material de apoyo para el módulo de cinÉtica...

Material de apoyo para el módulo de CINÉTICA RÁPIDA.

Rogelio Rodríguez Sotres

2015-04-21

Curso: Cinética Enzimática AvanzadaModalidad: IntensivaCoordinador: Dr. Ismaél Bustos JaimesPrograma de Maestría y Doctorado en Ciencias BioquímicasUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOProfesor del módulo: Rogelio Rodríguez SotresSemestre: 2015-2 (Febrero-mayo, 2015).

0.1 Abreviaturas

SS , Estado estacionario.v, rapidez de reacción.ode, ecuación diferencia ordinaria.

vi, rapidez instantánea.v0, rapidez inicial.t1/2, vida media.

1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estadoestacionario y las condiciones de estado preesatacionario.

Los procesos biológicos ocurren a diferentes escalas de tiempo. Comúnmente consideramos quenumerosas reacciones químicas ocurren exclusivamente en los seres vivos, porque su ocurrencia esmuy lenta en ausencia de catalizadores - a veces - casi imperceptible.

Por el contrario, la ocurrencia de mucha reacciones enzimáticas es demasiado rápida in vivo.Así, con el propósito de estudiarlas y conocer el efecto de diversas condiciones sobre la rapidez de lareacción (reactantes, productos, cofactores, catalizador, pH, temperatura, etc.), las condiciones invitro se manipulan para hacerlas más lentas y seguirlas con instrumentos convencionales, tales comoun cronómetro y un colorímetro. Además, para que la medición sea posible, el régimen de flujode la reacción catalizada se limita al rango en que la cantidad del reactante consumido o productoacumulado cae dentro del rango de sensibilidad del método de medición. El régimen de flujo máscomúnmente empleado y que cumple con estas condiciones se denomina estado estacionario (SS ).

Sin embargo, Mediante el uso de instrumentos especializados, se pueden auscultar eventos queocurren en fracciones de segundo, antes de que se establezca elSS. Estos eventos pueden brindar información muy valiosa acerca de la catálisis.

1

1.1 Ejemplo 1.Para ejemplificar lo anterior, consideremos un caso simple:, la desintegración radiactiva de unmaterial.

Suponga un material radiactivo cuya emisión se detecta con un contador Geiger. Para conocerla cantidad de radiaciones emitidas por unidad de tiempo, el contador nos permite medir las cuentaspor minuto o CPM y, mediante la calibración de la eficiencia del contador, es posible calcular lasdesintegraciones por minuto (DPM). Dicha medición es una medida en condiciones deSS.

Lo anterior nos dice si el material es peligroso o no, pues mide la dosis de radiación que recibiríaun sujeto expuesto al material, pero dice poco de la naturaleza de dicho material.

Si ahora registramos la variación en la emisión respecto del tiempo, es decir, hago esa mismadeterminación varias veces en los siguientes 150 días, tengo el resultado que se ilustra en la figura1.

La teoría de la desintegración radiactiva nos dice que los átomos radiactivos son inestables,pero se descomponen de modo aleatorio. En un número muy grande de átomos radiactivos laprobabilidad de observar una desintegración es proporcional a la cantidad de material radiactivo.es decir:

dpm = kC (Ecn. 1)En donde C es la cantidad de átomos radiactivos y k una constante de proporcionalidad. Cada

desintegración significa que perdimos un átomo radiactivo, es decir, en un intervalo de tiemposuficientemente pequeño (dt) el material radiactivo perdido (−dC) se reduce de manera proporcionala su concentración:

−dCdt = kC (Ecn. 2)La ecuación 2 es lo que se conoce como una ecuación diferencial ordinaria (ode ), porque

contiene la variables y sus diferenciales. Resolver una ecuación diferencial requiere expresar lavariable dependiente (C) como una función de la variable independiente (t) que cumpla con lo queexpresa la ode. En este ejemplo, la variable t, sólo aparece como diferencial y se puede separar dela Variable C que aparece en ambas formas. Entonces las diferenciales se pueden eliminar mediantela operación inversa, es decir la integración.

−∫ CC0

dCC = k

∫ tt=0

dt,que resulta en:

lnC = C0 − kt (Ecn. 3)podemos ajustar la curva de la figura 1 a la ecuación 3 y deducir que la vida media del material

(t1/2 = ln 2k = 17.17± 0.23 días). Las vidas medias son invariantes características de cada material.

De aquí, podemos deducir qué, para este ejemplo, el radionúclido era 32P y dar la cantidad deátomos de 32P presentes al día cero (quizá antes de recibir acceso al material).

1.2 Recapitulemos:1. La medición de la cantidad de radiactividad es una medida de rapidez instantánea (vi) de

descomposición, el tiempo que toma la medida es un instante, si se compara con la vida mediadel material (días).

2. La vi sólo depende del isótopo que se tiene y de su cantidad en la muestra.

3. La vi varía de modo definido en función del tiempo y se puede modelar con una ecuacióndiferencial, que define a la vida media, la cual es una firma del elemento.

2

Figura 1. Cuentas radiactivas por minuto emitidas por un material en función del tiempo tran-scurrido (días). La línea muestra el ajuste a una curva de decaimiento exponencial con un valorinicial de 25017±53DPM y una constante de decaimiento 0.0403481±0.0003735dias

−1. Además,

la estabilidad del isótopo es inversamente proporcional a la t1/2 y a la energía de las partículasemitidas.

3

De modo análogo, si estudiamos la rapidez de una reacción química en SS , la concentración delos diversos intermediarios de la enzima ya es constante. Podemos saber quizá que intermediarioes al más abundante y como es que el balance de las especies en el SS responde a cambios en latemperatura, concentración de reactante, etc. Pero las vidas medias de los intermediarios serándesconocidas y no sabremos nada de su estabilidad relativa.

Por el contrario, si podemos saber la vida media de un intermediario, podremos inferir sobre suestabilidad, su energía y podemos hacer propuestas acerca de su naturaleza.

A nivel macroscópico, los principios que gobiernan el comportamiento de los sistemas en equilib-rio no son distintos de los que gobiernan las situaciones en SS o en pre-SS . Sin embargo, estudiarun sistema en equilibrio es más sencillo que estudiar un SS , y estudiar el pre-SS se complica aúnmas.

La diferencia entre estudiar un sistema en SS y estudiarlo en otros regímenes de flujo está enla manera en los métodos de medida y la elección de las condiciones experimentales. Tal eleccióndetermina también los instrumentos a usar y la manera en que analizaremos nuestros datos.

2 Conceptos básicos: Equilibrio, estado estacionario, cicloslímite y estados transitorios.

Todo proceso natural obedece a las leyes de la termodinámica. Al aplicarlas al caso especial de lastransformaciones químicas se pueden derivar ciertos principios básicos que son centrales en cinéticaquímica.

1. La energía se conserva. Por lo tanto, los valores de energía de las partes, mídanse como semidan, suman siempre la energía del todo. Multiplicar energías equivaldría a crear energía ydividir dos energías equivale a desaparecer energía.

2. En las transformaciones químicas, la masa también se conserva. Es decir, la suma de la masade todas las especies presentes en el sistema no cambia con el tiempo.

3. Una consecuencia de la segunda ley de la termodinámica es que todos los sistemas tiendenal equilibrio. Tal tendencia, sin embargo, no nos dice cual es el camino que los sistemassiguen para llegar a dicho equilibrio. En la mayoría de las transformaciones químicas, el pro-ceso de aproximación al equilibrio ocurre transitando por un cierto número de intermediariosdefinidos. Cada intermediario aparece como resultado de la transformación del intermediarioanterior. Por ende, el sistema sigue una trayectoria con secuencia definida, aunque puedeestar ramificada.

4. En el equilibrio, los sistemas obedecen a un principio termodinámico postulado por Le Chate-lier, (Henri-Louis Le Chatelier; 1850 - 1936) que al ser aplicado a sistemas químicos da lugara la llamada ley de acción de masas y se resume así:

“un proceso químico ocurre con un rapidez proporcional a la concentración de lasespecies que participan en dicha transformación.”

5. Este principio se aplica a un sistema en equilibrio. Sólo puede aplicarse a las transformacionesparciales dentro de la trayectoria hacia el equilibrio, si conocemos cuales especies individualesparticipan en cada transformación parcial y el orden en que aparecen. A esta última secuenciase le conoce como el mecanismo cinético de la reacción.

4

Según lo anterior se pueden modelar un mecanismo cinético si plantemos una propuesta correctapara los intermediarios. Nuestro modelo debe coincidir ocn los datos experimentales de la aparicióny/o desaparición de uno o más intermediarios. La concordancia es evidencia indicativa, pero no esgarantía) de que el mecanismo sea correcto.

En un modelo cinético la concentración de cada intermediario se describe mediante una funcióndel tiempo. Dicha función depende de los intermediarios previos y de los que se generan después.Consideremos pues un sistema genérico:

R→ n1I1 → n2I2...→ mP

La concentración de cada especies puede describirse como una función del tiempo:CR = f0(t);CIi = fi(t)...;CP = fp(t)

Es decir, para n intermediarios habrán n funciones del tiempo. Además, la masa se conserva,por lo que la enésima función puede obtenerse por diferencia entre la masa total y un conjunto den− 1 funciones cualesquiera.

CP = m(MTOTAL − CR +1

n1CI1 −

1

n2CI2 ...+

1

nm−1CIm−1)

En su tránsito hacia el equilibrio pueden el régimen de flujo de un sistema cambia y su modeladose facilita o se complica. A saber, los regímenes de flujo pueden ser:

1. Caóticos: Son aquellos en que la función que describe la concentración presenta cambiosque no siguen ningún patrón regular apreciable. Usualmente los sistemas químicos bajocondiciones controladas no siguen este tipo de regímenes, pero los sistemas complejos demúltiples reacciones pueden mostrar comportamientos que son cuasicaóticos.

2. Ciclo límite o cuasiperiódicos: Son aquellos en que el sistema presenta oscilaciones regularesy los intermediarios aumentan y disminuyen su concentración entre valores definidos, conintervalos de tiempo (periodos) definidos. Generalmente, tardan fracciones de segundo enestablecerse y se agotan después de un tiempo. Mientras duran, es posible observar que laaparición de las especies finales (productos) ocurre con una rapidez constante (véase figura2).

3. Decaimiento o crecimiento exponencial, o cuasiexponencial: Ocurren cuando el aumento o ladisminución en la concentración de una especie es proporcional a la concentración de dichaespecie, o de alguna otra especie relacionada.

4. Estado estacionario (SS ): Son aquellos en los que las especies intermediarias se mantienencasi constantes en función del tiempo. Su duración es corta, ya que persisten mientras la con-centración de las especies iniciales no cambia de manera importante y los flujos se mantienenrazonablemente constantes (ver figuras 3 y 4).

La cinética de pre-SS considera los procesos que ocurren antes del establecimiento de un SS .En el caso de las reacciones enzimáticas, los procesos suelen seguir regímenes del tipo (3), aunquese han reportado algunos casos en los que se observan comportamientos del tipo (2).

El modelado de los regímenes de tipo (3) es posible empleando métodos analíticos o métodosnuméricos. Los métodos analíticos se pueden emplear si el sistema de ode puede resolverse, lo quesolo es posible para unos pocos casos. Una vez establecido un modelo válido, este puede usarse para

5

Figura 2. Un ejemplo de un ciclo límite es el flujo glucolítico en la levadura S. cereviciae in-cubada con concentraciones muy elevadas de glucosa y en presencia de cianuro, mismo que puedemonitorearse mediante la absorbencia de NADH en las células completas (Danø et al., 1999).

calcular el valor de los parámetros ajustables que mejor describen el comportamiento observado.Para tal propópisto se recurre a los métodos estadísticos de regresión no lineal (NRL ). Cuando elsistema de ode no puede resolverse analíticamente, es posible combinar los métodos numéricos deintegración de las ode con los métodos de NRL para estimar los parámetros del sistema.

Dado que el modelo se refiere a las diferentes especies del sistema, dichos parámetros indicanpropiedades de los intermediarios como estabilidad, cambios en la energía libre asociados a suaparición, etc. Todos estos datos pueden proporcionar gran información acerca de los actoresparticipantes, particularmente, acerca de la enzima en estudio.

3 Ejemplos que ilustran el poder de esta estrategia.

3.1 Ejemplo 1: Un sistema en equilibrio no equivale a reposo absoluto.Supongamos una proteína P se une a una substancia L y forma PL

k1

Pk2

PL

L+

Esquema 1.

Entonces, suponiendo que la reacción ocurre con un mecanismo simple, la rapidez con que P setransforma en PL será:

−dPdt = k1[P ]EQ[L]EQy, de igual manera, al alacanzar el equilibrio, PL se estará convirtiendo de regreso en P según:−dPL

dt = k2[PL]EQ.El equilibrio implica que la rapidez de formación de PL iguala a la rapidez de disociación:−dPdt = −dPL

dt y,por lo tanto:k1[P ]EQ[L]EQ = k2[PL]EQ

Así, si las concentraciones no son cero, tenemos:[PL]EQ

[P ]EQ[L]EQ= k1

k2= KF (Ecn. 4)

6

Inicio: el agua fluye rápidamente hacia el segundo tanque, pero sale lentamente por el orifício.

Más tarde, P1 se reduce y P2 aumenta, la fuga en el orificio iguala al flujo entre tanques.

Ejemplo físico: Imaginemos una orificio en la base del tanque pequeño del sistema anterior.

Energía potencial

acumulada P

Liberación de energía

Situación de equilibrio

P=0

A) Equilibrio

Ejemplo químico: Unión del oxígeno a la Mioglobina.

Ejemplo físico: Dos tanques conectados por un tubo

El volumen de agua es diferente, pero las presiones son iguales.

En el equilibrio el potencial químico se iguala (es decir G=0).

K equilibrio=[MbO2]eq

[Mb]eq⋅[O2]eq

P

1

P

1

P

2 P

2Estado estacionario

(SS)

Nivel de agua aparentemente

constante

Nivel de agua constante

Ejemplo químico: Catálisis enzimática.

B) Estado estacionario.

KM=[ E ]ss[ S ]ss[ E.S ]ss

La velocidad con la que E.S es formado, por la reacción entre E y S, iguala a la velocidad con la que E..S se disocia o cataliza la conversión de S a P.

La constante KM

no es una constante de equilibrio, se denomina constante de Michaelis

EL equilibrio puede describirse numéricamente mediante una constante de equilibrio.

O2 MbO2Mb +

E + S E·S E + productosKM kCAT

Figura 3. Comparación entre sistemas físicos y químicos en equilibrio (A), o en SS (B).

7

E + S E·S

E+productos

KM

kCAT

Figura 4. Comportamiento clásico de un sistema enzimático simple en su aproximación al régimende SS que conocemos como rapidez inicial ( v0).

El equilibrio es un proceso terminal que alcanza un sistema si su energía libre ha sido agotada. Elsistema permanece inmutable de modo indefinida y la concentración de las especies ya no cambiará.

Pero,

¿Es el equilibrio un estado en el que las moléculas se encuentran en reposo?

¡Claro que no!

veamos:

3.1.1 Ejercicio resuelto 1. Tasa de conversión en el equilibrio.

Consideremos el sistema anterior (Esquema 1) iniciando con una concentración de 1 × 10−9M deproteína total y 1× 10−5M total del ligando, siendo:

k1 = 100M−1s−1 y k2 = 0.1 s−1,en estas condiciones:KF = k1

k2= 100M−1 s−1

0.1 s−1 = 1× 103M−1

y, cuando se alcanza el equilibrio podemos hacer las siguientes consideraciones:Sea xEQ la concentración del complejo proteína-ligando en equilibrio ( [PL]EQ). Entonces, la

estequiometría de reacción indica que:[P ]EQ = (1× 10−9M − xeq) y[L]EQ = (1× 10−5M − xeq)

y substituyendo en la Ecn. 4 tendremos:KF =

xeq

(1×10−9M−xeq)(1×10−5M−xeq) = 1000M−1 ,es decir:

1000M−1x2eq − (1 + 1× 10−2 + 1× 10−6)xeq + 1× 10−11M = 0,

de donde:

8

xEQ =(1+1×10−2+1×10−6)±

√(1+1×10−2+1×10−6)2−4×10−8

2000 M = 9.9× 10−12M ,por lo que:

[P ]EQ = (1× 10−9 − 9.9× 10−12)M = 9.901× 10−10M y,[L]eq = (1× 10−5 − 9.9× 10−12)M = 9.999× 10−6M .

De lo anterior, se sigue: d[PL]dt = k2[PL]EQ = (0.1s−1)(9.9× 10−12M) = 9.9× 10−13M/s.

Si consideramos una cubeta de 1ml y tomamos en cuenta el número de Avogadro (6.022 ×1023 moléculas mol−1) tendremos:

d[PL]

dt= (9.9× 10−13mmol ml−1 s−1)(6.022× 1020 moléculas mmol−1)

= 5.962× 109moléculas/ s

Es decir, aún en el equilibrio y a concentraciones tan bajas como las que se suele manejar en loslaboratorios, la tasa de reacción es muy elevada, sólo que ocurre en ambos sentidos por igual.

3.1.2 Ejercicio no resuelto 1.

Calcule la tasa de interconversión usando ahora la expresión equivalente−dPdt = k1[P ]EQ[L]EQ

y compruebe que el flujo en ambas direcciones es el mismo.

3.2 Ejemplo 2: Tiempo en que se requiere para que se alcance el equi-librio en el sistema del ejemplo anterior.

Para modelar la trayectoria de aproximación al equilibrio, requerimos considerar la velocidad deambas reacciones (asociación como la de disociación) pero mientras no se ha establecido el equilibrio.La tasa neta de acumulación de PL dependerá de la diferencia entre las tazas de formación y dedescomposición. si “x” es la cantidad de PL formado al tiempo t, tenemos:

dxdt = k1(P0 − x)(L0 − x)− k2x = k1P0L0 − k1(P0 + L0 + k2

k1)x+ k1x

2 (Ecn 5).Este caso sencillo, da un ecuación diferencial no tan sencilla, que es de primer orden, pero

no homogénea (“x” aparece sin derivar) y de segundo grado (está elevada al cuadrado). Existenmétodos para resolver esta ecuación y los casos frecuentes que tienen solución analítica ya han sidodescritos (Consultar la tabla 2 de la referencia: Kuby, SA. A study of Enzymes. Vol. I Chap. 10pp. 377-415).

Pero en lugar de tomar la solución completa, aprovechemos el sistema para aprender a simplificarproblemas complejos mediante la manipulación de la condiciones experimentales.

En nuestro caso, la concentración de proteína total es cuatro órdenes de magnitud inferior a lade ligando. Por lo tanto, la cantidad de complejo formado (x) será despreciable en comparacióncon la de ligando libre. Es válido asumir entonces que:

(x� L0)⇒ ([L] = L0 − x ≈ L0) ,con lo que, el mecanismo del esquema 1 se simplifica para dar el esquema 2.y la ode 5 se simplifica a la ecuación 6.dxdt = k1(P0 − x)[L0]− k2x = APP k1P0 − (APP k1 + k2)x (Ecn. 6)

9

LPL

APPk1= k

1Pk2

Esquema 2


Resuelva la ode anterior (Ecn. 6) por el método de separación de variables ilustrado en la soluciónde la ecuación 2 (pag. 2, confronte su resultado con la solución indicada en seguida, Ecn. 7)

x = ([P ]0 − [P ]EQ)(1− e−(APP k1+k2)t) (Ecn. 7),en la que:

[P ]EQ = k2APP k1+k2

[P ]0

3.3 Recapitulando:1. Antes de atacar un sistema elimine las complejidades innecesarias (aquellas que no tienen

efecto apreciable en el comportamiento del sistema bajo las condiciones de estudio). Estofacilita el modelo y el relacionar el modelo con el experimento. En este caso:

La solución (Ecn. 7) indica que x se aproxima a su concentración de equilibrioexponencialmente, ([P ]0− [P ]EQ) alcanzándola cuando la exponencial vale cero,es decir a tiempo infinito.

2. La tasa con la que el sistema se aproxima al equilibrio sigue una exponencial decreciente, loque quiere decir que se acerca muy rápido al inicio, pero se va frenando conforme más cercaestá del equilibrio.

Como consecuencia de los dos puntos anteriores: tendríamos que suponer que nada llega jamásal equilibrio, si bien puede aproximarse mucho.

Esto es causado por las funciones de variables continuas empleadas, siendo que los sistemasmoleculares son discretos, i.e.:

Las soluciones presentadas aproximan bien el comportamiento del sistema mientras serefieran a predicciones que dependan de muchas moléculas, pero fallan al tener unaspocas decenas de moléculas, cuando la fracción de molécula en el resultado ya noresulta despreciable. Una fracción de molécula es un sinsentido.

3.3.1 Ejercicio resuelto 2. Tiempo requerido para que la concentración de PL rema-nente sea 99% de la concentración al equilibrio.

Llamemos t99 al tiempo en el que:x = 0.99 [PL]EQ = 0.99 ([P ]0 − [P ]EQ).

De la ecuación 7 :x = ([P ]0 − [P ]EQ)(1− e−(k1L+k2)t99).

Substituyendo los valores dados en el ejercicio resuelto 1 tendremos:

10

0.99 ([P ]0 − [P ]EQ) = ([P ]0 − [P ]EQ)(1− e−(k1L+k2)t99),por lo que:

e−(k1L+k2)t99 = (1− 0.99) = 0.01 y t99 = − ln(0.01)k1L+k2

= 45.6 sPara fines prácticos, aún es esta reacción, que podemos considerar lenta,

¡se requiere menos de un minuto para que se establezca el equilibrio!

Note que si aumentamos la concentración de proteína, esto no tendrá un efecto apreciable enel tiempo en el que se alcance el equilibrio, en tanto no se viole nuestra aproximación de que laconcentración de ligando inicial se mantenga casi constante durante la aproximación al equilibrio(es decir, mientras no pongamos proteína a un nivel cercano al de ligando).

Una particularidad de este ejemplo, que sorprende, es que la concentración de proteína nodetermina el tiempo en el que se alcanza el equilibrio. Además, la concentración de ligando tampocotiene un efecto notable, en tanto [L] se inferior a 10 mM, ya que 100 M−1 s−1[L] � k2 (ver losdatos en el ejemplo 1). Es decir, a pesar de que numéricamente, la constante de rapidez para ladisociación del complejo parece pequeña y se antoja poco relevante - lo que determina la rapidezde aproximación al equilibrio es la rapidez de la ruptura del complejo - ¡no la rapidez con la que seforma!

Esta es una situación común en muchos sistemas dinámicos, los pasos que determinan la dinámicodel proceso global son a menudo pasos que intervienen en el proceso que ocurre en la direcciónopuesta a aquella en la que se observa un flujo neto, es decir “los frenos pueden ser más significativosque el empuje”.

Note también que, en una alícuota de 1 nl de la disolución anterior, tendríamos:

0.99 [PL]EQ = 0.99× 9.9× 10−12 nmol nl−1 × (6.022× 1014moléculas nmol−1)

= 5902.2moléculas ml−1

Es decir aún con tan poco proteína y en un volumen muy pequeño tenemos muchas moléculasy la diferencia entre 5902 y 5902.2 moléculas es despreciable. En otras palabras el uso de funcionescontinuas se justifica aún en situaciones nanoscópicas.


Estime el tiempo adicional que tendré que esperar para pasar de 99% de la concentración de PLEQ

para llegar a 99.99% de su concentración de equilibrio.

3.4 Ejemplo 3. Aceleración de una reacción enzimática en su caminohacia el SS .

En el sistema anterior, consideramos un proceso físico de asociación de proteína y ligando. Es denotar, que las ecuaciones que describen la cinética de estos procesos no difieren de las que describenla cinética de transformaciones químicas. Consideremos la forma más sencilla de reacción químicacatalizada enzimáticamente, un único reactante, un sólo producto y sólo dos formas de la enzima(Esquema 3).

Consideramos que este proceso no está en equilibrio y se refiere a una trasformación química,pero para modelarlo recurrimos a las mismas herramientas que antes, es decir, la rapidez de lareacción química se mide como:

11

SE·S

k1

Ek2

E·PkCAT

EP

Esquema 3

dPdt = kCAT [E.S] (Ecn. 8)

y la rapidez de formación y desaparición del complejo está dada por:d[E·S]dt = k1[E][S]− (k2 + kCAT )[E ·S] = k1(E0 − [E ·S])[S]− (k2 + kCAT )[E ·S],

que se simplifica a:d[E·S]dt = k1E0[S]− (k1[S] + k2 + kCAT )[E ·S] (Ecn.9).

Asumimos nuevamente que [S] � [E] y que durante el tiempo del experimento [P ] � [S]. La[S] consumida en formar E ·S + P es despreciable y se puede considerar que [S]≈[S]0 y es casiconstante. Ahora, derivando la ecuación 8, obtenemos la Ecn. 10.

d2[P ]dt2

= kCATd[E·S]dt (Ecn.10)

entonces, multiplicando la ecuación 9 por kCAT e igualando, generamos la Ecn. 11.d2[P ]dt2

= kCATd[E·S]dt = kCAT k1E0[S]− (k1[S] + k2 + kCAT ) kCAT [E · S] (Ecn.11).

Substituyendo 8 en 11 tendremos:d2[P ]dt2

= kCAT k1E0[S]− (k1[S] + k2 + kCAT )dPdty que se ordena para dar:d2[P ]dt2

+ (k1[S] + k2 + kCAT )dPdt − kCAT k1E0[S] = 0 (Ecn.12).Esta ecuación diferencial ya no se puede resolver con los métodos que empleamos para resolver

la ecuación 3 (pag. 2), pero observemos que [P] sólo aparece como derivadas (es decir, se trata deuna ode homogénea), por lo que se puede simplicficar con un truco sencillo (substituir la variable).Sea

ν = d[P ]dt ,

por lo tanto: dνdt = d2[P ]

dt2de donde se tiene:

dνdt + (k1[S] + k2 + kCAT )ν − kCAT k1E0[S] = 0 (Ecn.13).

Ahora si podemos separar las variables y ordenarla, es decir:

dν

−(k1[S] + k2 + kCAT )ν + kCAT k1E0[S]= dt

dν

−([S] + [k2+kCAT

k1])ν + kCATE0[S]

= k1dt

(Ecn. 14).

Si ahora definimos:KM = k2+kCAT

k1(Ecn.15)

yVMAX = kCAT [E0] (Ecn.16),

y se substituyen 15 y 19 en 14 y como a t = 0 , [E ·S] = 0 y ν0 = 0 nos queda la siguienteintegral definida:

12

∫ ν

0

dν

−([S] +KM )ν + VMAX [S]= k1

∫ t

t=0

dt ,

que se resuelve para dar:

−(1

[S] +KM) [ln(−([S] +KM )v + VMAX [S])− ln(VMAX [S])] = k1t ,

o bien:ln

(VMAX [S]

+VMAX [S]− ([S] +KM )ν

)= k1([S] +KM )t , (17)

que es la solución en su forma logarítmica, en su forma exponencial tendremos:

VMAX [S] = ek1([S]+KM )t VMAX [S]− ek1([S]+KM )t([S] +KM )ν , (18)

es decir:d[P ]

dt= ν =

VMAX [S]

[S] +KM

(1− e−k1([S]+KM )t

)(Ecn. 19).

¡Sorpresa! - La ecuación de Michaelis y Menten multiplicada por un factor exponencial. Siahora, si queremos determinar como varía la concentración de producto en función del tiempo,basta con integrar esta función.

Suena a una integral complicada, pero como [S] ≈ [S]0 desde el planteamiento inicial, podemossimplemente separar las variables e integrar, considerando que [P ] = 0 a t = 0.∫ P

0

([S] +KM )

VMAX [S]d[P ] =

∫ t

0

(1− e−k1([S]+KM )t

)dt

[P ] =VMAX [S]

([S] +KM )

(t+

e−k1([S]+KM )t−1

k1([S] +KM )

)(Ecn. 20) ,

que equivale a:

[P ] =VMAX [S]

([S] +KM )

(k1([S] +KM )t+ e−k1([S]+KM )t−1

k1([S] +KM )

)Para analizar el comportamiento de esta ecuación consideremos primero que la reacción se encuentraen los primeros momentos; así, la función exponencial se puede simplificar considerando sólo losprimeros tres términos de la expansión de Taylor ( ex = 1 +x+ x2

2 ! + ...xn

n !), es decir, el numeradorde la expresión anterior dentro del paréntesis se convierte en:

−k1([S] +KM )t+(1− k1([S] +KM )t+ (1/2)k2

1([S] +KM )2t2)− 1 =

k21([S] +KM )2t2

2

y toda la expresión se simplifica a:

13

[P ] =VMAX [S]

2(k1) =

k1kCATE0[S]

2t2 (21)

Una gráfica de [P] vs. t2 es aproximadamente lineal y tiene pendiente (1/2)k1kCATE0S0.Ahora, si kCAT y KM han sido determinadas de los datos de SS , E0 es conocida y aceptando la

ecuación 15 como una definición correcta de KM , entonces es posible calcular todas las constantes.A tiempos largos, la ecuación 20 puede simplificarse considerando que el término de decaimiento

exponencial se hace despreciable, con lo que la ecuación se reduce a:[P ] = VMAX [S]

([S]+KM )

(t− 1

k1([S]+KM )

)(Ecn. 22).

En estas condiciones se alcanza el SS , el cual es ahora descrito por esta recta cuya pendientees:

VMAX [S]([S]+KM )

y que intercepta a la ordenada está del lado negativo del eje en:(−VMAX [S]k1([S]+KM )2

).

Si ahora extrapolamos la recta a la abscisa ([P ] = 0), nos da:(k1([S]+KM )t−1k1([S]+KM )2

)= 0.

Despejando el tiempo, al que llamaremos periodo de retardo ( τ) o fase “lag”, tenemos:τ = 1

k1([S]+KM ) .De nuevo, si se conoce KM , o si la concentración de sustrato es saturante ([S] +KM ) ' [S], se

puede determinar el valor de k1.Este caso puede no ser muy realista, porque se asume que la reacción es completamente irre-

versible y que en el proceso catalítico sólo interviene un complejo E ·S (lo cual no siempre es unaaproximación válida). Sin embargo, ilustra el poder de la medición de la reacción en condicionesprevias al establecimiento del SS y muestra que la cinética de pre-SS nos puede decir que tanrápido se asocian la enzima y el sustrato, que tan rápido se disocia el complejo y EL VALORVERDADERO DE LA CONSTANTE DE DISOCIACIÓN DEL COMPLEJO E·S.

Este enfoque fue empleado por Gutfreund para determinar las constantes de la reacción dehidrólisis de esteres sintéticos de aminoácido catalizada por la quimitripsina. El siguiente ejemploes una adaptación de sus resultados.

[S] (µM) δP/δt (µmolmin−1)± SE.

3.5 1.14 0.10

6.0 1.69 0.02

11.0 2.34 0.08

20.0 2.97 0.14

35.0 3.42 0.33

60.0 3.91 0.23


La quimotripsina cataliza la hidrólisis de ésteres de aminoácido como la acetil-tirosina (AcY). loreacción puede seguirse por el cambio en la fluorescencia de TYR cuando se desacetila. Se realizaron

14

las siguientes mediciones con 0.3µmoldeenzima, en cubetas de 3ml y variando la concentración delsustrato (según se indica arriba), bajo condiciones de SS .

Luego se siguió la reacción en el pre-SS mezclando dos disoluciones (par partes iguales) una con20µM de enzima y otra con 100µM de sustrato en un equipo de flujo detenido (sección siguiente).Los resultados se muestran en seguida.

tiempo (ms) [P ](µM) tiempo (ms) [P ](µM) tiempo (ms) [P ](µM)

0.0 0.000 6.2 0.362 14.1 1.200

0.9 0.012 6.5 0.387 14.6 1.261

1.0 0.014 6.7 0.406 15.0 1.312

1.2 0.021 7.0 0.432 15.5 1.364

1.5 0.030 7.3 0.459 16.0 1.427

1.8 0.040 7.5 0.487 16.6 1.490

2.0 0.051 7.8 0.509 17.0 1.543

2.3 0.063 8.1 0.538 17.5 1.607

2.5 0.078 8.3 0.561 18.0 1.661

2.8 0.091 8.5 0.584 18.5 1.725

3.0 0.105 8.7 0.607 19.0 1.779

3.2 0.121 9.0 0.640 19.5 1.834

3.5 0.141 9.3 0.664 20.0 1.900

3.8 0.156 9.5 0.689 21.0 2.021

4.0 0.175 9.7 0.714 22.1 2.142

4.2 0.192 10.0 0.748 23.1 2.264

4.5 0.214 10.5 0.800 23.9 2.365

4.8 0.232 11.0 0.854 25.0 2.499

5.0 0.252 11.5 0.909 26.1 2.622

5.2 0.272 12.0 0.965 27.0 2.735

5.5 0.293 12.5 1.023 28.1 2.858

5.7 0.315 13.0 1.081 29.1 2.982

6.1 0.344 13.5 1.140 30.0 3.091

Asumiendo que esta enzima sigue el modelo del Esquema 3 (Pag. 12) determine el valor de lasconstantes k1, k2 y kCAT .

15

Figura 5. Diseño de un equipo clásico de flujo detenido. En el esquema se muestran los componentesbásicos, incluyendo dos diferentes diseños de celdas y un mezclador de 4 vías.

4 Métodos para cuantificar los tiempos de relajación. “StoppedFlow” “Quenched Flow” y “Equilibrium Jump”.

Los primeros experimentos de cinética rápida se reportaron por Hartridge y Roghton en 1923, conbase en un instrumento diseñado por Reschig (1905), quién estudió reacciones en fase gaseosa.

Es esos experimentos, Hartridge y Roghton mezclaron una disolución de hemoglobina con otra demonóxido de carbono y la mezcla se hizo fluir por un tubo delgado que tenía una serie de termopares(sensores) a los largo de tubo. La reacción de la hemoglobina con el monóxido desprende calor ylos autores siguieron la reacción por el calor desprendido.

En este sistema, a flujo constante, se obtiene una disolución con una edad fija, después delmezclado, en cada punto del tubo. Cada termopar detecta el estado de la reacción a un tiempofijo después del mezclado. La concepción del diseño es simple y el equipo requerido no es muysofisticado en resolución y tiempo de respuesta. La información es certera y repetida, pues ladisolución en cada termopar es continuamente reemplazada por otra disolución igual fresca. Sinembargo se requieren cantidades enormes de proteína, que difícilmente pueden obtenerse cuandono se trata de la hemoglobina equina.

En 1940, Chance realizó un experimento semejante, pero detuvo el flujo abruptamente en la celdade un detector. Si el flujo se detiene cuando la disolución ha envejecido apenas unos milisegundos,se puede seguir el devenir de la reacción en los segundos siguientes, observando la celda con algúnespectroscopio (espectrofotómetro o espectrofluorómetro, comúnmente).

El diseño clásico de un equipo de flujo detenido se muestra en la figura 5. En ella se muestran lajeringas de reactantes que contienen dos disoluciones distintas, con los componentes de la reacción

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Figura 6. A) Diseño de un equipo clásico de flujo extinto (QUENCHED FLOW). En el esquema semuestran los componentes esenciales, pero en este equipo el tiempo de reacción está fijado por lalongitud del trayecto ente los mezcladores y la velocidad del flujo. B) se muestra una fotografía deun equipo comercial. C) Equipo básico de flujo extinto pulsado. En este equipo luego de un pulsoen el impulsor A, un sistema adicional de válvulas puede retener el líquido en el tubo de incubaciónpor el periodo deseado, en tanto que un pulso del impulsor B desplaza el líquido de la incubadoraal segundo mezclador para detener la reacción.

separados de manera que la reacción no se inicia, hasta después del mezclado. La mezcla ocurre enun dispositivo mezclador que provoca un régimen de flujo hidrodinámico turbulento en la conjunciónde las tuberías.

En un equipo de flujo rápido típico (Fig 5), la disolución se conduce hacia una cámara de obser-vación y se recoge finalmente en una jeringa receptora. Las jeringas de reactantes son empujadassimultáneamente, generalmente por un dispositivo automatizado. El émbolo de la jeringa receptoraestá también acoplado a un transductor que enciende el registro al ser empujado hasta su posiciónfinal. Los detectores estaban inicialmente acoplados a un osciloscopio para permitir un registrode lo ocurrido en la celda en los primeros 10 a 100 ms de la reacción. En los equipos modernosdispositivos electrónicos computarizados colectan datos en formato digital. Sin embargo, se trata deequipos costosos debido a que los procesadores de la señal deber ser capaces de registrar y procesarlos datos con gran rapidez y la sincronía entre la mecánica y la electrónica debe ser muy precisa.

Para algunas reacciones que no es posible seguir en los espectroscopios, se han diseñado equiposque se conocen como de flujo extinto (“quenched flow”). un esquema básico de ellos se muestraen la figura 6. Los equipos de flujo extinto difieren de los de flujo detenido en que tienen unasegunda cámara de mezclado que permite combinar la reacción con una disolución que la detiene,generalmente con ácido u otra substancia que ejerza su efecto de manera casi inmediata, esto encomparación con la rapidez del proceso en estudio.

Se requieren cantidades grandes de proteína y para seguir la reacción en el tiempo hay querecurrir a trucos como pulsar o variar el flujo, lo que generalmente se realiza con un sistema deválvulas controladas por computadora. Esto generalmente se traduce en experimentos más largos,con buen gasto de proteína y se obtiene una cantidad abundante de muestra por analizar.

El tiempo que transcurre para que el líquido llegue desde la cámara de mezclado a la celda sellama “tiempo muerto” del equipo. Aunque puede reducirse acortando la longitud de la tubería, en la

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práctica hay un límite a esta distancia, ya que los fenómenos de transporte en la disoluciones duranteel mezclado impiden que los reactantes formen una mezcla homogénea en tiempos demasiado cortos.

A pesar de los enormes adelantos tecnológicos, los tiempos muertos de los equipos de flujodetenido no han logrado reducirse gran cosa desde que se fabricaron los primeros equipos. Recien-temente, equipos que emplean los adelantos en la tecnología de materiales para fabricar tuberíamuy delgada, con muy poca fricción y cámaras de mezclado óptimas, con diseños asistidos porcomputadora han logrado reducir los tiempos muertos de 2 o 3 ms a tan sólo 0.5 ms. Como se ve,el avance no ha sido espectacular.

Cuando se desea estudiar reacciones en tiempos aún más corto se ha recurrido a la técnica deperturbación del equilibrio. Esta técnica tiene la ventaja de que no depende de la difusión parael mezclado, porque la reacción se mezcla y se deja llegar a equilibrio dentro de la cámara deobservación. Entonces, se emplea un cambio en las condiciones del medio que modifique la posicióndel equilibrio y se detecta como es que las especies se redistribuyen para satisfacer la condición deequilibrio. Estos estudios reciben el nombre de “salto del equilibrio” (EQUILIBRIUM JUMP).

Dos tipos equipos han sido los más empleados:I) los que modifican la temperatura, lo cual puede hacerse de manera muy eficiente en tiempos

tan cortos como 0.1 ms, sobretodo si el cambio es de unos pocos grados. Aunque su diseño puedeconsiderarse tan sencillo como el de un espectrofotómetro con control de temperatura por efectoPeltier, la necesidad de transmitir el calor en tiempos muy cortos y permitir su flujo hacia el cuerpode la disolución en periodos igualmente cortos, hace de este tipo de instrumentos equipos muycostosos. Recientemente el uso de luz láser (Fig. 7) permite calentar específicamente el solvente(usando un láser de Oxidos de Ytrio y Aluminio envenenados con Neodimio, conocido como Nd-YAG, que emite luz infrarroja de 1064 nm) en tiempos aún más cortos. En teoría el límite inferiorde resolución de esta estrategia puede ser llevado al orden de 10 ps.

II) Los que modifican la presión, cuyos efectos en la disolución se transmiten de manera casiinstantánea, especialmente en solvente poco compresibles como el agua. Sin embargo, para quese observen cambios importantes en las constantes de equilibrio se requiere aplicar cambios depresión de varios cientos o, incluso, miles de atmósferas, lo que no es resistido por cualquier equipo,especialmente en la cámara de observación, que tiene que permitir el registro de los eventos queocurren en su interior. Frecuentemente en estos equipos la celda de observación es un conductímetroy el diseño general del equipo se realiza en acero inoxidable, excepto por el disco o membrana deruptura que es de Nylan u otros materiales poliméricos resistentes a la deformación.

Finalmente, algunas reacciones pueden estudiarse mediante “saltos” del equilibrio que puedenprovocarse con luz o con electricidad mediante efectos fotoquímicos o electroquímicos. Aunqueestas estrategias están limitadas a reacciones en las que el proceso químico lo permite, su aplicaciónpuede ser muy informativa, dado que se puede tener un control muy estricto del inicio del proceso.

Un aspecto muy importante de esta estrategia es el tipo de registro espectroscópico que seha de realizar. Se han empleado muy comúnmente espectrofotómetros y fluorímetros en el rangoUV/visible. Pero más recientemente se ha introducido el uso de espectrofotometría infrarroja (IR),resonancia paramagnética del electrón (EPR), fluorescencia de energía transmitida por resonancia(FRET) y resonancia magnética nuclear (NMR). En algunos casos, ha sido posible el introducirmarcaje isotópico en sitios específicos del ligando o de la proteína. Esta técnica es de utilidad sise combina con la espectrofotometría IR, ya que el espectro diferencial entre la mezcla sin y conel marcaje isotópico proporciona la señal de aquellos átomos que están covalentemente unidos alisótopo.

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A B

Figura 7. A) Diseño esquemático de un espectroscopio de salto de temperatura basado encalentamiento por medio de luz láser. B) Emisión a 340 nm en respuesta a un salto detemperatura de 5 a 25 oC de una disolución con 20 µM de triosa fosfato isomerasa (TIM).(a) apo-TIM; (b) TIM con 5 mM gliceraldehído-3-fosfato. La línea roja es el registro de laseñal y la verde el ajuste de los datos. La señal transitoria entre 14 y 50 ns no tiene aúnexplicación satisfactoria (tomado de Callender y Dyer, 2002).

5 Escalas de tiempo, resolución de los espectroscopios ylímites de la técnica.

Para dar idea de la capacidad de resolución de esta técnica consideraremos lo siguiente:

1. Los diferentes métodos tienen diferente capacidad para mostrar información dependiendo dela rapidez con la que es posible “disparar” el fenómeno. Las técnicas que implican mezclado(stopped flow or quenched flow) tienen un límite técnico 0.1 ms, aunque en la práctica losmejores equipos actuales usualmente llegan a los 0.5 ms. Las técnicas de salto del equilibrioson mucho más eficientes y permiten registrar los fenómenos en tiempos de hasta 0.05 s.Algunos los equipos modernos utilizan un láser "sintonizado" para calentar el solvente (agua)y permiten llevar la resolución a límites 10 veces inferiores.

2. Sin embargo, para el control y el registor de datos, la tecnología moderna se apoya principal-mente en los dispositivos electrónicos. Tales dispositivos dependen en general de un circuitobásico llamado oscilador sinusoidal que genera corriente alterna de diversas frecuencias. Lasfrecuencias determinan en gran medida el tamaño de los fenómenos que se pueden codificaro inspeccionar con tal señal. En general, aquellos fenómenos cuya frecuencia es menor que lafrecuencia del oscilador se pierden. Nuestros dispositivos actuales trabajan en frecuencias de0.1 a 100 MHz (millones de oscilaciones por segundo). Esto quiere decir que se puede sondearbien cosas que ocurren en rangos de µs o menos. Desafortunadamente, entre mayor se lafrecuencia de la onda, mayor su tendencia a viajar por el aire fuera del conductor (circuito),lo que genera pérdida dde sensibilidad y ruido. Por lo mismo, las señales observadas debentener una intensidad apreciable para que puedan separarse del ruido. Este problema ha sidoobviado en parte gracias a la conversión digital. Los mejores circuitos disponibles en la actu-alidad manejan conversiones en el orden de 96 MHz. Lo que significa que para analizar una

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AB

C

Figura 8. Diseño clásico de un equipo de salto de presión A) esquema general B) diagramade la bomba de presión para detección con conductividad. C) diagrama de la celda deconductividad y su montaje (tomado de Takahashi y Alberti)

curva con una duración de 1µs podemos procesar unos 96 puntos de la señal. Si vemos lacurva de la figura 9, observaremos que para analizar una curva de este tipo se requiere de 3o 4 puntos para definir la región lineal, pero se requieren10 o más puntos para definir bien laparte curva.

3. En la reacciones químicas catalizada por enzimas los fenómenos generalmente ocurren endisoluciones acuosas. Por ello los fenómenos de segundo orden no superan un valor de 4 ×109M−1s−1, que el la rapidez de difusión. Para determinar el valor de una constante desegundo orden de 1 × 109M−1s−1, si el menor valor de τ que podemos medir es de digamos1ms y necesitamos una concentración de sustrato de 1µM , pero con una concentración desustrato de ese nivel, la cantidad de producto acumulado sería 20 veces menor a la que semuestra en la figura 7, lo que significaría que aún por fluorescencia sería casi imposible detectarla señal del producto acumulado.

4. La espectroscopía empleada también requiere consideraciones. Con la fluorescencia la ex-citación lumínica emite fluorescencia en tiempos que pueden exceder un milisegundo, por loque es posible que no se mida la fluorescencia de SS y entonces habría que resolver también lostiempos de relajación debidos a la acumulación o pérdida de la forma excitada del fluoróforo.

5. Con las constantes de primer orden el problema es que no dependen de la concentración, loque significa que son inversamente proporcionales a los tiempos de relajación y, por lo tanto,valores superiores a 1× 104s−1 escapan a auscultación directa por técnicas de flujo detenido,o bien 1× 106s−1 para las técnicas de salto del equilibrio.

6. Por último, cuando un intermediario sufre dos isomerizaciones consecutivas, sus tiempos derelajación aparecen sumados en las ecuaciones, es decir, lo que veremos es la suma de ambos

20

Figura 9. Datos del problema 4 ( pag. 14) en forma gráfica. La línea verde es resultado del ajustepor regresión no lineal a la parte final de la curva, la línea azul es una parábola de la forma y = x2

ajustada al inicio de la curva. Ambas líneas fueron extendidas más allá de la región en que fueronajustadas.

tiempos de relajación, si uno de ellos es muy lento con respecto al otro, su valor dominará enel proceso y sólo podremos detectar uno de ambos intermediarios.

6 Solución analítica de mecanismos cinéticos comunes y susimplicaciones.

En la primera parte de este escrito tratamos de un caso relativamente sencillo, que seguramenteno puede ser aplicado más que a unos pocos casos, ya que supone que la formación de productose da en un sólo paso y la liberación del producto ocurre sin la presencia de formas intermediariasdel complejo enzima producto. Si se asume que la concentración de sustrato no es limitante y quepermanece constante en los experimentos, es posible obtener una solución analítica para el sistemacompleto considerando la reacción reversible y varias formas intermediarias. Consideremos porejemplo el esquema 4.

Por supuesto, no es difícil imaginar que la concentración de producto en función del tiempotendrá una forma compleja.

Para empezar podemos ver que se trata de un sistema que generará 4 ecuaciones diferencialesindependientes, una por cada especie enzimática menos una, más la ecuación de balance de masapara la enzima. La formación de producto en función del tiempo dependerá de la conversión de ESen EP, la cual puede además revertirse, es decir:

−d[P ]dt = fkCAT [E ∗ S]− rkCAT [E ∗ P ] (Ecn 23)

Pero para resolver la ecuación 23 en términos de la concentración de sustrato, producto, enzima

21

SE*S

k1

Ek2

E·PfkCAT

EP

E·Sik2

ik4

rkCAT

E*Pik6

ik8

k4

k3

Esquema 4

total y los valores de las constantes de rapidez, necesitamos saber como varía la concentración deE*S y E*P en función del tiempo, lo que implica conocer también las demás formas, ya que todasellas están interconectadas por los eventos químicos.

Matemáticamente se puede demostrar que un sistema de ecuaciones diferenciales lineales deprimer orden con 5 ecuaciones independientes (incluyendo el balance de masa de la enzima) y 5funciones desconocidas (una describiendo la variación en la concentración de cada especie comofunción del tiempo) tiene al menos una solución completa.

La manera más evidente de obtener tales soluciones es usar las funciones exponenciales, yaque esta función, al ser derivada da lugar a si misma, lo que significa que puede eliminarse de lasecuaciones igualadas a cero (por factorización) y se resuelve entonces una ecuación algebraica conlos coeficientes, que permite determinar los valores de todos los coeficientes, el resultados será dela forma:

[P ](t) = A0 + f(t) +A1 et/τ1 +A2 et/τ2 +A3 et/τ2 +A4 et/τ4 +A5 et/τ5

en donde f(t) es usualmente una función algebraica de t, A0, A1, etc. son las amplitudes de loscomponentes exponenciales y τ1, τ2, etc. son los llamados tiempos de relajación de los componentesexponenciales., que son funciones de las constantes de rapidez. Los tiempos de relajación sonfunciones algebraicas racionales de las constates de velocidad, la concentración de sustrato y laconcentración de enzima total.

En la actualidad, es incluso posible ajustar las curvas experimentales a los datos directamente alas ecuaciones diferenciales, ya que hay programas capaces de resolver el sistema en forma numéricay luego aproximar los valores de las constantes mediante ajuste por iteraciones sucesivas. Si bien,tales algoritmos son complejos, requieren numerosos controles para solventar las complicacionesnuméricas de hacer cálculos repetidamente y son, por ello, costosos en tiempo de cálculo. Afortu-nadamente, la aproximación puede realizarse en la computadoras de escritorio modernas en tiempobastante razonables, pero uno tiene que realizar experimentos con diversas condiciones iniciales con-trastantes, con el fin de asegurar que el modelo es consistente con los datos en todas ellas. Además,existen programas que manejan las ecuaciones en forma simbólica y pueden ayudar a obtener lasolución de un sistema en forma completa.

En cualquier caso, como se podría esperar, hay un pelo en la sopa, ya que las sumas de funcionesexponenciales tienen formas que siguen pareciéndose a una función exponencial y para determinarel número de componentes exponenciales que explican un sistema, se requiere que los valores delos tiempos de relajación ( τ) y las amplitudes se encuentren bien separadas (es decir, serán demagnitudes razonablemente distintas). En la práctica, resulta muy difícil separar razonablementemás de 3 componentes a partir de un sólo conjunto de datos experimentales.

Un análisis completo de un sistema como el mostrado en el esquema 4 es posible si se asumeque las concentraciones de los ligandos S y P , así como otros ligandos intermedios que puedanaparecer en el mecanismo, se pueden mantener en niveles cuasiconstantes. Es decir, que existen

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valores promedio Li promedio que describen el comportamiento del sistema de manera razonable,bajo las condiciones experimentales en estudio. Tal análisis ha sido descrito en detalle por Hammesy Schimmel (1966; 1967).

Estos esquemas ilustran que se pueden analizar secuencias de reacciones consecutivas y resolverla aparición y desaparición de los intermediarios, para determinar las constantes del sistema.

Ejemplos de la aplicación de este análisis hay muchos, menciono tres y en los dos primeros losresultados pudieron ajustarse a modelo planteado en esquema 5 y cuya solución estaría dada porlas Ecn. 24 y 25.

CA(t) = CA(0)e−k12t (Ecn.24)CB(t) = CA(0) k12

k12+k23(e−k12t − ek23t) (Ecn.25)

1. La emisión de luz por la aequorina reportada por Hastings et al., (1969).

2. El reporte por Halford, Johnson & Grinsted (1979), usando la enzima de Resitricción EcoRI.En dicho trabajo, se aprovecha que la enzima realiza el corte en cada hebra en momentosdistintos y usando un plásmido superenrrollado se pueden separa el DNA superenrrollado(sustrato) del DNA circular relajado (cortado en una hebra, pero no abierto) y el DNAabierto (cortado en ambas hebras).

3. La aplicación este tipo de análisis para el estudio de la enzima piranosa-2-oxidasa por Prongjity colaboradores (2009). En dicho estudio los autores aseguran haber resuelto hasta 5 compo-nentes exponenciales independientes, lo cual es muy poco común.

7 Integración numérica de ecuaciones diferenciales.

Vamos ahora a usar octave para resolver numéricamente un sistema de ecuaciones que simula elcomportamiento completo de una enzima monosustrato, pero sin hacer ninguna consideración.Esta simulación debería ser capaz de predecir el comportamiento de la catálisis en el pre-SS, en el SS e incluso al alcanzarse el equilibrio.

El software que emplearemos se denomina octave y es el equivalente abierto de MatLab™.

El script necesario es el que se incluye en seguida y está disponible en línea para que evitentener que teclearlo. Las líneas que inician con # son comentarios y no se ejecutan

# 1. THESE ARE COMMENTS, CHANGE THEM AT YOUR CONVINIENCE# SYSTEM DEFINITION:# kf1*[S] kfc kf2# E <==========> Es <===========> Ep <=========> E# kr1 krc kr2*[P]# So initial substrate concentration# Et total enzyme concentration#- THE LINES BELOW DEFINE TEH VALUES OF THE CONSTANTS# AND CONCENTRATIONS#- THE MUST BE WRITTEN TWICE, ONCE HERE# AND ONCE INSIDE THE FUNCTION#rate constants kvel= [kfc=120, krc=10, kf1=1100, kr1=700, kf2=300, kr2=115];

23

# Co=[Substrate, Enzyme], initial total concentrations#------------ begins section that needs to be copied into the function -----kv=[120, 10, 1100, 700, 300, 115];Co=[0.747 0.000010];#------------ end of section that needs to be copied into the function ------# Mxtm=MAXIMUM TIME OF THE SIMULATION,# Finess is the number of points to integrate and plot# the more points the smoother the ploted line.Mxtm=0.025;Finess=500;# pltflg are FLAGS TO INDICATE WHICH SPECIES# YOU WANT IN THE PLOT, 1= plot, 0= don’t plot.pltFlg = [1,1,1,0,1];# sclFact this number is used to multiply the final values, so all number can# be seen in the plot.# the first sclFact is the factor aaplied to the x axis, which is by default in s.# but if you want the number in ms use 1E3 as sclFact.# i.e. if you want to plot the [S] in mM and the [E.S] in nM# you need to multiply the [E.S] by 1E6# so the values do not appear compressed on the X axis a flat line.sclFact = [1E3 1E6 1E6 1E6 1 1E6];# plotnames is the titles to put in the x (first label) and in the Legend (the rest).plotnames=char(’time (s)’,’[E] ’,’[Es] ’,’[Ep] ’,’[S]’,’[P]’);# the next labels indicate the file names for the output.data_filename=’progress_MM_1.txt’;plot_filename=’progress_MM_1.pdf’;# your results will be saved to files unscaled,# so units are uniform in numeric data.plotfile_format=’-dpdf’;function xdot = mm (x, t)# in this function x is a vector with concentrations of# E Es P# xdot would be derivatives:# dE/dt, dEs/dt and dP/dt, respectively.# due to the inflexible fortran syntax of lsode# declaring the variables as global would not work# so after changing them above in the main script# copy them here

# 1 2 3 4 5 6#rate constants kv= [kfc=120, krc=10, kf1=1100, kr1=700, kf2=300, kr2=115];#---copy from above in here (2 lines)kv=[120, 10, 1100, 700, 300, 115];Co=[0.747 0.000010];S=Co(1)-x(3);Ep=Co(2)-x(1)-x(2);xdot(1)=kv(4)*x(2)+kv(5)*Ep-(kv(3)*S+kv(6)*x(3))*x(1);

24

xdot(2)=kv(3)*S*x(1)+kv(2)*Ep-(kv(4)+kv(1))*x(2);xdot(3)=kv(5)*Ep-kv(6)*x(3)*x(1);

endfunction

# - END OF DEFINITIONS, THE REST MAY BE LEFT# UNCHANGED FOR MOST CASES.# make a set of color choices (black, red, green, blue, magenta, cyan)colrlst=["k", "r", "g", "b", "m", "c" ];

# set initial conditions vector and time points vector for interpolationx0=[ Co(2), 0, 0];t=linspace(0, Mxtm, Finess)’;

# lsode does the job, this is actually the core of this scriptx=lsode("mm",x0 ,t );

# calculate the remaning concetrations such as substrate and# Ep order everything in# a matriz matching plotnamesz=[ t x(:,1) x(:,2) (Co(2).-x(:,1).-x(:,2)) (Co(1).-x(:,3)) x(:,3) ];

# save unscaled data to a filesave(data_filename,’z’) ;

# scale data for the plotz=z.*sclFact;

# create the plotgrph=figure;figure(grph), hold on;leyendas="";for i = 1:length(pltFlg)if ( pltFlg(i) )leyendas=char(leyendas,sprintf("%sx%.1e",plotnames(i+1,:),sclFact(i+1)));plot(z(:,1),z(:,i+1),colrlst(mod(i-1,length(colrlst))+1));endifendforxlabel(sprintf("%s x %.1e",plotnames(i+1,:), sclFact(1)));legend(leyendas(2:end,:));ylabel(’Concentration (mM)’);legend(’boxoff’);legend(’left’);legend("location","north");refresh;

# save the plot to a file;

25

print(plot_filename, plotfile_format);figure(grph), hold off;

A B C

k23

k12

Esquema 5

8 Manipulación de la condiciones para reducir la complejidaddel problema.

Los ejemplos anteriores y la sección previa nos hacen ver que la elección de las condiciones experi-mentales es crucial para reducir la complejidad del problema.

Por ejemplo, consideremos el esquema 4 (Pag. 22). Si la concentración de sustrato no sólo esconstante, sino además saturante, podemos considerar que la formación de complejo E ·S es muyrápida y su disociación en E + S prácticamente no ocurre. Esto puede hacer que el paso de E ·S aE∗S y los posteriores sean mucho más lentos y determinen la cinética, por lo que la contribucióndel primer paso de asociación se puede “esconder” a los ojos del espectroscopio.

Usualmente, la presencia de producto es también muy baja y la reversión de la reacción (de-terminado por k3P ) no es observable, lo que simplifica bastante la forma de las ecuaciones y suanálisis.

Por otro lado, se podría añadir una cierta [P ], provisto que enmascare la medida del que se estáformando. También, si existe alguna señal espectroscópica de la proteína que sea característica dealguna de las formas intermediarias (vgr. fluorescencia al unir algún ligando). En este caso, seenlentece el paso S → P , con lo que este paso podría las curvas y darnos señales fáciles de analizar.

Finalmente, es posible modificar la rapidez de los cambios conformacionales de la proteínaalterando la temperatura, el pH, la viscosidad del medio o la presión. Con lo cual, si logramos quealguno de los pasos sea afectado de manera particular, podemos hacerlo suficientemente lento paraestudiarlo sin interferencia apreciable de los demás eventos.

Desde luego no existe una receta única, cada sistema tiene sus peculiaridades propias y esnecesario conocerlas bien, a fin de explotarlas cabalmente. Es decir, cada sistema requiere unabuena cantidad de trabajo de caracterización previa para que su análisis pueda realizarse con éxito.

Veamos un caso más, reconsideremos el ejemplo 3, pero ahora hagamos que la cantidad deenzima y sustrato sean tales que la formación de producto casi se agote luego de un ciclo catalítico.Sensu estricto deberíamos resolver nuevamente el modelo, porque se había asumido que [S] ≈ [S]0 ≈constante, lo que ya no es válido en la nueva situación. Sin embargo, en aras de la simplicidadconsideremos que existe una “concentración de sustrato promedio ( [S])” tal que los valores de lasconstantes serán también promedio y que las desviaciones causadas por las variaciones de [S] afectanel valor de las constantes, dentro de la incertidumbre del error experimental, pero no la forma delas curvas.

26

Consideremos que:

1. la cantidad de enzima es igual o superior a la de sustrato, por lo que la formación del complejoE ·S será bimolecular y mucho más rápida que otros eventos.

2. la enzima es de tal forma que su complejo E ·S se convierte en un intermediario I que generauna señal espectroscópica semejante a la del producto (para una deshidrogenasa, equivale adecir que el complejo E ·NADH absorbe casi igual al NADH soluble);

3. la reacción no se revierte con las cantidades de producto que se generan durante el experi-mento, es decir la termodinámica de la reacción dificulta su reversibilidad.

El modelo puede escribirse a hora como sigue:

SI

kf

Ekr

kL

EP

Esquema 6

Para simplificar el esquema y la solución haremos un truco introducido originalmente por Clelandy usado de manera amplia por Fersht, que consiste en abreviar el mecanismo escribiendo constantesde velocidad aparentes que reemplazan a las verdaderas (net rate constants), pero que reducen cadapaso a un sólo evento pseudoirreversible. como se muestra en el esquema 7.

Ia

E EP

b

Esquema 7

Para estas constantes a y b, consideramos que el tránsito de E a E+P pasando por I es igual ala probabilidad de que E pase a I ( kf [S]) multiplicada por la probabilidad de que I pase a E + Pen lugar de romperse de nuevo ( kL

kL+kr) , es decir:

a = kLkL+kr

kf [S] = (kCAT /KM )[S] (Ecn. 26),en tanto que el paso de I a E + P estará determinado únicamente porb = kL = APP kCAT (Ecn.27),

entonces, la formación de intermediario I estará determinada por:d[I]dt = a[E]− b[I], la liberación de producto por d[P ]

dt = b[I] y tenemos [E]0 = [E] + [I].Substituyendo [E] en la primera expresión se obtiene:d[I]dt = a[E]0 − (a+ b)[I] (Ecn.28),

Que de nuevo puede resolverse por separación de variables, ya que [E]0 es constante.

27

Usemos esta ecuación para aprovechar la herramienta maxima, que nos permite obtener solu-ciones simbólicas. La figura 10 presenta el trabajo de obtención de la solución en este software, endonde la solución (%o9) se puede simplificar a:

[I](t) = [E]0aa+b

(1− e−(a+b)t

)(Ecn.29),

ahora, como:d[P ]dt = b[I] = [E]0

aba+b

(1− e−(a+b)t

),

obtenemos una ecuación diferencial integrable fácilmente de la que se obteine [P ](t).[P ](t) = [E]0

aba+b t− [E]0

ab(a+b)2

(1− e−(a+b)t

)(Ecn.30).

La ecuación 30 es de hecho equivalente a la ecuación 20 (Pag. 13), lo que se puede ver reem-plazando a y b por sus valores originales. Recordando que el intermediario y la señal espectroscópicadel producto no son distinguibles, tendremos que la señal total F(t) = [I](t) + [P](t) (de Ecn. 29+Ecn. 30) :

[P ](t) + [I](t) = [E]0aba+b t− [E]0

ab(a+b)2

(1− e−(a+b)t

)+ [E]0

aa+b

(1− e−(a+b)t

), o bien,

[F ](t) = [E]0aba+b t+ [E]0

aa+b

(1− e−(a+b)t

) (1− b

a+b

)[F ](t) = [E]0

aba+b t+ [E]0

a2

(a+b)2

(1− e−(a+b)t

)(Ecn. 31)

Esta expresión tiene un término lineal en t y un término exponencial decreciente. A tiemposmuy cercanos a cero, el término exponencial se acerca a cero. Por lo tanto, esta expresión describeun comportamiento inicial de una recta que parte del origen y representa la acumulación inicialdel complejo [I], es decir [F ](t) = [E]0

aba+b t. La recta adquiere curvatura conforme el término

exponencial alcanza un valor detectable y, cuando t es grande y el término exponencial se aproximaa cero (ver figura 11, pag 30), nos queda ahora una recta dada por [F ](t) = [E]0

aba+b t+[E]0

a2

(a+b)2 .El

valor del corte con el eje “Y” de esta segunda fase es iY = [E]0a2

(a+b)2 , que como se puede ver, esproporcional a [E]0.

Aquí podemos tener dos situaciones:i) [S] es relativamente saturante, a2

(a+b)2 = (kCAT [S]/KM )2

(kCAT [S]/KM+kCAT )2= [S]2

([S]+KM )2≈ 1 ,

lo que significa iY = [E]0. En este caso deben usarse [E] muy elevadas, ya que [S] ≈ [E0].ii) si [S] no es saturante, la gráfica iY vs. [S] sigue una curva de tipo sigmoidal, pero que puede

convertirse a una recta tomando√iY como función de [S].


Derive la forma de la función√iY vs. [S], demuestre que es una línea recta y determine la forma

algebraica de su pendiente y su intersección con las ordenadas en dicho regráfico.

28

(%i1) assume(nra>0,nrb>0,E0>0);(%i2) declare(E0,constant); declare(nra,constant);declare(nrb, constant);(%o1) [nra > 0, nrb > 0, E0 > 0] | (%o2) done |(%o3) done |(%o4) done(%i5) mmodeq: ’diff(In, t)= nra*E0 - (nra+nrb)*In;

dIn(%o5) --- = nra E0 - (nrb + nra) In

dt(%i6) gsolmmodeq: ode2(mmodeq, In, t);

- (- nrb - nra) tnra E0 %e (- nrb - nra) t

(%o6)In = (-------------------------- + %c) %enrb + nra

(%i9) icsolmmodeq: expand(ic1(gsolmmodeq, t=0, In=0));(- nrb t - nra t)

nra E0 nra E0 %e(%o9) In = -------- - ----------------------------

nrb + nra nrb + nra(%i10) velmmodeq: ’diff(P,t)= nrb*rhs(icsolmmodeq);

- nrb t - nra tdP nra E0 nra E0 %e

(%o10) -- = nrb (--------- - ------------------------)dt nrb + nra nrb + nra

(%i11) solvelmmodeq: ode2(velmmodeq, P,t);(- nrb - nra) t

nra nrb E0 %enra nrb E0 t - -----------------------------

- nrb - nra(%o11) P = -------------------------------------------- + %c

nrb + nra(%i12) icsolvelmmodeq: expand(ic1(solvelmmodeq, t=0, P=0));

- nrb t - nra t 2nra nrb E0 %e nra nrb E0 t

(%o12) P = ---------------------------- + -----------------------2 2 2 2

nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra2

nra nrb E0 t nra nrb E0+ -------------------------------------------------

2 2 2 2nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra

Figura 10. Solución de la Ecn. 28 en el programa maxima. El resultado (%o9) es equivalentea la Ecn. 29, en tanto (%o12) es equivalente a la Ecn. 30.

29

Figura 11. Resultado de un experimento de cinética de la explosión, que permite ver la variaciónen el intercepto a la ordenada (respecto de la enzima total) con la concentración de sustrato em-pleada. Note que a concentraciones elevadas de sustrato este valor se aproxima a 1. La presenteestrategia se ha empleado en numerosos artículos para titular el total de sitios activos realmentefuncionales de una enzima.

Un aspecto interesante que surge de la comparación entre el análisis presentado en el ejemplodel apartado 3 (pag 12) y este último es el hecho de que la constantes respectivas k2 y kr no sonnecesariamente equivalentes. Ello debido a que en un caso se está midiendo la liberación neta delproducto del sitio activo de la enzima, en tanto que en el segundo la medición monitorea tanto alproducto liberado como aquel que se encuentra atrapado en los complejos intermediarios EP (quepueden ser uno o más, pero que se ven juntos). Es decir, nuestro análisis parte de una simplificación,

30

al aplicarla los valores de algunas constantes son aparentes y pueden incluir pasos adicionales. Dadasla condiciones experimentales y la estrategia de monitoreo de la reacción, dichos pasos no puedenresolverse y quedan ocultos.

Un mecanismo que contiene en realidad los pasos mínimos para la catálisis por una hidrolasacomo la mayoría de las proteasas, carbohidrolasas, fosfatasas y lipasas, asumiendo que la hidrólisises esencialmente irreversible en medio acuoso diluido, debería ser:

SE·S

k1

Ek2

E·PQkCAT

EP

E.QQ

k4

k6

k3

k5

Esquema 8

En el que se asume que los productos se liberan ordenadamente (lo cual es cierto para las serinaproteasas y las lipasas, pero no necesariamente para otras hidrolasas). Note entonces que en esteúltimo análisis, la concentración de intermediario que se mide es [E.PQ]. En cambio, [E] + [E.Q] ,son vistas como “enzima libre” y [E.S] es una especie “invisible” cuyo impacto en la cinética quedaoculto, dadas las condiciones experimentales y cuya influencia está enmascarada en los valores dealgunas constantes. Es decir algunos parámentros estimados son valores aparentes, que dependende otras variables y que serán afectados por un cambio en las condiciones del experimento.

En cambio, en el primer análisis (ejemplo 3, apartado 3, pag 12)) los valores de k1 y k2 debenser reales, pero obskCAT es un valor aparente que involucra tanto a kCAT , k4 y k6, quizá con algunainfluencia menor de k3[P ] y k5[Q], en la medida en que su acumulación no resulta tan despreciablecomo usualmente se asume.

Nuevamente, para conocer en detalle un mecanismo cinético es necesario recurrir a una variedadde condiciones experimentales que permitan realizar un análisis completo de los diversos pasos dela reacción.


En el siguiente experimento se midió la actividad de la quimotripsina con p-nitrofenilacetato, cuyaseñal se detecta desde la ruptura del enlace ester en el sitio activo de la enzima, antes de la liberacióndel segundo producto (que permanece unido covalentemente a la proteína), misma que es el pasolento de la reacción y determina la rapidez neta de la catálisis.

Asuma que los parámetros cinéticos ( KM y VMAX) determinados en el ejercicio 4 (Pag. 14)son válidos para este sustrato (lo que no implica que las constantes de velocidad también los sean).Para estas medidas, la cantidad de sustrato empleada fue cercana a la concentración de proteína(1:1 o 3:1), variando entre 10 y 90 µM (0.21 a 1.89 mg/ml). Otras condiciones experimentalesfueron iguales a las del problema 1. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

[S]0[E]0

=1 [S]0[E]0

=3[S]0=10 30 (µM) 50 (µM) 90 (µM) 30 (µM) 60 (µM) 150 (µM) 270 (µM)t

(ms)∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

t(ms)

∆A/ε(µM)

31

2.6 0.89 1.7 4.68 1.3 9.38 1.9 34.29 2 1.93 1.1 8.65 1.1 21.44 1.1 55.234.4 1.44 3 7.70 2.4 15.70 2.9 43.95 3.5 3.14 2.2 14.60 2.4 34.31 1.9 71.096 1.86 4.3 9.86 3.6 20.12 3.9 50.68 4.9 4.03 3.3 18.60 3.1 38.31 2.9 79.897.3 2.19 5.5 11.55 4.7 23.38 4.8 55.65 6.1 4.72 4.4 21.42 4.6 43.43 3.9 84.558.6 2.48 6.6 12.89 5.7 25.94 5.8 59.46 7.3 5.29 5.4 23.46 5.4 45.11 5 87.149.8 2.73 7.7 14.02 6.7 27.99 6.8 62.50 8.4 5.77 6.5 25.02 6.1 46.39 6.1 88.8610.9 2.96 8.7 14.97 7.8 29.69 7.8 65.04 9.5 6.18 7.6 26.22 7.7 48.29 7.2 90.1112 3.16 9.7 15.81 8.7 31.13 8.8 67.19 10.6 6.55 8.6 27.18 8.5 48.99 8.4 91.3213 3.35 10.7 16.55 9.7 32.41 9.8 68.99 11.6 6.87 9.7 27.97 9.2 49.63 9.5 92.5214.1 3.52 11.7 17.21 10.7 33.51 10.8 70.60 12.6 7.16 10.8 28.67 10 50.23 10.6 93.7315 3.68 12.7 17.82 11.7 34.50 11.7 72.04 13.6 7.43 11.9 29.26 11.6 51.33 11.8 94.9616 3.82 13.7 18.36 12.7 35.39 12.7 73.30 14.6 7.67 13 29.83 12.4 51.83 12.9 96.2717 3.96 14.6 18.86 13.6 36.20 13.7 74.45 15.6 7.90 14 30.33 13.2 52.38 14.1 97.5117.9 4.10 15.6 19.34 14.6 36.94 14.7 75.54 16.6 8.11 15.1 30.82 14 52.87 15.2 98.8718.8 4.22 16.5 19.77 15.5 37.63 15.7 76.53 17.5 8.31 16.2 31.27 15.6 53.85 16.3 100.219.7 4.34 17.5 20.18 16.5 38.27 16.7 77.43 18.5 8.49 17.3 31.71 16.4 54.37 17.5 101.520.6 4.46 18.4 20.56 17.5 38.87 17.7 78.28 19.4 8.67 18.4 32.15 17.2 54.86 18.6 102.921.5 4.57 19.3 20.91 18.4 39.43 18.7 79.08 20.4 8.84 19.5 32.58 18 55.40 19.7 104.222.4 4.67 20.3 21.27 19.4 39.96 19.7 79.78 21.3 9.00 20.6 32.99 19.6 56.41 20.9 105.623.2 4.77 21.2 21.60 20.4 40.44 20.8 80.49 22.3 9.15 21.7 33.41 20.4 56.94 22 107.024.1 4.87 22.1 21.91 21.3 40.92 21.8 81.16 23.2 9.30 22.8 33.81 21.2 57.43 23.1 108.425 4.96 23.1 22.21 22.3 41.39 22.9 81.77 24.1 9.44 23.9 34.24 22 57.95 24.3 109.725.8 5.05 24 22.49 23.3 41.79 23.9 82.31 25.1 9.58 24.9 34.65 23.6 59.02 25.4 111.126.6 5.14 24.9 22.76 24.3 42.21 25 82.89 26 9.72 26 35.07 24.4 59.53 26.5 112.427.5 5.22 25.9 23.03 25.3 42.59 26.1 83.41 26.9 9.85 27.1 35.48 25.2 60.06 27.7 113.828.3 5.31 26.8 23.28 26.3 42.97 27.1 83.84 27.9 9.98 28.2 35.90 26 60.57 28.8 115.229.2 5.39 28.7 23.75 28.3 43.66 28.2 84.32 28.8 10.10 29.3 36.31 28.4 62.13 30 116.530 5.47 30 24.06 30 44.20 30 84.95 30 10.26 30 36.57 30 63.19 30 116.6

¿cuántos sitios activos hay por molécula de quimotripsina?¿Cuánto vale la constante de liberación de producto i.e. la tasa de catálisis neta?¿cómo se compara este valor con la kCAT obtenida en el primer experimento?

9 El problema del mezclado.Como se puede deducir de la discusión anterior, a pesar de que se ha realizado buena dosis deinvestigación en el tema (véase por ejemplo el artículo Wong et al., 2004, Sensors and ActuatorsB 100:359–379), uno de las limitaciones a las que no se les ha logrado superar es la reducción de

32

los tiempos de mezclado. Los mejores resultados se aproximan a los 0.1 ms, pero esto dependemucho de aspectos como la viscosidad de medio, que, en el caso de las proteínas, se eleva de maneraimportante. Sin embargo, en lo que se ha avanzado substancialmente es en lo referente al volumen dela muestra requerido para cada lectura y en el filtrado electrónico de los datos que permite mejorarla sensibilidad a través de elevar la relación señal/ruido. Se ha logrado también avances importantesen lo referente a la versatilidad de los equipos de “quench-flow”, ya que el control computarizado dela instrumentación permite la manipulación de los tiempos de incubación de las mezclas previas ala extinción, ya sea variando la rapidez del flujo, o bien recurriendo a flujos pulsados con un controlmuy preciso de la demora entre el mezclado de la enzima con el sustrato y su posterior mezcladocon la disolución de extinción.

Por otro lado, la reducción en el volumen de la muestra también trae asociado una limitanteque, de nuevo, tiene que ver con el mezclado. El mezclado es más eficiente cuando el flujo se vuelveturbulento, pero la turbulencia del flujo es directamente proporcional a la velocidad, inversamenteproporcional a la viscosidad y directamente proporcional a los que se conoce como la longitudcaracterística del flujo, la cual es una función directa del diámetro de la tubería (para tuberías desección circular).

Esto significa que al disminuir el volumen de muestra es necesario reducir el diámetro de lastuberías y esto lleva a aumentar los flujos. En consecuencia, los experimentos requieren presión,pero la presión genera cambios en los valores de las constantes de rapidez, lo que también puedecomplicar el análisis de los experimentos.

Una alternativa a estas complicaciones es el uso de los métodos de relajación. En estos métodosla limitante es que la reacción debe ser susceptible de alcanzar una situación de equilibrio, lo cualno siempre es posible, pero en muchos casos si lo es.

Consideremos la reacción:

k1

Pk2

PL

L+

Esquema 9

El sistema parte de un condición de equilibrio hacia la condición final nueva en la que [P ]EQi =p′, [PL]EQ = c′ y [L]EQi = l′. Después de un intervalo de tiempo t después del cambio de condicionesel c′ se encuentra a una distancia del equilibrio que llamaremos x.

Así [P ] = p = p′ + x, [L] = l = l′ + x y [PL] = c = c′ − x.El cambio en el sistema puede describirse como:

d(c′ − x)

dt= k1(p′ + x)(l′ + x)− k2(c′ − x)

que puede reordenarse en:

dc′

dt− dx

dt= k1p

′l′ − k2c′ + k1(p′ + l′)x+ k2x+ k1x

2

33

Pero cuando se alcance la nueva situación de equilibrio tendrá que verificarse que:dc′

dt = k1p′l′ − k2c

′ = 0, por lo que la ecuación de arriba se reduce a:

−dxdt

= k1(p′ + l′)x+ k2x+ k1x2

Dado que la diferencia entre ambos equilibrios no es usualmente muy grande x, es usualmente lobastante pequeña para despreciar el término de segundo grado x2.

La ecuación anterior se integra entonces para dar:

x = (p− p′) ek1(p′+l′)+k2

Podemos entonces ver que la relajación del sistema hacia el nuevo equilibrio es un decaimientoexponencial simple con un tiempo de relajación:

1τ = k1(p′ + l′) + k2.Una gráfica del tiempo de relajación ( τ) obtenido a diferentes concentraciones de ligando y

proteína contra la concentración de ligando más proteína libre al equilibrio ( p′+ l′) dará una rectacuya pendiente es igual a la constante de segundo orden y cuyo intercepto a la ordenada es el valorde la constante de primer orden.

Evidentemente los mecanismos en los que hay más de dos especies de proteína en equilibrioinvolucran múltiples tiempos de relajación, lo cuales están usualmente acoplados. Por ejemplo enun esquema como el que sigue:

SE*S

k1

Ek2

E·Sik2

ik4

Esquema 10

El análisis del experimento rinde el valor de los dos tiempos de relajación que se recuperanacoplados y que pueden resolverse ajustando la señal a sumas de exponenciales (Naraghi, 1997), dela forma:

SOBS(t) =

n∑k=1

ak

(1 +

τkτ − τk

e−t/τk − τ

τ − τke−t/τ

)en la que τ es el tiempo de relajación del equipo y del detector combinados (convolucionados).

El producto y como la suma de los tiempos de relajación estarían dados por las expresionessiguientes:

1τ1

+ 1τ2

= k2 + k1(eEQ + sEQ) + ik2 + ik4

(1

τ1)(

1

τ2) = k2

ik4 + k1(ik2 + k2)(eEQ + sEQ)

en las que las eEQ y sEQ son las concentraciones de enzima y sustrato libres al equilibrio (final).De estos valores el posible recalcular los valores de las constantes, en la mayoría de los casos.Un ejemplo de este tipo de análisis se muestra en la figura 7 (pag. 19).

34

10 Información susceptible y refractaria a la auscultaciónmediante estas metodologías.

Después de toda este análisis, cabe aún preguntarse que es lo que puedo averiguar con estasmetodología sobre una enzima (u otro catalizador) y que es lo que está fuera del alcance de es-tos métodos.

Para contestar a esta pregunta consideremos lo siguiente:En estos métodos las determinaciones consisten en cuantificar la presencia de alguna especie

química detectable. Sin embargo, hay especies químicas cuya vida media es muy corta y no presen-tan señales espectroscópicas únicas que permitan diferenciarlas de otros componentes en la mezcla.En muchos casos, puede tratarse de estados de transición o confórmeros desconocidos por no haberseaislado, i.e. sus propiedades no nos son familiares y, por ello, no siempre es posible asociarlos aalguna señal detectable.

A pesar de que la electrónica y la espectroscopia se han sofisticado substancialmente, las especiesde vida media muy corta suelen encontrarse en cantidades muy pequeñas, por lo que su bajaconcentración puede impedir el alcanzar certidumbre cuando se intenta medirla, aún si conocemosalguna propiedad que nos permita su detección.

Los métodos aquí estudiados muestran fenómenos en función del tiempo, pero en términosgenerales, nuestros modelos asumen que los diferentes estados son en sí especies químicas definidas.En formulaciones alternativas (como la teoría de la fluctuaciones y la teoría de las tasas de reacción)se plantea que cada especie química es en si un conjunto confórmeros semejantes (ensambles), perono idénticos; o bien, que un confórmero puede atravesar por una infinidad de microestados siguiendoun paisaje de casi infinitas trayectorias, algunas de los cuales son de menor energía por un estrechomargen (figura 12). Así, las “barreras energéticas” que parecen existir y que representamos comoconstantes de velocidad dependientes de la temperatura y la presión, son en sí una consecuenciade un ensamble en el que sólo algunos de los individuos pueden llegar “al otro lado del camino” ytodos los demás estados deben esperar a que el azar los lleve a esos estados “privilegiados” capacesde transitar hacia el siguiente intermediario (que a su vez es otro ensamble), o alternativamente,sólo algunos confórmeros “aciertan” a seguir la trayectoria que finalmente conduce al siguienteintermediario, sin desviarse en el camino. Estas formulaciones son difíciles de concebir con moléculaspequeñas, dadas los escasos grados de libertad que se presentan cuando existes sólo unos cuantosátomos, pero son particularmente atractivas con macromoléculas, especialmente, dado lo que hemosaprendido de la macromoléculas con el análisis conformacional que permite la espectroscopia deresonancia magnética nuclear.

El comportamiento predicho de las macromoléculas en tales modelos no es tan diferente alpropuesto por la teoría clásica, excepto por detalles sutiles de difícil auscultación, lo que explicaque no exista todavía un consenso en la literatura acerca del modelo que mejor describe a lanaturaleza.

Dado que las metodología estudiadas en este apartado se basan en la inspección de los inter-mediarios a través de técnicas que tienen a promediar las propiedades de los posibles confórmeros,estas metodologías no permiten establecer cual de estos modelos es más cercano a la realidad yaque todos ellos pueden ajustarse para explicar las observaciones experimentales de la cinética deestado pre-estacionario.

A pesar de lo anterior, la combinación de las técnicas fisicoquímicas y analíticas modernas puededarnos información sobre la termodinámica, la química y los fenómenos cuánticos asociados a losfenómenos químicos observados. Toda esta información en conjunto podría en el futuro ayudarnos

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múltiples estados de energíaintermedia

Multiples trajectorias,pero sólo una efectiva

estado de alta energía

Un camino definidode un estado a otro

Multiples veredas con tiempos de tránsito

diversos

Figura 12. Dos tipos de modelos para explicar la barrera energética para la conversión de unaespecie química en otra. El modelo clásico de Eyring propone un intermediario con configuraciónpoco favorable requiere de elevada energía en forma transitoria. En otros, la teoría de las tasas dereacción y las teorías de las fluctuaciones proponen que las moléculas no atraviesan por estado real-mente, pero si pueden quedar temporalmente “atrapadas” en confórmeros que no pueden convertirsedirectamente en productos, o bien transitar por tiempos largos entre estados de energía intermediasin “encontrar la ruta” hacia los productos. En ambos casos, de la población de moléculas presente,sólo una fracción está en posibilidad real de completar la reacción, ya sea por que tiene la energíasuficiente, o porque alcanzó el confórmero o trayectoria efectiva.

a resolver estas interrogantes.Adicionalmente, el análisis de la cinética de estado pre-estacionarios es excelente para detec-

tar intermediarios y medir el curso temporal de reacciones fisiológicas en las que las respuestasde la célula depende de respuestas transitorias controladas por la rapidez relativa de reaccionesalternativas que compiten por la misma posa de reactantes.

A pesar del poder de estas técnicas existen consideraciones importantes que uno debe hacerpara planear un experimento informativo:

a) ¿Las condiciones experimentales son posibles?c) ¿El modelo matemático de la situación a inspeccionar tiene soluciones expresas? o bien,

¿Contamos con métodos numéricos que integren el modelo de manera confiable?

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b) Los métodos numéricos y el poder de las computadoras disponibles permiten extraer lainformación buscada en forma fidedigna.

11 Ejemplos de la literatura que ilustran el poder de estaestrategia.

Shore & Gutfreund (1970) Estudiaron la reacción catalizada por la alcohol deshidrogeneas hepática(LDH). En este estudio existe la ventaja de que tanto la proteína como el nucleótido poseen señalesfluorescentes características que varían a lo largo de la reacción. Además, es posible seguir laliberación de protones mediante el uso de indicadores de pH y se puede usar alcohol deuterado paradeterminar la relevancia de la transferencia del hidruro en la reacción general.

Ellos observaron que el alcohol deuterado era oxidado con una tasa de reacción mucho más lentay que la liberación de protones precedía ligeramente a la reducción del nucléotido en el sitio activode la enzima, por lo que propusieron un mecanismo como el que sigue:

EH+ EH+EH+E

etOH

NAD+ NADH

etO

NADH

Esquema 11

Travers et al. (1979) encontraron que por debajo de 4oC hay un cambio dramático en la energíade activación de la reacción catalizada por la Creatina cinasa (CK).

Trabajando a estas temperaturas pudieron subdividir el transcurso inicial de la reacción catañl-izada por la CK en una fase lag, una explosión y un SS . En esta enzima el complejo ternario(E.ATP.Creatina) está en equilibrio rápido con las especies libres y aparece un intermediario queno contiene cretina fosfato, pero es diferente al complejo ternario.

E EEE

ATP ATP

Cr

ADP

EX E

CrP

k1

k2

k3

k4

k5

Esquema 12

Un éxito notable de este trabajo fue el haber podido determinar el valor de las cinco constantesde rapidez involucradas en los pasos entre el complejo ternario y la regeneración de la enzima libre.

Otra enzima estudiada extensamente con estas técnicas es la miosin-ATPsa. Numerosos trabajosrealizados con esta enzima allanaron el camino de la interpretación de la información estructural deesta proteína en relación con su función en la contracción muscular, todo ello, apesar de que en esa

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época (70s y 80s) no se contaba con suficiente información cristalográfica de esa proteína (Greeves,1991).

Estos métodos has sido empleados también para analizar el comportamiento de reaccionesacopladas del tipo R −Eb→ I −Ea→ P. Cuyo entendimiento facilita la interpretación de diver-sas vía metabólicas en la célula, pero también es importante en el diseño de ensayos enzimáticasacoplados, procesos industriales y otras situaciones de índole práctico.

12 Referencias:Ballew R M, Sabelko J, Reiner C, y Gruebele M, (1996) A single-sweep, nanosecond time resolutionlaser temperature-jump apparatus Rev. Sci. Instrum. 67(10):3694-3699

Callender R, Dyer R B (2002) Probing protein dynamics using temperature jump relaxationspectroscopy. Current Opinion in Structural Biology 12(5):628-633.

Danø S, Sørensen PG, & Hynne F (1999) Nature 402(6759):320-2.Greeves (1991) Biochem. J. 274:1-14.Halford S E, Johnson N P, and Grinstead J (1969). Biochem. J. 179: 353-365Hammes G G, Schimmel R P (1966) J. Phys. Chem. 70(7):2319-2324Hammes G G, Schimmel R P (1967) J. Phys. Chem 71(4):917-923Hastings J W Mitchell G, Mattingly P H, Blinks J R van Leeuwen M (1969) Nature 222:1047-

1050.Naraghi M (1997) T-jump study of calcium binding kinetics of calcium chelators. Cell Calcium

22(4), 255-268Prongjit M, Sucharitakul J, Wongnate T, Haltrich D, Chaiyen P (2009) Biochemistry 48(19):4170-

4180Sadqi M,Lapidus L J, Muñoz V (2003) How fast is protein hydrophobic collapse? Proc Natl

Acad Sci U S A. 14 100(21):12117-12122.Shore & Gutfreund (1970) Biochem. 9, 4655-4659Travers, Barman y Bertrnad (1979) Eur. J. of Biochem. 100:149-155

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material de apoyo para el módulo de cinÉtica...

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