micro.. morfologia y estructura bacteriana (2º parte)

UNFV/FIIS Morfología y estructura bacteriana

Microbiología I 1

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIIA I

MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA BACTERIANA

(2º PARTE)

CITOPLASMA

PROPIEDADES FÍSICAS Y SEPARACIÓN DE LOS COMPONENTES

CITOPLASMÁTICOS.

En las micrografías electrónicas de cortes de bacterias, el citoplasma

aparece repleto de pequeñas granulaciones esféricas de 10 a 50 de

diámetro, los ribosomas. Estas partículas, que deben el nombre a su

riqueza en ácidos ribonucleicos (ARN), faltan en las regiones nucleares.

Mediante la microscopia electrónica de preparaciones teñidas

negativamente con ácido fosfotunsgstico se ha confirmado que los

ribosomas están constituidos por dos partículas de tamaño distintos

(HUXLEY y ZUBAY, 1960).

Los ribosomas son la sede de biosíntesis de proteínas. Varios autores han

establecido así mismo que, en las bacterias el crecimiento del 30 al 60 %

de ribosomas se agrupan formando polisomas, estructuras con constantes

de sedimentación comprendidas entre 120 y 400 S y quien las micrografías

electrónicas aparecen como ristras de ribosomas unidos por un filamento

delgado y poco opaco a los electrones.


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Si los polisomas se tratan in Vitro con ribonucleasa, se descomponen en

ribosomas 70 S; así mismo estas ultimas estructuras son únicas que se

obtienen al centrifugar los extractos de bacterias previamente sobre metidas

in vivo la acción de la actinomisina D, antibiótico que inhibe en la síntesis

de ARN mensajero. Estos resultados, unidos al hecho de que la

incorporación de aminoácidos se efectúa con mayor rapidez en los

ribosomas aislados indican que aquellos están integrados por ribosomas

unidos entre si por una misma molécula de ARN mensajero y que constituye

la forma activa de los sistemas de biosíntesis proteica.

La célula de E. coli contiene unos 18 000 ribosomas 70 S que representan

el 30 – 40 por 100 de la masa celular, el 90 % del ARN total y el 25 % de las

proteínas totales. Los ribosomas son estructuras muy hidratadas (80 % de

agua), que se componen en especial, o tal vez exclusivamente de ARN y

de proteínas, cuyos porcentajes respectivos son el 63 y 37 % del peso

seco. Se ha indicado la existencia de trazas de ADN y de lípidos; pero dado

que estas sustancias son menos abundantes cuanto mejor purificadas estén

las preparaciones, es probable que su presencia se deba a contaminación.

Los ribosomas contienen además proteínas recién formadas, pero en

cantidades poco importantes. En efecto, el ensamble de una proteína de

cuatrocientos restos de aminoácidos se efectúa en cinco segundos, y, por

tanto, el número de cadenas peptídicas en formación que se encuentran

ligadas a ribosomas no sobrepasa las cinco mil por célula de colibacilo.

Los ARN ribosómicos presentan dos peculiaridades importantes: una de

ellas es su estabilidad, que contrasta con la rápida renovación de los ARN

mensajeros y la otra es que su composición de bases es casi idéntica en

todas las especies bacterianas.


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INCLUSIONES CITOPLASMATICAS

1.- VOLUTINA

Con azul de toluidina al 0,1 por 100 o con azul policromo se ponen de

manifiesto en algunas bacterias granulaciones meta-cromáticas de volutina,

que quedan teñidas de rojo violáceo en contraste con el fondo azul del resto

de citoplasma. Estas granulaciones, que fueron descritas por BASES y por

ERNST, son muy obstensibles en el bacilo diftérico (Corynebacterium

diphteriae) y también existen en otros géneros y especies (Spirilum,

Aerobacter aerogenes, Mycobacterium) y en otros organismos no

bacterianos (Cianofíceas, Levaduras, Algas Verdes unicelulares, Mohos y

otros protistas).

La granulación de volutina alcanza hasta 0,6 u de diámetro, y al

microscopio electrónico se presentan como masas relativamente opacas

que se desintegran al incidir sobre ellas un flujo de electrones de alta

energía. Esta última propiedad es característica de las estructuras ricas en

fósforo.

La volutina esta constituida por largas cadenas lineales de polifosfatos

minerales, que en A. aerogenes constan de trescientas a quinientas

unidades:

O O O

O P O P O ....... O P O

O O O


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La metacromasia característica de este tipo de polifosfatos aparece cuando

la cadena sobre pasa las ocho unidades (EBEL, 1958). Los metapolifosfatos

cíclicos, cuya existencia no ha sido observada en organismos, no

presentan esta propiedad.

Por lo general, las granulaciones de volutina no se forman durante la fase

exponencial de crecimiento, sino que parecen cuando el crecimiento esta

limitado por algún factor que no sea fuente de energía y en especial cuando

hay deficiencia de azufre o también al añadir fosfatos a un cultivo

previamente deficiente en este factor.

Los polifosfatos se sintetizan por medio de una quitinaza que según se ha

demostrado, es de acción reversible (KORNBERG, 1957).

ATP + (P)n ADP + (P) n +1

Debido a la reversibilidad de esta reacción, se supuso que la volutina podía

ser una reserva intracelular de energía que se acumularía en las

condiciones fisiológicas en que el ATP se produce en exceso y que se

formaría de nuevo ATP al restablecerse las condiciones favorables para el

desarrollo del organismo. Sin embargo, esta hipótesis ha sido descartada,

ya que parece claro (HAROLD, 1963) que la volutina se hidroliza sin formar

ATP, por la acción de una enzima diferente, la Polifosfatasa:

(P)n + H2O (P)n +1 + PO 4 H2

El Ortofosfato exógeno reprime la síntesis de ambas enzimas

polifosfatoquinasa y polifosfatasa.

Parece ser, pues, que las granulaciones de volutina desempeña el papel de

reservas de fosfatos para la síntesis de ácidos nucleicos (WIAME 1949).


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2. Glucógeno

Algunas bacterias (Aerobacter aerogenes, Escherichia coli,

Agrobacterium tumefactiens, etc.) acumulan glucógeno en su citoplasma

cuando se desarrollan en un medio que contiene un exceso del sustrato

carbonado (glucosa, lactato) y cantidades limitantes de nitrógeno o de

cualquier otro factor (HOLME Y PALMSTIERNA, 1956). El glucógeno

bacteriano es, como el de los mamíferos, un polisacárido integrado por una

cadena larga de unidades de D-glucopiranosa, unidas por enlaces 1,4

glucosidicos y con cadenas laterales más cortas que parten de la posición

6: la densidad óptica del cultivo durante la fase estacionaria. El contenido en

glucógeno de las células llega hasta casi el 30 % del peso seco en una

diez horas y después disminuye con lentitud cuando se ha agotado el

sustrato carbonado, lo que corresponde a una degradación secundaria de la

glucosa acumulada en forma de polisacárido.

En las bacterias tratadas con lugol (yodo + IK), el glucógeno aparece en

forma de pequeños gránulos teñidos de pardo rojizo, aparentemente

localizados en los polos de la célula; sin embargo, las micrografías

electrónicas de cortes celulares (HOLME) revelan que esta localización

polar es un artefacto debido a que la región central de la célula, ocupada

por la zona nuclear, no contiene glucógeno, pero éste está distribuido

homogéneamente por el resto del citoplasma.

En las bacterias, el glucógeno se sintetiza mediante un sistema enzimático

análogo al descubierto por LELOIR y su grupo (1959) en los mamíferos.

Sin embargo, en las bacterias la forma activada en que la glucosa se

incorpora al glucógeno no es la uridina di fosfoglucosa (UDPG) (SEGEL y

col. 1964).


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Por regla general, al glucógeno no se sintetiza únicamente durante la fase

estacionaria del crecimiento, sino en todas las condiciones fisiológicas que

entrañan un desajuste energético, es decir, cuando la producción de

energía a partir del sustrato carbonato es mas rápida que su utilización en la

biosíntesis de proteínas (SEGEL y col. 1964). La acumulación de glucógeno

tiene el significado fisiológico de una reserva intracelular de carbono y

energía.

El glucógeno bacteriano presenta propiedad molecular (longitud media de

la cadena principal, índice de ramificación) muy similar a las de glucógeno

hepático (SEGEL, CATTANEO Y SIGAL, 1964). Su acumulación en las

células se refleja en las curvas de crecimiento de los cultivos carentes de

nitrógeno como un aumento lento y lineal.

3. POLI- -HIDROXIBUTIRATO

En otras bacterias, la función de reserva de carbonato y energía se realiza

por acumulación de compuesto macromolecular de naturaleza lipidica, el

poli- -hidroxibutirato (PHB).

CH3 CH3 CH3

CH CH CH

O CH2 O CH2 O CH2 O

C=0 C=0 C=0


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Esta sustancia, descubierta en 1927 por LEMOIGNE en Bacillus

megaterium, se ha encontrado después en otras especies del mismo

genero y en numerosas bacterias pertenecientes a los mas distintos

géneros (Aerobacter, Rhizobium., Vibrio, Chromobactrium,

Pseudomonas, Micrococcus Sphaerotillus, Spirillum,

Hydrogenomonas, etc) también se ha hallado en bacterias fototrofas

purpúreas, sulfúreas (Chromatium okenii) o no (Rhodospirillum rubrum,

Rhodopseudomonas spheroides).

El poli- -hidroxibutirato se reconoce por que se tiñe con los colorantes

específicos de las grasas, en particular con el negro Sudan, de ahí su

nombre de granulaciones sudanofilas. En microscopia de contrastes de

fase aparece como pequeñas granulaciones muy refringentes, que llenan a

la célula.

Al igual que el glucógeno, el PHB se acumula cuando el crecimiento esta

limitado por el nitrógeno o el fosfato, en presencia de exceso de sustrato

carbonado (glucosa, piruvato, acetato o hidroxibutirato) y puede representar

hasta un 50 por 100 del peso total de las células.

La síntesis de poli- -hidroxibutirato a partir del acetato ha sido elucidada por

STANIER y DOUDOROFF (1959) en R. Rubrum, en donde este proceso

constituye un mecanismo muy interesante de fosfoasimilación del carbono.

Se realiza, como se representa esquemáticamente en la figura, a partir de

la acetoacetil – COA ( -cetobutiril-COA), que a su vez, se reduce hasta

poli- -hidroxibutiril-COA mediante una Deshidrogenasa que actúa con

piridinnucleotico (PN), y por ultimo se polimeriza. En Hydrogenomonas, el

monómero activo se puede formar también a partir de Crotonato.


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Cuando se agota la fuente de carbono, se moviliza el PHB mediante un

sistema enzimático diferente y especifico, formado en primer lugar por una

depolimerasa (PHB-estarasa) que libera -hidroxibutirato, este se oxida,

pasando a acetoacetato mediante una deshidrogenasa que actúa con NAD;

luego se activa, formando acetil-COA, y, por ultimo, se metaboliza por la

vía clásica del ciclo tricarboxilico.

Además de su función como reserva de energía, de carbono y de poder

reductor, el PHB representa la acumulación de ácidos orgánicos.

MATERIAL NUCLEAR

1. Morfología:

Durante mucho tiempo se creo que las bacterias carecían de núcleo o que

poseían un “núcleo difuso” lo cual es explicable, ya que el citoplasma

bacteriano es muy rico en ARN (ribosoma), que interfiere como los

métodos histiquimicos usualmente empleados para la tinción del ADN

componente característico del material nuclear. Sin embargo, ADN

PIEKARSKI demostró por vez primera en 1937, mediante la tinción de

Feulgen (fucsina decolorada con ácido sulfúrico), que en las bacterias

existen corpúsculos nucleares individualizados.

Años más tarde, ROBINOW (1945) confirmo estas observaciones e ideo

una técnica que demuestra sin ligar a dudas la morfología del material

nuclear de las bacterias. Consiste este método en un tratamiento previo de

la células son CIH 0,1 Na – 60º durante a 4 a 5 minutos, a fin de hidrolizar e

iluminar por completo el ARN citoplasmático, sin alterar el ADN.


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En la célula así tratada, la tinción mediante la reacción de FEUGEN o el

colorante de Giemsa pone de manifiesto unos cuerpos cromáticos muy

ostensibles y de contornos bien definidos. Una variante de esta técnica

consiste en sustituir la hidrólisis clorhídrica por un tratamiento con

ribonucleasa.

Los cuerpos cromáticos contienen casi todo el ADN celular, el cual

constituye del 3 al 4 por 100 del peso seco total, ya que no se observan

cuando las bacterias se tratan previamente con desoxirribonucleasa

(DNAasa). Por lo general son múltiples (tres a cuatro por célula), pero su

numero y su volumen total varían según las condiciones del cultivo.

Algunos autores han descrito en las células bacterianas en división

cambios morfológicos en los cuerpos cromatinicos y los han interpretado

como análogos a figuras mitóticas. Esta interpretación, que fue objeto de

vivas controversias, no se admiten en la actualidad, si no que se considera

que el comportamiento morfológico de la cromatina en la célula bacteriana

en vías de división equivale a una simple escisión. Además, conviene

señalar que la división mitótica, que asegura el reparto equitativo del

material hereditario en el núcleo procariótico, que, como se sabe, es

haploide y no contiene mas que un solo cromosoma.

La microscopia electrónica ha proporcionado datos importantes sobre la

estructura del material nuclear de las bacterias. En las micrografías de

cortes ultrafinos, las regiones nucleares aparecen como zonas más claras

que el citoplasma, sin granulaciones ribosomaticas. Su contorno es irregular

y difuso y a diferencia del núcleo eucariótico, nunca están rodeados de

una membrana propia. En algunas micrografías pueden observarse el ADN

en forma de filamentos enmarañados o a veces, como estructuras

rectilíneas y tubulares.


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Que el ADN se encuentra localizado en estas regiones se puede

demostrar mediante autorradiografia de bacterias autótrofas para la timina

cultivadas en presencia de esta base o de timidina tritiadas, con el fin de

marcar de modo específico el ácido. Como se ha dicho anteriormente la

región nuclear esta adherida a los mesosomas y se desplaza junto con

estos cuando la célula se plasmoliza o se convierte en protoplasto.

2. ESTRUCTURA DEL ADN BACTERIANO

Caracteres generales

El ADN esta constituido por cadenas de monocleotidos unidos entre si por

las moléculas de ortofosfato, de forma que cada una de estas esterifica, por

un lado, la desoxirribosa de un nucleósido, en posición 5’. Las bases de los

ADN bacterianos son dos bases púricas: adenina y guanina, y dos

pirimidinas: timina y citosina.

WATSON y CRICK (1952), basándose en el análisis por difracción de rayos

X, han establecido que en las bacterias, como en los demás organismos, la

molécula de ADN tiene una configuración bihelicoidal, formada por dos

cadenas de polinucleotidos antiparalelas y enrolladas sobre un eje central.

Estos mismos autores han precisado, además que las dos cadenas están

unidas por puentes de hidrógeno que, por razones de ensamble

tridimensional, solo pueden establecerse entre adenina y timina y entre

guanina y citosina. La estructura tridimensional de la doble hélice se

conoce con exactitud. Su diámetro es de 20a ; la longitud de onda de las

espiras es de 34 A , y la distancia que separa las bases en la superficie de

la molécula es de 3,4 A.


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Como consecuencia de esta estructura, la información genética reside en el

orden lineal de bases a lo largo de la cadena de polinucleotidos y esta

escrita en forma de un mensaje de cuatro signos, que son las cuatro bases.

La masa total de ADN es del orden de 10-14 g y por célula de Escherichia

coli, o sea que, como cada célula posee por termino medio tres núcleos

habrá 0,3 10-14 g de ADN por núcleo y por cromosomas.

Conociendo las dimensiones de la doble hélice y la densidad del ADN

(1,7g/cc), se deduce que el cromosoma del colibacilo tiene una longitud de

unas 700 , esto es, setecientas veces mayor que la de la célula, lo que

indica que el ADN se encuentra en forma de ovillo muy compacto.

Es interesante calcular la cantidad de información genética que podría

contener teóricamente el cromosoma bacteriano. Las tres bases

consecutivas de un Codón, es decir, la unidad de información que

determina la posición de una aminoácido en una cadena polipeptidica,

ocupan un segmento de 10,2 A de la doble hélice de ADN y, por lo tanto,

la totalidad del cromosoma (700 =7.106 A) equivalente a unos 7.109

codones. Dado que el peso molecular medio de las proteínas (50 000)

corresponde a trescientos residuos de aminoácidos y que solo una de las

cadenas de ADN se expresa en el fenotipo. Se deduce que el cromosoma

del colibacilo puede en teoría albergar suficiente información genética para

la síntesis de unas dos mil proteínas diferentes.

Este potencial de información genética es muy superior al del los ácidos

nucleicos de los virus.


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ESPORA BACTERIANA

Estas estructuras están rodeadas por varias capas características bien

delimitadas y relativamente gruesas. La mas interna (corteza) es

transparente a los electrones y, al parecer, carece de estructuras, sin

embargo, en las esporas de Clostridium pectinovorum tratados con

nitrato de lantano, la corteza presenta un aspecto laminar como de bulbo de

cebolla, pero no se sabe si corresponde a una verdadera estructura o se

trata de un artefacto. Rodeando a la corteza se encuentra la envoltura, que

puede ser sencilla (Bacillus cereus) o estar formada por varias capas

concéntricas (Bacillus polymyxa. B. Megaterium); en tal caso, la capa

mas externa es la mas gruesa. La envoltura es relativamente opaca a los

electrones. Su superficie puede ser lisa (B. cereus. B subtilis), o formar

depresiones regulares a modo ser lisa (B. polymyxa). En algunas

especies, la envoltura esta rodeada por otra membrana muy fina, que se

denomina EXOSPORIUM.

Composición química

La envoltura de las esporas contiene, como la pared de las células

vegetativas, ácido teicoikco y el hexapeptido del ácido muramico; pero

además de estos compuestos, y aproximadamente en igual proporción,

existe una proteína sumamente rica en cistina. Dado que los grupos SH

libres desaparecen durante la germinación, se cree que los puentes

disulfuro de esta proteína desempeñan un papel importante en la formación

de la envoltura y en las propiedades de la espora.

El citoplasma contiene muchas enzimas metabólicas, entre las que destaca

la cadena completa de la glucólisis; pero a juzgar por el hecho de que las

esporas carecen de toda actividad respiratoria, estas enzimas permanecen

inactivas hasta la germinación.


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Por otra parte, se han descrito interesantes diferencias cuantitativas y

cualitativas entre la composición enzimático de la espora y de la célula

vegetativa, por ejemplo, en B. cereus las esporas contienen una

ribosidasa y una transferasa que no existen en la célula vegetativa, y en

cambio, carecen de succinico-oxidasa y de glutámico-transaminasa

(HALVORSON, 1962).

El componente característico y específico de las esporas es el ácido

dipicolinico (ácido piridin-2,6-dicarboxilico):

CH

HC CH

HOOC C C COOH

N

Este compuesto se produce únicamente durante la esporulación, y su

síntesis es inhibida por la fenilalanina, por la cisteina y el malonato de

estilo. Es probable que se origine a partir del ácido diaminopimelico

(PERRY y FOSTER, 1955), y que, por tanto, pertenezca a la misma cadena

biosintetica que lisina, la treonina y la metionina, pero todavía no se

conocen con exactitud los pasos intermedios de esta síntesis.


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El Ácido Dipicolirico (DPA) constituye aproximadamente el 10 % del peso

seco de la espora, y al parecer esta localizado en la corteza. Esta asociado

a cantidades sensiblemente equimoleculares de calcio, y existen muchos

datos indicativos de que el complejo Ca - DPA es uno de los factores

esenciales de la termorresistencia de las esporas (CHURCH y

HALVORSON, 1959). Por ejemplo, se ha demostrado que la formación de

DPA se produce una hora antes que la aparición de la termorresistenca,

siempre y cuando haya calcio en el medio de esporulación. El calcio puede

sustituirse por estroncio, pero las esporas que se forman en estas

condiciones son termo sensibles, a pesar de que su aspecto y su contenido

en DPA son normales. Si estas esporas defectivas se incuban en una

solución de calcio, este desplaza parcialmente al estroncio, produciéndose

un aumento paralelo de la resistencia al calor.

La termorresistencia de las esporas todavía no esta explicada, pero se

considera muy relacionada con dos propiedades complementaria de las

esporas: su impermeabilidad y el estado de deshidratación de sus

componentes citoplásmicos hay varios hechos experimentales que apoyan

esta incorporación. Se debe que las proteínas anhidras resisten mejor la

desnaturalización térmica que cuando están en solución y que, por ejemplo,

una ovo albúmina que contenga tan solo un 9 % de agua puede soportar

el calentamiento a 120º durante diez minutos sin desnaturalizarse más que

en un 50 % se ha comprobado que las esporas están mucho menos

hidratadas que las células vegetativas, y una parte de su masa,

probablemente la región citoplásmica central, es inaccesible al agua a este

respecto, otro hecho significativo es que la primera fase de la germinación

consiste en un hinchamiento de la espora seguido a la solubilización del

DPA, que es excretado al ,medio externo.


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Estas observaciones están de acuerdo con el hecho de que las esporas son

mucho más resistentes al calor seco que al calor húmedo de todo lo

expuesto se deduce que el complejo Ca – DPA constituye principal barrera

de protección contra la humedad. Sin embargo, es posible también que en

algunos organismos cuya envoltura esporal es muy rica en lípidos (B

megaterum) estos compuestos contribuyen a la impermeabilidad de la

espora.

Ciclo esporal

Formación de la espora. La esporulación de las bacterias constituye un

modelo muy interesante del proceso de diferenciación celular, y su estudio

esta experimentando en la actualidad un rápido avance ya que permite

abordar simultáneamente sus aspectos morfológicos, bioquímicos y

genéticos.

Se sabe desde hace tiempo que la esporulación se desencadena por un

agotamiento del sustrato nutritivo, pues no se inicia hasta después de haber

cesado el crecimiento. En los cultivos cuyo crecimiento esta limitado por

otro factor (fuente de nitrógeno), la presencia o la adición de glucosa inhibe

la formación de esporas; pero, como se vera mas adelante este efecto

inhibidor deja de producirse a partir del estadio IV, en que se forma la

corteza. Para que se produzca la esporulación han de concurrir además

otras condiciones: por ejemplo, en B. subtilis, la presencia de Mn-. El

oxigeno es necesario para la esporulación de las bacterias aerobias

(Bacillus), pero inhibe este proceso en las anaerobias (Clostridium).


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DIFERENCIAS ENTRE ENDOSPORAS Y CELULAS VEGETATIVAS

CARACTERÍSTICAS Célula vegetativa Endospora

Estructura Célula Gram positiva típica PCorteza de la espora gruesa

Cubierta de la espora

Exosporium

Apariencia microscópica No refringente Refringente

Contenido cálcico Bajo Alto

Ácido dipicolinico Ausente Presente

Actividad enzimática Alta Baja

Metabolismo (captación de O2) Alto Bajo o ausente

Síntesis de macromoléculas Presente Ausente

UNAM Presente Escaso o ausente

Resistencia al calor Baja Elevada

Resistencia a la radiación Baja Elevada

Resistencia a los compuestos químicos Medio Elevada

(Por ejemplo, H2O2) y a los ácidos

Capacidad para teñirse por colorantes Fácil tinción Tinción solo con métodos especiales

Efecto de la lisozima Sensible Resistente

Contenido en agua Elevado, 80-90 % Bajo, 10-25% en el núcleo

Pequeñas proteínas solubles en ácido Ausentes Presentes

(Productos de los genes ssp)

pH citoplasmático Aprox. pH 7 Aprox. pH 5.5 – 6.0 en el núcleo


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Microbiología I Biol.. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza 18

micro.. morfologia y estructura bacteriana (2º parte)

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