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Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín

Año 2o19Sección Bioquímica

Módulo III:Vías de la información genéticaCódigo GenéticoTraducción

ADN ARN PROTEINAS

Transcripción Traducción

Replicación

retrotranscripción

Generalidades de la traducción:

• Proceso MUY conservado • Intervienen mas de 100 proteínas y ARNs• Muy elevado costo energético

En bacterias en crecimiento rápido, la traducción involucra:

• Hasta el 80% de la energía• 50% del peso seco de la célula

Antecedentes

El código genético

Relaciona el “lenguaje” de los ácidos nucleicos con el de las

proteínas

El Código Genético

Sobre el código genético• Se lee por tripletes (marcos de lectura)• No es solapante, codones contiguos• Es universal*

• Es redundante / degenerado• Existen excepciones!• Fue descifrado por experiencias de traducción

in vitro con ARN sintéticos

Preguntas:

1) Escribir los codones STOP2) Escribir el codón de INICIO3) Escribir los codones de Prolina4) Escribir los codones de Arginina5) Escribir la secuencia codificante del péptido: Met-Phe-Ala

Código genético

Descifrado por experiencias de «traducción in vitro» con ARN sintéticos

Extracto celular de E coli + ARN sintético + amino ácidos marcados.

Se determina el péptido sintetizado

Preguntas:

1)¿Cómo haría para producir ARN sintético?UUUUUUUUUUUUUUU

2) Cuales serían los péptidos sintetizados in vitro empleando los siguientes ARNs : a)poli U (UUUUUUUU)b)UACUACUACUACUACUACUACc)AUAGAUAGUAGAUAGAU

Elucidación del Código

Sobre el código genético

• Se lee por tripletes• No es solapante• Es universal • Es redundante / degenerado• 64 codones: identifican los 20

aminoácidos, marcan inicio y terminación.

Para casi todo hay excepciones!

Seleno-cisteína: (amino ácido 21) incorporada en la traducción, en el codón UGAen bacterias

Una excepción al código genético no solapante:

(Sanger, 1976)El ADN del bacteriófago ØX174 codifica genes superpuestos(ADN: 5386 nucleótidos)

Voet&Voet

Existen algunas excepciones a la “universalidad” del código genético,

codón usual alternativo

en mitocondrias y protozoarios

Unión al aminoácido

Bucle TΨUBucle D

Bucleanticodón

3’ 5’

¿Cuántos ARNts se necesitan para traducir los 61 codones?

Hipótesis del Balanceo (Crick):1- Las primeras bases del codón forman enlaces W-C.Es la parte más importante para la especificidad del Código.

2- La 1ª base de algunos anticodones determina el Nº de codones leídos por un ARNt determinado.(ver tabla)

3- Si un aác. es especificado por varios codones diferentes los codones que difieren en cualquiera de las dos primeras bases requieren ARNts diferentes.

4- La traducción de los 61 codones requiere un mínimo de 32 ARNts diferentes.

Hipótesis del Balanceo: flexibilidad en la interacción codón-anticodón

5’ del anticodón 3’ del codónG une C / UC GA UU A / GI (inosina) A / U / C

 

 

Inosina, en el anticodón

G - C

G - U

Preguntas:

¿Cuál es el número mínimo de tRNAs necesarios para la incorporación de ácido aspártico en las proteínas?

¿Cuántos tRNAs son necesarios para codificar Prolina?

¿Y para la Leucina?

En la traducción intervienen:

El molde: el ARNmPrecursores : los 20 aminoácidosLos “adaptadores”: los ARNt

Catalizador: los ribosomasFuente de energía

ARNt aminoacilados

Las aa-tRNAs sintetasas

Etapas de la Traducción

Science, junio 2016

en bacterias : ARNm poli-cistrónicos

ADN

Transcripto : ARNm

1) los ARNm

En eucariotas, los ARNm son monocistrónicos

ORF: fase abierta de lectura(Open Reading Frame)

GUAUGGACCAUACGAACGACUCAUUUGACGUAGCGACA

GU AUG GAC CAU ACG AAC GAC UCA UUU GAC GUA GCG ACA

Secuencia “Shine-Dalgarno” en el extremo 5’ del ARNm complementaria al ARNr 16S 5’ UTR: unión al ribosoma

Secuencia “Shine-Dalgarno” en el extremo 5’ del ARNm complementaria al ARNr 16S5’ UTR: unión al ribosoma

ARNr 16S

ARNr 16S

ARNr 16SARNmProteína L10

Lac z

Cro

5’UTR en E.coli (ejemplos)

Estructura terciaria de un ARNt por difracción de rayos X

2) los tARNs

I, inosine m1I, 1-metylinosinem1A, 1-methyladenosine t6A, N6-threonylcarbamoyladenosine i6A, N6-isopentenyladenosine Ar(p), 2´-O-ribosyladenosine (phosphate) Am, 2´-O-methyladenosine m5C, 5-methylcytidine ac4C, N4-acetylcytidinem3C, 3-methylcytidine Cm, 2´-O-methylcytidine m1G, 1-methylguanosine m2G, N2-methylguanosine 22m G, N2,N2-dimethylguanosine Gm, 2´-O-methylguanosine m7G, 7-methylguanosine yW, wybutosine Ψ, pseudouridine D, dihydrouridine m5U, 5-methyluridine Um, 2'-O-methyluridine mcm5U, 5-methoxycarbonylmethyluridinemcm5s2U, 5-methoxycarbonylmethyl-2 thiouridine ncm5U, 5 carbamoylmethyluridine ncm5Um, 5-carbamoylmethyl-2'-O-methyluridine.

Nucleósidos modificadas en los tRNA de S. cerevisiae

Modificado de : Transfer RNA modifications and modifying enzymes in Saccharomyces cerevisiae Johansson and Byström

Topics in Current Genetics, 2005, Vol. 12, 87-118

Estructuras de nucleósidos modificados de los tRNAS de S. cerevisiae

Ejemplos de bases nucleotídicas modificadas encontradas en los tRNAs

Aminoacilación de ARNts por las aa-ARNt sintetasas

Reacción en dos etapas

Reacción en dos etapas

Tasa de error: 1 / 10000Las aa-tRNAs sintetasas hacen “corrección de prueba”:1º sitio activo(aminoacilación)2º sitio activoCorrector de Aminoacilaciones incorrectas Ej.: Ile-ARNtIle

Interacción e/ aac-ARNt-sintetasa ARNt:“2º Código Genético”

Elementos de reconocimiento en los ARNt

3) Los ribosomas

Componentes del ribosoma 70S procariota

Posible estructura secundaria del ARN 16 S

Interacciones del ARNt con el ribosoma determinadas por entrecruzamiento (“cross-linking”).

Etapas de la Traducción

Iniciación de la síntesis de proteínas en procariotas.

IF : Factores de IniciaciónIF1, IF2, IF3

(Iniciación)

(Iniciación)

Resumen de la Iniciación :

- sub-unidad 30S + ARNm + fMet-tRNA

-Requiere los Factores de Iniciación: IF1, IF2, IF3

- Requiere GTP-IF2- unión del tRNA-fMet en el sitio P, codón AUG

- unión sub-unidad 50S

Tres sitios en el ribosoma:

P, péptidoA, aminoácido

E, salida

Elongación• Requiere los factores de elongación:

EF-Tu, EF-Ts, • Requiere GTP• Reciclado del factor EF-Tu

• Formación de sucesivos enlaces peptídicos• Requiere los factores de elongación:

– EF-Tu, (y EF-Ts):

ubicación de cada aa-tRNA en sitio A– EF-G (translocación)

• EF-Tu y EF-G: requieren unión e hidrólisis de GTP• Reciclado del factor EF-Tu: por EF-Ts

• Un enlace peptídico requiere: 2 GTP + 1 ATP

Formación del enlace peptídicoSitio P Sitio A Sitio ASitio P

• El aa entrante se ubica en el sitio A, (codón-anticodón)

• Formación del enlace peptídico: reacción peptidil transferasa, catalizada por el ARN (el 23S de la subunidad mayor)

• Translocación

Formación del enlace peptídico (2)

►

Formación del enlace peptídico

Translocación

► ►

Regeneración del factor EF-Tu-GTP por intercambio EFTu - EFTs .

Terminación de la traducción en procariotas.

IF1, IF3 1 / 7 - Disociación del 70SIF3 1 / 7 + Unión tRNA iniciador

EF-Tu 10 + unión tRNA al sitio AEF-Ts 1 + unión GTP al EF-TuEF-G 1 + facilita la traslocación

RF1 1 / 20 - disociación (UAA, UAG)RF2 1/20 - disociación (UAA, UGA)RF3 ? + GTPasa, promueve disociación

Factor No/rib. une GTP función

Factores auxiliares en la traducción de procariotas

Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas.

eritromicinaestreptomicina

CloramfenicolBloquea peptidil transferasa

Tetraciclina ( sitio A)

Puromicina( sitio A)

Traducción en eucariotasMuchas Semejanzas, algunas diferencias con los

procariotas• Transcripción y traducción NO están acoplados• Los ARNm• “Maquinaria” traduccional

– Ribosomas– Factores traduccionales

• Iniciación: reclutamiento diferencial

Inicio de la traducción

Secuencias “Kozak” (R una purina, A/G)Shine-Dalgarno

(GCC)RCCATGG

3 factores de iniciación(IF1, IF2, IF3)

> 13 factores de iniciación(eIF1, eIF2, eIF3, etc)

procariotas eucariotas

Inicio de la traducción en eucariotas

43S : Complejo ternario (eIF2-GTP-Met-tRNAi) + 40S

48S : 43S + eIF3, 4A, 4B, 4G, 4E, PABP + unión al ARNm

cap binding 4EDEAD helicasa 4AeIF 4G

Complejo eI4F

PABP – eIF4GCircularización del ARNm :

Complejo de iniciación 48S

• eIF2-GTP• eIF3 (800 kDa): multímero• eIF4A, 46 kDa, RNA helicasa• eiF4B, RNA binding protein• eIF4H, estimula la actividad

RNA helicasa de 4A• eIF4E (25 kDa): unión a 5’CAP• eIF4G, esencial en el

ensamblaje del complejo 48S

• PABP, 70 kDa, unión al poliA

Esquema del complejo de iniciación de C elegans

•48S: rastreo hasta encontrar el 1er AUG. • Rastreo requiere hidrólisis de ATP por eIF4A (helicasa)•eIF5 y 5B estimulan hidrólisis del GTP- eIF2, llevando a la unión de la subunidad 60S•Factores de elongación participan antes de la formación el 1er enlace peptídico

Inicio de la traducción

(Kozak)

eIF2-GDP se recicla a eIF2-GTP.Participa eIF2B : factor intercambiador de nucleótidos de G

ORFs solapantes

Más de 100 modificaciones postraduccionales

Incorporación covalente de coenzimas (biotina, ácido lipoico, fosfato de piridoxal,..)

Procesamiento : Eliminación de aminoácidos o péptidosGlucosilación. Glicosilación

Sobre Ser-Thr. O- glucosilación. Facilitan interacciones con otras moléculas (por ej. proteoglucanos como receptores de baja afinidad,..) y el plegamiento.

Fosforilación (reversible). Mecanismo rápido de activación/desactivación. Quinasas / Fosfatasas

Metilación (reversible). (por ej. metilación de histonas).Acetilación (reversible).Unión de ácidos grasos. Descrito para src / ras: palmitoilación sobre Cys

ayudan al posicionamiento en la membrana plasmática.

Algunos ejemplos:

Modificaciones postraduccionales

Glicosilación

Translocación al RE

Degradación de proteínas

General: degradación lisosomalEspecífica:

Unión covalente de Ubiquitina (proteína de 10 kDa). Poli-Ubiquitinación, y degradación en el proteasomaE3 ligasas: confieren la especificidad

Otras tipo Ubiquitina: ej SUMO (sumoilación de proteínas)

El proteasoma

Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada

ADN ARN PROTEINAS

Transcripción Traducción

Replicación

retrotranscripción

Ciclo de un retrovirus

Genoma: ARNContiene una transcriptasa reversa El ADNc se inserta en el genoma de la célula huésped.

Ciclo de un retrovirus

- Genoma: ARN- Contiene una transcriptasa reversa - El ADNc se inserta en el genoma de la célula huésped.

Transcriptasa reversa (TR)

• Entra a la célula huésped junto con el genoma viral.

• Enzima multifuncional• Es un dímero (51 y 66 kDa)• Sintetiza ADN a partir de molde de ARN• Sin actividad exonucleasa : sin capacidad de

corrección de pruebas• Alta tasa de error : mutagénesis espontánea

elevada.

3'-Azido-2'3'-Dideoxitimidina (AZT)

• AZT : 1era droga autorizada para el tratamiento de las infecciones con HIV.

• Este nucleósido actúa como inhibidor de la transcriptasa reversa del virus..

Otros inhibidores de la TR

En el laboratorio; la TR es utilizada para clonado de secuencias codificantes

• ARNm purificados• Síntesis del ADNc (complementario) con la

Trancriptasa Reversa• Síntesis de la 2da hebra de ADN • Inserción en un plásmido

Una mutación intergénica

supresora puede superar el efecto de

una mutación “sin sentido”

Terminación de la traducción en procariotas.