métodos espectroscópicos en bioquímica

Métodos espectroscópicos en bioquímica

• Sensibilidad

• Especificidad

• Complementariedad

• Velocidad

• Accesibilidad

• Precio

Representación esquemática de las características de las proteínas globulares que pueden seguirse durante el plegamiento. Aunque no hay una sola forma de seguir todos los detalles estructurales de un intermediario del plegamiento el uso de sondas múltiples y complementarias puede brindar una imagen detallada de la distribución de confromaciones que componen los transitorios del plegamiento

Current Opinion in Structural Biology 1996, 6:630-636.

Citocromo cEstructura de rayos X

LisozimaEstructura de RMN

Estructuras por RMN

Átomos de la cadena para los residuos 72-145 de las estructuras en disolución de apo-BsCopAb (a) y Cu(I)-BsCopA(73-151) (b) Representados como un tubo de radio variable proporcional al valor del desvío estándar de la posición de cada residuo. Se muestran también las cadenas laterales del Cys85, Cys88 y el ion Cu(I).

J. Mol. Biol. (2002) 317, 415-429

Citocromo cEstructura de rayos X

Cinética de plegamiento de citocromo c en presencia y ausencia de imidazol por dilución de desnaturalizante químico. Se mide la emisión total de fluorescencia a > 320 nm

Autoquenching

TIBS (2000) 25; 631-637

FRET

Espectro Raman de elastina bovina (en sólido) en la región de 500 a 1750 cm-1 y asignaciones propuestas.

Descomposición de las bandas amida I de elastinas bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (línea continua) y calculados (línea punteada). Asignaciones HW, agua de hidratación; , hélice ; , hebra ; U, conformaciones no identificadas (giros + ovillo).

J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 26099–26103

J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777

Resumen de resultados de estructura secundaria derivados de dicroísmo circular: Los porcentajes se obtuvieron por descomposición espectral en espectros básicos reportados. Otra indica estructuras desordenadas o no asignadas

Hélice hoja Giro Otra -T-8K (M2-M3) 85 — 15 — -T-10K (M1-M2-M3) 80 — 20 — -T-4K (M4) 87 — 13 — -T-5K (M4) 80 — 11 9

-T-4K -T-5K

Espectros FTIR en la región de 1700 a 1540 cm-1. A, Proteína hp8 (no fosforilada, línea continual), y PKAhp8 (fosforilada (línea punteada). B, porcentajes calculados de estructura secundaria en las muestras no fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas (barras negras)

J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751

Espectros de FTIR en el tiempo y análisis cinético. (a) Espectros de absorción a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7, 10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de mezclar (negro) con trifluoroetanol y espectro final (verde). (b) Segunda derivada de los espectros de a (líneas continuas y los resultados de un ajuste exponencial de tres estados (punteado). (c) Los tres espectros básicos resultantes del ajuste. (d) Curso temporal de los tres estados deducidos del ajuste.

PNAS (2001) 98; 6646–6649

Despliegue de guanilato kinasa inducido por cloruro de guanidinio medido por fluorescencia con excitación a 282 nm

J. BIOL. CHEM. (1997) 272; 19343–19350

Intercambio de protones de amida para hp8 luego de 5 minutos de incubación con D2O a 25 ºC.

J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751

290 nm

Espectros de RMN 19F del despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano al pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rápida a 22 ºC.

Intensidad de picos de resonancia asignados a W30 y W47 en la proteína desplegada. Hay una primera fase demasiado rápida para registrar con este método.

Constantes de velocidad y amplitudes para el despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano en urea 5 M.

Método A1 k1 (s-1) A2 k1 (s

-1) Fluorescencia 0.205 0.727 0.795 0.014

Dicroísmo circular 0.199 0.499 0.801 0.014

RMN: Trp 22 0.237 ND 0.763 0.010

RMN: Trp 30 + 47 0.225 ND 0.775 0.015

RMN: Trp 74 0.252 ND 0.748 0.020

RMN: Trp 133 0.438 ND 0.562 0.015

Espectro visible de citocromo aa3 de P. denitrificans oxidado (a) y reducido con ditionito (b). La línea c es el espectro diferencial de la forma reducida unida a CO menos la forma reducida

J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568

Espectros de resonancia raman de citocromo aa3 de P. Denitrificans reducido (a) mutante Y280H (b). Los espectros c y d corresponden al complejo con 12CO y 13CO respectivamente. El espectro diferencial 12CO 13CO aparecen en e.

J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568

(A)Cobalamina(II) en solución ;

(B)Complejo enzima + Cobalamina(II)

(C)Complejo enzima + Cobalamina (II) + 5´-desoxiadenosina

Biochem. J. (2001) 355, 131-137

Espectro de EPR del aducto MNP/Hb a partir de la reacción de Hb con peroxinitrito y comparación con los aductos MNP/péptido

(A) Hb + ONOO- + MNP

(C) Igual que A + 0.5 mg/mL de pronasa.

(E) Péptido GGYR (10 mM) + ONOO- + MNP.

Tiempos de correlación

Biochemistry (1999) 38; 2078-2087

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