citotoxicidad y genotoxicidad de dos extractos...
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Citotoxicidad y genotoxicidad deCitotoxicidad y genotoxicidad dedos extractos naturalesdos extractos naturales
García Franco, Susana Nora
2003
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:García Franco, Susana Nora. (2003). Citotoxicidad y genotoxicidad de dos extractos naturales.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3650_GarciaFranco.pdf
Cita tipo Chicago:García Franco, Susana Nora. "Citotoxicidad y genotoxicidad de dos extractos naturales". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2003.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3650_GarciaFranco.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRESFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
“ CI TOTOXICIDADY
GENOTOXICI DAD
de DOS EXE. ¡“4'03 NATURALES ”
SUSANA NORA GARCIA FRANCO
Director : Dr. Edgardo J. Wood
Co Director : Dra Eva Kesten
Lugar de Trabaio: Departamento de Química Biológica
Cátedra de Toxicología y Química Legal
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universia. ‘ de Buenos Aires
Tesis presentada para optar al títqu de 3 6 5 oDoctor de la Universidad de Buenos Aires _
N2003
DEDICATORIAS
A mis padres, de quienes recibí amory el tesón que me ha permitido seguir un camino
Amis amigos,por su incondicional presenciapor ser una compañía en los buenos momentos
y un bálsamo en los sinsabores
A mis sobrinos , a quienes mucho quiero
A mi marido, que me acompaña y sostiene.
A mis hijos , que recuerden que son lo que más quiero y en quienes espero
AGRADECIMIENTOS
AlDr. Edgardo J. Wood, por su confianza en mí y en nuestros proyectosypor dar fiterza y optimismoa su alrededor.
A la Dra Eva Kesten, por su apoyo.
A la Dra Eugenia Sacerdote de Lustig,por ser un modeloen el laboratorio y en la vida.
A la Dra Celia Cotode Ravaschino, por hacerme querer la Virología einiciarme en el mundo de los cultivos de células
A Marta León, Ma del Carmen Ríos, Rosa Wainstock,por guiarme en losprimeros pasos en el universo de la investigación
científica
AAna María Ambrosio,por su permanente apoyopersonal yprofesional
A mis compañeros de trabajo
A mis compañeros de la Cátedra de ToxicologíaNorma B. Casabé , Ma Luisa Onetto y Julio Fuchs.
A Baltar 0. Serrano
AMaría Rosa Feullade,por su asistencia en losanálisis estadísticos de este trabajo
AEnrique Peralta y a Mariana Hack,por su ayuda en este escrito
ADios , por sobre todas las cosas, por todo lo que me ha dadoy a la Madre Maria de Schoenstatt por acompañarme en mi andar.
2.
INDICE GENERAL
. INTRODUCCION
2.1
2.2
ANTECEDENTES
MATERIALES VEGETALES
2.1.1 ANCOCHE
2.1.2 ILEX PARAGUAIENSIS
ENSAYOS
. OBJETIVOS
. ESTRATEGIA DE TRABAJO
. MATERIALES Y METODOS
5.1
5.2
MATERIALES
5.1.1 Material Vegetal5.1.2 Células
5.1.3 Medios y Soluciones
5.1.4 Equipos
METODOS Y TECNICAS
5.2.1 Preparación de Sustratos Celulares
5.2.2 Observación al Microscopio y Registro de
Imágenes
5.2.3 Preparación de Extractos Vegetales5.2.4 Recuento de Células Viables
5.2.5 Determinación de la Concen. de Proteínas
5.2.6 Ensayo de Acumulación de Colorante
12
13
13
16
22
31
33
35
36
36
36
37
40
42
42
42
42
45
45
5.2.7 Ensayo de Toma de Rojo Neutro5.2.8 Determinación de Actividad de LDH
5.2.9 Ensayo de Eficiencia de Clonado
5.2.10 Ensayo del Cometa
5.2.11 Toxicidad Aguda
5.2.12 Toxicidad Repetida5.2.13 Toxicidad Crónica
5.2.14 Evaluación Estadistica
6. RESULTADOS
6.1 ANCOCHE
6.1.1 TOXICIDAD AGUDA
6.1.2 TOXICIDAD REPETIDA
6.1.3 TOXICIDAD CRONICA
6.2 ILEX PARAGUAIENSIS
6.2.1 TOXICIDAD AGUDA
6.2.2 TOXICIDAD REPETIDA
6.2.4 TOXICIDAD CRONICA
7. DISCUSION
7.1 ANCOCHE
7.2 ILEX PARAGUAIENSIS
8. CONCLUSIONES
9. BIBLIOGRAFIA
46
47
49
50
51
51
52
53
56
58
77
88
100
102
118
128
140
142
147
159
164
10. RESUMEN
INDICE DE IMAGENES
coqpmpuN-s
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA (a)
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA (b)
. ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA (a)
ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA (b)
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EFICIENCIA DE CLONADO
ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EFICIENCIA DE CLONADO
. ANCOCHE, TOXICIDAD AGUDA, ENSAYO DEL COMETA
. ANCOCHE, EXPOSICION REPETIDA, 1er PASAJE
. ANCOCHE, EXPOSICION REPETIDA, 81oPASAJE
10. ANCOCHE EXTR. ACUOSO, EXP REPETIDA, ENSAYO DEL COMETA
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
ANCOCHE, EXPOSICION CRONICA, 1er PASAJE
ANCOCHE, EXPOSICION CRONICA, 4m PASAJE
ANCOCHE, EXPOSICION CRONICA, 9no PASAJE
YERBA MATE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA (a)
YERBA MATE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA (b)
YERBA MATE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA (a)
YERBA MATE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA (b)
YERBA MATE, EFICIENCIA DE CLONADO
YERBA MATE, EXPOSICION REPETIDA, 1er PASAJE
YERBA MATE, EXPOSICION REPETIDA, 810 PASAJE
YERBA MATE, EXPOSICION CRONICA, 1er PASAJE
YERBA MATE, EXPOSICION CRONICA, 4to PASAJE
YERBA MATE, EXPOSICION CRONICA, 9no PASAJE
INDICE DE GRAFICOS
Om‘üN-l
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA
. ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION REPETIDA
. ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION REPETIDA
. ANCOCHE EXTR. ACUOSO, EXP. REPETIDA, ENSAYO DEL COMETA
. ANCOCHE EXTR. METAN., EXP. REPETIDA, ENSAYO DEL COMETA
173
81
82
68
87
72
73
75
82
83
86
97
98
99
105
108
110
111
1 15
123
124
137
138
139
83
77
79
84
85
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION CRONICA (a)
ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION CRONICA (b)
ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICON CRONICA (a)
ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICON CRONICA (b)
YERBA MATE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION AGUDA
YERBA MATE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION AGUDA
YERBA MATE EXTRACTO ACUOSO, EXPOSICION REPETIDA
YERBA MATE EXTRACTO METANOLICO, EXPOSICION REPETIDA
YERBA MATE EXTR. AC., EXP. REPETIDA, ENSAYO DEL COMETA
YERBA MATE EXTR. METAN., EXP. REPTD., ENSAYO DEL COMETA
YERBA MATE EXTR. ACUOSO, EXPOSICION CRONICA (a)
YERBA MATE EXTR. ACUOSO, EXPOSICION CRONICA (b)
YERBA MATE EXTR. METANOLICO, EXPOSICION CRONICA (a)
YERBA MATE EXTR. METANOLICO, EXPOSICION CRONICA (b)
INDICE DE TABLAS
1
2
3
4
6.
6
7
8
. ANCOCHE CI 50
. ANCOCHE EXTRACTO ACUOSO, EFICIENCIA CLONADO
. ANCOCHE EXTRACTO METANOLICO, EFICIENCIA CLONADO
. ANCOCHE, EXPOSICION AGUDA. ENSAYO DEL COMETA
YERBA MATE Cl 50
. YERBA MATE EXTRACTO ACUOSO, EFICIENCIA DE CLONADO
. YERBA MATE EXTRACTO METANOLICO, EFICIENCIA DE CLONADO
. YERBA MATE, ENSAYO DEL COMETA
88
90
92
94
102
107
1 18
120
125
128
128
130
132
134
68
69
70
74
112
113
113
118
Fe de Erratas correspondiente a IaTesis Doctoral
CITOTOXICIDAD Y GENOTOXICIDAD DE DOS EXTRACTOS NATURALES
Susana Nora García Franco; 30 de diciembre de 2003
1 ) Página 26
c. - Estudio del Metabolismo y de la
Biotransfonnación de los Xenobi'óti'cos
Para estos casos el sistema más utilizado es la preparación de
hepatocitos frescos .......... ia búsqueda de la actividad enzimática de tipos l y II
en el sistemas ............. ..
Se aclara que
los sistemas enzimáticos de tipo I comprenden a las enzimas de
localización subcelular que actúan en reacciones de hidroxilación, óxido /
reducción, hidroliticas (esterasas, amidasas)
En cuanto a sistemas enzimáticos de tipo Il , se refiere a todas las enzimas
involucradas en reacciones de conjugación como ser Glucuronidación,
Sulfatación, conjugación mercaptúrica.
2 ) Página 34
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
1) Por Ensayos de Genotoxicidad
Ensayo del Cometass'”Debe decir
1) Por Ensayos de Genotoxicidad
Ensayo del Cometa67’“
3) Página 44
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
Ensayo de Determinación deConcentración de Proteínas“69
Debe decir
Ensayo de Determinación deConcentración de Proteínas”70
4) Página 50
Explicación sobre el cálculo de Ponderación del Daño
Siendo f niv i = número de núcleos en cada nivel de daño
ID= (1xfniv1+2xfniv2+3xfniv3+4xfniv4)l 5
5) Páginas 58 y 63
El eje de abcisas en los gráficos 1 y 2 debe decir Concentración de
Extracto gg l ml (Se elimina la palabra log)
La escala de representación de ese eje es logaritmica
6) Páginas 64-76 y80
En la evaluación estadística de la Tendencia de los datos:
Se suprimen los términos "Altamente o marcada” para Ia
significancia de las respectivas tendencias.
7) Páginas 102 y 107
El eje de abcisas en los gráficos 11 y 12 debe decir Concentración de
Extracto ug l ml (Se elimina la palabra log)
La escala de representación de ese eje es logaritmica
8) Páginas 103 - 108 - 121 y 129
En la evaluación estadística de la Tendencia de los datos :
Se supn'men los términos "Altamente o marcada” para la
significancia de las respectivas tendencias.
9) Página 146
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
.....extractosvegetales".
Debe decir
.....extractosvegetales".
10) Página 150
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
..... ..de la literaturam.
Debe decir
..... ..de la literatura75.
Donde dice
....... tubérculo de Stephanie venosa
Debe decir
....... tubérculo de Stephania venosa76
11) Página 151
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
....... diferentes autores y organizaciones80
Debe decir
......... ..diferentes autores y organizaciones77
Donde dice
...... ............ ..en publicaciones anteriores31
Debe decir
..............en publicaciones anteriores”
Donde dice
............técnica a ser usada para ensayos de toxicidadin vitro”.
Debe decir
..........técnica a ser usada para ensayos de toxicidadin vitro".
Donde dice
......... ..preciso y que brinda una rápida indicación de toxicidad”.
Debe decir
......... ..preciso y que bn'nda una rápida indicación de toxicidad“.
12) Página 152
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
....... ..el grado de toxicidad agudaa4
Debe decir
....... ..el grado de toxicidad aguda"1
Donde dice
......... ..individualcon un alto grado de sensibilidad“.
Debe decir
......... ..individualcon un alto grado de sensibilidad".
13) Página 155
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
......... procesamiento de cientos o miles de muestras“.
Debe decir
......... procesamiento de cientos o miles de muestras”.
14) Página 156
corrección en los números de las citas bibliográficasDonde dice
....... .. bien descripto por Zucco y colaboradores87 y la ampliación yactualización".
Debe decir
..............está muy bien descripto por Zucco y colaboradores“ y la
ampliación y actualización“.
Donde dice
Existe una publicación”
Debe decir
Existe una publicaciónse
15) Página 157
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
Las líneas genéticamente modificadas” y ................
Debe decir
Las líneas genéticamente modificadasa7y ............. ..
Donde dice
con las ICSOde algunos productos”.
Debe decir
con las ICSOde algunos productos“.
16) Página 158
corrección en los números de las citas bibliográficas
Donde dice
que podría brindar nueva luz sobre este campo”.
Debe decir
que podría brindarnueva luz sobre este campo".
Donde dice
satisfactorias garantías de inocuidad en una nueva publicación93......... ..
Debe decir0satisfactorias garantías de inocuidad en una nueva publicacióna ...........
17) Página 160
corrección en los números de las citas bibliográficas
Existe evidencia en la literatura de actividad insecticida de algunos
extractos vegetales entre otros”. También se ha reportado un informenegativo
sobre la utilidadde algunos extractos para esos fines”.
Otros son promison’os como protectores para algunas patologías93 o
sistemas25 o por sus propiedades antioxidantesM‘”. Aunque se describen
también n'esgos en este sentido“ y para ello se proponen ensayos para
evaluación de riesgo”.
18) Página 165-172
se copia la Bibliografía por orden de apariciónen su totalidad
10.
11.
12.
13.
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DUCCI
INTRODUCCION 8
El reino vegetal representa un reservorio extraordinario de nuevas moléculas
químicas bio-activas. El interés por un gran número de productos tradicionales de
origen natural ha ido aumentando1 ’ 6. Sin embargo, sólo un pequeño porcentaje de
las 500.000 especies de plantas del mundo se han investigado fitoquímicamente y,
de ellas, las que se han estudiado buscando efectos biológicos o farmacológicos son
apenas una pequeña porción.
El desarrollo de drogas y productos para diferentes aplicaciones en algunos
casos es el resultado de estudios colaborativos o interdisciplinariosque se inician en
el descubrimiento y aislamiento de compuestos químicos naturales, principalmente
de plantas. En este desarrollo es necesario efectuar una evaluación del riesgo
potencial que implicaría la exposición a los agentes involucrados. Estos pueden ser
fármacos, productos cosméticos, alimentos o aditivos, herbicidas o insecticidas.
Uno de los principales objetivos del toxicólogo es proveer información precisa
sobre el aseguramiento del peligro a Ia exposición y por lo tanto a la efectiva
prevención de los potenciales problemas de salud derivados de esa exposición.
Existen variedad de aproximaciones y se han desarrollado muchas técnicas
de monitoreo7para evaluar a la población expuesta a potenciales xenobióticos.
El aseguramiento “total” del riesgo implicaría un sistema muy complejo de
ensayos y sería ¡mpracticable para todo tipo de agente en estudio.
En los últimos setenta años, las estrategias de evaluación de los productos de
estas categorías, englobados por Ia Toxicología y la Farmacología, se han basado
en procedimientos que implicanel uso de animales enteros.
Desde hace poco más de veinte años se ha estado trabajando en el
desarrollo, la validación y la implementación de técnicas de reemplazo que
involucran principalmente el uso de sistemas ¡n vitro.
Se espera que este tipo de ensayos de algún modo aporte mayor información
en el aseguramiento de riesgo. Pero el rol que estos desempeñen o el vigor que
posean para estos fines dependerá del tipo y sistema de ensayos que se esté
empleando.
Numerosas organizacionesa dan apoyo a este tipo de tecnología como ser la
CAAT (Center for Altematives to Animal testing) ERGATI' (European Research
Group for Altematives in ToxicityTesting), el programa de MEIC (The Multicenter
INTRODUCCION 9
Evaluation of In vitro Cytotoxicity) y la FRAME (Fund for the Replacement of Animals
in Medical Experiments) entre otras.
La línea de trabajo que se eligió se enmarca en la filosofía de ECVAM
(European Centre for the Validation of Alternative Methods) que promueve la
aceptación científica y regulatoria de métodos de relevancia en las bio-ciencias que
tienden a reducir, refinar y/o reemplazar el uso de animales de laboratorio.
Uno de las primeras prioridades de ECVAM ha sido poner en práctica
procedimientos que le permita llegar a estar bien informada sobre el estado del
desarrollo y de la validación de la prueba en sistemas libre de animales y del
potencial para la incorporación de pruebas alternativas en procedimientos
reguladores.
Como se definió’ en su momento, ha sido y es un gran desafío el desarrollar
y validar técnicas in vitro que permitan hacer de ellas una práctica de aplicación
cada vez más frecuente y confiable.
Para la evaluación de la toxicidad de agentes químicos existe un considerable
interés por desarrollar ensayos cortos de citotoxicidad ¡n vitro, basados en cultivos
celulares”. Esto no evitaría el uso de animales, pero disminuiría la proporción de
los mismos en estos estudios y permitiría la determinación de la dosis letales o
efectivas a través de una aproximación más económica y rápida". El desarrollo
tecnológico en las áreas de cultivos celulares y de las técnicas bioanalíticas, ha
abierto nuevas oportunidades a la evaluación de toxicidad por técnicas ¡n vitro".
Ese tipo de ensayos ofrece además la posibilidad de detectar cambios
celulares tempranos que podrían ser inadvertidos in vivo13
La Toxicología in vitro ha surgido de este modo como una verdadera rama de
la Toxicología“.
El propósito de este trabajo es evaluar el potencial citotóxico y genotóxico de
extractos de Ancoche (Valesia glabra) y de Yerba mate (¡lexparaguaíensis).
El potencial de Ancoche como bio-insecticida . ha despertado mi interés por
obtener más datos sobre este material.
Por otra parte, el hábito de gran parte de Ia población humana rioplatense en
el consumo de yerba mate otorga importancia a este material vegetal como para
que lo seleccione para este trabajo.
lNTRODUCCION 10
Organización del Escrito:
A continuación se explica brevemente cómo está organizada la presentación
de este trabajo de tesis.
El mismo está compuesto de las siguientes secciones: Introducción,
Antecedentes, Objetivos, Estrategia de Trabajo, Materiales y Métodos. Resultados,
Discusión, Conclusiones y Resumen. La Bibliografía se presenta por orden de
aparición y por orden alfabético del primer autor al final del escrito.
La lntrgduccign hace una breve referencia sobre los materiales vegetales y
sobre los ensayos in vitro.
En los Antecedentes se refieren los aspectos generales que describen a los
productos naturales que nos conciernen, así como también una idea general sobre
el por qué del uso de los sistemas in vitropara estos propósitos. Se indica además la
Estrategia de Trabajo seguida.
En la Sección Materiales y Métodos se describen en forma detallada todos los
materiales e insumos utilizados, con las consideraciones teóricas pertinentes.
Los Resultados son expuestos en forma de gráficos, tablas e imágenes
realizando breves comentarios de cada una de ellas.
Se divide esta parte en dos capítulos, una que corresponde a los resultados
de Val/asiaglabra y otra para Ilexparaguaiensis.
A su vez cada uno se compone de tres secciones:
Toxicidad Aguda
Toxicidad Repetida
Toxicidad Crónica
La Discusión se realiza en base a los resultados obtenidos, en forma
individualo por grupo de experimentos.
Las Conclusiones son presentadas al final de la Discusión.
EI Resumen hace una breve reseña de los trabajos realizados, los resultados
obtenidos y las conclusiones a las que se arribó.
ANTECEDENTES 13
2.1 MATERIALES VEGETALES
2.1.1 Vallesia glabra o Ancoche
La Vallesia glabra (Apocinaceae) fue descripta por primera vez en 1799 por
Ruíz y Pavón 15
Su distribución geográfica está bien definida, y ocupa una amplia zona quese extiende desde el norte de la Provincia de Córdoba hasta California en Estados
Unidos de Norteamérica. Además fue observada en Florida, Méjico, Islas
Galápagos, Yucatán, Cuba, Bahamas, Colombia, Norte de Brasil, Perú, Bolivia,
abundando en la R. Argentina, especialmente en las provincias de Córdoba,
Santiago del Estero, Tucumán, Salta, La Rioja, Catamarca y Jujuy.
En la Argentina esta familia cuenta con 16 géneros y 41 especies
ampliamente distribuidas en zonas del norte y centro del pais.
Recibe diferentes nombres regionalmente
Anquchi - s. Fit. Vallesia glabra. Una variedad de árbol significado dado según el
diccionario quichua castellano “el quichua de Santiago del Estero” de Jorge R.Alderetes.
Cacaragua o Sitabaro o Citabaro, cutabaro en Méjico
Otros Sinónimos o nombres latinos“:
Rauwolfia glabra Cav., Rauwolfia oppositiflora (Sesse y Mocino),
Vallesia cymbifolia (Ortega) o
Vallesia dichotoma también dado por Ruiz López & Pavón.
Otros nombres comunes según la región: pearlberry (California),huelatave,
huetatave, otave
El nombre ANCOCHE con que usualmente se hace referencia a este arbusto en
Argentina, fue tomado o derivado del quichua .
Hábitat y Características Botánicas 17;
Arbusto siempre verde, a veces forman matorrales de 2 a 3 m de altura,
delgado, ramificado, pulvurulento (cubierto de polvillodiminuto); hojas angostamente
oblongo-lanceoladas (más largas que anchas en forma de lanza), ampliamente
ANTECEDENTES 14
cuneadas (en forma de cuña) a redondeadas en Ia base, puntiagudas o ligeramente
puntiagudas en el ápice; flores, de color blanco; fruto colgante oblongo, traslúcido;
semillas de 2,5-3 mm de diámetro.
Florece en primavera. En la región de estudio crece de forma silvestre en
sitios cercanos a los asentamientos humanos, en general en tierras áridas,
aluvionales, arenosas, pedregosas, poco ricas en humus y con agua a poca
profundidad. Busca sol fuerte y radiante Es originaria de América Tropical.
Las Apocináceas poseen gran importancia económica por el valor medicinal,
ornamental y forestal de muchas de sus especies; también incluyen plantas
productoras de caucho y plantas tóxicas.
Se ha recomendado su uso colocando plantines en planes de restauración de
zonas dañadas en suelos moderadamente anegados y algo arenosos".
Propiedades:
En Ia Argentina los trabajos sobre Apocináceas iniciados por T. Meyer en
1947, fueron actualizados” por Ezcurra, C en 1981. Varias Apocináceas han sido
utilizadas desde Ia antigüedad en medicina popular, atribuyéndoseles propiedades
febrífugas, depuratrivas laxantes y antihelmínticas
Por otra parte en 1998 se publicó un trabajo de recopilación del Ing Agrónomo
Inés Gil de Ringuelet”, efectuada en Cruz del Eje, Córdoba, Argentina indica que
"...los lugareños entremezclan con las chauchas, algunas plantas repelentes como el
atamisqui, el paico, el ancoche , que alejan a los insectos de las vainas...
Sus propiedades como antimicrobiano frente a 40 cepas de bacterias fueron
descriptas“22 en Cuba para compuestos derivados de Apocináceas .
Un estudio efectuado por la Cátedra de Fitoquímica23 del Instituto de
Vegetales de Ia Universidad de Tucumán ha demostrado que algunos extractos de
propóleos provenientes de varios vegetales entre ellos Ancoche obtenidos en
Cerrillos, Santiago del Estero, tienen actividad antibacteriana contra bacterias gram
(+).
Estudios más recientes24 demostraron que extractos metanólicos de hojas
verdes de Vallesía glabra presentan propiedades anti-insectos, toxicidad aguda en
Artemia salina y en Eisenia fetida. Los productos botánicos como bio-insecticidas
ANTECEDENTES 15
son en general de acción lenta, de toxicidad moderada y de degradación muy rápida
en el ambiente, por esto se lo suele registrar como biorracionales (Eco-plaguicidas).
No se conoce el mecanismo de acción, aunque se supone no-neurotóxico,
posiblemente interfiriendocon las fuentes de energía celular.
En Colombia se plantean retos de investigación25 con miras a una utilización
racional e integral de los recursos forestales, siendo de singular importancia las
plantas con efectos biocidas aplicables al control de plagas y enfermedades.
Muchas son tóxicas al consumir las partes vegetativas como los frutos y lasflores.
Otros autores en España , describen la alta toxicidad de las hojas de Adelfa
(Apocinácea) conteniendo sustancias digitálicas que se usan como componentes de
productos raticidas ( lntematura, Guía de Arbustos, España).
Se ha descripto también una actividad antifúngica y de control de fitopatógenoszs.
Composición:
Desconocida, aunque actualmente se han encontrado en muchas de ellas alto
contenido en alcaloides y glucósidos.
Se ha descripto27 en 1982 la presencia de alcaloides en las maderas y hojas
de algunas apocináceas de Costa Rica .
ANTECEDENTES 16
2.1.2 IIexparaguaiensis o Yerba Mate
Datos tomados de Nidia Cobiella28
Datos Históricos
El origen del uso de la yerba mate, alimento básico de los indios guaraníes y
conocida por éstos como CAA-MATE,de cuyos términos "caá" significa en idioma
guaraní "planta o hierba", en tanto que "mate", se supone derivado de la palabra
quichua "mati", con Ia cual designaban a la calabacilla que usaban en general para
beber, se pierde en lo remoto del tiempo.
Los Jesuitas, que se establecieron en la zona que hoy ocupa la provincia
de misiones, mejoraron su cultivo, por lo que allí se ubican los mejores
yerbatales.
Atribuye Ruiz Díaz de Guzmán, en su historia escrita en el año 1612, a
Hernando Arias de Saavedra, el descubrimiento del uso de las hojas de yerba mate,
en 1592.
El médico y naturalista francés Aimé Goujaud, conocido como Bonpland,
inició los primeros estudios científicos sobre la planta de yerba mate, su cultivo y sus
usos. Su libro diario de Botánica con más de 4000 descripciones sistemáticas y el
herbario con 60 000 plantas fueron entregadas por él al Jardín de Plantas de París.
Federico Neumann en 1896 en la Colonia "Nueva Germania" en el Paraguay,
al margen del río Aguaray Guazú, luego de muchos años de fracasados intentos
logró obtener la germinación de semillas de yerba mate, obteniendo por primera vez
en 1901, después del esplendor de la época jesuítica, un producto elaborado con
yerba mate de cultivo.
En 1903, se realizó la primera plantación racional y de importancia, en San
Ignacio, Misiones y a partir del año 1911 comenzó a expandirse el cultivo.
Descripción de la planta
Científicamente se conoció Ia planta de yerba mate en Europa a principios del
siglo XIX con la denominación de "Ilex theazans" dada por Bonpland en 1821, en
tanto que Saint Hilaire. en 1822, denominó "Iles paraguariensis" en las
ANTECEDENTES 17
a
"Memoires du Museúm d'Histoire naturale" o en su "Histoire des plantes plus
remarquables du Brasil et du Paraguay" (1824) a la planta de yerba mate que
encontrara en Curityba, usando esta denominación de especie en razón de que los
antiguos historiadores españoles usaban para el adjetivo "paraguayo" la palabra
latina "paraguariensis".
Tal denominación ha prevalecido sobre las de "Ilex paraguayensis", "Ilex
Mate", "Ilex paraguensis Lambert", "llex paraguaiensis Unger", "Ilex Curitibensis" y
muchísimas otras con las que se le ha descripto.
La yerba mate pertenece a la clase de las dicotiledóneas, diapétales
corolianas, familia de las Aquifoliáceas, del género Ilex, que comprende casi toda la
familia (175 de las 181 especies) dispersas en toda Sudamérica.
Morfología externa
Planta originaria de la América del Sur, abunda en estado silvestre y en
plantaciones cultivadas.
Por lo general en el cultivo y explotación racional, por razones prácticas, se
mantiene su altura entre unos 3 a 6 metros, presentando un corto tronco que se
ramifica a escasa altura del suelo, adquiriendo así, por sucesivas podas, el aspecto
de un pequeño arbusto.
En estado silvestre en cambio, donde necesita unos 30 años para su
desarrollo completo, alcanza alturas de hasta 12-16 metros, formando un
majestuoso árbol, cargado de hojas, de tronco recto de hasta 50-70 centímetros de
diámetro, de corteza lisa y color grisáceo-ceniciento.
Sus hojas perduran en la planta unos tres años. Son alternas coráceas, de
forma cuneiforme, ovales o elípticas, con borde ligeramente dentado. Sus
dimensiones difieren según las variedades, entre 5 y 15 centímetros de largo por 2 a
5 de ancho, más o menos.
Es 100% natural, produciéndose en forma totalmente ecológica. No recibe
ningún tratamiento químico en ninguna fase de su producción y procesamiento.
Composición
Según estudios de Instituto Pasteur de Francia, es una planta muy rica en
ANTECEDENTES 18
Vitaminas, contiene ácido pantoténico que comprende el complejo de Ia vitamina B1
y B2, Vitamina E, A y C prácticamente todas las vitaminas indispensables para Ia
vida.
Walter Hauschild, sobre ocho muestras de producto de cultivo, cosechado en Santo
Pipó (Misiones) consigna los siguientes valores:
MATERIAL %
Extracto acuoso de las hojas 36,1 / 46
Extracto etéreo 5,57 / 9,10
Extracto alcohólico 24,10 /39,70
Azúcar total 7,4/ 11,35
Sacarosa 3,6 / 6,9
Azúcar reducida directamente 1,8 / 4,5
Nitrógeno 1,85 / 2,60
Cafeína 0,97 / 1,79
Sustancias curtientes 7,55 / 11
Celulosa 22,10
Cenizas 5,07 / 6,60
Cenizas de extracto acuoso 2,15 / 3,34
Propiedades
Actúa como estimulante natural por su contenido en mateína, no produce
hábito y es más sana que el té y el café.
Es energética, su uso activa Ia vida cerebral, excita el aparato locomotor y
demás funciones del organismo debido a su calidad tonificante; es diurético y es un
suplemento dietético. Tiene propiedades digestivas y Iaxativas. Se Io utiliza en
bebidas calientes, como el mate cocido o el mate, y como bebida fría en el Tereré.
Cosecha y Elaboración
La cosecha consiste en el cuidadoso corte de las ramas, cargadas de hojas,
ANTECEDENTES 19
mediante tijera, machete o serrucho, según el grosor de las ramas a cortar. Se
efectúa preferentemente entre los meses de mayo a octubre, cuando la planta ha
detenido la circulación de su savia y en que cuenta con un mayor porcentaje de
hojas maduras. Luego se procede a Ia "quiebra" delas ramas y se separan.
El tratamiento de las hojas, que comprende el "sapecado", el "secado o
secanza" y el "canchado", debe iniciarse dentro de las 24 horas de cosechadas, con
el fin de evitar su fermentación o sea su pérdida.
Sapecado:
Consiste en la exposición de !as hojas, en un proceso primario y rápido (20 a
30 segundos) a la acción directa de un fuego vivo que al formar vapor de agua en el
parénquima foliar mata al protoplasma, destruye los fermentos y , previa formación
de pequeñas ampollas, raja la epidermis de la hoja con un ligero crepitar.
Con la destrucción de los fermentos, se impide la oxidación de las sustancias
tánicas contenidas en la hoja, asegurando la conservación de su color verde. Según
algunos autores, durante el sapecado Ia yerba mate adquiere su característico
aroma, que se atribuye a un aceite etéreo, con pérdida del sabor a hoja verde otisana
Secado:
Dentro de las 24 horas siguientes al sapecado, Ia hoja debe ser sometida a un
proceso de secado y ligera torrefacción hasta reducir su contenido en humedad, a
aproximadamente un 5 a 6%, disminuyendo consecuentemente en peso que, con
relación a cada 100 kilogramos de hoja "verde" queda reducido, según haya sido la
madurez de las hojas cosechadas, a unos 23 kilogramosde yerba mate seca con un
5% de palitos.
Canchado:
Secada la yerba, con el fin de facilitar su embolsado y transporte, se somete a
un grosero proceso de trituración, fraccionándolo en pedazos más o menos
pequeños, y por lo general no mayor de un centímetro cuadrado
ANTECEDENTES 20
Después de canchada, la yerba se estaciona, embolsándola en bolsas de
arpillera durante un periodo mínimo de nueve meses
Molienda:
La yerba mate canchada y estacionada es la materia prima que los
industriales molineros, mediante sucesivas operaciones de trituración, zarandeo y
mezclas, adecuan al uso de cada región.
Finalizada Ia clasificación se procede a su mezcla en distintas proporciones,
según calidad, origen, sabor, grado de molienda, etc. con agregado o no de "palos",
cortados previamente en trozos uniformes .
Se elaboran así dos tipos bien definidos en su molienda, la integral, vale decir,
con contenido de fibra y palos, denominada de "tipo paraguayo" y la molienda "sin
palos ni fibra" de "tipo argentino".
El Código Bromatológico de Argentina define a la yerba mate como el
producto formado por las hojas del "Ilex paraguariensis" (Saint Hilaire) desecadas,
ligeramente tostadas, rotas o groseramente pulverizadas, a veces con fragmentos
de ramas secas jóvenes, pecíolos y pedúnculos florales.
El Reglamento Alimentario, por su parte, para considerarla apta para el
consumo exige además que contenga más del 0,6 por ciento (en sustancia seca) de
cafeína y un extracto acuoso superior al 25%.
Usos
El mate es una típica costumbre de los países del Río de la Plata.
Actualmente la yerba (hoja de yerba mate picada) se puede adquirir en paquetes
de 1/2 y 1 kilo, y en la región productora, fraccionada en bolsitas.
El recipiente en el que se ceba el mate, es el "mate", que puede ser el
tradicional, hecho de calabaza curada, o un jarrito de loza o enlozado, o madera.
La infusión se toma con bombilla, y se puede cebar, dulce o amargo, con agua
que se considera "a punto" unos grados anteriores a la ebullición. Esta costumbre
es bien hogareña en Argentina, aunque actualmente hay lugares en donde se
usan termos, para trasladarse con el equipo de mate, para tomarlo en cualquier
lugar u ocasión.
ANTECEDENTES 21
Actualmente existe un mercado creciente en Europa y partes de Asia, por
Io cual hay también una necesidad de conocer más detalladamente los
compuestos naturales presentes y sus propiedades terapéuticas. Además de los
estudios sobre metilxantinas, últimamente se han realizado investigaciones
acerca de la estructura de los flavonoides, ácidos cafeolínicos y saponina del
mate”.
ANTECEDENTES 22
2.2 ENSAYOS
La estrategia cientifica para la evaluación ¡n vitro de productos naturales con
actividad biológica ha cambiado en los últimos añosa'” 33.
El programa del MEIC, que involucra 96 laboratorios de diferentes países, ha
probado que los datos ¡nvitro podrian predecir el efecto tóxico agudo de compuestos
químicos para humanos. Este proyecto EDIT (Evaluation-Guided-Development of
In vitro Tests) que está en ejecución, tiene como uno de los objetivos un profundo
reemplazo de los animales en la evaluación de la toxicidad aguda a través de una
batería de ensayos?4
Para elaborar una estrategia con el fin de evaluar los compuestos que aquí se
presentan se tuvo en cuenta la vasta experiencia y los consejos vertidos en
congresos y publicaciones sobre estos temas.35 ’37
USO DE LOS CULTIVOS CELULARES
En los últimos años se intenta reemplazar los modelos animales por modelos
biológicos celulares o sub-celulares, por otros de elaboración de datos técnico
matemáticos y por modelos moleculares computarizados.
Ya desde el siglo XIX, la célula es considerada una unidad funcional viviente, con
vida autónoma.
Los primeros intentos de cultivar un fragmento de tejido datan 1907.
En 1943 Earle obtuvo Ia primera línea continua de células de mamífero.
En 1952 se logró el cultivo de Ia primera línea tumoral humana : HeLa.
Con el avance de la tecnologia, considerando también las técnicas moleculares, hoy
en dia es posible cultivar células de casi cualquier origen. Aunque estas lineas no
conservan las características del ¡n vivo por mucho tiempo, se pueden utilizar para
llevar a cabo estudios de sondeo (screening) o preliminares y tienen gran
potencialidad como técnicas alternativas.
Evolución de un Cultivo
Hayflicky Moorhead establecieron tres fases en el ciclo vital de una linea :
(1) Cultivo primario : poblaciones con tiempo de duplicación lento.
(2) Línea primaria : poblaciones con tiempo de duplicación constante y más
acelerado que el anterior.
ANTECEDENTES 23
(3) Linea secundaria: las células presentan signos de senescencia, con tiempos de
duplicación largos, llegando a la degeneración y muerte o a la transformación.
Hay gran variación en la composición y características de las células presentes
en cada fase. Inicialmente en el cultivo primario existe un equilibrio entre las células
multipotentes y las células maduras ya diferenciadas. Este equilibrio puede
quebrarse por las condiciones ambientales, por ejemplo, pasajes seriados a bajas
densidades y con bajas concentraciones de suero y en presencia de hormonas
apropiadas favorecen la diferenciación en detrimento de la proliferación.
Una linea celular puede ser:
a) De vida finita: En general son diploides; no menos del 75% debe tener el
cariotipo de la especie de origen.
b) Continua: Un cultivo primario o una linea celular finita se pueden transformar
espontáneamente en una línea continua, a veces inducida por agentes virales, por
agentes químicos o físicos (radiaciones) o por transferencia de oncogenes.
c) Clonal : Se hace para homogeneizar la población con la que se trabaja.
La curva de crecimiento dg una linea celular luego de que se ha sembrado en un
sustrato o recipiente, se puede dividiren cuatro fases cuya duración depende de quélínea se trate.
Cum de crecimiento de líneacelularFase Decaimiento y
3D . i ¿ ,. . lular
'IIHIIIBcélulasiml
a
12345Bï'3310111213Días de incubación
ANTECEDENTES 24
o Fase de Latencia: El número de células no aumenta, por el contrario puede
disminuir; las células se están reponiendo del shock del repique, reparando los
daños, restableciendo los elementos del glicocalis perdidos durante la
tn'ptinización,finalmente se adhieren al substrato.
o Fase log o de Crecimiento exponencial: Las células se multiplican a la
velocidad óptima. EI crecimiento celular es directamente proporcional al número
de células sembradas, a la velocidad de crecimiento y a la densidad a la cual
sufre inhibición por contacto. En esta fase se mide el tiempo de duplicación de la
población celular, que son características de la línea y de las condiciones en las
que se efectúa el cultivo.
o Fase estacionaria: EIcultivoestá oonfluente; hay un enlentecimiento progresivo
de la proliferación,aumenta la síntesis de proteínas especializadas respecto de
las estructuradas y por un cierto tiempo el sistema permanece viable peroestable.
o Fase de decaimiento o muerte: En este punto se requiere un subcultivode otro
modo el cultivo comenzaría a degenerar y morir.
CULTIVOS CELULARES EN TOXICOLOGÍA
Los cultivos celulares son, desde hace más de 20 años, los modelos libre de
animales más promisorios para ser usados en el campo de la Toxicología y la
Farmacología.
Su relevancia radica, entre otras cosas, en el hecho de ser un sistema muy
simplificado respecto del organismo completo, constituyendo al mismo tiempo una
unidad viviente organizada. Esto hace de los cultivos un modelo interesante y
práctico con vastas posibilidades en el campo de la Toxicología.
Esto permite estudiar efectos tóxicos sobre el modelo humano, que de querer
hacerse ¡n vivo. se vería limitado por aspectos éticos y regulatorios. Esto también
acercaria aún más la posibilidad de extrapolar resultados de citotoxicidad alhombre”.
Los cultivos celulares, tomados como sistema de experimentación, tienen
como limitación la extrema simplicidad respecto de la compleja organización de los
ANTECEDENTES 25
organismos pluricelulares. Esto haría que la aplicación de estos sistemas se vea
limitada a las fases iniciales de la experimentación o de la investigación de los
mecanismos de toxicidaden sistemas celulares específicos.
Sin embargo, hay numerosos desarrollos tendientes a avanzar en parte sobre
esta barrera”. La organización de ensayos de co-cultivo o el uso de baterías de
ensayos a veces con diferentes sistemas celulares, el empleo cada vez más intenso
de las líneas celulares modificadas genéticamente, abre un futuro promisorioen esta
aplicación.
Las ventajas“ principales de usar sistemas in vitro basados en cultivos de
células se pueden resumir en:
o Sistemas simplificados altamente reproducibles
o Análisis de mecanismos celulares y moleculares de la toxicidad
o identificación de Daño Precoz
o Reconocimiento de efectos reversibles
o Uso de pequeñas cantidades de sustancia
o Técnicas relativamente simples
o Bajo costo (una vez que se cuenta con el sistema en funcionamiento)
o Respuesta rápida
o Posibilidad de muchas réplicas para evaluación estadística
o Reducción del uso de animales de experimentación
Por otra parte, las limitaciones o desventajas que estos sistemas pueden tener
para estos fines son:
o Sistema muy simplificado respecto de organismo pluricelular
o Condiciones de exposición diferentes a la in vivo
o Algunas sustancias pueden interaccionar con componentes del medio de cultivo
o No se pueden estudiar efectos tóxicos mediatos (hormonas)
o No se pueden evaluar todos los mecanismos de toxicidad en un único sistema
experimental
o Más desarrollado para toxicidad aguda
o Todavia hay dificultad para correlacionar concentración activa ¡n vivo con la in
vitro.
ANTECEDENTES 26
El uso de los cultivos celulares en Toxicología se puede aplicar a
a. Ensayos para la evaluación de sustancias potencia/mente tóxicas.
Son ensayos de tipo predictivo del riesgo in vivo. Estos sistemas en general
utilizan una amplia gama de líneas celulares, los ensayos son cortos y simples. Por
el bajo costo que requieren pueden ser aplicados no sólo por empresas privadas
sino por Instituciones o Establecimientos de tipo estatal. Sin embargo, requiere un
costo inicial de instalación del laboratorio y manejo de las técnicas por personal
capacitado
b. - Estudios de Mecanismos de Toxicidad
En este aspecto el sistema celular usado dependerá de la necesidad de
estudiar en detalle algún modelo órgano-efecto. Se adoptan ensayos que
resguardan la integridad de las estructuras o las funciones particulares del sistema
celular usado, que permitan por tanto una evaluación efectiva. Se usan
principalmente cultivos primarios o sistemas celulares aislados.
c. - Estudio del Metabolismoy dela
Biotransfonnación de los Xenobióticos
Para estos casos el sistema más utilizado es la preparación de hepatocitos
frescos, dado que el hígado es el órgano donde ocurren la mayor parte de las
transformaciones metabólicas de los xenobióticos. Actualmente se están empleando
también otros sistemas celulares como por ejemplo la búsqueda de la actividad
enzimática de tipos I y IIen el sistemas reticqu histiocitario, en células de intestino y
de la epiderrmis4G
d- Estudios de la Genotoxicidad
Se pueden llevar a cabo estudios de la sintesis de ADNno esperado (UDS),y
por el Ensayo del Cometa Ensayos de Reparación y De Evaluación del Daño.
ANTECEDENTES 27
La células nucleada eucariota tiene dos formas de muerte:
por necrosis y por apoptosis.
El proceso degenerativo que lleva la célula a la muerte por necrosis ocurre
enseguida que el daño se ha extendido a la célula.
Por el contario, la muerte por apoptosis es un proceso activo. En general se
presenta como respuesta a cambios en el micro ambiente, por estrés o por
exposición a agentes físicos o químicos. En estos casos, según la intensidad del
estímulo, la célula puede devenir en apoptosis o, si el efecto es muy intenso, morir
por necrosis.
La célula está en un estado permanente de equilibrio entre proliferación,
senescencia, apoptosis, diferenciación, envejecimiento y transformación neoplásica,
como respuesta a diversos estímulos. EI resultado del enfrentamiento con
sustancias, dependerá de la intensidad del estímulo y el estado particular de Ia
célula al recibirlo.
AI trabajar con cultivos celulares como sistema para las evaluaciones
toxicológicas, se debe tener en cuenta :
1) La morfología por observación de las células individuales (a mayor
aumento) o en grupo (menor aumento). Observar el estado de Ia cromatina y Ia
morfología del núcleo, la presencia de estructuras citoplasmáticas anómalas y el
comportamiento de adhesividad al sustrato.
2) La alteración de parámetros de crecimiento y metabólicos por medio de
ensayos que evalúen la formación de clones a partir de pequeño número de células
o los niveles de ciertos metabolitos, Ia actividad de algunas enzimas o la evaluación
del estado energético de la célula.
3) La alteración de la Penneabilídad Celular
ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD IN VlTRO
EI empleo de los cultivos celulares en la evaluación de la citotoxicidad de
agentes químicos y otras sustancias está bastante difundidoy es posible encontrar
diversos sistemas comerciales (kits) que incluyen ensayos de cierta simplicidad y
rápida ejecución“.
ANTECEDENTES 28
Mediante el uso de ensayos con cultivos de células para el llamado
"screening" o en las primeras etapas de evaluación de un producto, se obtiene un
resultado preliminar orientativo para realizar ensayos ulteriores ¡n vivo o ¡n vitro que
resolverán mecanismos o detalles sobre el mismo42'“.
Los ensayos que se emplean en estas primeras etapas de evaluación se
agrupan dentro de lo que se llama Ensayos de CitotoxicídadGeneral, aunque estecriteriono está totalmente resuelto“.
Este tipo de ensayos va dirigido a evaluar la actividad proliferativa de la
célula, están relacionados con la actividad basal de la célula y la respuesta al agente
tóxico al que se ve expuesta es independiente de las caracteristicas morfo
funcionales específicas.
La robustez de estas afirmaciones se ha logrado luego de la acumulación de
datos concordantes sobre el poder citotóxico de un importante número de
sustancias, utilizandodiferentes líneas o sistemas celulares en diversos ensayos in
vitro en múltiples laboratorios del mundo45'46.
Los ensayos pueden realizarse47sobre células de lineas estabilizadas por ser
éstas de fácil disponibilidad y por presentar estos características de altamente
homogeneidad respecto de las de los cultivos primarios. Como las líneas
estabilizadas carecen de los sistemas que permiten la transformación metabólica del
xenobiótico, se verán los efectos relevantes de la sustancia sólo en su forma
originaria, y no metabolizada , como se veria en un organismo entero.
De cualquier modo para hacer una predicción sobre la toxicidad en el hombre
si se dispone de líneas celulares humanas es aconsejable este recurso antes quelíneas derivadas de otro mamífero.
La forma de realizar la exposición del xenobiótico con las células ha sido
tema de varias reuniones y las recomendaciones generales y básicas para ensayos
de evaluaciones preliminares (screening) se encuentran bien explicitadas por
FRAME“.
Alser sistemas relativamente simples y económicos, permite la evaluación del
producto en una amplia gama de concentraciones pudiendo reproducir sistemas de
exposición aguda (tiempo breve y dosis altas) o crónicas (lapsos prolongados y
dosis subagudas).
ANTECEDENTES 29
Como los tiempos de exposición también pueden ser variados en algunos
casos esto hasta permite evaluar reparación del daño o reversión de una inhibición
metabólica o que se evidencien efectos de citotoxicidad retardada .
La valoración de la toxicidad se realiza generalmente en forma relativa.
Lo que interesa es definir Ia potencia tóxica de concentraciones razonables ,
generalmente inferiores a 10 '3 M .
TIPO DE ENSAYOS
Actualmente para cuantificar y caracterizar la vitalidad celular, se utilizan
diversos protocolos experimentales que miden Ia capacidad reproductiva y/o la
capacidad funcional de Ia célula.
Permeabilidad de la Membrana Plasmática
Estos ensayos permiten evaluar el estado de Ia célula mediante Ia
o Exclusión de Colorante , como Azul Tripán que puede atravesar Ia membrana
de células dañadas“.
o Acumulación de Colorante , como Rojo Neutro (RN) que Ia célula dañada
pierde Ia capacidad de retener“.
o Liberación de constituyentes celulares al medio de cultivo :
Liberación de Enzimas como Iacticodeshidrogenasa (LDH),fosfatasa alcalina,
galactosidasa, malatodeshidrogenasa,aminopeptidasa
Liberación de ácidos nucleicos, nucleótidos, azúcares y productos de
degradación
o Adhesión al sustrato , éste parámetro se debe cuantificar contando las
células que se encuentran en el sobrenadante aI finaldel tratamiento“.
Inhibición del Crecimiento
En los ensayos de citotoxicidadel parámetro más comunmente considerado es
Ia inhibición de Ia proliferación celular en un cultivo masivo. Esta evaluación se
puede hacer a través de :
o Conteo directo de las células, esto es poco usado por lo tedioso y proclive a
errores del método.
ANTECEDENTES 30
o Eficiencia de Clonado, estima en una población qué fracción de células está
en estado de reproducirse. Mide la verdadera integridad reproductiva de la célula".
o Determinación Indirecta del Número de Células, por determinación
cuantitativa de componentes endógenos de la célula: proteínas53 ADN. ARN o de
colorantes que reaccionan con éstos en las células frescas (RN)54o con las células
fijadas y teñidas con Cristal Violeta(CV)“.
o Interferencia con el Ciclo Celular como el Ensayo de determinación del Indice
Mitótico
o Incormración de Precursores Marcados en la Célula, estos ensayosevidencian la inhibiciónde la síntesis de una o más macromoléculas celulares.
Ensayos del Metabolismo o Estado Energético de la Célula
Estos ensayos se basan en el presupuesto de que el daño celular reduce la
capacidad de la célula de mantenerla energía necesaria para ejecutar las diferentes
funciones metabólicas. Evalúan la vitalidad celular midiendo los componentes y las
actividades enzimáticas necesarias para mantener el estado energético de la célula.
Los ensayos más comunmente usados son:
o Mediciones del Nivel de ATP, ADP y AMP intracelular
o Determinación de la Actividad de enzimas involucradas en la sintesis de
ATP: succinato-deshidrogenasa, ensayo de MTT‘G'57
o Determinación de la Síntesis de Proteínas
o Capacidad de mantener Iones y Aminoácidos
o Medición de la Respiración y de la Glicólisis
Ensayos Morfológicos
La observación de la morfología es el modo más simple para evaluar la
normalidad de la célula. Una observación precisa debe ser seguida y documentada,
eventualmente con fotografías en cada pasaje. Es preferible muy frecuentes, breves
y simples observaciones de los cultivos en fresco. al microscopio invertido simple
antes que pocas con alta sofisticación de tinciones y preparación o fijaciones de lascélulas“.
OBJETIVOS 32
Dado el potencial y el uso difundido que tienen desde
hace algunos años los vegetales y algunos de sus derivados
Y
la importancia que tienen los nuevos sistemas de
evaluación tendientes a reemplazar, reducir o replantear el
uso de los animales de laboratorio en Ia evaluación de la
toxicidad
se encararon estos estudios tendientes a:
> Evaluar Ia toxicidad de dos arbustos regionales en
diferentes condiciones de exposición
> Utilizar para eIIo ensayos ¡n vitro
> Comparar Ia toxicidad de los dos vegetales
ESTRATEGIA DE TRABAJO 33
ESTRATEGIA DE TRABAJO 34
Como estrategia para arribar a los resultados se utilizótécnicas in vitro
que evalúan la toxicidad aguda59y otras para la evaluación de Ia toxicidad a
mayores lapsos, por exposición frecuente o repetida“ y por exposicióncrónica“.
Para la exposición a los extractos así como para los controles
negativos se evaluaron los siguientes parámetros de los cultivos celulares:
1) Por Ensayos de Citotoxicidad General62
i) Morfología Celular observaciones al microscopio invertido63
ii) Crecimiento Celular determinación del número de células
iii) Vitalidad por Determinación de Concentración de:
(a) Proteínas
(b) Por Acumulación de Colorante en la Monocapa Fijada (Cristal
Violeta)!“s
2) Por Ensayos de Alteración de la Permeabilidad de la Membrana
i) Vitalidad Celular por Acumulación de Colorante Rojo Neutro
ii) Liberación Enzimática Medición de Actividad de LDH“
3) Por Evaluación de Parámetros Metabólicos y Energéticos“
Ensayo de M'I'l'
4) Por Ensayos de Proliferación"6
Ensayo de Eficiencia de Clonado
5) Por Ensayos de Genotoxicidad
Ensayo del Cometa67‘“
MATERIALESY MÉTODOS ' _
e MATERIALESY MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS 36
5.1 MATERIALES
5.1.1 Material Vegetal
Vallesia glabra: en el presente estudio se utilizaron hojas del arbusto
provenientes de la Provincia de Santiago del Estero (Rio Hondo) fue
botánicamente clasificado por el Dr. Palacios, Director del Laboratorio y
Herbario de Plantas Vasculares del Departamento de Ciencias Biológicas
de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
Ilex paraguaiensis: la Yerba Mate usada en este trabajo es de origencomercial marca Unión. Establecimiento Las Marías. Gobernador Virasoro.
Corrientes
5.1.2 Líneas Celulares
Las líneas de células se eligieron con tres criterios.
a Disponibilidaddentro de las más comunmente usadas para los EnsayosV
de Citotoxicidad General
b Líneas adherentes de origen mamífero, preferentemente humanasV
pasibles de permanecer en cultivos por varias semanas(Toxicidad
Crónica)
Las líneas celulares utilizadas fueron:
o L929
Asociación Banco Argentino de Células ( ABAC),semilla derivada de la
American Type Culture Collection (ATCC) catálogo CRL- 2148
fibroblastos de ratón (Mus musculus) provenientes de la
o MRC5 fibroblastos de pulmón fetal humano normal provenientes de la
Asociación Banco Argentino de Células ( ABAC),semilla derivada de la
ATCC catálogo CCL -171.
Las células fueron amplificadas durante dos pasajes en medio de cultivo
completo y congeladas en nitrógeno líquido para su posterior uso.
MATERIALES Y MÉTODOS 37
5.1.3 Medios y Soluciones
5.1.3.1 Reactivos y Drogas
La calidad y marca de los reactivos utilizados para llevar a cabo este trabajo
fue la srgunente: J
Fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) Anhidro Merck, catálogo 6586
Fosfato di-ácido de sodio (NaH2PO4) - Mono hidrato Merck Catálogo 6346
Cloruro de Sodio (NaCI) - Merck Catálogo 6404
Hidróxido de sodio (NaOH) —Merck Catálogo 6498
Cristal Violeta Merck Catálogo 115940
Rojo Neutro GibCo 15330-079
Azul Tripán al 0,4 % GibCo 15250-061
Alcohol Metílico - Merck Catálogo 106009
Alcohol Etílico - Merck Catálogo 47600983
Acido Clorhídrico - Merck Catálogo 100317
Acido Acético - Merck Catálogo 102211528
Dimetil Sulfóxido Sigma- Catálogo D-8418
Tritón X-100 - Sigma Catálogo H-0613
Tris - Fluka Catálogo 93352
EDTA di sódico - Merck Catálogo 15846
Laurilsarcosinato de sodio - Sigma Catalogo L5777
Bromuro de etidio - Sigma Catalogo E-7637
Agarosa bajo punto de fusión: Promega V211B
Agarosa de punto de fusión normal: Seakem Catalogo 50.000
Tripsina - EDTA GibCo catálogo 15400-054
5.1.3.2 Equipos Comerciales
Para Ensayo de MÏT: Se usó CeIITiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell
Proliferation Assay; Promega catálogo G 5430
MATERIALES Y MÉTODOS 38
o Para Determinación de LDH: Se usó CytoTox 96 Non-Radioactive
CytotoxicityAssay Promega catálogo G 1780.
o Para Dosaie de Proteínas: Se usó BioRad Protein Assay BioRad Protein
Assay Dye Reagent concentrate , 500-0006
5.1.3.3 Agua para la preparación de soluciones
Todas las soluciones, la reconstitución de los reactivos Iiofilizadosy los
medios de cultivo fueron preparados con agua adecuada para cultivoscelulares.
La obtención de este agua se hizo pasando agua de red a través de un
equipo MilliporePR0000002 ó por doble destilación en vidrio en equipo Sanyo
Cyclon Freestrim .
5.13.4 Medios Nutritivos y Factores de Crecimiento
o Medio Mínimo Esencial (MEM) con aminoácidos no esenciales catálogoGibco 41500-034
o Suero Fetal Bovino Gibco catálogo 10270-106 ó 16000
o l-glutamina Gibco catálogo 15039-027, liofilizada, 200 mM, para prepararsolución 100 X
o Antibiótico-Antimicótico Gibco catálogo 15240-061, solución 100 X
conteniendo por ml
10 000 U Penicilina G base, como sal sódica
10 000 pg de Estreptomicina base como sulfato
25 pg de Anfotericina B
5.1.3.5 Medios de Cultivo
. Medio de Crecimiento
Medio de cultivo MEM suplementado con
suero fetal bovino al 10 %
MATERIALES Y MÉTODOS 39
antibióticos y antimicóticos
I-glutamina
. Medio de Mantenimiento
Medio de cultivo MEM suplementado con
suero fetal bovino al 2 %
antibióticos y antimicóticos
l-glutamina
5.1.3.6 PBS Buffer Fosfato Salino pH 7, 4
Na2HPO4 ...... .. 1,128 g
NaH2PO4 ..... .. 0,240 g
NaCI ................. .. 8,5 g
H20.csp 1000 ml
5.1.3.7 Soluciones para Ensayo Cometa
o Agarosa 0,5 % en PBS
o de punto de fusión normal ..150 ul / porta
o de bajo punto de fusión ......150 ul / porta
o Buffer de lisis
o Solución inicial
NaCl....................... ..2,5 M
EDTA ................. .. 100 mM
Tris ....................... .. 10 mM
ajustar a pH 10 con granallas de NaOH
Lauril Sarcosinato de Na ........ .. 1%
. Solución final
Almomento de usar añadir cada 100 ml de buffer de lisis final
Tritón X-100 .............. .. 1m|
DMSO ..................... .. 10ml
o Solución de coloración: 10 x
MATERIALES Y MÉTODOS 40
Bromuro de etidio............ .. 20 ug / ml
o Buffer de Corrida:
NaOH ................. .. 300 mM
EDTA disódico ........ .. 1mM
o Buffer de neutralización:
Tris .......................... .. 0,4M
Ajustar pH a 7,5 con HCl
5.1.3.8 Sustratos para Cultivo
En todos los casos se utilizómaterial descartable marca Corning
5.1.4 Equipos
o Microscopio invertido Nikon TMS
o Incubadora gaseada (CO2) Forma 3121 con camisa de agua
o Cámara Color Sony CCD Iris
o Pipeta inalámbrica Eppendort Easypet
o Video Impresora Sony SSC-C370 P
o Flujo Laminar Vertical de Seguridad Biológica The Baker Company
o Flujo Laminar Vertical de Seguridad Biológica, modelo Class ll A / Bs ,
Forma Scientific
o Espectrofotómetro Spectramax Plus de Molecular Devices
o Espectrofotómetro Biorad Microplate Reader Benchmark
o Cuba de electroforesis.LKB, para geles horizontales
o Microscopio de Fluorescencia Olympus BX60 con Programa Smart
Capture yfiltro red
o Computadora Personal, con Programa de captura de imágenes LeadTek
Win View Video Capture para Microsoft AVIfile format pcl 2.1
o Computadora Personal con Programa para Análisis Estadístico Instat 3.0
MATERIALES Y MÉTODOS 41
5.2 MÉTODOS Y TÉCNICAS
5.2.1 Preparación de los Sustratos Celulares
Todos los cultivos se llevaron a cabo a 37QC en incubadora Forma 3121
gaseada a 5% en 002.Las células se expandieron con medio completo en botellas T75, luego
se pasaron mediante repique con tripsina y se crecieron durante 24 hs en
Toxicidad Aguda: placas de 96 cavidades
Toxicidad Repetida: botellas T25 y placas de 96 cavidades
Toxicidad Crónica: placas de 48 cavidades
Eficienciade Plaqueo: en placas de 6 cavidades durante 72 hsantes de ser sometidas a los tratamientos.
Para los períodos de tratamiento se utilizómedio de mantenimiento.
5.2.2 Observaciones y Registro de Imágenes
Las células fueron observadas bajo microscopio invertido. Las imágenes
de los ensayos de Toxicidad Aguda y Eficiencia de Plaqueo de Ancoche fueron
registradas con cámara y video impresora Sony indicadas en 5.1.4.
EI registro de imágenes para todos los ensayos de llex paraguaiensis y
para Toxicidad Repetida y Crónica de Ancoche se hizo con Programa Leadtekindicado en 5.1.4.
Para los Ensayos del Cometa los preparados fueron observados en
microscopio Olympus indicado en 5.1.4.
5.2.3 Preparación de los extractos
Los materiales ensayados fueron producto del siguiente procesamiento:
Se separaron las hojas, se dejaron secar al aire y una vez secas se molieron.
Se extrajeron con agua bi-destilada (extractos acuosos) o con metanol
(extractos metanólicos) a temperatura ambiente con agitación suave durante
aproximadamente 18-20 hs.
MATERIALES Y MÉTODOS 42
Se dejó decantar y se fraccionó el sobrenadante en alícuotas
conservadas a -20° C hasta el momento de ser ensayadas.
Se pesó una alícuota de 1 ml de cada uno de los extractos así obtenido,
se dejó secar al aire y se volvió a pesar. Se estableció la diferencia de las
pesadas como el contenido en material extraíble. A ese dato se refieren todas
las concentraciones que se mencionan en el presente trabajo y para cada
material la concentración original es la siguiente:
Vallesia glabra Extracto Acuoso: 113 rng/ml
Extracto metanólico: 73,4 mg/ml
IIex paraguaiensis : Extracto Acuoso: 141 mg/ml
Extracto metanólico: 99,6 mg/ml
Preparación de las diluciones de los extractos
En todos los casos las diluciones de los extractos se prepararon enmedio de mantenimiento.
Ancoche :
Exposiciones Agudas : Las concentraciones usadas fueron O (células control)
y desde 3,91 ug / mI hasta 4 mg / ml , para los cultivos tratados tanto para el
extracto acuoso como para el metanólico.
Exposiciones Repetidas: Las concentraciones usadas fueron 100 ug / ml para
el Extracto Acuoso y 25 ug / ml para el Extracto Metanólico.
Exposiciones Crónicas: Las concentraciones usadas fueron
160 y 40 ug / ml para el extracto acuoso y
50 y 12,5 ug / ml para el extracto metanólicoYerba Mate:
Exposiciones Agudas : Las concentraciones usadas fueron 0 (células control)
y desde 3,91 ug / ml hasta 4 mg / ml , para los cultivos tratados tanto para el
extracto acuoso como para el metanólico.
Exposiciones Repetidas: Las concentraciones usadas fueron 50 ug / ml para el
Extracto Acuoso y 25 ug / ml para el Extracto Metanólico.
Exposiciones Crónicas: Las concentraciones usadas fueron
100 y 50 ug / ml para el extracto acuoso y
50 y 12,5 ug / ml para el extracto metanólico
MATERIALES Y MÉTODOS 43
Los controles de células recibieron un volumen de medio de mantenimiento
igual al volumen de la dilución de muestra que recibieron los tratados.
Para el caso de los ensayos con extracto metanólico el control no tratado
o control de solvente (CSV) que se usó fue agregando al medio de
mantenimiento un volumen de metanol equivalente a la que tenia la
concentración más alta de extracto metanólico usada. I
Toxicidad aguda:
CSV ANCOCHE se preparó con 123p| metanol / ml de medio de
mantenimiento.
CSV ILEX se preparó con 90,2 ul metanol / ml de medio de mantenimiento.
Toxicidad repetida:
CSV ANCOCHE se preparó con 40 pl metanol / ml de medio de mantenimiento.
CSV ILEX se preparó con 29,3 pl metanol / ml de medio de mantenimiento.
Toxicidad Crónica:
CSV ANCOCHE se preparó con 1p| metanol / ml de medio de mantenimiento.
CSV ILEX se preparó con 0,8 pl metanol / ml de medio de mantenimiento.
5.2.4 Recuento de Células Viables
Se utilizóel Método de Azul Tripán. Este se basa en la coloración de las
células no viables al tomar el colorante por aumento de permeabilidad de sumembrana.
Se toma una muestra de 50 pl de la suspensión celular bien
homogeneizada, se diluye al medio con solución de azul tripán y se cargan los
dos compartimentos de una Cámara de Neubauer. Se cuentan las células
coloreadas (no viables) y no coloreadas (viables) dentro de los cuatro
cuadrantes y del central y se saca un promedio.
Pv : promedio de células viables.
an : promedio de células no viables.Se efectúa el cálcqu teniendo en cuenta la dilución
°/ode células viables =( ( Pv / (Pv + an) ) X 100
MATERIALES Y MÉTODOS 44
5.2.5 Ensayo de Determinación deConcentración de Proteínas°9'7°
Para elegir este ensayo se tuvo en cuenta que en células proliferantes y
viables la cantidad de proteínas es directamente proporcional al número de
células.
Se efectuó mediante el ensayo de Microplaca de BioRad, basado en el
método de Bradford, por el cual las proteínas se solubilizan en solución ácida y
se pueden cuantificar al unirse al azul brillante de Coomasie G-250
Procedimiento
Pasado el período de exposición de las células a los extractos, se descartaron
los sobrenadantes, se Iavaron las monocapas con PBS. Se lisaron las células
por congelado y descongelado. Diez microlitrosde cada una de las cavidades a
analizar se pasaron a otra microplaca,. Se prepararon concentraciones
conocidas de albúmina bovina en PBS como estándar y también se midieron
sobre la microplaca 10 ul de cada una por duplicado. Se agregaron 200 ul de
reactivo a cada cavidad excepto a los blancos. Se incubó la placa a
temperatura ambiente durante 15 minutos en oscuridad. Se leyó la absorbancia
a 595nm. Se hizo una curva con los datos de los estándares y se calcularon los
datos de concentración de proteínas de las muestras.
5.2.6 Ensayos con Colorantes
Ensayo de Acumulación de Colorante enla Monocapa Fijada:
Tinción con Cristal Violeta (CV)
Este ensayo permite determinar la densidad relativa de célulasadheridas en el cultivo.
El cn’stalvioleta se une al ADN y por solubilización del mismo se puede
cuantificar la cantidad de células, dado que ésta es directamente proporcionala la intensidad de color.
MATERIALES Y MÉTODOS 45
Procedimiento
Pasado el período de exposición de las células a los extractos, se
descartaron los sobrenadantes, se Iavaron las monocapas con PBS.
Se fijaron luego las células con 100 pl de una solución alcohólica de
cristal violeta en cada cavidad y se incubaron las placas a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Se descartó el colorante y se lavó varias veces
con agua. Se dejaron secar las placas al aire. Se eluyó el colorante agregando
200 ul de una solución al 20 % de ácido acético, y se cuantificó por
espectrofotometría a 655 nm.
Se hicieron análisis estadísticos y evaluaron los resultados comparando
los tratados con los controles.
5.2.7 Ensayo de Toma de Rojo Neutro(RN)71
Se llevó a cabo según el Protocolo N 3 de INVITI'OX: The Frame
Modified Neutral Red uptake Cytotoxicity Test.
Este ensayo se basa en que la citotoxicidad de un compuesto,
cualquiera sea su sitio o mecanismo de acción. interferirá con éste, resultando
así en una reducción de la tasa de crecimiento que se ve reflejada en el
número de células. El grado de inhibición del crecimiento, referido a la
concentración del compuesto en estudio, da una idea de la toxicidad . Este
ensayo evidencia las alteraciones en el metabolismo celular y da idea de la
viabilidad global del cultivo.
EI RN (hidrocloruro de 3-amino-7 dimetiI-2-metilfenazina) es un colorante
catiónico débil , soluble en agua,que penetra rápidamente la membrana celular
por una difusión no iónica. Las células sanas acumulan el colorante por unióndel mismo a sitios aniónicos de la matriz Iisosomal. Alteraciones de la
superficie celular o de la sensibilidad de la matn‘z Iisosomal. conducen a una
fragilidad del Iisosoma y a otros cambios que son gradualmente irreversibles.
Estos cambios provocadds por la acción de algún xenobiótico, resultan en una
disminución de la toma y unión de RN, pudiéndose distinguir células viables de
dañadas y de muertas.
MATERIALES Y MÉTODOS 46
La cuantificación por espectrofotometría del colorante extraído de las
células ha sido correlacionado con el número de células viables, tanto por
conteo directo como por determinación de Ia concentración de proteínas.Procedimiento
De células no tratadas (control)y tratadas con los extractos, terminado el
período de exposición se descartaron los sobrenadantes. Se agregó luego
solución de RN, en una concentración final de 50 ug / ml se incubó por tres
horas más a 37°C, luego se observaron bajo microscopio invertido para
determinar la morfología de los Iisososmas y la presencia de colorante en los
mismos; se registraron los datos e imágenes .
Para la evaluación por espectrofotometría se vació la placa de colorante,
se lavó con PBS suavemente dos veces y luego se extrajo el colorante por
elución con 150 ul de solución ácida de etanol ( 1% acético / 50% etanol) y se
cuantificó en espectrofotómetro a 540 nm.
Se hizo el análisis estadístico de los datos y se comparó Ia viabilidad de
las células tratadas con la de los controles.
5.2.8 Ensayos de Evaluación de Actividad Enzimática
y Parámetros Metabólicos
5.2.8.1 Ensayo de LDH72
LDHes una enzima citosólica que se libera de la célula cuando ésta es
Iisada; su medición en sobrenadantes de cultivo da un valor cuantitativo de la
pérdida de viabilidad celular.
La LDH liberada es medida mediante un ensayo enzimático acoplado.
que resulta de la conversión de una sal de tetrazolio, cloruro de 2(p-iodofenil)
3-p-nitrofenil-5-fenil-tetrazolio (INT) en formazán, catalizada por la diaforasa y
es un compuesto coloreado.
MATERIALES Y MÉTODOS 47
LDH
NAD‘ + lactato -’ piruvato + NADH
dlaforasa
NADH+ INT - NAD’ + formazan (rojizo)
La intensidad de color obtenido es proporcional a la cantidad de células
lisadas; es decir es inversamente proporcional a la cantidad de células viables.Procedimiento
Luego del período de exposición. se determinó la actividad de LDH
extracelular sobre 50 ul de sobrenadante de cada cavidad.
Para determinar la actividad de LDHintracelular, se Iavaron las monocapas con
PBS y se lisaron con Tritón X 100 al 9% durante 45 minutos a 37°C ; se usaron
50 ul de cada cavidad lisada para la determinación de actividad enzimática.
Para ello se agregaron 50 ul de mezcla de sustratos (diaforasa + lactato/NAD) ;
se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se frenó Ia reacción con
ácido acético 1M.Se registró la absorbancia a 490 nm.
La proporción de LDHliberada de las células dañadas se calculó como:
LDH ext = actividad de LDH liberado o LDH extracelular
LDH total = actividad de (LDH extracelular + LDH intracelular)
°/oLDH lib = (LDH ext l LDH total) x 100
5.2 8.2 Ensayo de MTT
Se llevó a cabo según el Protocolo N17 de lNVlTTOX: MTT assay,
teniendo en cuenta lo establecido en ATLA24 suplemento1 1996 página 255.
Este ensayo permite evaluar la actividad metabólica de la célula. La habilidad
de las células para metabolizar este compuesto dan una idea de la integridadmitocondrial.
La cantidad de formazan obtenida es directamente proporcional a lacantidad de células viables.
MATERIALES Y MÉTODOS 48
La reacción se atribuye principalmente a las enzimas deshidrogenasas
mitocondriales y a transportadores de electrones de Ia célula sana.
Estos reducen la sal de tetrazolio MTS o reactivo de Owen (3-(4,5
d¡metiItiazoI-2-iI)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonil)-2H tetrazolio) a
formazan. Este es un compuesto coloreado y puede ser cuantificado
eSpectrofotométricamente.
OCH20'3'3H SD; OCchc-DH Sl...-a
l r.s
H El (¡Hg "H s CHE
CHa CHE
MTS ———p. Formazan
Procedimiento
Pasado el período de exposición de las células a los extractos, se
agregaron 20 ul de reactivo; se homogeneizó suavemente y se incubaron las
placas por 1 h a 37 °C en 5% atmósfera de 002. Se determinó la absorbancia a490 nm.
Se hicieron las evaluaciones estadísticas y se compararon los datos detratados versus controles.
5.2.9 Ensayo de Eficiencia de Clonado
Mide el número de colonias que se originan a partir de una sola célula.
Es un ensayo muy sensible y muy usado para determinar requerimientos
nutricionales, medir los efectos de factores de crecimiento y para ensayos
toxicológicos.
MATERIALES Y MÉTODOS 49
Procedimiento:
Básicamente se siguió el procedimiento descripto por Tanaka“.
Placas de 6 cavidades con 100 células por cavidad fueron tratadas con
concentraciones de los extractos del orden de Cl 20%.
Se determinó la eficiencia de clonado (Ef) como el porcentaje de
colonias celulares formadas en las cavidades tratadas respecto del control sin
tratar, a los 10 días pi.
Nt = Número de colonias tratado
Nc = Número de colonias control
Ef = (Nt / Nc) X100
5.2.10 Ensayos para Evaluación del Daño al ADN
Ensayo del Cometa
También llamado ensayo electroforético de células individuales (SCGE ;
single cell gel electrophoresis assay) es un ensayo nuevo rápido, simple,
sensible y económico para medir y analizar la ruptura del ADN en células
eucarióticas. El desenrollamiento de las cadenas de ADN y Ia formación de
fragmentos con diferente grado de organización, que migran en forma
diferencial al ser sometidos a electroforesis, adquieren un aspecto de colas o
cornetas al microscopio óptico, luego de ser teñidos con bromuro de etidio.
Procedimiento
Se siguió la técnica descripta por Singh y colaboradores” con lasmodificaciones de Tice".
Brevemente: Se desprendieron de la placa células provenientes del pool
de dos cavidades (Toxcicidad Aguda) o de la suspensión celular de un T25 al
hacer el pasaje siguiente (Toxicidad Repetida). Alrededor de 1000 células
nucleadas no tratadas (Control)y tratadas con los extractos fueron sembradas
bajo agarosa y analizadas al microscopio de fluorescencia luego de lisadas yde someterlas a electroforesis alcalina tras desenrollar su ADN.
MATERIALES Y MÉTODOS 50
Se determinaron los índices de daño (ID)para varias concentraciones de
droga y se compararon con los obtenidos para los controles. Se registraron los
datos para cada nivelde daño.
Para el cálcqu del Indice de Daño(lD), se hizo una estimación
ponderada de la distribución de los datos.
lD=(1xfniv1+2xfniv2+3xfniv3+4xfniv4)/ 5.La evaluación estadística correspondiente se hizo por regresión lineal y cálculo
del coeficiente r.
5.2.11 Ensayo de Citotoxicidad Aguda59
Se sembraron 20 000 células por cavidad, en placas de 96 cavidades
de modo tal que crecidas durante 18-24 hs, estuvieran en una confluencia del
80 %. Se descartaron los sobrenadantes y se enfrentaron con diluciones de los
extractos (tratadas) o no tratadas (controles). Se hizo el tratamiento sobre 30
cavidades por cada punto de concentración o control. La evaluación por cada
tipo de ensayo se hizo por cuadruplicado para cada concentración de extracto
y los controles de células.
Se evaluaron las monocapas de cada cavidad a las 24 hs. post
inoculación al microscopio. Se registraron las observaciones y se tomaron
imágenes.
Las lecturas de densidad óptica se efectuaron en un equipo Spectra MaxPlus de Molecular Devices.
Sobre las dos cavidades restantes de cada punto de tratamiento o
control, se efectuó el Ensayo del Cometa.
La Concentración Inhibitoria 50% (Cl50) se determinó como la
concentración de extracto que inhibe en un 50% la respuesta del sistema con
los colorantes vitales Cristal Violeta, Rojo Neutro y por medio del Ensayo MTT.
Es decir Cl 50 corresponde a Ia concentración de extracto dada por
°/ocontrol = ( Respuesta de la muestra l Respuesta del control ) x 100 = 50%
En una Tabla se compararon los datos obtenidos de Cl50% para cadasistema de evaluación.
MATERIALES Y MÉTODOS 51
5.2.12 Ensayo de Exposición Repetida°°
Es un ensayo que permite evidenciar el aumento de sensibilidad de unsistema.
Se sembraron células en botellas T25 de modo tal que crecidas durante
18-24 hs, estuvieran en una confluencia del 70 %. Se descartaron los
sobrenadantes y se enfrentaron con una dosis sub aguda de los extractos.
Tomando en consideración las concentraciones usadas por otros autores en
ensayos previosGopara exposiciones repetidas, la concentración de extracto
usada para esta exposición, se eligió como la Cl 20 %.
Luego de 72 hs de exposición, se subcultivaron las células tanto
tratadas como los controles sin tratar y 24 hs después de la adherencia crecimiento se volvió a enfrentar las células a la misma concentración de
extracto. Esto se repitiódurante 5 ciclos consecutivos.
Al final de cada exposición, una fracción (40 000 cél l cavidad) de las
células se sembró en placas de 96 cavidades (30 cavidades por cada punto) y
se efectuó un análisis de los sistemas por coloraciones vitales y evaluación deliberación o actividad enzimáticas.
Otra parte de la suspensión de células se lavó con PBS, se contaron las
células y sembraron en portaobjetos (1000 cél / porta) con agarosa para el
Ensayo del Cometa.
Se efectuó un análisis estadístico de los datos por comparación de los
cultivos tratados y los controles.
5.2.13 Ensayo de Exposición Crónica“1
Este ensayo también permite evidenciar el aumento de sensibilidad de
un sistema por aumento del tiempo de exposición al xenobiótico.
Se sembraron 40 000 células por cavidad en placas de 48 cavidades de
modo tal que crecidas durante 18-24 hs, estuvieran en una confluencia del 80
%. Se descartaron los sobrenadantes y se enfrentaron con diluciones de los
extractos (tratadas) o no (controles), (24 cavidades por cada punto) con dos
MATERIALES Y MÉTODOS 52
concentraciones diferentes sub agudas de los extractos. Las concentraciones
usadas para la exposición de los cultivos fueron dos niveles, eligiendo así una
concentración baja que puede no presentar daño en exposición aguda (CI
10%) y una más alta (CI 60%) para tener más posibilidades de ver efectos, si
los hubiera.
Luego de 72 hs de exposición, se descartaron los sobrenadantes, se
Iavaron las monocapas y se repitió el tratamiento. Esto se efectuó 8 veces
consecutivas. Se hizo un seguimiento por microscopio invertido a lo largo de
todos el experimento. AI final de cada exposición, una fracción de las células
fue analizada por coloraciones vitales y evaluación de liberación y deactividades enzimáticas.
Se efectuó un análisis estadístico de los datos por comparación de los tratados
y los controles.
5.2.14 Evaluación Estadística
Para establecer si habia diferencia significativa entre los
resultados obtenidos para los sistemas tratados y los del control, para
todos los ensayos por reacciones con coloraciones o actividades
enzimáticas se aplicaron las siguientes evaluaciones estadísticas:
o Para los ensayos de Exposiciones Agudas
a) Análisis de Varianza (ANOVA) de una vía por ensayo no paramétricos
de KruskaI-Wallis.
En los casos que el ANOVA resultó tener diferencia significativa, se
aplicó el Ensayo de Comparaciones Múltiplesde Dunn (ECM).
b) Análisis de Varianza (ANOVA) de una vía, por ensayo paramétricos. En
los casos que el ANOVAresultó tener diferencia significativa, se aplicó el
Ensayo de Comparaciones Múltiplesde Dunnett
c) Análisis de Ia tendencia de los datos.
MATERIALES Y MÉTODOS 53
o Para evaluar los Ensayos de Cometa se usó la Regresión Lineal en todos
los casos.
o Para los Ensayos de Exgosición Regetida y Crónica
a) Análisis de Varianza (ANOVA) por mediciones repetidas por ensayo
no paramétrico de Friedman y a continuación el Ensayo de
Comparaciones Múltiplesde Dunn.
b) Análisis de la tendencia de los datos
Todos los cálculos y evaluaciones se llevaron a cabo usando el Programa
Instat 3.0 para Windows.
D0
RESULTADOS 55
Los Resultados se presentan en dos Capítulos :
6.1 Ancoche o Vallesia Glabra
6.2 llex paraguaiensis o yerba mate
A su vez, cada uno consta de tres secciones
6.1.1 ' y 6.2.1 Toxicidad Aguda
6.1.2 y 6.2.2 Toxicidad Repetida
6.1.3 y 6.2.3 Toxicidad Crónica
Los efectos de la Toxicidad Aguda sobre los cultivos tratados o control de cada
sistema de punto final fueron evaluados por
o Ensayos de Citotoxicidad General : (morfología y número de células,
concentración proteica y tinción con cristal violeta)
o Alteración de Permeabilidad de la Membrana (RN y LDH)
o Medición de Parámetros Metabólicos y Energéticos (MTT)
o Ensayos de Proliferación (Eficiencia de Clonado)
o Evaluación de Ia Genotoxicidad (Ensayo del Cometa)
Los efectos de la Toxicidad Regetida sobre los cultivos tratados o control de cada
sistema de punto final fueron evaluados por
o Ensayos de Citotoxicidad General : (morfología y número de células,
concentración proteica y tinción con cristal violeta)
o Alteración de Permeabilidad de la Membrana (RN y LDH)
o Medición de Parámetros Metabólicos y Energéticos (MTT)
o Evaluación de la Genotoxicidad (Ensayo del Cometa)
Los efectos de la Toxicidad Crónica sobre los cultivos tratados o control de cada
sistema de punto final fueron evaluados por
o Ensayos de Citotoxicidad General : (morfología y número de células,
concentración proteica y tinción con cristal violeta)
o Alteración de Permeabilidad de la Membrana (RN y LDH)
o Medición de Parámetros Metabólicos y Energéticos (MTT)
ImmCrÜyUOm mm
mu. >ZOOOI|m o <>Eumm_> OF>WW>
RESULTADOS 57
Exposición Aguda
a) Se presentan en primer termino los gráficos correspondientes a los diferentes
sistemas de evaluación para las Exposiciones Agudas, tanto para el Extracto
Acuoso (gráfico 1) como para el Metabólioo (gráfico 2), con sus
correspondientes Evaluaciones Estadísticas. Se incluyen imágenes de las
placas de 96 cavidades sobre las que se hicieron los ensayos, luego del periodo
de exposición, tras fijar y teñir las células con CV.
A continuación, en la Tabla 1 se resumen los datos de Cl50 según los distintos
sistemas de determinación del punto final.
b) En las Tablas 2 (extracto acuoso) y 3 (extracto metanolico) se presentan los
resultados de Inhibición de Ia Proliferación; y a continuación las imágenes
correspondientes a las placas de 6 cavidades sobre las que se efectuaron los
ensayos de Eficienciade Clonado.
c) Se presentan luego los resultados correspondientes a la Evaluación de la
Genotoxicidad por el Ensayo del Cometa. Estos se resumen en la Tabla 4
indicando el Índice de Daño para los dos tipos de extractos, en función de la
concentración de los mismos. Se muestran luego algunas imágenes típicas
obtenidas por observación al microscopio durante el desarrollo de esta
evaluación
.,—..w..-\..,E_v.
<vvvv‘-. vv‘v
‘r'uv‘v
y
bv'v-v'w'"
RESULTADOS 58
6.1.1. HQXICIDAD AGUDA]
l ENSAYOS DE CITOTOXlClDAD GENERAL
Il ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
lll PARAMETROS METABOLICOS Y ENERGETICOS
Evaluación por Coloraciones y Reacciones Enzimáticas
Las concentraciones usadas para realizar las exposiciones agudas fueron 0
(células control) y desde 3,91 pg I ml hasta 4 mg I mI , para los cultivos tratados.
En el Gráfico 1 se presentan las curvas correspondientes a cada ensayo de
evaluación, como porcentaje respecto del control en función de las
concentraciones de extracto acuoso para tratamiento de los cultivos por
exposición aguda.
Ancoche ExtractoAcuoso
Exposición Aguda
%DelControl
+Rq'oNeuro +Cristhldm +M1T +LDH
o 3,91 7,81 15,62 31.25 62,5 125 250 500 1000 2000 4000
logConcentracióndeExtractomglml
Gráfico 1
RESULTADOS 59
Mediante la evaluación estadística de los datos por el ensayo de Kruskal
Wallis (KW) se observó una diferencia significativa en el análisis de la varianza a
partir de los 1000 pg / ml , para los dos ensayos de coloración, para LDH y para
M'lT. Evidenciándose luego una diferencia significativa entre los controles y las
dosis 2000 y 4000 pg /ml con p < 0,05 para RN y p< 0,001 para LDH, al aplicar el
Ensayo de Comparaciones Múltiplesde Dunn.
Por otra parte, al aplicar este mismo sistema de evaluación al ensayo de MTI',
se observó una p < que 0,05 para las comparaciones de los resultados de 4000 pg/
ml con todas las dosis mayores o iguales que 500 pg / ml. Esto se explicaría dado
que a partir de 500 pg / ml, por observación al microscopio , se vio comienzo de
deterioro de los cultivos.
Asimismo, el análisis de Ia tendencia de los datos resultó ser altamente significativa
(p<0,0001) para RN , LDH y MTI' con r 2 de 0,13 (RN y LDH) y 0,11 (MÏT).
El análisis estadístico de los datos para CV no evidenciaron diferencias significativas
por Dunn (p > 0,05) ni tendencia (r 2=0,017).
Se observa una evolución semejante para todos los ensayos en función de la
concentración de extracto, aunque el sistema de Evaluación por Rojo Neutro y el de
LDHparecen tener una respuesta más definida.
RESULTADOS 60
Ancoche Extracto Acuoso Exposición Aguda
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 1
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras 24 hs de exposición aguda con
concentraciones entre 3,75 pg / mIy 62,5 pg / ml de Extracto Acuoso de Ancoche.
Imagen 2
Cultivo de células L929 luego de 24 hs de exposición aguda con concentraciones
entre 125 pg / ml y 4000 pg / ml de Extracto Acuoso de Ancoche.
1l
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rQ..,.v...v.—."
NMMHHWMMWM
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ToxicidadAgud 4 w, A,_
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_ V ¿1 .“4’;,»_r>», Í. A c’ 2__ y ¿q _, w x
61
62RESULTADOS
Ancache : Extracto AcuasoToxicidadAguqa
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i
"'"""""'.. ""
’."'
RESULTADOS 63
En el Gráfico 2 se presentan las curvas correspondientes a cada ensayo de
evaluación, como porcentaje respecto dei control en función de las
concentraciones de extracto metanólico para tratamiento de los cultivos en
exposición aguda.
mmmWM1m
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Gráficoz
El ANOVA por el ensayo de KW resultó con una diferencia altamente
significativa (p < 0,0001)para RN,LDH y CV, y con p = 0,0004 para MTT.
RESULTADOS 64
El ECM de Dunn evidenció una diferencia significativa (p < 0,05) para dosis
mayores o iguales que 1000 ug / ml (CV) o que 500ug / ml (RN) respecto de loscontroles sin tratar.
Se observó asimismo una marcada tendencia (p < 0,0001) para los ensayos
de CV, LDHy RN con r2 =entre 0,66 ; 0,0011 y 0,83 respectivamente.
Los análisis para los datos del ensayo de MTI' no dieron diferencias significativas
entre los controles y los tratados.
En este caso también las respuestas a los sistemas de evaluación parecen ser
semejantes en la tendencia, aunque se evidencia mayor respuesta por medición deliberación de LDHal entorno extracelular.
RESULTADOS 65
Ancoche Extracto Metanólico Exposición Aguda
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 3
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras 24 hs de exposición aguda con
concentraciones entre 3,75 pg / mIy 60 pg / mI de Extracto Metanólico de Ancoche.
Imagen 4
Cultivo de células L929 luego de 24 hs de exposición aguda con concentraciones
entre 125 pg / ml y 4000 pg / ml de Extracto Metanólico de Ancoche.
RESULTADOS 66
Ancoche : Extracto Metanófico
Taxfcfdad Aggda r,4‘
,0; sus
¡WPF-qm». Lam" a ’
67RESULTADOS
Extracto MetanóficoToxicidadAge9lAncoche
“9M2I
RESULTADOS 68
En la Tabla 1 se resumen los datos de Concentraciones Inhibitorias 50%
(Cl50) obtenidas a partir de las lecturas efectuadas con Spectra Max Plus y por
observaciones de los cultivos al microscopio tras 24 hs de tratamiento.
CI 50 en células L 929Muestra Observación
de alAncoche Microscopio
RN MTT CV
Extracto Acuoso 2,8 mglml 3 mglml 4 mglml 500 ug/ml
Extracto Metanólico 150 pglml 500 pg/ml 500 uglml 250 ug/ml
TABLA 1
Los datos de actividad de LDHno permiten calcular por este medio la CI50, pero
indican o evidencian un daño celular que se acompaña con los datos registrados al
hacer las observaciones de los cultivos bajo microscopio.
RESULTADOS 69
IV ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN
EFICIENCIA DE CLONADO
En la Tabla 2 se resumen los resultados obtenidos para el ensayo de
eficiencia de clonado al tratar los cultivos durante 10 días con las concentraciones de
extracto acuoso indicadas.
Las concentraciones elegidas para los tratamientos fueron en todos los casos
menores que las CI 50.
Ancoche Extracto Acuoso
Eficiencia de Clonado
Concentración0 25 50 100 250 500
en pg I ml
Dano neg neg neg neg x xxx
Número declones 33 36 43 33 23 6
% inhibición O O 0 0 31 80
Tabla2: x indica intensidad de daño por observación al microscopio
RESULTADOS 70
En la Tabla 3 se resumen los resultados obtenidos para el ensayo de
eficiencia de Clonadoal tratar los cultivos durante 10 dias con las concentraciones de
extracto metanólico indicadas.
Las concentraciones elegidas para los tratamientos fueron en todos los casos
menores que las CI 5o.
Ancoche Extracto Metanólico
Eficiencia de Clonado
Concentración0 12,5 25 50 125 250
en pg / mI
Daño neg neg neg x xx xxx
N‘"“°’° de 45 39 43 43 12 oclones
% inhibición O 11 0 O 75 100
Tabla 3: x indica intensidad de daño por observación al microscopio
RESULTADOS 71
Ancoche Extracto Acuoso Eficiencia de Clonado
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 5
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras diez días de exposición con
diferentes concentraciones de Extracto Acuoso de Ancoche.
Imagen 6
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras diez días de exposición con
diferentes concentraciones de Extracto Metanólicode Ancoche.
Se puede observar una respuesta inhibitoria más acentuada frente al extracto
metanólico que frente al acuoso.
Eficiencia de Clonado
Ancoche Oa Extracto Acuoso
RESULTADOS 72
.yv''
RESULTADOS 73
Ancoche :Extracto Metanóllco
¡“Eficiencia de Clado >_‘ f.....¡A
I «¿W? eq. w Ea“
rálw’éïs’üï_ ‘ f 91" .¿“É-í?"¡ÜÏÏÏ -‘ ÁZ'¿l '
RESULTADOS 74
V EVALUACIÓN DE LA GENOTOXIOCIDAD
ENSAYO DEL COMETA
En la Tabla 4, se reúnen los datos de Indice de Daño obtenidos al enfrentar
los cultivos en forma aguda con extractos acuoso o metanólico.
Los valores de Indice de Daño se obtuvieron mediante un calculo ponderado,
según se describe en Materiales y Métodos
Ancoche - Exposición AgudaEnsayo del Cometa
Extracto Acuoso Concentración Extracto MetanólicoExtracto
Indice de Daño pg I mI Indice de Daño
29+l-2 0 32+I-1
27+/-1 7,81 26+l-2
24+I-1 31 ,25 35+I-1
17+I-2 125 37+I-1
20+l-1 500 N.D.
Tabla 4: N.D. indica no determinado
Se efectuó un análisis de Regresión Lineal obteniéndose coeficientes de
regresión entre 0,92 y 0,98 para límites de confianza de 95 %.
Los sistemas tratados con extractos acuosos resultan con menores índices de daño
que los expuestos a extractos metanólicos.
RESULTADOS 75
Imagen 7
Imágenes obtenidas de células L929 , tras 24 hs de exposición a extracto acuoso de
Ancoche y procesadas para Ensayo de Cometa como se indica en Materiales y
Métodos.
Los preparado se tiñeron con Bromuro de Etidio y luego se observaron al
microscopio de fluorescencia.
Imagen? Células en diferente estado de daño ; aumento 200 x .
RESULTADOS 76
Exposición Repetida
a) Se presenta la evolución de los distintos sistemas de evaluación a lo largo de
bV
los 6 pasajes y tratamientos de las células con los Extractos Acuoso (gráfico
con las correspondientes Evaluaciones3) y Metanolico (gráfico 4),
Estadísticas.
Algunas imágenes registradas durante las observaciones al microscopio de
estos sistemas se encuentran en las páginas 82 y 83. Se escogieron las más
representativas para ilustrar mejor los datos que se derivan de los gráficos.
Los resultados de la Evaluación de Ia Genotoxicidad por el Ensayo del
Cometa, se presentan en los gráficos 5 (Extracto Acuoso) y 6 (Extracto
Metabólico), mediante la evolución del Índice de Daño a Io largo de seis
pasajes y tratamientos sucesivos.
Se incluyen algunas imágenes típicas de la observación al microscopio denúcleos con diferente nivel de daño.
RESULTADOS 77
6.1.2 [EXPOSICION REPETIDAI
| ENSAYOS DE ClTOTOXIClDAD GENERAL
Il ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
lll PARÁMETROS METABOLICOS Y ENERGETICOS
Evaluación por Coloraciones y Reacciones Enzimáticas
En el Gráfico 3 se observan los resultados de la exposición repetida de
los cultivos con una dosis fija C|20% (100 pg I ml) de extracto acuoso de
Ancoche.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación, se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número de
pasaje.
Ancoche Extracto AcuosoExposición Repefida
%delControl
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Númerode pasaje
-+—- Rojo Neutro ¿I- Cristal Violeta --A—MTT -—-x-—LDH Liberado —e—Proteínas
Gráfico 3
RESULTADOS 78
El análisis estadístico de los datos por el ensayo de Friedman resultó con una
diferencia altamente significativa para los ANOVAde los ensayos de coloración con p
= 0,01 (RN); 0,0025 (CV) y 0,0001 para MÏT y LDH. La evaluación de CM de Dunn
permitió ver una diferencia significativa (0,01 < p < 0,05) entre los controles y los
pasajes 3 , 5 y 6 (MTT) , entre el P1 y P2 versus P6 (RN) y entre P1 y P3 versus el
resto para LDH..
La observación de Ia tendencia de los datos demostró ser altamente significativa
( p < 0,001), con r 2 = 0,097 (M'IT) ; 0,48 (RN) y 0,52 (LDH) , no asi para cv
(r 2= 0,02) ó Proteínas (r 2= 0,17).
Por estos ensayos se evidencia una marcada diferencia en daño o
sensibilización del sistema a través de la repetición de los tratamientos con extracto
acuoso sólo para los ensayos de MTl' y LDHa altos números de pasaje.
RESULTADOS 79
En el Gráfico 4 se observan los resultados de ia exposición repetida de los
cultivos con una dosis fija CI 20% (25 pg I ml) de extracto metanólico de Ancoche.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación, se presentan como
porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número de pasajes.
Ancoche Extracto 'MetanóiicoExposición Repetida
160 . i r
140
120
E 100‘Eo0 80 l7613
.\° 60
4o ‘ y
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Número de Pasaje
Gráfico 4
EIANOVApor el ensayo de Friedman resultó con una diferencia altamente
significativa (p < 0,0001) para RN , Proteínas y MTT, y con p = 0,0023 para CV;
RESULTADOS 80
siendo no significativa (p>0,954) para LDH .
El ECM de Dunn evidenció una diferencia significativa (p < 0,05) entre los datos para
controles y los de los pasajes 3 y 6 (CV)o entre los pasajes 1 y 6 de los controles o
entre los pasajes 2 y 6 de los tratados (RN y Proteínas) respecto de los controles
sin tratar.
Se observó asimismo una marcada tendencia para los todos los ensayos con r 2
entre 0,048 (CV) ; 0,21 (Proteínas) y 0,64 (RN). excepto para LDH (0,0046).
En el caso de los tratamientos repetidos con extracto metanólico, se evidencia
una leve mayor sensibilización o una modificación de la respuesta del sistema a
partirde cuatro pasajes consecutivos.
RESULTADOS 81
Ancoche Exposición Repetida
Imágenes de los de cultivos frescos
observaciones al microscopio invertido; aumento 100 x
Pasajes seriados de células L 929 :
Tratamientos en cada pasaje con cada preparación acorde a como se indica en
Materiales y Métodos 5.2.3
Medio de Mantenimiento ................. .. CC (control de células)
Dilución de Metanol ........................ .. CSV (control de solvente)
Extracto Acuoso de Ancoche Aa
ExtractoMetanólicode Ancoche Arn
Imágenes 8
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los extractos
durante 72 hs; después del primer pasaje / exposición
Imágenes 9
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los extractos
durante 72 hs; después del sexto pasaje l exposición
RESULTADOS 82
Ancoche: ToxicidadReperida Primer Pasaje
83RESU LTADOS
AncocheExposiciónRepetida Sexto Pasaje
RESULTADOS 84
V EVALUACIÓN DE LA GENOTOXIOCIDAD
ENSAYO DEL COMETA
En el Gráfico 5 se observan los resultados de la exposición repetida de los
cultivos con una dosis fija de extracto acuoso de Ancoche.
Las curvas correspondientes ai control sin tratar y a los cultivos tratados con una
dosis sub aguda (100 pg I mi) se presentan como Indice de Daño en función del
número de pasajes.
mmm-mmmBBayomlemla
50
45
40
.g ün 3)3 25
.3 m'D«E 15
10
5
0
1 2 3 4 5 6
NimoPaafe
Gráficos
Mediante el análisis de Regresión Lineal se obtuvieron coeficientes de
regresión entre 0,12 y 0,13 para límites de confianza de 95 %, con una pendiente no
significativa.
En el tratamiento inicialy luego de tres y cuatro pasajes l tratamientos, (P3
P4) se observa un mayor índice de daño para ios cultivos no tratados respecto de ios
expuestos al extracto acuoso. Lo mismo se ve luego del sexto pasaje.
RESULTADOS 85
En el Gráfico 6 se observan los resultados de Ia exposición repetida de los
cultivos con una dosis fija de extracto metanóiico de Ancoche.
Las curvas correspondientes ai control sin tratar y a ios cultivos tratados con una
dosis sub aguda ( 25 pg / mi) se presentan como indice de Daño en función del
número de pasajes.
Ancoche Extracto MetanóliooExposiciónRepefida - Ersayo del Cometa
45
40
35OI:
s 3‘;8.3 2°g 15“ 1o
5
0
1 2 3 4 5 6
Número Pasaje
Gráfico 6
Se efectuó el análisis de Regresión Lineal obteniéndose una pendiente
significativa con coeficientes de regresión entre 0,15 y 0,16 para límites de
confianza de 95 %.
Luego de dos pasajes l tratamientos, se observa un mayor daño en el sistema
control respecto del cultivoexpuesto al extracto metanólico, que luego se revierte con
mayor número de pasajes / tratamientos, pero se reitera tras ei cuarto pasaje y enadelante.
RESULTADOS 86
Imagen 10
Imágenes obtenidas de células L929 , tras 24 hs de exposición a extracto acuoso de
Ancoche y procesadas para Ensayo de Cometa como se indica en Materiales yMétodos.
Los preparados se tiñeron con Bromuro de Etidio y luego se observaron al
microscopio de fluorescencia.
Imagen 10 células con diferente grado de daño ; aumento x 200
RESULTADOS 87
Exposición Crónica
a) Se presentan en primer término los resultados de los distintos sistemas de
bV
evaluación luego de los tratamientos con Extracto Acuoso, para la
concentración 160 uglml (grafico?) y 40 uglml (gráfico 8) en forma Crónica
durante 9 exposiciones consecutivas.
Se presentan luego los resultados correspondientes a las exposiciones con las
concentraciones 50 uglml (gráfico 9) y 12,5 uglml (gráfico10) de Extracto
Metanólico.
Algunas imágenes registradas durante las observaciones al microscopio de
estos sistemas se encuentran en las páginas 97 a 99.
Se escogieron las más representativas para ilustrar mejor los datos que se
derivan de los gráficos.
RESULTADOS 88
6.1.3 IEXPOSICIÓN CRÓNICA]
En el Gráfico 7 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cultivos con una concentración fija sub aguda de 160 pg I ml de extracto acuoso de
Ancoche. '
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número de
tratamientos.
AnoocheEadractoAcuosoExposiciónCrónica160uglni
%delControl
Gráfico 7
RESULTADOS 89
El análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0.0001) por todos los ensayo realizados.
EI ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativa entre los resultado para una exposición (C1) respecto del resto de los
pasajes (p<0,01). Asimismo, no se vio diferencia significativa( p > 0,05) entre
pasajes sucesivos entre los pasajes desde C2 hasta C8. Contrariamente, en la
comparación C1con C2 y el último pasaje, entre C8 y C9 (p < 0,001 en ambos
casos). Estos resultados para CV dieron una diferencia altamente significativa
(p < 0,001) para todos las comparaciones.
Por el contrario, las evaluaciones por Dunn para LDH y Proteínas resultaron con
una diferencia no significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones.
El análisis de la tendencia de los datos a lo largo de las exposiciones resultó
significativa (r 2 entre 0,95 y 0,15), en todos los casos excepto LDH ( r 2 = 0,0016),
no significativa.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con Extracto
Acuoso en concentración 160 ug l mI (A1) en página 97 a 99
Luego de cinco exposiciones consecutivas al extracto, se observa una
pequeña modificación en la respuesta, acentuándose el efecto con la consecucióndel tratamiento.
RESULTADOS 90
En el Gráfico 8 se observan los resultados de Ia exposición crónica de los
cultivos con una concentración fija sub aguda de 40 pg I mI de extracto acuoso de
Ancoche.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan como
porcentaje respecto del control sin tratar en función del número de tratamientos.
Ancoche Extracto AcuosoExposición Crónica 40 uglml
%delControl
+CV2 +LDH2 +Proteínasz
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
Númerode Exposiciones
Gráfico 8
RESULTADOS 91
El análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
El ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN , indicó una diferencia
significativa entre los resultado para una exposición (C1) respecto del resto de los
pasajes (p < 0,001). Asimismo, no se vio diferencia significativa( p > 0,05) entre
pasajes sucesivos entre los pasajes desde C5 hasta C8. Contrariamente. en Ia
comparación C1hasta C4 y el último pasaje, entre C8 y C9 (p < 0,001 en los tres
casos). Estos resultados para CV dieron una diferencia altamente significativa
(p < 0,001) para todos las comparaciones. excepto C5 l C6.
Por el contrario, las evaluaciones por Dunn para Proteinas resultaron con una
diferencia no significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones.
Y el ANOVA para LDH resultó no significativa (p = 0,104), por Io cual no se efectuó
un ensayo posterior.
El análisis de la tendencia de los datos a lo largo de las exposiciones resultó
significativa(r 2 entre 0,73 y 0,16) en todos los casos, excepto LDH( r 2 = 0.0018), no
significativa.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con Extracto
Acuoso en concentración 40 ug l ml (A2)en página 97 a 99
Se observa un cambio suave de respuesta del sistema celular en función de la
frecuencia a la exposición a esta concentración de extracto acuoso. Esto se ve por
los ensayos de RN y CV, pero no por Proteínas.
Para la actividad de LDH,se evidencia un aumento de actividad a paritr de la
quinta exposición y luego un decrecimiento con el aumento del número de
exposiciones.
RESULTADOS 92
En et Gráfico 9 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cultivos con una concentración fija sub aguda de 50 pg I ml de extracto metanólico
de Ancoche.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número de
tratamientos.
AncocheErdractoWiooExposiciónQonicasownl
%vdelControl
+CV1 +LDH1
C1 CZ C3 C‘A CS CB C7 08 C9
MimdeExpostdorns
Gráfico 9
RESULTADOS 93
El análisis estadístico de Fn'edman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
El ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativa entre los resultado para el para una exposición (C1) respecto del resto
de los pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,001)
entre pasajes sucesivosexcepto para Cl I C2.
Para el ensayo de CV esta comparación dio una diferenciua significativa (p<0,001)
excepto para C3 l C4 y C61C7(p >0,05).
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa p < 0,001) para
todos las comparaciones, excepto C5 I C6 (p > 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteínas dieron una diferencia significativa
(p = 0,0011) y por Dunn resultaron con una diferencia no significativa (p > 0,05)
para todas las comparaciones.
El análisis de la tendencia de los datos a lo largo de las exposiciones resultó
significativa (r 2 entre 0,88 y 0,67) en todos los casos.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con Extracto
Metanólico en concentración 50 ug I ml (M1) en página 97 a 99
Se observa una gran fluctuación en la respuesta del sistema a la frecuencia
de exposición a esta concentración de extracto metanólico, medida por la actividad
de enzima LDHen el extracelular.
RESULTADOS 94
En el Gráfico10 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cultivos oon una concentración fija sub aguda de 12,5 pg l ml de extracto metanólicode Ancoche.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan como
porcentaje respecto del control sin tratar en función del número de tratamientos.
Ancoche Extracto MetanólicoExposicion Crónica 12.5 pglml
%delControl
C1 C2 03 C4 05 06 C7 C8 C9
Númerode Exposiciones
Gráfico 10
RESULTADOS 95
El análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
El ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativa entre los resultado para una exposición (C1) respecto del resto de los
pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,001) entre
pasajes sucesivos excepto para C1 / C2 (p > 0,05).
Para el ensayo de CV esta comparación dio una diferencia significativa (p<0,001)
excepto para C8 / 09(p >0,05).
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa p < 0,001) para
todos las comparaciones, excepto CSI CS (p > 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteinas dieron una diferencia significativa
(p = 0,001) para la comparación de los resultados de la primera exposición (C1)
respecto de todas las demás y por Dunn resultaron con una diferencia significativa
(p < 0,001) para todas las comparaciones, excepto para C8 I C9 (p > 0,05)
El ensayo de Proteínas no dio diferencias significativas (p = 0,790).
EI análisis de la tendencia de los datos para RN y LDH a Io largo de las
exposiciones resultó significativa (r 2 entre 0,81 y 0,25). No se observó tendencia
significativa por medio de la determinación de la concentración de proteinas ni CV
(r 2 = 0,0002).
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con Extracto
Metanólico en concentración 12,5 ug I ml (M2) en páginas 97 a 99
No se observan cambios de respuesta del sistema en función de Ia
frecuencia de exposición de los cultivos a esta concentración de extracto metanólico.
RESULTADOS 96
Ancoche Exposición Crónica
Imágenes de las de cultivos fijados y teñidos con Cristal Violeta
observaciones al microscopio invertido; aumento 100x
Exposiciones Sucesivas de células MRC 5 :
Tratamientos en cada exposición con cada preparación acorde a como se indica en
Materiales y Métodos 5.2.3
Medio de Mantenimiento ................. .. CC (control de células)
Diluciónde Metanol ........................ .. CSV (control de solvente)
Extracto Acuoso de Ancoche concentración 160 pg / ml ........ .. A1
Extracto Acuoso de Ancoche concentración 40 pg I ml ............ .. A2
Extracto Metanólico de Ancoche concentración 50 pg I ml ....... .. M1
Extracto Metanólico de Ancoche concentración 12.5 pg l ml .... .. M2
Imágenes 11
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los extractos
durante 72 hs; después de la primera exposición
Imágenes 12
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los extractos
durante 72 hs; después dela cuarta exposición
Imágenes 13
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los extractos
durante 72 hs; después dela novena exposición
J 0051.5 - 063M Mi!kaIMICV IMZCV
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ÁNCOCHETOXICIDÁD CRONICA
RESULTADOS 97
RESULTADOS 98
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RESULTADOS 99
ANCOCHETOXICÏDAD¿PONICÁ
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1' X M2 CV9 DOSIS - ¿19'5nt Makro
ILEX PARAGUAIENSIS O YERBA MATE
RESULTADOS 101
Exposición Aguda
a) Se presentan en primer término los gráficos correspondientes a los diferentes
sistemas de evaluación para las Exposiciones Agudas, tanto para el Extracto
Acuoso (gráfico 11) como para el Metanólico (gráficot2). con sus
correspondientes Evaluaciones Estadísticas. Se incluyen imágenes de las
placas de 96 cavidades sobre las que se hicieron los ensayos, luego del
periodo de exposición, en el punto final de la reacción. antes de leer las
absorbancias en el espectrofotómetro.
A-—continuación, en la Tabla 5 se resumen los datos de Cl50 según los
distintos sistemas de determinación del punto final.
b) En las Tablas 6 (Extracto Acuoso) y 7 (Extracto Metanólico) se presentan los
resultados de Inhibición de la Proliferación; y a continuación las imágenes
correspondientes a las placas de 6 cavidades sobre las que se efectuaron los
ensayos de Eficiencia de Clonado, luego de fijar las células y teñirlas con CV.
c) Se presentan luego los resultados correspondientes a Ia Evaluación de la
Genotoxicidad por el Ensayo del Cometa. Estos se resumen en la Tabla 8
indicando el Índice de Daño para los dos tipos de extractos, en función de la
concentración de los mismos.
RESULTADOS 102
OXICIDAD AGUD
I ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD GENERAL
ll ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
lll PARAMETROS METABOLICOS Y ENERGETICOS
Evaluación por Coloraciones y Reacciones Enzimáticas
Las concentraciones usadas para realizar las exposiciones agudas fueron
desde 0 ( células control) y desde 3,91 pg / ml hasta 4 mg I mi, para los
cuitivostratados.
En el Gráfico 11 se presentan las curvas correspondientes a cada ensayo
de evaluación, como porcentaje respecto del control en función de las
concentraciones de extracto acuoso de Ilex paraguaiensis para tratamiento de
los cultivos por exposición aguda.
“MmmmWM+OJ +RN +MiT +LD-I
%delControl
o am 7,8115,&31,25&5125 250 50010002000
iogoanemaiútcbeaachotgm
Gráfico 11
RESULTADOS 103
No se observó una diferencia significativa en el análisis de la varianza por
el ensayo de KWpara CV (p = 0,22), pero sí para MTT(p = 0,004), RN
(p = 0,0036) y LDH (p < 0,01), evidenciándose luego una diferencia
altamente significativa entre los controles y la dosis de 4000 pg / mI con un p <
0,05 para RN al aplicar el Ensayo de Comparaciones Múltiplesde Dunn.
Por el ensayo de Dunnett se vio una diferencia altamente significativa
(p < 0,0001) entre los controles y los tratados con dosis 4000 pg l ml para RN y
LDHno asi para los otros ensayos.
Asimismo se evidenció una tendencia significativa para RN ( r z = 0,56) y
para LDH ( r2 = 0,013).
Se observa una marcada respuesta al tratamiento con concentraciones
altas de extracto acuoso. por los ensayos de RN y de MTT, y mediante la
determinación de actividad de LDHen el espacio extracelular.
Se pueden observar imágenes de Células en ExposiciónAguda con
ExtractoAcuoso en concentraciones crecientes en las páginas siguientes
RESULTADOS 104
Yerba Mate Extracto Acuoso Exposición Aguda
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 14
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras 24 hs de exposición aguda con
concentraciones entre 3,75 pg / mI y 62,5 pg / ml de Extracto Acuoso de Yerba
Mate.
Imagen15
Cultivode células L929 luego de 24 hs de exposición aguda con concentraciones
entre 125 pg / ml y 4000 pg / ml de Extracto Acuoso de Yerba Mate.
105RESULTADOS
s‘.É'VV"L1"3'
ï¡CF/17' ‘/1.z:
1 ' ‘A__3pg-'m| '
A! "¿tiv“sr..>ï;.*"
{lexparaguafensisExtraeto AcuososToxicidad Aguda
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RESULTADOS 106
Hexparaguafensis:Extracto AcuosoToxicidad Aguda“
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¡no‘s' P47
RESULTADOS 107
En el Gráfico 12 se presentan las curvas correspondientes a cada ensayo
de evaluación, como porcentaje respecto del control en función de las
concentraciones de extracto metanóiico de Ilexparaguaíensis para tratamiento de
los cultivos en exposición aguda.
ILEX PARAGUAIENSIS - EXTRACTO METANÓLICOEXPOSICION AGUDA
+CV -I- RN + MTT —-)(-LDH
%delControl
O 3,91 7,81 15,62 31,25 62,5 125 250 500 1000 2000 4000
log concentración de Extracto ¡Ig/ml
Gráfico 12
El ANOVA por el ensayo de KW resultó con una diferencia altamente
significativa (p <0,0001) para RN y MTT, significativa (p < 0,01) para LDH y con
p = 0,021 para CV.
Ei ECM de Dunn evidenció una diferencia significativa (p < 0,05) para
concentraciones mayores o igual que 1000pg l mi (RN) respecto de los
controles. Mismo resultado se obtuvo para todas las bajas dosis respecto de
4000pg l mi (MTT), y para LDH (p< 0,01). No así para CV.
RESULTADOS 108
Se observó asimismo una marcada tendencia para los ensayos de MTl' y
RN y LDHcon r 2 = 0,35; 0,5 y 0,4 respectivamente.
No asi para CV con un r 2 = 0,002.
Los análisis para los datos por el ensayo de Dunnett evidenciaron
diferencias significativas entre los controles y las dosis más altas para los cuatro
ensayos.
Se puede observar que a concentraciones más altas de extracto
metanólico, hay diferencia en la respuesta por todos los ensayos de evaluación.
Se pueden observar imágenes de Células en ExposiciónAguda con
Extracto Metanólicoen concentraciones crecientes en las páginas siguientes
RESULTADOS 109
Yerba Mate Extracto Metanólico Exposición Aguda
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 16
Cultivo de células L929 control no tratadas y tras 24 hs de exposición aguda con
concentraciones entre 3,75 ug / ml y 62,5 ug / ml de Extracto Metanólico de Yerba
Mate.
lmagen17
Cultivode células L929 luego de 24 hs de exposición aguda con concentraciones
entre 125 ug / ml y 4000 ug / ml de Extracto Metanólico de Yerba Mate.
27
Ilex paragua:ens:sExtracto Metanólíco
“.3Á
4.4«71h23!hr.h..
Toxicidad Aguda; _
‘Q..o .i Ñ.a , ü¡WK“¿mi.9.QÍFCVMJÓ‘ú
RESULTADOS 110
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HexparagExtracto Metanóh'c
ua¡ens¡s
ToxicidadAgudaO
7M_250pg—|
RESU LTADOS 111
RESULTADOS l 12
En Ia Tabla 5 se resumen los datos de Concentraciones Inhibitorias 50%
(CISO)obtenidas a partir de las lecturas efectuadas con Spectra Max Plus y por
observaciones de los cultivos al microscopio tras 24 hs de tratamiento.
CI 50 en células L 929ILEX P9 / ml
PARAGUAIENSIS Ob , , lRN MTT cv 59mm“. aMicroscopio
Extracto Acuoso > 4000 > 4000 > 4000 1500
Extracto Metanólico > 4000 > 4000 3000 2000
Los datos de actividad de LDH no permiten calcular por este medio la CI50, pero
indican o evidencian un daño celular que se acompaña con los datos registrados
al hacer las observaciones de los cultivos bajo microscopio.
RESULTADOS 113
IV ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN
EFICIENCIA DE CLONADO
En la Tabla 6 se resumen los resultados obtenidos para el ensayo de
eficiencia de Clonado al tratar los cultivos durante 10 días con las dosis indicadas
de extracto acuoso de Ilexparaguaiensis.
Las concentraciones elegidas para los tratamientos fueron en todos los
casos menores que las CI 50
Ilexparaguaiensis - Extracto AcuosoEficiencia de Clonado
Concentración0 12,5 25 50 125 250
en p_glm|
Daño neg neg xxx xxx xxx xxx
Númem de 28 32 o o o oclones
% inhibición O O 100 100 100 100
Tabla 6: x indica nivel de daño por observación al microscopio
En Ia Tabla 7 se resumen los resultados obtenidos para el ensayo deeficiencia de clonado al tratar los cultivos durante 10 días con las dosis indicadas
de extracto metanólico de Ilexparaguaiensis.
Las concentraciones elegidas para los tratamientos fueron en todos los
casos menores que las CI 50
llex paraguaiensis - Extracto MetanólicoEficiencia de Clonado
Concentraciónen pglml O 25 50 100 250 500
Daño neg x xxx xxx xxx xxx
Número de 34 6 o o o oclones
% inhibición 0 82 100 100 100 100
Tabla 7: x indica nivel de daño por observación al microscopio
RESULTADOS l 14
Yerba Mate Eficiencia de Clonado
Imágenes de las observaciones del cultivo fresco
al microscopio invertido; aumento 100 x
Imagen 18
Hilera superior: (3) Cultivode células L929 control no tratadas y tras diez días de
exposicióncon diferentes concentraciones de Extracto Acuoso de Yerba Mate.
Hilera Inferior: (4) Cultivode células L929 control no tratadas y tras diez dias de
exposición con diferentes concentraciones de Extracto Metanólico de Yerba
Mate.
Las otras cavidades de células tratadas con concentraciones más altas de
extractos, presentaron 100% de inhibición.
Los clones desarrollados en presencia de extracto acuoso, evidencian una
respuesta inhibitoriay de daño de las células más acentuado que con extractometanólico.
¡lexparaguaiensisExtractos Acuoso y Metanófico
Eficiencia de Clonado
lm2_ 25ug-ml
RESULTADOS
la3_ 25ug-ml
115
RESULTADOS l 16
V EVALUACIÓN DE LA GENOTOXIOCIDAD
ENSAYO DEL COMETA
En la Tabla 8, se reúnen los datos de Indice de Daño obtenidos al
enfrentar los cultivos en forma aguda con extractos acuoso o metanólico.
El valor de Indice de daño se obtuvo mediante un cálculo ponderado,
según se describe en Materiales y Métodos
Ilex paraguaiensis - Exposición AgudaEnsayo del Cometa
Extracto Acuoso Concentración Extracto Metanólico, Extracto _Indice de Daño pg/ml Indice de Daño
40+/-3 0 38+/-3
N.D. 7,81 36+/-3
29+/-4 15,62 N.D.
27+/-2 62,5 24+/-2
N.D. 125 31+/-2
32+/-2 250 40+/-4
37+/-3 500 34+/-1
Tabla 8: N.D. indica no determinado
Mediante el análisis de Regresión Lineal se obtuvieron pendientes
no significativas con coeficientes de regresión entre 0,22 y 0,0025 paralímites de confianza de 95 °/o.
No se evidencian diferencias en los Indices de Daño encontrados
tras los tratamientos efectuados con los dos tipos de extractos.
RESULTADOS 117
Exposición Repetida
a) Se presenta Ia evolución de los distintos sistemas de evaluación a lo largo
de los 6 pasajes y tratamientos de las células con los Extractos Acuoso
(gráfico 3) y Metanólico (gráfico 4), con las correspondientes Evaluaciones
Estadísticas.
Imágenes registradas durante las observaciones al microscopio de estos
sistemas se encuentran en las páginas 123 y 124. Se escogieron las más
representativas para ilustrar mejor los datos que se derivan de los gráficos.
b) Los resultados de la Evaluación de la Genotoxicidad por el Ensayo del
Cometa, se presentan en los gráficos 5 (Extracto Acuoso) y 6 (Extracto
Metanólico), mediante la evolución del Índice de Daño a lo largo de seis
pasajes y tratamientos sucesivos.
‘,vvv
RESULTADOS l 18
6.2.2 [EXPOSICION REPETIDAI
I ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD GENERALl| ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA
||I PARAMETROS METABOLICOS Y ENERGETICOS
Evaluación por Coloraciones y Reacciones Enzimáticas
En ei Gráfico 13 se observan los resultados de la exposición repetida de
los cultivos con una dosis fija de 50 pg l mi de extracto acuoso de [lex
paraguaiensis. Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación, se
presentan como porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número
de pasajes.
liex paragueiensis- Extracto AcuosoExposición Repetida
%delControl
+ RN +CV + MTT -)(- LDH -*- Proteinas
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Número de Pasaje
Gráfico 13
RESULTADOS l 19
El análisis estadístico de los datos por el ensayo de Friedman resultó con
una diferencia altamente significativa para los ANOVA de los ensayos de
coloración con p < 0,0001 (RN, MTT y LDH) y p = 0,005 (CV y Proteínas).
La evaluación CM de Dunn permitió ver una diferencia significativa (p <
0,05) entre los controles y los pasajes 2 y 3 (M1T)o entre los controles y el pasaje
5 ó entre los Controles (CV)y los pasajes 1,2 y 4 ó entreP1 versus P6 (RN).
Asimismo esta comparación resultó con una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) para LDHpara todos los pasajes.
La observación de la tendencia de los datos demostró ser significativa
para LDH (r2 = 0,145) , Proteinas (r2 = 0,245) y RN (r2 = 0,41) respectivamente,
no así para MTT (r 2: 0,02), o cv (r2 = 0,0004) .
No se encontraron diferencias en las respuestas con el pasaje y las
exposiciones repetidas de los cultivos al extracto acuoso,hasta el pasaje sexto en
que se ve una declinación en los valores para Proteínas, y una aumento para
todas las otros ensayos
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Repetida con
Extracto Metanólico en concentración 50 ug / ml en páginas 123 y 124.
RESULTADOS 120
En el Gráfico 14 se observan [los resultados de la exposición repetida de
los cultivos con una dosis fija de 25 ug I ml de extracto metanólico de Ilex
paraguaíensis.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación, se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar, en función del número de pasajes.
llex paragueiensis - Extracto MetanólicoExposición Repetida
140
120
100
80
60%delControl
40
20 I ‘ r
‘ MTT —>e—LDH -e- Proteínas
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Número de Pasaje
Gráfico 14
RESULTADOS 121
El ANOVA por el ensayo de Friedman resultó con una diferencia
significativa (p < 0,001) para RN, LDH y MTI', y con p = 0,018 para CV y 0,015
para Proteínas.
El ECM de Dunn evidenció una diferencia significativa (p < 0,05) entre los
datos para controles y los del pasaje 1 (CV) o entre varios pasajes y los
controles o entre los pasajes entre si de los tratados (RNy Proteinas) respecto de
los controles sin tratar (MTT).
Esta evaluación para el ensayo de LDH, evidenció una diferencia
significativa (p < 0,001) para la comparación entre los diferentes pasajes
consecutivos principalmente entre P3 y los subsiguientes.
Se observó asimismo una marcada tendencia en la respuesta para los
cinco ensayos con r 2entre 0,021 y 0,59.
Se observa una respuesta de los cultivos a esta concentración de extracto
metanólico luego de cinco pasajes / tratamientos consecutivos, por los ensayos
de RN, MTTy mediante la determinación de concentración proteica.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Repetida con
Extracto Metanólico en concentración 25 pg / ml en páginas 123 y 124.
RESULTADOS 122
Yerba Mate Exposición Repetida
Imágenes de los de cultivos frescos
observaciones al microscopio invertido; aumento 100 x
Pasajes seriados de células L 929 :
Tratamientos en cada pasaje con cada preparación acorde a como se indica en
Materiales y Métodos 5.2.3
Medio de Mantenimiento ................. .. CC (control de células)
Dilución de Metanol ........................ .. CSV (control de solvente)
Extracto Acuoso de Y. Mate la
Extracto Metanólicode Y. Mate Im
Imágenes 19
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los
extractos durante 72 hs; después del primer pasaje l exposición
Imágenes 20
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los
extractos durante 72 hs; después del sexto pasaje I exposición
P1 la P1 Im
é
1P1 cc P1 csv
HexparaguaiensisToxicidadrepetida
Pasaje I
RESULTADOS 123
cc p6
RESULTADOS .124
[lexparaguayensisExposición Repetida Sexto Pasaje
axNx
w‘X
x v4.
x
RESULTADOS 125
V EVALUACIÓN DE LA GENOTOXIOCIDAD
ENSAYO DEL COMETA
En el Gráfico 15. se observan los resultados de la Exposición Repetida de
los cultivoscon una dosis fija de extracto acuoso de IIexparaguaiensis.
Las curvas correspondientes al control sin tratar y a los cultivos tratados
con una dosis sub aguda de 50 pg l ml se presentan como Indice de Daño en
funcióndel número de pasajes.
Ilexparaguaiensis - Extracto Amoso - Exposición RepetidaEnsayo del Comaa
ÍndicedeDaaño
1 2 3 4 5 6
Número Pasaje
Gráfico 15
Se efectuó un análisis de Regresión Lineal obteniéndose coeficientes de
regresión entre 0,04 y 0,06 para una pendiente no significativa con límites de
confianza de 95 %.
Con esta concentración de extracto acuoso no se observa diferencia de
respuesta a Iolargo de los pasajes I tratamientos.
RESULTADOS 126
En el Gráfico 16. se observan los resultados de la exposición repetida de
los cultivos con una dosis fija de extracto metanólico de Ilexparaguaiensis.
Las curvas correspondientes al control sin tratar y a los cultivos tratados
con una dosis sub aguda de 25 ug I ml se presentan como Indice de Daño en
funcióndel número de pasajes.
llex paraguaiensis - Extracto Metanólico ExposiciónRepetida - Ensayo del Cometa
indicedeDañoI
1 2 3 4 5 6
Número Pasaje
Gráfico 16
La regresión lineal de los datos indicó una pendiente no significativa con
valores de coeficiente de regresión entre 0,011 y 0,013.
No se observan diferencias de daño con los pasajes l tratamientos
sucesivos hasta el pasaje 6 (P6).
RESULTADOS 127
Exposición Crónica
a) Se presentan en primer termino los resultados de los distintos sistemas de
bV
evaluación luego de los tratamientos con Extracto Acuoso, para la
concentración 100 ug / ml (gráfico 7) y 50 ug / ml (gráfico 8) en forma
Crónica durante 9 exposiciones consecutivas.
Se presentan luego los resultados correspondientes a las exposiciones con
las concentraciones 50 ug / ml (gráfico 9) y 12,5 ug / ml (gráfico10) de
Extracto Metanólico.
Algunas imágenes registradas durante las observaciones al microscopio
de estos sistemas se encuentran en las páginas 137 a 139.
Se escogieron las más representativas para ilustrar mejor los datos que se
derivan de los gráficos.
RESULTADOS 128
6.2.4 ¡EXPOSICIÓN CRÓNICA]
En el Gráfico17 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cuitivos con una concentración fija sub aguda de 100 pg l ml de extracto acuoso
de I/exparaguaiensis.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar en función del número de
tratamientos.
%delControl
C1 C2 CS 04 C5 CB C7 CB 03
NInnroribEmosidmas
Gráfico 17
RESULTADOS 129
EI análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
El ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativaentre los resultado para una exposición (C1) respecto del resto de los
pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,001) entre
pasajes sucesivos excepto para C8 / C9 (p < 0,01).
Para el ensayo de CV esta comparación dio una diferencia significativa (p<0,001)
para todas las comparaciones.
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa con p <
0,001 para todos las comparaciones, excepto C4 / CS (p < 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteínas dieron una diferencia no
significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones.
El análisis de la tendencia de los datos para RN, CV y LDHa lo largo de las
exposiciones resultó altamente significativa (r 2 entre 0,94 y 0,25).
La respuesta a mayor número de exposiciones consecutivas, se evidencia
más por los ensayos de RN y determinación de la liberación de LDHy algo menos
por CV.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con
Extracto Acuoso en concentración 100 ug / ml (I1) en página 137 a 139.
RESULTADOS 130
En el Gráfico18 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cultivos con una concentración fija sub aguda ( 50 pg / ml) de extracto acuoso de
Ilexparaguaiensis.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar en función dei número de
tratamientos.
IIexpu‘agmiersis-EmactoAcuoeoExposiciónCnórlcasojdn'l
14o
120
100
a3 ao808 eo:2
4o
20
+RN2 +Cv2 +LDH2 +Pmteíms2o l I l 1 I l
c1 02 c3 C4 cs os c7 ca csMimodeExpodcionas
Gráfico 18
El análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
EIensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativa entre los resultado para una exposición (C1) respecto del resto de
los pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,0001)
entre pasajes sucesivos excepto para C8 l C9 (p > 0,05).
Para el ensayo de CV esta comparación dio una diferencia significativa (p<0,001)
para todas las comparaciones, excepto C2/C3 y C5/C6 (p > 0,05).
RESULTADOS 131
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa con p <
0,001 para todos las comparaciones, excepto C7 / C8 y CB/ 09 (p < 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteínas dieron una diferencia no
significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones.
El análisis de la tendencia de los datos en todos los casos resultó
significativa a lo largo de las exposiciones (r 2entre 0,96 y 0,24).
Se observan cambios de respuesta del sistema en función de la
frecuencia de exposición de los cultivos a esta concentración de extracto
metanólico a partir del cuarto tratamiento .
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica con
Extracto Acuoso en concentración 50 ug / ml (I1) en página137 a 139.
La respuesta a mayor número de exposiciones consecutivas, se evidencia más
por los ensayos de RN y determinación de la liberación de LDHy algo menos por
CV y mediante la determinación de la concentración proteica.
RESULTADOS ‘ 132
En ei Gráfico19 se observan ios resultados de la exposición crónica de los
cultivos con unaconcentración fija sub aguda de 50 pg I ml de extracto metanólioo
de Ilexparaguaiensis. '
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
como porcentaje respecto del control sin tratar en función del número detratamientos.
Ilexpamaensis - ExtractoMetaióiimExposición Crón'ca
+RN1+CV1+LDH1+PMBÍM1
%delControl
C1 C2 C3 C4 C5 06 C7 08 09
mas Brpoaidones ’
Gráfico 19
EI análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
El ensayo estadístico de CMde Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativaentre ios resultado para una exposición (C1) respecto del resto de los
pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,0001) entre
pasajes sucesivos excepto para C2 / C3 (p > 0,05).
RESULTADOS 133
Para el ensayo de CV esta comparación dio una diferencia significativa
(p<0,001) para todas las comparaciones.
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa con p <
0,001 para todos las comparaciones, excepto para C2 / CS y C4 / C5 (p < 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteínas dieron una diferencia no
significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones.
El análisis de la tendencia de los datos para RN, CV y LDHa lo largo de las
exposiciones resultó significativa (r 2entre 0,86 y 0,13).
Se observan cambios de respuesta del sistema en función de la
frecuencia de exposición de los cultivos a esta concentración de extracto
metanólico. a partir de la cuarta exposición por RN y CV y, a partir del sexto
tratamiento para Ia actividad de LDHque crece con el deterioro leve que sufre el
cultivoy finalmente decrece por acentuarse este fenómeno.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica
con Extracto Metanólico en concentración 50 ug / ml (I1) en página 137 a 139.
RESULTADOS 134
En el Gráfico 20 se observan los resultados de la exposición crónica de los
cultivos con una concentración fija sub aguda de 12,5 pg l mi de extracto
metanólico de Ilexparaguaiensis.
Las curvas correspondientes a cada ensayo de evaluación se presentan
oomo porcentaje respecto dei control sin tratar en función dei número de
tratamientos.
ilex paragueiensis - Extracto MetanóliooExposición Crónica
%delControl
+RN2 +CV2 +LDH2 -)(--Prdeínas2
Número de Exposiciones
Gráfico 20
Ei análisis estadístico de Friedman evidenció una diferencia altamente
significativa (p < 0,001) por todos los ensayo realizados.
Ei ensayo estadístico de CM de Dunn para el ensayo de RN, indicó una diferencia
significativa entre los resultado para una exposición (C1) respecto dei resto de
los pasajes (p < 0,001). Asimismo, se vio diferencia significativa (p < 0,0001)
entre pasajes sucesivos excepto para 02 / C3 (p > 0,05).
RESULTADOS 135
Para el ensayo de CV el ANOVAresultó con una diferencia no significativa
(p = 0.9986).
Estos resultados para LDH dieron una diferencia significativa con p < 0,001
para todos las comparaciones, excepto C5 / C6 y C6 / C7 (p > 0,05).
Por el contrario, las evaluaciones para Proteinas dieron una diferencia no
significativa (p > 0,05) para todas las comparaciones, excepto C1/C2.
El análisis de la tendencia de los datos en todos los casos resultó
significativa a lo largo de las exposiciones (r 2 entre 0,82 y 0,02).
Se observan cambios de respuesta del sistema en función de la
frecuencia de exposición de los cultivos a esta concentración de extracto
metanólico sólo a partir de la sexta exposición por RN y para la actividad de
LDH, que crece con el deterioro leve que sufre el cultivo y finalmente decrece poracentuarse este fenómeno.
Se pueden observar imágenes de Células en Exposición Crónica
con Extracto Metanólico en concentración 12,5 ug / ml (|1) en página 137 a 139.
RESULTADOS 136
Yerba Mate Exposición Crónica
Imágenes de las de cultivos fijados y teñidos con Cristal Violeta
observaciones al microscopio invertido; aumento 100x
Exposiciones Sucesivas de células MRC 5 :
Tratamientos en cada exposición con cada preparación acorde a como se indica
en Materiales y Métodos 5.2.3
Medio de Mantenimiento ................. .. CC (control de células)
Diluciónde Metanol ........................ .. CSV (control de solvente)
Extracto Acuoso de Yerba Mate concentración 160 pg I ml .......... .. I1
Extracto Acuoso de Y. Mate concentración 40 ug / ml .................... .. I2
Extracto Metanólico de Y. Mate concentración 50 ug l ml .............. .. lm1
Extracto Metanólico de Y. Mate concentración 12.5 pg l ml ........... .. Im2
Imágenes 21
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los
extractos durante 72 hs; después de Ia primera exposición
Imágenes 22
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los
extractos durante 72 hs; después de la cuarta exposición
Imágenes 23
Células no tratadas ( CC), expuestas a control de solvente (CSV) o a los
extractos durante 72 hs; después de la novena exposición
RESULTADOS 137
MWMM,.
Magyar.Se ¿ 7;Wifi},,¡a“ ¡v 'IÉÍÏV,’ ¡vrfl .4 ‘ "a‘' ¡ha
y. y,
h ' ->. ‘ f It e//' . F f í
l» /¡l .j ‘II a ¡li, ‘ 7 ' y z V 1ra ‘ u ‘
.r r}. ‘ ‘l," ' 'a ' y,V'V 'Í' (vi:
I IM: CV I 11442CV1 00.515 —¿mm March
/’/
RESULTADOS 138
Il EX PÁRÁGUEÁIENSIS[2M4 : ‘
1'VIM2_crr1.l H: ,4 1._. ., . .. _N4 i‘ny
x y.P E‘A «g‘\z'‘.“' ‘JU u)."’. n .- ‘.' "3"." .g
‘ vías! \“g,}\_¿ ¿V v. y
IVC‘Jchv4 00315- aún! mina
RESULTADOS 139
WMTOXICTDÁD“ONIL?!
JXIMZ CVfl 0051.5 - MSM Maleta
DISCUSIÓN 141
Esta discusión se divide en tres Capítulos principales.
Al igual que en Antecedentes y Resultados; uno que corresponde a Va/lesia
glabra o Ancoche y otro a l/ex paraguaiensis o Yerba Mate.
A su vez, se discurre sobre cada una de las formas de Exposición (Aguda,
Repetida o Crónica) para todos los grupos de ensayos en forma individual y/o
comparativa entre ellos por separado, y para el extracto acuoso primero, el
metanólico luego y finalmente comparativo entre ambos.
Se hace posteriormente una evaluación global sobre los dos vegetales y
sobre Ia aplicación de este tipo de ensayos ¡n vitro.
Finalmente se hace una mención a la correlación IC50 / LDSOy al futuro de
este tipo de ensayos.
DISCUSIÓN 142
7.1 Vallesia glabra o ANCOCHE
Exposición Aguda:
No se evidenció una diferencia de respuesta por todos los sistemas de
evaluación realizados ante el tratamiento de los cultivos en forma.aguda con
concentraciones crecientes de extracto acuoso de Ancoche (gráfico 1).
Se pudo medir un aumento no significativo en los valores de LDH liberada
para concentraciones de 500 y 1000 ug/ml, que coinciden con observaciones al
microscopio de comienzo de daño de los cultivos.
Por otra parte, el decrecimiento en los valores de este mismo ensayo y para
toma de Rojo Neutro y MTT se debe a muerte celular a partir de la concentración
de 2000 ug/ml.
Por otra parte, por el ensayo con colorante Cristal Violeta no se evidencian
diferencias al hacer la solubilización del colorante y evaluación por
espectrofotometria, pero si por observación de la imagen de la placa del ensayo al
fijar las células. Allíse observa notoriamente, disminución en la densidad de la
monocapa a partir de la concentración 500 ug/ml que se hace más manifiesta con
concentraciones más altas del extracto usado para el tratamiento.
Las imágenes 1 y 2 (pág 61 y 62) permiten observar la evolución de los
cultivos con las concentraciones crecientes a que fueron expuestos.
En el caso de las exposiciones en forma aguda de los cultivos con extracto
metanólico de Ancoche se observa en el gráfico 2 que a partir de la concentración
de 125 ug/ml hay un descenso en los valores para cada uno de los ensayos de
coloración y un crecimiento de la LDH liberada. Esto al mismo tiempo coincide con
comienzo de deterioro celular observando los cultivos al microscopio.
En las imágenes 3 y 4 (pág 66 y 67) se puede ver un debilitamiento de las
monocapas a concentraciones de 125 ug/ml, efecto que se acentúa con el aumentode las concentraciones de extracto.
Para evaluar el efecto de estos extractos sobre la maquinaria de duplicación
celular se llevóa cabo el ensayo de Eficiencia de Clonado.
DISCUSIÓN 14a
De éste se pudo determinar que concentraciones de 100 ug/ml de extracto
acuoso no dañan al sistema mencionado, pero si la exposición a 250 ug/ml (31%
de inhibición)o mayores de extracto acuoso (Tablas 2 y 3).
En un ensayo preliminar con otro rango de concentraciones de extracto
acuoso resultó con 100% de inhibición de la formación de clones para las
concentraciones de 2000, 1000 y 500 ug/ml; y con 53% para 250ug/ml y 12 %
para 100 pg/ml.
Similarmente, para el ensayo preliminar con el extracto metanólico, se tuvo
100 % de inhibición para las concentraciones de 1000, 500, 250 y 125 ug/ml; y un
16% con 50ug/ml.
Más notorio es el efecto al exponer los cultivos al extracto metanólico, pues ya
con concentraciones de 125 ug/ml se tiene un 75% (ó 100%)de inhibición de
formación de clones celulares. Mientras que para lograr el mismo efecto se
necesitan 500 ug/ml o más de extracto acuoso (94 % ó 100%).
Esto se ve claramente en las imágenes 5 y 6 (pág 72 y 73)
Alevaluar mediante el Ensayo del Cometa el ADNde las células tratadas en
forma aguda con los extractos acuoso y metanólico de Ancoche y comparar
(Tabla 4) con los cultivos no expuestos se pudo determinar que el tratamiento con
bajas concentraciones de extracto acuoso presentan un Indice de Daño similar al
observado para los controles sin tratar y menor para las mismas concentracionesde extracto metanólico.
Cultivos enfrentados a mayores concentraciones de extracto acuoso o a
extracto metanólico presentan un Indice de Daño mayor al ser evaluados por el
Ensayo del Cometa.
En todos los casos se pudo ver un mayor número de núcleos en el estadio de
mayor daño (estadio 4) en los cultivos tratados con extracto metanólico, respectodel acuoso o los sin tratar.
DISCUSIÓN 144
Exposición Repetida:
Alsometer los cultivos a mayor número de exposiciones no se observan diferencias
en las respuestas a lo largo de los diferentes pasajes y tratamientos con el extracto
acuoso para los ensayos de CV, y tampoco por medio de la determinación de la
concentración de proteinas (gráfico 3)
Por estos ensayos se evidencia una diferencia en daño o sensibilización del
sistema a través de Ia repetición de los tratamientos con extracto acuoso sólo para
los ensayos de MÏT y LDHa altos números de pasaje.
Este tipo de ensayo, llevado a cabo con extracto metanólico permite ver una
leve mayor sensibilización del sistema a partir del cuarto pasaje y tratamiento de los
cultivos (Gráfico 4). Luego de seis pasajes y exposiciones consecutivas gran parte
de las células están muy dañadas; esto se evidencia por los valores de RN y
Proteínas. AIfijarlas para la coloración de CV, quedaron células muertas pegadas al
sustrato de cultivoy resulta en un valor más alto de absorbancia que Io que hubiera
correspondido para esa concentración de extracto.
Se puede ver esto mejor en las imágenes 8 y 9 (pág 82 y 83)
El análisis del daño al ADN por medio del Ensayo del Cometa luego de
someter los cultivosa exposiciones repetidas para las concentraciones de extracto
elegidas, evidencia un mayor Indice de Daño para los cultivos sin tratar más notorio
luego del tercer pasaje / tratamiento consecutivo en el caso del extracto acuoso
(gráfico 5) y en casi todos los pasajes para el tratamiento con el extracto
metanólico (gráfico 6).
Se evidenció un mayor número de núcleos en estadio 4 de daño a partir de la
quinta exposición de los cultivos con el extracto acuoso y del cuarto pasaje para el
extracto metanólico.
Exposición Crónica:
AI someter los cultivos a varias exposiciones consecutivas se observan
diferencias en las respuestas a Io largo de los diferentes tratamientos con una
concentración de 160 pg/ml de extracto acuoso de Ancoche para los ensayos de
CV y RN y por medio de la determinación de la concentración de proteínas (gráfico
DISCUSIÓN 145
7). La actividad de LDHdemuestra que a partir del quinto tratamiento de los cultivos
hay un aumento debido al comienzo del deterioro de los cultivos, y luego de la
séptima exposición hay una disminución debido a la menor cantidad de células
presentes por muerte y desprendimiento del sustrato.
En el gráfico 8, cuando se hace el análisis de estos sistemas para la
concentración de 40 uglml se observa una tenue declinación en los valores de CV,
RN y Proteínas, debido a la menor cantidad de células viables en las cavidades a
mayor número de exposiciones.
Una respuesta más notoria se tiene por la determinación de actividad de LDH.
Se pueden ver como dos tendencias, una hasta la quinta exposición y luego un
aumento de actividad que se acompaña con el daño observado al microscopio y una
caída luego de la séptima exposición causada por menor cantidad de células en la
cavidad por muerte y desprendimiento, dado que el daño celular se acentúa con la
exposición al extracto.
En el caso de la Exposición Crónica con extracto metanólico (gráficos 9 y
10), no se observa una marcada diferencia en la respuesta a lo largo de las
exposiciones para las concentraciones de extracto de 50 ug/ml ni para la de 12,5
ug/ml por los ensayos de CV o de concentración de proteínas.
El ensayo de RN revela una tenue declinación a Io largo del número de
exposiciones, más notorio a partir de la quinta, para ambas concentraciones deextracto.
El ensayo de LDH muestra, en el caso de la concentración de 50 ug/ml, un
aumento de actividad a partir de Ia quinta exposición que luego de la séptima
exposición al extracto declina. Toda esta secuencia acompaña las observaciones de
deterioro progresivo de los cultivos efectuadas por microscopía (imágenes 11-12 y
13; pág 97 a 99).
Comparación de los Extractos
De Ia comparación de los dos extractos se puede decir que el extracto acuoso
resulta menos tóxico que el metanólico dado que a la misma concentración, éste
DISCUSIÓN 146
último presenta menores valores para los ensayos que indican viabilidad celular
(RN, CV, Proteínas, MTT)y mayores para los que indican daño celular (LDH).
Esto se corrobora con las observaciones al microscopio con un comienzo de
daño a concentraciones de 62,5 ug/ml de extracto metanólico y a concentraciones
de 250 ug/ml de extracto acuoso.
Parece haber algún efecto protector del daño sobre las células a
concentraciones de 31,25 y 125 ug/ml, con un Indice de Daño 24 y 17 %
respectivamente). Este efecto fue ya descripto por otros autores para varios
extractos vegetales".
En cuanto a las exposiciones repetidas, no evidenciaron una gran diferencia
entre ambos, excepto a partir del quinto pasaje, con una mayor toxicidad también
para el extracto metanólico.
La misma tendencia fue vista mediante los Ensayos del Cometa y por
Eficiencia de Clonado.
Respecto de la Exposición Crónica, se observa mayor grado de toxicidad
luego de cuatro o cinco exposiciones consecutivas, en los cultivos tratados con los
dos tipos de extractos, pero con respuesta más acentuada para el extracto
metanólico, aun a concentraciones más bajas.
DISCUSIÓN 147
7.2 Ilexparaguaiensis o Yerba Mate
Exposición Aguda:
No se evidenció una diferencia de respuesta por todos los sistemas de
evaluación realizados ante el tratamiento de los cultivos en forma aguda con
concentraciones crecientes de extracto acuoso de llex paraguaiensis (gráfico
11). Con la concentración de 4000 ug/ml se tiene una alta toxicidad evidenciada
por los valores de MÏT y LDH y por las observaciones de los cultivos al
microscopio (imágenes 14 y 15; pág 105 y 106).
Para el caso de Ia exposición aguda al extracto metanólico se puede ver
aumento de toxicidad en la respuesta con concentraciones de 2000 ug/ml o
mayores (gráfico 12) y por las observaciones de los cultivos al microscopio
(imágenes16 y 17; pág 110 y 111).
Para evaluar el efecto de estos extractos sobre el sistema de duplicación
celular se llevóa cabo el ensayo de Eficiencia de Clonado.
De la evaluación de los resultados obtenidos se pudo ver que
concentraciones de 25 ug/ml o mayores de extracto acuoso inhiben la formación
de clones en un 100 %, mientras que sólo en un 82 % por la exposición a la misma
concentración de extracto metanólico o mayores (Tablas 6 y 7).
Las imágenes 18 (pág 115) muestran que algunos clones muestran alta
toxicidad, como los formados en presencia de 25 ug/ml de extracto acuoso frente a
los formados en presencia de la misma concentración pero de extracto metanólico.
Resultados obtenidos de un ensayo preliminar para ajustar las
concentraciones a usar para este mismo ensayo, permitieronestablecer que hay un
100% de inhibición de la formación de clones para cultivos tratados con 375, 200,
100 y 37,5 ug/ml; y un 6% con 20 ug/ml de extracto acuoso.
Para el extracto metanólico, los resultados preliminares fueron del 100% de
inhibiciónpara todas las concentraciones usadas entre 37,7 y 750 ug/ml.
DISCUSIÓN 14a
AIevaluar mediante el Ensayo del Cometa el ADNde las células tratadas
en forma aguda con los extractos acuoso y metanólico de llex paraguaiensis y
comparar (Tabla 8) con los cultivos no expuestos, se pudo determinar que no se
observa daño de las células, medido como Indice de Daño, a pesar de encontrar
una mayor cantidad no significativa de núcleos en estadios 3 y 4 de daño para
células de los cultivos tratados con extracto acuoso frente a la misma
concentración de extracto metanólico .
Exposición Repetida:
Al someter los cultivos a mayor número de exposiciones no se observan
cambios en las respuestas de los diferentes ensayos para todos los pasajes /
tratamientos efectuados con una concentración de 50 ug/ml de extracto acuoso
(gráfico 13) ó de 25 ug/ml de extracto metanólico (gráfico 14) a bajo número de
pasajes.
Sólo luego de seis pasajes se ve una respuesta modificada en el caso del
extracto acuoso y a partir del quinto en el caso de extracto metanólico.
Esto indicaría una baja toxicidad para las concentraciones de extractos usadasen estas condiciones.
Las imágenes 19 y 20 (pág 123 y 124) evidencian esta respuesta.
El análisis del daño al ADN por medio del Ensayo del Cometa luego de
someter los cultivos a exposiciones repetidas para las concentraciones de extracto
elegidas, no evidencia un Indice de Daño aumentado para los cultivos tratados con
los dos tipos de extractos (gráficos 15 y 16).
Exposición Crónica:
AIsometer los cultivos a varias exposiciones consecutivas se observa que con
una concentración de 100 pglml de extracto acuoso de llex paraguaíensis hay
diferencias en las respuestas a mayor número de exposiciones para los ensayos de
CV, FiN y en la actividad de LDH, siendo ésta mucho más notoria que los otros
puntos finales (gráfico 17).
DISCUSIÓN 149
El efecto observado cuando se exponen los cultivos durante nueve tratamientos
a una concentración de 50 pg/ml muestra una tendencia semejante pero menos
acentuada (gráfico 18).
Esto confirma las observaciones registradas al microscopio, con un aumento del
deterioro de los cultivos a partir del quinto tratamiento para el primer caso y del cuarto
para la menor concentración usada. Esto se puede ver mejor en las imágenes 21 a
23 (pág 137 a 139).
Los resultados de la exposición de los cultivos en forma crónica a extracto
metanólico muestran una marcada respuesta a mayor frecuencia de exposición de
los cultivos a una concentración de 50 pg/ml por el ensayo de RN, levemente por
CV. Algo más notoria es la tendencia por la actividad de LDH, pero queda
estadísticamente enmascarada por la fluctuación de los datos (gráfico 19).
También para las exposiciones a una concentración de 12,5 uglml se
observan cambios de respuesta del sistema en función de la frecuencia de
exposición de los cultivos, pero sólo a partir de la sexta exposición por RN y para
la actividad de LDH, que crece con el deterioro leve que sufre el cultivo, y
finalmente disminuye por haber menor cantidad de células en la cavidad, por
muerte y desprendimiento del sustrato de cultivo(gráfico 20).
Comparación de los Extractos
De la comparación de los dos extractos se puede decir que el acuoso resulta
algo más tóxico que el metanólico en exposiciones agudas para ambos tipos de
extracto dado que a la misma concentración, éste últimopresenta mayores valores
para los ensayos que indican viabilidad celular (CV, Proteínas, MTl') y menores
para los que indican daño celular (LDH).
Por observaciones al microscopio se puede ver que a 500ug/ml y 1000 ug/ml
de extracto acuoso hay un retardo en el cultivo dado que a concentraciones
menores se encuentran las monocapas sobrecrecidas. Con 2000 ug/ml se ve
comienzo de daño que es mucho más acentuado con 4 mg/ml. Con extracto
metanólico, las células tratadas con concentraciones entre 1000 ug/ml evidencian
DISCUSIÓN 150
comienzo de daño o deterioro de la monocapa por observación al microscopio,
siendo algo más notorio a 2000 ug/ml. Con el aumento de la concentración también
aumenta progresivamente el daño celular, con un alto deterioro para 4 mg/ml.
Como resultado de las exposiciones repetidas, éstas no evidenciaron una
gran diferencia entre ambos, excepto a partir del quinto pasaje, con una mayor
toxicidad también presentada por el extracto metanólico.
Mediante los Ensayos del Cometa no se pudo ver diferencia entre los dos
tipos de extracto, como tampoco respecto de los controles sin tratar.
La evaluación de la Eficiencia de Clonado ¡ndicaría un mayor daño en el
aparato de duplicación celular causado por la exposición al extracto acuoso.
Por otra parte la exposición en forma crónica de los cultivos, a la
concentración de 100 ug/ml de extracto acuoso muestra una tendencia ya descripta
de aumento de toxicidad con el número de exposiciones.
Los resultados de todos los puntos finales evidencian poca o nula toxicidad
para la Exposición Crónica al extracto metanólico en concentración de 12,5 ug/ml.
Para la comparación de los dos extractos a la misma concentración (50 ug/
ml), se observa una caída más acentuada en los datos de viabilidad (RN y CV) y un
aumento más notorio para el marcador de daño celular (LDH) para los cultivos
expuestos al extracto acuoso respecto de los que fueron tratados con el extractometanólico.
Las concentraciones encontradas como tóxicas en los ensayos de exposición
aguda para los extractos de ambos vegetales se encuentran dentro de valores
comparables para otros compuestos de uso habitual con algunos de la literatura".
Por ejemplo : Formol con ICSO 3,6 pg/ml o Fenol con 0,2 9 mg/ml, y para
extractos en productos naturales en un rango entre 29,6 y 184,9 ug/ml para
extractos acuosos y etanólicos de tubérculo de Stephania venosa”.
DISCUSIÓN 151
Evaluación de los Ensayos Usados
Se puede ver a lo largo de todos los ensayos efectuados que los ensayos de
RN y de LDH, seguido luego por el de M'IT permiten tener una respuesta más
sensible del efecto que ocurre ante la exposición de los cultivos a las
concentraciones de extractos. Los resultados obtenidos con CV, Proteinas yCometa fueron menos determinantes.
Como abunda en la literatura, diferentes autores y organizacionesao eligen
grupos de ensayos a llevar a cabo, dentro de un panel que ofrece alternativas de
enfoque sobre eI punto de visualización del daño que se puede estar ejerciendosobre el sistema celular.
Los dos primeros tipos de punto final, RN y LDH, fueron ya elegidos en
publicaciones anterioresB1como parte de una batería; en varias de ellas este par se
considera suficiente.
El ensayo de Toma de Rojo Neutro ha sido incorporado al listado de ensayos
¡n vitro propuestos por ERGATT/FRAME Data Bank of ¡n vitro Techniques in
Toxicology; modificado por INVITTOX / FRAME en 1990 (Protocolo lP-3a)
INVITI'OX y en el año 1994 otra versión (Protocolo |P-100).
Dado el buen desempeño que ha tenido el ensayo de RN siempre que se Io ha
utilizado, ha pasado satisfactoriamente las etapas de validación de ECVAMy, en su
variante para fototoxicidad, está en camino de aceptación regulatoria como técnica
a ser usada para ensayos de toxicidad ¡n vitro”.
Respecto del ensayo de actividad de LDH, éste es de aplicación muy difundida
y se encuentra incluido en la batería de ensayos que ofrecen algunas empresas
como servicio para evaluación de toxicidad de drogas.
El ensayo de MTT fue adoptado por ERGATT/FRAME en 1990 (Protocolo IP
17)
Para algunos Iaboratoristas, éste es un ensayo de citotoxicidad ¡n vitro
conveniente para establecer la viabilidad de las células dado que es de fácil
aplicación, preciso y que brinda una rápida indicación de toxicidad”.
DISCUSIÓN 152
Se encuentra también incluído en la batería de ensayos que ofrecen algunas
compañías juntamente con el de Cristal Violeta.
El ensayo de determinación de la concentración de Proteínas está
altamente aceptado como uno de los que pueden predecir muy bien el grado de
toxicidad aguda“. Sin embargo, en este trabajo no brindó una información
determinante. Ello indica la necesidad de incluir varios ensayos para poder
caracterizar mejor el sistema.
En muchos trabajos recientes sobre el ensayo del Cometa se ha remarcado
que esta técnica está siendo ahora muy ampliamente adoptada por los toxicólogos
ambientalistas y oncólogos y es Ia primera técnica que permite detectar rupturas en
el ADNen virtualmente cada célula individualcon un alto grado de sensibilidad“.
Su aplicación en este trabajo permitió ver diferencias de daño en las células
enfrentadas con los extractos a concentraciones menores que la IC50.
DISCUSIÓN 153
CORRELACIÓN IN VIVOl IN VITRO
Evaluación del Peligro
Cuando encaramos estudios toxicológicos sobre un material los objetivos son:
1) identificar el peligro, o sea conocer si posee efectos potenciales adversos,
que pudieran desencadenar cáncer, lesiones residuales, u otros trastornos.
2) Hacer una estimación cuantitativa de Ia relación exposición - respuesta.
3) Estimar el riesgo
Para ello se debe
/ hacer una valoración del peligro ó hazard assessment . Este es el proceso que
evalúa cualitativamente el potencial impacto de la exposición del hombre a
ciertos agentes xenobióticos (produce cáncer, afecciones respiratorias, nada)
f y luego, en consecuencia, una valoración de Ia exposición ó risk assessment es
la estimación cuantitativa de la exposición, es decir concentración, tiempo, en
qué condiciones, a qué población (étnico, etario) relaciona exposición
intensidad y tipo de respuesta.
La relación exposición / respuesta describe la probabilidad de que un
organismo desarrolle una respuesta biológica NO DESEADA por exposición a la
sustancia, o sea cuantifica el riesgo.
Los sistemas ¡n vitroson sumamente satisfactorios para evaluar y estudiar el
metabolismo de compuestos extraños o de estructura desconocida dado que, en
condiciones especiales o con sistemas agregados, presentan puntos finales claros
que pueden ser medidos o cuantificados.
En general existe una correlación razonablemente buena entre la velocidad
de la reacción y Ia vía de metabolismo ¡n vitro y Io observado in vivo. Pero no existe
DISCUSIÓN 154
un criterio determinado de viabilidad o disfunción, por Io tanto se deben establecer
ciertos marcadores que determinen el grado de toxicidad al usar este tipo de
ensayos.
No se puede correlacionar directamente toxicidad in vivo (dosis) con ¡n vitro
(concentración tóxica) sin tener en cuenta datos biocinéticos.
Es más directo si se hace esta correlación específica, es decir usando un
sistema órgano /cultivode órgano
Las respuestas ¡n vitro pueden variar mucho según las condiciones en que se
lleve a cabo el ensayo, por ejemplo, tiempo de exposición a la droga, temperatura,
pH, etc.
Para poder correlacionar mejor habria que entender más los mecanismos de
toxicidad y las diferentes especies. Saber por ejemplo cuál es el primer marcador de
toxicidad in vitroy no cuál es el marcador de muerte final.
En muchos casos la comparación ¡n vitro / in vivo es retrospectiva, esto
implica que por ahora estos ensayos sólo tienen valor predictivo relativo, faltándolesaún consistencia.
Como ya se dijo, la Farmacología y la Toxicología tradicional llevan a cabo
estudios en animales, tendientes a predecir o evaluar este riesgo potencial.
Para ello, mediante una exposición aguda, se determina Ia DOSIS LETAL50
(DL50). Esta mide Ia letalidad aguda, determinando así la potencia como tóxico.
Permite obtener una medida estadísticamente precisa de Ia cantidad de
producto químico que produce un 50% de mortandad en los animales.
Alcomparar distintos compuestos que tienen diferente DL50, se obtiene una
escala de toxicidades relativas.
Se puede determinar también la DOSIS EFECTIVA 50 (DE50), que es Ia
cantidad de producto que produce un determinado efecto nocivo sin llegar a Iamuerte del animal.
Muchos estudios muestran muy buena correlación entre los datos LD50 y los
de citotoxicidad in vitro sobre líneas de células no diferenciadas. Pero en algunos
DISCUSIÓN 155
casos de drogas que evidencian su toxicidad a través de mecanismos complejos o
que requieren receptores específicos, es más difícilencontrar un sistema adecuado
que lo reproduzca.
Hasta 1994 se establecía que, a pesar de la muy buena correlación existente
entre los grupos de datos in vivo e ¡n vitro, no era posible usar sólo los datos de in
vitro para una droga nueva si no se disponía de los datos ¡n vivo; esto ahora es
menos estricto. Se han desarrollado muchos ensayos ¡n vitro pero sus datos no
tienden a ser coordinadamente usados aun para predicciones.
La predicción de letalidad in vivo es uno de los propósitos de la aplicación de
evaluaciones mediante ensayos in vitro.Aunque muchos de los efectos particulares
no pueden ser vistos por estos sistemas, su aplicación es sumamente destacada en
el procesamiento de cientos o miles de muestras".
Disponiendo de datos toxicológicos ¡n vivo, los ensayos ¡n vitro tienen la
función clave de ayudar al entendimiento de las diferencias específicas de especie
en las respuestas.
La extrapolación de los resultados es un pre-requisito para el aseguramiento
del riesgo para el hombre.
A pesar de la notoria evolución que han tenido los ensayos ¡n vitro en los
últimos años, sólo cuentan con modelos regulatorios (Guidelines) los ensayos para
mutagenicidad y recientemente se ha incorporado un reemplazo para el test deirritación ocular.
Hasta ahora, el mejor modelo que provee información más completa para
aseguramiento de riesgo, es el modelo in vivo. Mientras que los ensayos in vitro
contribuyencomo técnicas de screening y como proveedoras de datos adyacentes
para mejorar la sensibilidad y especificidad de los estudios en animales.
Un punto clave de la utilización de ensayos in vitro es la posible relación do_sis
efectiva (DE) in vivocon concentración efectiva (CE) in vitro. O sea se deberán tener
en cuenta importantes factores biocinéticos cuyos parámetros deberán incluirse en
las predicciones del modelo matemático.
Lo más usado es la DL50,que son dosis criticas corporales y se expresan en
general en mg/kg peso corporal. Las potencias in vitro se dan en unidades de
DISCUSIÓN 156
concentración por ejemplo ug/ml de cultivo. Por supuesto que estas dos cantidades
no se han de comparar directamente debido a factores biocinéticos, aunque en la
mayoría de los casos se han comparado valores de DL50 con los de CE50 ¡n vitro
para predicción de toxicidad aguda ¡n vivo.
Por _lotanto para convertir los datos de CE ¡n vitro a dosis corporales
equivalentes sería necesario tener por lo menos la siguiente información:
a) Características tisicoquímicas del compuesto (pKa, lipofilicidad,volatilidad)
b) Estructura cuantitativa de unión a proteínas (el binding)
c) Características básicas del sistema ¡n vitro (concentración de células, relación
células - medio, concentración de albúmina, etc.)
La validación de ¡n vitro / ¡n vivo para el uso de los cultivos celulares en
ensayos in vitro, ha sido y es un tema de mucha expectativa, no sólo por razones
éticas sino por la necesidad de reducir tiempo y costos en el aseguramiento de
riesgo antes de introducir un producto en el mercado. Todo este proceso, que es
sumamente complejo, está muy bien descripto por Zucco y colaboradores87 y la
ampliación y actualización"8
Actualmente, continúa el Programa de fortalecimiento de estas técnicas,
tendientes al reemplazo o reducción en el uso de animales, pero con regulaciones
para la aplicación de estas evaluaciones.
Existe una publicación” que compendia el resultado de los esfuerzos realizados
en los últimos 10 años, tendientes a lograr un acercamiento en esta correlación
Futuro de estos sistemas
EI futuro en este área de la Toxicología, es decir el futuro de los ensayos ¡n
vitro depende de ciertos puntos aún sin resolver, algunos se mencionan a
continuación.
La probabilidad de que un método in vivo,en animales, sea reemplazado por uno
in vitrodepende de varios factores:
1) Entendimiento del mecanismo del proceso toxicológico; conociendo este
mecanismo es más probable poder desarrollar un ensayo ¡n vitroque se base en
DISCUSIÓN 157
él. Existe un pensamiento simplista que indica que la mayoría de los compuestos
químicos causa toxicidad por citotoxicidad basal. Pero si esto fuera así, no daría
cuenta de la gran cantidad de procesos patológicos que pueden ocurrir.
2 La complejidad de los puntos finales: En algunos procesos complejos, como los
que ocurren en piel, la evolución o el proceso a través de las diferentes capas o
\_—
las transformaciones que este sistema va sufriendo pueden ser mejor
visualizados. Sin embargo, en otros, como en los estudios a 90 días o crónicos
existe mayor grado de complejidad y dispersión.
3 Número de dosis o de exposiciones necesarias para ver un efecto: Por ejemplo la\.—
cirrosis o el enfisema requieren un daño repetido al órgano como pre-requisito
para el desarrollo de la lesión. En algunos casos es necesario hasta 6-12 meses
de exposición al producto para llegar a una lesión. Esto sería dificilde mimetizar
en un sistema ¡n vitro,con los conocimientos actuales.
Hay muchos esfuerzos empeñados en el sentido de lograr nuevas técnicas o
aplicar metodologías que permitan obtener más y mejor información a partir de
ensayos ¡n vitro.
El pasado y presente de los ensayos ¡n vitro ha sido trabajar intensamente
con lineas establecidas, que tienen como ventaja que están bien definidas, son de
fácil disponibilidad, es posible hacer intercambio entre laboratorios y en general son
adecuadas para determinaciones de citotoxicidady de genotoxicidad.
Las lineas genéticamente modificadass’oy las lineas celulares inmortalizadas
o el uso de cultivos de células stem o pluripotentes son un recurso promisorio para la
evaluación toxicológica que involucre los metabolismos.
El uso de cultivos tridimensionales tiene la ventaja adicional de una bien
definida geometría, que permite una relación directa entre la estructura y la función y
Ia posibilidad de preservar Ia interacción celular
La Inmunotoxicologia es otro campo de la Toxicología que está cobrando
interés, debido a reacciones de hipersensibilidad o autoinmunidad que pueden
desencadenar y existe un interesante planteo en su relación con las ICSOde algunos
productos91 .
DISCUSIÓN 158
En este momento, se está viviendo la transición entre la biología molecular
clásica y los comienzos de la era post - genómica y la Proteómica. Debido a la
disponibilidadde los datos del genoma humano, se cuenta con miles de secuencias
de ADNen las que se puede monitorear su expresión cuando la célula se enfrente
con sustancias xenobióticas. Seria entonces la Toxicogenómica la que podria
brindar nueva luzsobre este campo”.
Estos nuevos sistemas tienen entre otras ventajas, que sirven para generar e
identificar metabolitos de la droga, son útiles para predecir el clearance dé in vivo,
permiten estudiar interacciones droga-droga y son especiales para estudiar lainducción enzimática.
Dependiendo del objetivo del estudio que se ha de encarar se eligen lineas
que expresen "alguna" enzima metabólica con fines de determinar una toxicidad
potencial (Hazard assessment), o para evaluación de riesgo (risk assessment) el
sistema celular debe ser muy cercano a la situación ¡n vivo.
En pasos posteriores, más a futuro, se requiere contar con la construcción de
sistemas celulares que expresen sistemas enzimáticos de fase ll y otros más
complejos.
Desde el año 2001 la Comisión Europea para el registro de compuestos
quimicos ha estado trabajando sobre una nueva politica para estos fines. Es decir
para asegurar que un producto llegue al usuario sólo con satisfactorias garantías de
inocuidad,en una nueva publicación93 se explica el sistema REACH (Registration,
Evaluation, and Authorization of CHemicals) que seria el camino a seguir para
realizar con éxito los sistemas ¡n vitro para los fines de registro de productos.
8XCONCLUSION
CONCLUSIONES 160
Existe evidencia en la literatura de actividad insecticida de algunos extractos
vegetales entre otros“. También se ha reportado un ¡nforme negativo sobre la
utilidadde algunos extractos para esos fines“.
Otros son promisorios como protectores para algunas patologías96 o
sistemas25 o por sus propiedades antioxidantes97'93.Aunque se describen también
riesgos en este sentido99 y para ello se proponen ensayos para evaluación de
riesgo1°°.
En los últimos años, por ejemplo, se ha destacado la labor desarrollada por
INBIO, Instituto de Biodiversidad de Costa Rica, el cual ha iniciado un catastro
sistemático de la flora y fauna nacional, identificando y clasificando especies, y
preparando extractos de partes de ellas para aislar principios activos que podrian
tener uso en la medicina, biotóxicos, insecticidas o industriales. Mediante convenios
con laboratorios farmacéuticos extranjeros ha obtenido recursos económicos y ha
suscrito contratos para obtener los derechos que correspondan y compartir la
propiedad industrial de los principios activos descubiertos (informe de FAO-ORG).
CONCLUSIONES 161
En este trabajo se evaluaron las actividades citotóxica y genotóxica de
extractos acuosos y metanólicos de
> Vallesia glabra o Ancoche
> IIexparaguaiensis o Yerba Mate
Se concluye que
> Vallesia glabra
f presenta actividad citotóxica
en exgosición aguda
a concentraciones de 500 pg / ml o mayores de extracto acuoso
a concentraciones de 250 pg / ml o mayores de extracto metanólico
en exposición repetida
se observa una mayor toxicidad luego de seis o cinco pasajes y tratamientos
consecutivos con los extractos acuoso y metanólico respectivamente a las
concentraciones ensayadas (1OOpg/ mIy 25pg / ml respectivamente).
en exposición crónica
a concentraciones de 160 pg / ml o mayores de extracto acuoso pero nomenores
a concentraciones de 50 pg / ml o mayores de extracto metanólico pero nomenores
f en cuanto a la actividad genotóxica
en exgosición aguda
Se observa cierto grado de protección de los cultivos tratados con extracto
acuoso con concentraciones entre 30 y 125 pg / ml y, toxicidad leve a
concentraciones mayores.
por exposición regetida
No se observa daño aumentado de los cultivos a los diferentes extractos.
CONCLUSIONES 162
> IIexparaguaiensis
J presenta actividad citotóxica
en exposición aguda
a concentraciones de 3 mg / ml o mayores de extracto acuoso
a concentraciones de 2 mg / ml o mayores de extracto metanólico
en exposición repetida
se observa una mayor toxicidad luego de seis o cinco pasajes y tratamientos
consecutivos con los extractos acuoso y metanólico respectivamente a las
concentraciones ensayadas (50 ug / ml y 25 ug / ml respectivamente).
en exposición crónica
se observa un cierto grado de toxicidad a partir de la quinta exposición a
concentraciones de 100 ug / ml o mayores de extracto acuoso pero nomenores
se observa un cierto grado de toxicidad a partir de la cuarta exposición a
concentraciones de 50 ug / ml o mayores de extracto metanólico pero nomenores
/ en cuanto a Iaactividad genotóxica
en exposición agudaNo se observa daño de los cultivos tratados con los extractos a las
concentraciones ensayadas.
por exposición repetidaNo se observa daño aumentado de los cultivos a los diferentes extractos.
Conclusión final sobre los extractos y los vegetales:
De la comparación de los dos extractos se puede decir que el metanólico
resulta algo más tóxico que el acuoso en exposiciones agudas para Ancoche dado
que a la misma concentración, éste último presenta mayores valores para los
ensayos que indican viabilidad celular (RN, CV, Proteínas, MTI') y menores para
los que indican daño celular (LDH).
CONCLUSIONES 163
Inversamente para Yerba Mate, principalmente determinado por los datos de
Eficiencia de Clonado y las imágenes de Exposición Crónica.
Se puede ver a lo largo de todos los ensayos efectuados que los ensayos de
RN y de LDH, seguido luego por el de MÏT permiten tener una respuesta más
sensible del efecto que se visualiza por microscopía ante la exposición de los
cultivos a las concentraciones de extractos. Los resultados obtenidos con CV,
Proteínas y Cometa fueron menos determinantes.
Propuestas
A partir de los resultados obtenidos con los ensayos in vitro aplicados para
evaluar la citotoxicidady genotoxicidad de dos tipos de extractos de dos compuestos
naturales que:
1) Hacer análisis de composición química de Ancoche
2) Profundizar los estudios de actividad insecticida de Ancoche
3) Intensificar estos estudios con otros ensayos ¡n vitrocomplementarios y
ampliatorios. para ambos vegetales
4) Tratar de asociar estructuras químicas con actividades biológicas o
respuestas citotóxicas, para ambos vegetales
e BIBLIOGRAFÍ
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FiESUMEN 174
Es de actual importancia el desarrollo y uso de extractos vegetales en el
control biorracional de plagas e insectos.
Existe además una creciente inclinación por el uso de extractos
naturales como parte de la dieta o en aplicaciones benéficas como ungüentos olociones.
Por otra parte, hay un intenso avance en la búsqueda e implementación
de técnicas alternativas al uso de animales en la evaluación de Ia toxicidad de '
drogas y compuestos químicos.
Estas razones motivaron el interés por llevar a cabo estudios de
citotoxicidad y genotoxicidad, sobre extractos acuosos y metanólicos de dos
vegetales autóctonos regionales de Argentina y parte de la zona subtropical de
América: Val/asia g/abra o Ancoche e Ilexparaguaíensis o Yerba Mate.
Se efectuaron por lo tanto estos estudios, aplicando técnicas ¡n vitro
basadas en cultivoscelulares, sometidos a tres tipos de exposiciones :
I ) aguda
ll ) repetida
Ill ) crónica
La Citotoxicidad se evaluó mediante
a) ensayos de coloración (Cristal Violeta, Rojo Neutro) o por medición de
actividades enzimáticas (Láctico deshidrogenasa, Succinato
deshidrogenasa) o por determinación de la Concentración deProteínas.
b) Eficiencia de Clonado
La Genotoxicidad se determinó por medición del Indice de Daño del
ADN en el Ensayo del Cometa.
Mediante exposiciones agudas se concluyó que los extractos
metanólicos de Ancoche presentaron mayor comportamiento citotóxico que
los acuosos para los ensayos que indican viabilidad celular (RN, CV,
Proteínas, M'lT) y menores para los que indican daño celular (LDH).
RESUMEN 175
Mediante el ensayo de Eficiencia de Clonado el extracto acuoso de IIex
paraguaiensis mostró ser más tóxico que el metanólico.
El extracto acuoso de Ancoche a bajas concentraciones brindó cierto
grado de protección de los cultivos.
Las exposiciones repetidas evidenciaron aumento de las respuestas en
el pasaje sexto.
Las exposiciones crónicas de los cultivos con los extractos durante
nueve pasajes consecutivos permitieron observar un aumento de la repuesta
citotóxica a partir del cuarto (extracto metanólico) o del quinto (extracto acuoso)
tratamiento para Ancoche .
En exposiciones crónicas de los cultivos con los extractos durante
nueve pasajes consecutivos permitieron determinar un aumento de la repuesta
citotóxica a partir del cuarto (extracto acuoso) o del quinto (extracto metanólico)
tratamiento para Yerba Mate.
Las CI50 que se determinaron por estos ensayos fueron:
Ancoche en extracto acuoso : 500 ug / ml
Ancoche en extracto metanólico : 250 ug / ml
Yerba Mate en extracto acuoso : 1500 ug / ml
Yerba Mate en extracto metanólico : 2000 ug / ml
Sería interesante profundizar estas evaluaciones con estudios ¡n vitro
complementarios que permitan caracterizar mejor estos productos y asociar, si
fuera posible, actividad biológica con estructura química.
Palabras clave : Ensayos ¡n vitro —Citotoxicidad - Genotoxicidad - Exposición
Crónica - Exposición Aguda - Exposición Repetida - Extractos Vegetales
Compuestos Biorracionales.
RESUMEN 176
The development and use of plant extracts is presently of key importance
in the biorational control of plagues and insects.
Besides, natural extracts have become increasineg important as dietary
componentst or as beneficial applications, such as ointments or lotions.
At the same time, there ¡s an intense advance in the search and
implementation of alternative techniques to the animal use in the evaluation of
drugs and chemical compounds toxicity.
These reasons motivated the interest to carry out studies of cytotoxicicity
and genotoxicity on aqueous and methanolic extracts of two regional native
plants of Argentina and part of the subtropical area of America: Val/asia g/abra
or Ancoche and llexparaguaiensis or Yerba Mate.
These studies were conducted using ¡n vitro techniques based on cell
cultures, which underwent three kinds of expositions:
I) acute
II) repeated
lll) chronic
Cytotoxicitywas evaluated by means of colorimetric staining assays with
dyes (Crystal Violet, Neutral Red) or through the measurement of enzymatic
activities (Lactic dehydrogenase, Succinate dehydrogenase) or by Protein
Concentrationassays. Cloning Efficiency assays for each extracts of both
plants were also run.
Genotoxicity was determined by measurement of the Index of DNA
Damage in the Comet assay .
From the acute expositions ¡t could be concluded that methanolic
extracts of Ancoche displayed greater cytotoxic behavior than aqueous ones by
all the tests run. Low concentrations of aqueos extract of Ancoche exhibíted
certain levels of protection of the cultures.
For Ilex paraguaiensis, aqueous extracts resulted as more toxic than
methanolic , mostly by means of microscopy observations and Cloning
Efficiency.
Repeated expositions demonstrated an increase of the response on the
sixth passage.
RESUMEN 177
Chronic exposure of the cultures with the extracts during nine
consecutive passages allowed us to observe an increase of the cytotoxicityon
the fourth exposure (methanolic extract) or on the fifth (aqueous extract)
treatment for Ancoche.
Chronic exposure of the cultures with both extracts of Ilex paraguaiensis
during nine consecutive treatment showed an increase of the cytotoxicityon the
fourth exposure (aqueous extract) or on the fifth(methanolic extract).
Cl50 determined through this assays are:
Ancoche ; aqueous extract : 500 pg / ml
Ancoche; methanolic extract: 250 pg / ml
Yerba Mate; aqueous extract : 1500 pg / ml
Yerba Mate; methanolic extract : 2000 pg / ml
Chemical composition of the extracts still have to be determined.
To better characterize these products and, if possible, to associate
biological activity with chemical structure, further complementary ¡n vitro studies
have to be carried out.
Key words : ¡n vitro assays - cytotoxicity —Genotoxicity - Chronic Exposure
Acute Exposure - Frequent Exposure - Natural Extracts - Biorational
Compounds