Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas.

Gustavo Viniegra GonzálezUniversidad Autónoma Metropolitana,

Iztapalapa, D.F.MEXICO (vini@xanum.uam.mx)

Esquema metabólico global

Consumo total – DST= SO – S

Biomasa-DSX = DX/YC

Respiración-DSQ = DX/YQ

ATP Biosíntesis-DSin = DX/Yin

ATP Mantenimiento-DSin =mXDt

Productos -DSP= DX/YP

Balance metabólico

tmXYXST DDD

Balance: YX/S = gX/gS; YX/P = gX/gP; Yp/S = gP/gS

Consumo =

Biosíntesis + Producción + Mantenimiento

(Modelo de J. Pirt)

Si DSP = 0;

tmXYYY

XSSPPXSX

T D

DD

///

11

Ciclo de vida de un moho

Germinación

Crecimento vegetativo

Crecimiento aéreo

Esporulación

Diferenciación

Modelo macroscópico

• La tasa específica de crecimiento, r, está definida como

r = (1/rA)drA/dtSe supone que, r, se anula cuando rA, se

aproxima a, rAmax.Modelo de von Bertanlanffy

r = m{1 – (rA/rAmax)n}rA << rAmax r m; rA rAmax, r 0

Liberación de calor en la FMS de A. niger sobre bagazo de caña, con glucosa.

• Dos picos de calor: germinación y crecimiento.

• Crecen con la concentración del substrato.

Datos de Oriol et al.

Medición de CO2 y O2

Componentes:• Columnas de FMS.• Cromatógrafo de

gases.• Computador.Beauveria bassiana

sobre cutícula de grilo

Tesis de D. Rodríguez, UAM (2009)

Respiración, metabolismo y crecimiento de A. niger vs. aw

Harina de yuca y bagazo de caña, aw, aumenta por la adición de

glucosa en el bagazo.SuperiorRespiración y consumo de substrato

en la FMSInferiorm aumenta com aw ()Germinación () más breve com

mayor aw

Datos: E. Oriol et al.

FMS con suporte inerte

A. niger en bagazo de caña, con jarabe de glucosa.

El hongo creció con 400 g/L de glucosa!

Cultivo de Verticillium lecanii sobre cutícula de grillo

J.E. Barranco-Florido et al. / Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 910–915

0 40 80 120 1600

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

ATCC 46578

ATCC 26854

UDLA

t (h)

mg

CO

2/h

g M

SI

Respiración de Beauveria bassiana

Salvado de trigo o cutícula de grilo.

Dos fases respiratorias (Ikasari y Mitchell, 2000)

a) Crecimiento exponencial

b) Autólisis de parte de la biomasa 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0

-

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

Datos: D. Rodríguez, tesis doctoral en la UAMI, 2009

0 10 20 30 40 50 60

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mg

CO 2 /

g M

SI* h

STS Cepa 88 STS Cepa 885.2

Balance respiratório

Respiración-DSQ = DX/YQ

ATP biosíntesis-DSx = DX/YX

ATP mantenimiento-DSm =mXDt

Productos -DSP =YPDX + bXDt

b está ligada à mantenimiento

Si los flujos de O2 y S están equilibrados, → m/m << 1,

(DSP = 0) Y, const..

DS/DX = 1/Y+m/m 1/Y

Cociente respiratorio

• CR = DCO2/DO2

• Ejemplos: C6H12O6 + 6O2 6 CO2+ 6H2OCR = 6/6 = 1

C6H12O6 + 2O2 2C2H4O2+ 2CO2 + 2H2OCR = 2/2 1

Es una indicación del tipo de metabolismo.

Modelo respiratorio*

• Se, X < XC (crecimiento exponencial)

• Se, X XC ; t tC (autólisis parcial)Biomassa X = X(activa) + X(inactiva)

EttEC XeXXk

dtdC

C )()( m

tekXdtdCX

dtdX mm 0;

C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

Crecimiento y Respiración de Mucor bacilliformis

• Poliuretano.• Crecimiento

exponencial con Glucosa (100 g/L)

• Esporulación si el substrato se agota.

C. Lareo et al. / Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 391–399

Cultivo de Gibberella fujikuroii por FMS

Amberlita• Substrato: Almidón

(189 g/L)

• La giberelina es producida después de que disminuye la respiración.

C. Gelmi et al. : Process Biochemistry 35 (2000) 1227–1233

Septo

Spitzenkörper

N

O2 O2 O2O2

O2O2 O2 O2

S S S

S S S

C6H12O6

2NAD6NAD 6NADH2

2CH3CH2COOH2NADH2

6O2

6CO2

6H2O2

6H2O2 → 6H2O +3O2catalases e peroxidases

Las especies reactivas de oxígeno (ROS)

• “La diferenciación … es una respuesta al estrés oxidativo”*.

*Hansberg and Aguirre, 1990; Aguirre et al., 2005.

Las hifas vegetativas aireadas se pegan para formar hifas aéreas.

Secreción de polisacáridos (PS)

logX → ← PS

A/V = 5

← PSA/V = 1

El O2 induce la formación de las hifas aéreas

“Cuando se aumentan o decrecen las concentraciones de oxígeno, ... Se observan, respectivamente, cantidades aumentadas o disminuídas de hifas aéreas ...”

+H → Air húmedo, -H → Air seco, airO2→ 50% O2, airN2→ 50% N2

(Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: 235-257, 2008)

La catalasa 3 de N. crassa regula los ROS ligados a la diferenciación.La mutante negativa,

cat-3RIP, produce más hifas aéreas que Wt y más fotones asociados a la producción de ROS.

(Brit. Mycol. Soc. Symp. Series 27: 235-257 2008)

La red regulatoria de la respuesta a los ROS en levaduras es muy

compleja.Mcs1, Mcs2 e Mcs4

responden a H2O2.MAPK fosforila

proteínas regulatorias.

Cadena de respuestas génicas.

Tomado de: Aguirre et al., Trends in Microbiology. 13(3): 111 ,2005.

Modelo del impedimento estérico*

• Densidade máxima, rmax 50 mg (sólidos)/cm3.

• Contenido de sólidos r0 150 mg

/cm3.

• 2/3 de porosidad (aire)• Para el intercambio de

O2 y CO2.*Laukevics et al. B & B, 27: 1687 (1985). Dados de Nopharatana et al. B & B, 84: 71 (2003); Fotografía: D. Rodríquez, 2008

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.40.000.010.020.030.040.05

Perfil de la biomasa de Rhizopus oligosporus

Espesor (cm)m

g/cm

3

Relación entre densidades de superficie, rA, y de volumen, rV.

rV = g/cm3 ; rA = g/cm2, h = cm; rV = rA/hdensidad de volumen =

densidad de superficie/espesor

S0 S0

O2 hc 0.01 cm

rV 0.05 g/cm3

rA = rVh ≤ 0.01 g/cm2

h 0.2 cm hc

h

Agotamiento del O2 por R. oligosporus crecido en caja Petri

hC = 60 mm; espesor de la capa crítica para el O2

¿Como se calculará el espesor crítico (hC) de un micelio?

z = hC

C = C0(1-z/hC)2

z

Comentario sobre hC

• El valor de, hC = 0.01 cm = espesor de la capa aeróbica.

• Fué medido con electrodos sensibles a oxígeno.

• El valor h hC, es el espesor de las capas aeróbica y anaeróbica

Integración de los modelos

• El micelio crece exponencialmente con un balance redox (Difusión = Consumo).

• Al llegar a un nivel rV < 0.05 g/cm3, la difusión de O2 es más lenta que su demanda.

• La penetración del oxígeno es, hC < 0.01 cm.

• El micelio con h > hC, es anóxico y no produce más biomasa, pero consume y transporta sustrato.

Crecimiento en capa fina

La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax

O2 O2 O2 O2

La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d hC

S S S S S S

Capa aerobia Capa anaerobia

Agar con substrato

hC

d

Definición de s0 (g/cm2)

• S0 = concentración del sustrato dentro del soporte (g/cm3).

• A = área del soporte (cm2)• V = volumen del suporte (cm3)• s0 = S0V/A (g/cm2)

• s0 = Sustrato inicialmente disponible en toda la superficie de contacto con el micelio.

• a = A/V (área específica); s0 = S0/a

Cálculos de a

• Placa con espesor, H; a 1/HEjemplo: placa de agar H = 1 cm; a 1/cm

• Cilindro con diámetro, d; a 4/dEjemplo: fibra con d = 0.1 cm; a

40/cm

• Esfera con diámetro, d; a 6/dEjemplo: esferas con d = 0.02 cm; a

300/cm

Volúmenes específicos (A/V)Matraz de 250 mL con V = 50 mL de agua

A/V = 2/cm

Menisco de 0.06 cm de espesor

A/V = 333/cm

A. niger en PUF con glucosa

¿Por qué la pendente es fija para FMS ()? YX/S = 0.35 gX/gS

¿Por qué es variable para FSm ()?

0 < S0< 100g/L

0

10

20

30

40

0 20 40 60 80 100

So (g/L)

X max

(g/L

)

Datos de SJ Romero, 2001

Crecimiento de A. niger en caja Petri.

• rA h rV = rA/h rV no varía con s0

1/Y = 1/Y0 + s0/eY0 = 0.5; si s0<< e(capa aeróbica)e rVhmax rAmax

0 10 20 30 40 50 60 700

4

8

12

0

1

2

3

σ0 (mgcm-2)

ρA

(mgc

m-2

)

h (m

m)

0 10 20 30 40 50 60 7002468

so (mgcm2)Yx

/s-1

rA

Datos de E. Ortega, 2012

Crecimiento en capa fina

La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax

O2 O2 O2 O2

La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d hC

S S S S S S

Capa aerobia Capa anaerobia

Agar con substrato

hC

d

Modelo de Nopharatana et al. (1998, 2003)*

El micelio aerobio crece h < hC hasta que rV rVmax

La capa aerobia sigue creciendo y formando nuevo micelio.

La capa anaerobia transporta sustrato (translocación)

El modelo no explica los resultados experimentales con Rhyzopus oligosporus (vea el Problema 3).

*Biotechnol. Techniques,12(4): 313–318, 1998; B & B 84(1): 71-77, 2003

¿Qué controla las densidades de los hongos?

Diferentes e1 con distintas cepas de A. niger.

Diferentes e2 con la misma cepa de A. niger y diferente soporte.

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

f(x) = 0.0670088631721111 x + 1.9991457660392

f(x) = NaN x + NaN

so (g/cm2)

1/Yx

/s

0 1 10 100 1000012345678

f(x) = 0.0132625642474307 x + 2.45420464882244

f(x) = 1.31097342244176 x + 1.54015490402264

e1 (mg/cm2) 15, vs.75; e2 0.8, vs. 74

Efecto de cepa y soporte sobre e

Las mutantes con menor eficiencia, tendrán e menor.

Los soportes con menos espacio intersticial tendrán e menor.

e mide la máxima producción de biomasa sobre la superficie.

Cuando s0 < 1 mg/cm2 el rendimiento es máximo y similar para diferentes cultivos.

Consecuencias del modelo• Dos fases respiratórias exponenciales:

creciente y decreciente.• La 1ª → metabolitos primários; la 2ª →

metabolitos secundários, → esporulación.• Transición: acumulación de espécies

reactivas de oxígeno (ROS).• La variación de s0 controla el espesor y tipo

de metabolismo de la capa fúngica.

Aplicaciones:

• Control respiratorio en línea →control de la FMS.

• El O2 limita la densidad y espesor de la biomasa sobre superfícies sólidas.

• Pulsos de O2 esporulación.

Los pulsos de O2 aumentan la esporulación en superficie

Tratamiento

X=biomasa(mg cm-2)

Conidia(x107conidia cm-

2)

YC/X (x107conidia mg-1 X)

P (x105 conidia cm-2 h-1)

21% O2 4.78* (±0.25)

2.08 (±0.21)

0.43 (±0.05)

1.33 (±0.13)

26% O2 3.78 (±0.18)

4.25* (±0.13)

1.12* (±0.03)

2.72* (±0.08)

Metarhizium anisopliae var. lepidiotumTecuitl-Beristain et al. Mycopathologia (2010) 169:387–394

Problema 1

¿Cuántas bandejas por lote quincenal se requieren para producir esporas de M. anisopliae, aplicadas en 5,000 Ha?¿Cuántas Ha cubrirá esa fábrica en 300 días?

Datos: 1.36 kg (MS) de salvado de trigo por bandeja con partículas cúbicas de 0.05 cm de arista y 60% de humedad. C = 3x107 esporas por cm2. Cada Ha requiere 1012 esporas

Problema 2

Columnas con gránulos esféricos de almidón (d = 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 cm) y sales minerales. El almidón retiene una vez su volumen de agua y se degrada en un 80%.

Un cultivo de A. niger, produce rendimientos Y = 0.69, 0.32, 0.24, 0.16 (gX/gS).

Calcule, el área total de 1 kg (húmedo) de gránulos con d = 0.15 cm y densidad del sustrato 1.2g/cm3

Calcule e y estime la biomasa producida con ese d.

Problema 3

Compare los artículos de Oostra et al. (2001) y Rahardjo et al. (2002) sobre hC.

Diga por qué los perfiles de oxígeno en el micelio explican las diferencias entre el modelo de Nopharatana et al. (1998) y sus resultados de 2003.

¿Cómo se imagina la capa de Rhyzopus oligosporus?

Problema 4

Explique por qué los cultivos aireados de A. niger sobre partículas de agriolita, pueden metabolizar jarabes hipertónicos de glucosa (300 g/L).

Suponga que las partículas tienen A/V = 50/cm y que Y0 = 0.5, e = 0.001 g/cm2. Calcule Y.

Discuta qué tipo de metabolismo estará ocurriendo. ¿Cómo será el cociente respiratorio? Revise el Balance Metabólico