) La parte interna de los frascos no debeser tocada con la mano ni debe quedarexpuesta al polvo, humo u otras impurezas.


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g) Las personas encargadas de la recolecciónde muestras deben mantener las manoslimpias y usar guantes.

h) Los frascos deben ser llenados completa-

mente y de manera rápida con la muestra yluego resguardadas fuera del alcance de laluz solar.

i) En lo posible, para la preservación en sutraslado al laboratorio (Figura 12), lasmuestras deben ser refrigeradas en cajasde poliestireno de manera inmediata.Para evitar posible contaminación de lasmuestras, no debe añadirse sal al hielo derefrigeración.

j) Se debe mantener un registro de toda lainformación de campo. Para esto se deberállenar una cha de recolección por muestrao conjunto de muestras de las mismascaracterísticas.

k) El muestreo en pequeños cursos de aguadebe hacerse aguas arriba y aguas debajode las fuentes de contaminación, con lainclusión opcional de puntos adicionales

para evaluar el grado de contaminación oasimilación de carga orgánica a lo largo deltramo en estudio.

l) En el caso de aguas subterráneas, deben

considerarse protocolos especícos paraevitar la alteración de las muestras. Entrelos datos que se deberán registrar están:

- Tiempo de bombeo,

- Profundidades de donde se realizaron las re-colecciones,

- Profundidad del pozo,

- Profundidad de los niveles estático y dinámico,

- Tipo de bomba,

- Profundidad del ranurado, etc.

Para determinar si existe una relación de dosis – efecto,

la muestra de agua debe evaluarse considerando las si-

guientes proporciones de dilución:

- Sin dilución (100% la muestra),

- Dilución al 50%,


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- Dilución al 25%,

- Dilución al 12,55%, y

- Dilución al 6,25%.

Las diluciones pueden realizarse con agua hervida de

grifo o agua destilada, la misma que deberá utilizarse

también para el control negativo o blanco.

Figura 11. Toma de muestra para ensayos. Figura 12. Lectura de micronúcleos en microscopios.


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Medición de micronúcleos

Para el ensayo con bulbos de Allium cepa (cebollines),se debe seleccionar el número necesario o suciente debulbos con el mismo tamaño y apariencia. Se recomien-

da bulbos con diámetro de 1 cm. Mínimamente debe-

rá considerarse un número de 140 bulbos, 20 para el

control negativo o blanco (agua de grifo o destilada), 20

para el control positivo (muestra sin dilución) y 20 para

cada una de las diluciones de la muestra (80 bulbos). Los

restantes 20 servirán para reemplazar algún imprevisto.

En cada caso deberán realizarse 2 réplicas de 10 bul-

bos cada una. Si se ve por conveniente, también puede

hacerse 3 réplicas para facilitar luego la aplicación de

análisis estadístico. De usarse cabezas de cebollas más

grandes, tres son sucientes por tratamiento.

Para proceder con los ensayos se deberá seguir la si-

guiente secuencia de acciones:

1) Preparación de cebollines: Con un estileteu cuchillo muy no, de la zona radicular sedebe quitar o cortar con cuidado todas lasraíces. Se debe evitar lastimar la coa olugar de nacimiento de las raíces. Luego sedebe retirar la cascara externa de la cabezadel cebollín y nalmente cortar las hojasdejándolas con unos 5 a 7 cm de longitud

(Figura 13).

2) En vasos de precipitados o en copasde coctel con agua hervida de grifo odestilada (2 réplicas por tratamiento), sedebe colocar 10 bulbos, asegurándoseque la zona radicular quede en contactocon el agua (Figura 14), pero nunca

tocando la base o fondo del vaso porquese inhibiría el crecimiento radicular. Sepuede insertar y sujetar los 10 tallos conpalitos mondadientes.


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Figura 13. Cebollines preparados para serensayados

3) Dejar reposar en esta agua, a temperaturaambiente, por 48-72 horas hasta que lasraíces alcancen una longitud de 1 – 1,5 cm.

4) Al segundo o tercer día, según elcrecimiento de las raíces (en invierno estassuelen crecer más lentamente), sacar elmanojo de cebollines del agua, lavarloscon agua hervida de grifo y colocarlos en

la muestra de agua que se está evaluando(control negativo, 6,25%, 12,5%, 25%,50% y 100%, si fuera necesario tambiénen control positivo) todo por duplicado otriplicado).

Figura 14. Bulbos de cebollines enagua hervida de grifo


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5) Dejar el ensayo corriendo por 24 o 48horas. Anotar en el reporte este dato detiempo.

6) A las 24 o 48 horas, sacar el manojo de

cebollines de las muestras de agua, lavarcon agua hervida de grifo o destilada yobservar inicialmente las características delas raíces como color, grosor y forma de laterminación, Se debe contar y medir lasraíces, reportar los datos en una tabla paraprocesarlos.

7) Cortar y colectar las raíces de los 20cebollines de cada tratamiento en vialescon tapa conteniendo la solución deetanol: ácido acético 3:1. Se puede utilizartambién botellitas de antibióticos. Se debeguardarlos por un máximo de 22 horaspara que se jen y detengan los procesosmetabólicos.

8) A las 22 horas se debe cambiar las raícescolectadas a otro vial con etanol al 70%y rotular cada muestra con cuidado. Sepuede colocar dentro del vial, junto con

las raíces, un papel cebolla con el nombrede la muestra, código, fecha, etc. escritocon lápiz negro. Estas raíces están listaspara evaluar micronúcleos. La muestras asípreparadas se pueden guardar hasta tresmeses en refrigeración.

9) Colocar unas cuantas raíces, puedenser 5, en un tubo con solución de ácidoclorhídrico (HCl) 1 N, tapar y dejar en bañoMaría de 3 a 5 minutos. Si no se cuentacon baño María, se puede usar un vaso conagua hervida. Se debe cuidar que el vial no

se abra cuando está en el baño María.

10) Sacar 1 a 2 raíces sobre un portaobjetos,cortar aproximadamente los 3 mm nalesde la raíz y eliminar el resto.

11) Cortar las raíces con el gillete o bisturí,de manera transversal en forma de microrodajas, lo más namente posible.

12) Añadir una gota de orceína acética y dejar10 a 15 minutos. Si se seca, añadir másorceína acética.


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13) Tapar con un cubreobjetos, presionar fuer-temente y repiquetear con la goma de unlápiz.

14) Observar al microscopio, ubicar campos

donde las células estén dispersas, contar

1 000 células por placa. Esta acción deberealizarse por duplicado.

15) Reportar las células que contengan uno omás micronúcleos (Figura 15).

Figura 15. Células binucleadas presentando más de 3micronúcleos


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Datos y cálculos

El recuento de micronúcleos se realiza en microscopiobinocular con el objetivo de 40X. El criterio para análisis

de micronúcleos de las células debe cumplir con los si-

guientes requisitos (Fenech 2000; Figura 16):

1) Debe tener morfología idéntica a losnúcleos principales,

2) Debe tener una forma redonda u ovalada,

3) Su diámetro debe estar entre 1/16 y 1/3 delos núcleos principales,

4) Debe tener el mismo color, textura y retrac-ción que el núcleo principal,

5) No debe presentar refringencias (núcleos opartes de núcleos brillosos),

6) Debe estar claramente separado delnúcleo principal,

7) No debe estar sobrepuesto a ninguno delos núcleos,

8) El micronúcleo dudoso será descartado enel análisis.

Figura 16. Célula con núcleo y micronúcleoidentifcado.


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9) Cuando la frecuencia de micronúcleos sea

menor de 3/1 000 (0,3%) se deberá evaluar

un máximo de 3 000 células. Esto para dis-

minuir la probabilidad de que la presencia

de los micronúcleos se pudiese deber a unevento al azar.

La frecuencia de Micronúcleos (MCN %) se calcula comosigue:

MCN%= x 100 Número de células con micronucleos

Número total de celulas contadas

Para el análisis estadístico se puede hacer uso de Micro-

soft Excel y determinar medias y error estándar en cada

grupo experimental, así como el cálculo de la varianza

de todos los tratamientos. Asimismo, se puede utilizar el

t-test Dunnett, que se aplica para determinar la diferen-cia signicativa entre medias del control y los grupos detratamiento (Duan et al, 1999).

Interpretación de


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Resultados

Los resultados son considerados positivos cuando seobserva un aumento signicativo en la frecuencia decélulas con micronúcleos respecto al grupo de control

negativo o blanco. En este entendido, si el número de

micronúcleos (MCN) formados en el agua evaluada es

igual o mayor al doble de los formadas en el ensayo en

blanco, se dirá que el agua tiene riesgos genotóxicos.

MCNmuestra

≥ 2MCNblanco

=> Tiene riesgo genotóxico

Los resultados son considerados negativos cuando no

hay un aumento signicativo en la presencia de micronú-cleos. Es decir, si en el agua evaluada el número de mi-

cronúcleos formados es menor al doble de micronúcleos

formados en el grupo de control negativo o blanco, se

dirá que el agua no tiene riesgos genotóxicos.

MCNmuestra

< 2MCNblanco

=> No tiene riesgo genotóxico

La Figura 17 muestra parte de los resultados con células

de raíces de haba (Vicia faba) y la Figura 18 resultados

con raíces de cebollines (Allium cepa).


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Figura 17. Micronúcleos desarrollados en ensayos concélulas de raíces de Vicia faba (haba).

Figura 18. Micronúcleos desarrollados en ensayos concélulas de raíces de Allium cepa (cebolla).


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Glosario

Aneugénicos: Agente capaz de producir en la célula

que uno o más cromosomas completos de un conjunto

normal falten o se presenten más de una vez.

Clastogénicos: Agente que causa rotura de los cromo-

somas y/o consecuentemente, ganancia, pérdida o reor-

denamiento de los fragmentos cromosómicos

Micronúcleos: Fragmentos de cromosomas o cromoso-mas completos que espontáneamente o por causa de

agentes que rompen cromosomas, como las radiaciones

(agentes que se denominan clastógenos) o que dañan

el huso mitótico, como la vincristina (aneuploidógenos),

quedan fuera del núcleo durante la mitosis.

Mutación: Alteración en la secuencia de ADN. Puede

ser causado por daños producidos por químicos, porradiación o por errores durante la replicación y la repa-

ración del ADN. Entre sus consecuencias están las enfer-

medades genéticas y el cáncer.

Mutagenicidad: Propiedad de agentes físicos o quími-

cos de inducir cambios en el material genético que se

transmiten durante la división celular.

Mutágenos: Un agente químico, físico o biológico que

altera o cambia la información genética de un organis-

mo y causa un incremento en la frecuencia de mutacio-

nes espontanea. Cuando numerosas mutaciones causan

cáncer, se denominan carcinógenos.

Genotóxico: Tóxico o dañino para el ADN. Las sustan-

cias genotóxicas pueden unirse directamente al ADN

o actuar indirectamente mediante la afectación de las

enzimas involucradas en la replicación del ADN y cau-

sando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no

desembocar en un cáncer. Las sustancias genotóxicas noson necesariamente cancerígenas, pero la mayor parte

de los cancerígenos son genotóxicos.


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Bibliografía consultada

Ascarrunz M, Rodrigo G. 2010 Manual de Genética To-

xicológica. 1ra ed. Universidad Mayor de San Andrés La

Paz-Bolivia editor: Mercedes Morales. 252 pp. Capítulo8. La genética toxicológica desde el punto de vista ana-

lítico. 213-245

Duan CQ., Hu B., Jiang XH., Wen CH., Wang Z., Wang YX. 1999 Genotoxicity of water samples from Dianchi-

lake detected by the Vicia faba micronucleus test. Muta-tion Research 426:121-125

Fenech M. 2000 The in vitro micronucleus technique.

Mutation Research 455:81-95

Fiskesjo G. 1985 The Allium test as a standard in environ-mental monitoring. Hereditas 102:99-112

Kong ZM., Zang Y., Wu QL. 1998 Monitoring the geno-toxicity of Lake Taihu, using two kinds of mi-cronucleus

tests. Environmental Pollution 99:279-283

Litter MI., Armienta MA., Farías SS. 2009 IBEROARSENMetodologías analíticas para la determinación y especia-ción de arsénico en aguas y suelos. Editado por CYTED.

Argentina.

Ma TH., Xu Z., Xu C., McConnell H., Rabago EV., ArreolaGA., Zhang H. 1995 The improved Allium/Viciaroot tip.Micronucleus assay for clastogen-icity of environmental

pollutants. Mutation Research 334:185-195

Ma TH. 1999 The international program on plant bioassa-ys and the report of the follow-up study after the hands-

on workshop in China. Mutation Research 426:103-106

Ji Q., Yang h., Zhang X. 1999 Vicia root-micronuclei as-says on the clastogenicity of water sam-ples from the Kui

River near Xuzhou city, People’s Re-public of China. Mu-

tation Research 426:133-135

Majer B., Grummt T., Uhl M., Knasmüller S. 2005 Use of


38/39

plant bioassays for the detection of geno-toxins in the

aquatic environment. Acta hydrochim. Hydrobiology

33:45-55

Minissi S., Ciccotti E., Rizzoni M. 1996 Micro-nucleus testin erythrocytes of Barbus plebejus (Tele-ostei, Pisces)from two natural environments: a bioassay for the in situ

detection of mutagens in freshwater. Mutation Research

367:245-251

Minissi S., Lombi E. 1997 Heavy metal content and muta-genicity activity, evaluated by Vicia faba mi-cronucleus test,

of Tiber river sediments. Mutation Research 393:17-21

Minissi S., Caccese D., Passaume F., Grella A., CiccottiE., Rizzoni M. 1998 Mutagenicity micronucleus test in Vi-cia faba root tips, polycyclic aromatic hy-drocarbons and

heavy metal content of sediments col-lected in Tiber

river and its tributaries within the urban area of Rome.

Mutation Research 420:77-84

Terradas M., Martin M., Tusell L., Genesca A. 2010 Gene-

tic activities in micronuclei: is the DNA en-trapped in mi-

cronuclei lost for the cell?. Mutation research 705: 60-67.


39/39

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