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Diagnóstico bacteriológico de mastitis

bovina, marco teórico y práctico

Luis Calvinho

Curso de Actualización en Mastitis Bovina

Cnia. Vignaud APROCAL – INTA Rafaela

Resumen de temas

Diagnóstico bacteriológico de mastitis: fundamentos ¿Qué

información puede darme el laboratorio? ¿Qué debo

solicitarle?

Pruebas de susceptibilidad a antibióticos (fundamento y

valor de las mismas)

Patógenos contagiosos

Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

Mycoplasma

Corynebacterium bovis

Transmisión durante el ordeño

Patógenos ambientales

Estreptococos y organismos

coliformes

Streptococcus uberis,

dysgalactiae, otras especies

Transmisión principal en intervalo entre ordeños

S. dysgalactiae: ambas formas de transmisión

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Organ

ismo

s co

ntagio

sos

Organismos ambientales Sandholm, 1995

Prevalencia organismos patógenos en Argentina (MSC)

ORGANISMOS A B C D E F G H I J

S. aureus 54 43,2 21,7 17 25,3 31,5 16,6 21,9 13,9 21,3

S. agalactiae 23,4 13,5 2,7 - 8,8 11,6 5,4 5,8 1,6 4,4

S. uberis 2,8 19,2 5,9 - - - 9,2 - - 0,4

S. dysgalactiae 1,8 5,3 2,2 - 3,6 - - - - 4,4

Strepto. spp. 4,1 1,7 23,4 19,3 5,82 13,3 4,34 6,5 -

Coliformes 2,8 1,6 0,9 - 2,7 3,1 5,9 2 - 2,1

A: Tessi et al. (1979) (Cuenca central santafesina), B: González et al. (1980) (Cuenca de Córdoba), C: Calvinho

et al. (1991a), (Cuenca Central Santafesina), D: Giraudo et al. (1995) (Cuenca de Córdoba), E: Chertcoff et al.

(1996) (varias cuencas); F: Tirante et al. (1998) (varias cuencas); G: Acuña et al. (2001) (varias cuencas); H:

Chaves et al. (2001) (varias cuencas); I: Amand de Mendieta et al. (2001) (Cuenca Mar y Sierras); J: Dieser et al.

(2014) (Cuenca Villa María)

Prevalencia organismos patógenos en Argentina (MC)

ORGANISMOS A

(n=278)

B

(n=342)

C

(n=238)

D

(n=1458)

E

(n=2138)

F

(n=310)

G

(n=585)

S. aureus 34,45% 18,1% 30,5% 29,2% 23,24 6,45 10,25

SCN 2,1% - 19,4% 12,7% 17,96 12,26 18,46

S. agalactiae 13% 36,5% 7,7,% 3,9% 1,49 - -

S. uberis 11% - 10% - 27,5 32,9 44,78

S. dysgalactiae 1,7% - 19,8% 15,9% - - -

Streptococcus spp. - 6,4% 1,4% 19,8% 13,23 18,06 6,49

Coliformes 20% 2,6% 7,1% 4,4% 11,4 24,51 7,52

Otros 17,75 36,4 4,1 14,1 5,18 5,82 12,5 A: González & Echaide (1983) (Valle de Lerma, Salta); B: Rivero et al. (1984) (Cuenca Abasto a Buenos Aires); C: Calvinho et al. (1991b), (Cuenca Central Santafesina); D: Chertcoff et al. (2001) (Buenos Aires), E: Izak et al. (2007) (Varias cuencas), F: Izak & Ackerman (2010) (Varias cuencas), G: Rodriguez et al. (2015) (Oeste Buenos Aires)

Programa de 10 puntos (NMC)

• Establecer objetivos

• Mantener ambiente limpio

y seco

• Adecuada rutina de ordeño

• Llevar registros

• Manejo adecuado mastitis

clínicas

• Manejo adecuado vaca

seca

• Bioseguridad patógenos

contagiosos

• Monitoreo salud mamaria

• Revisión periódica

programa control

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Definición IIM y mastitis

Infección

intramamaria

Mastitis

Federación

Internacional de

Lechería (FIL)

Infección en tejido

secretorio y/o ductos y

túbulos de GM

Inflamación de uno o

más cuartos de GM,

causada casi siempre

por microorganismos

Diagnosticada por: Cultivo bacteriológico

de muestras obtenidas

asépticamente

Subclínica: indicadores

de inflamación en

muestras de leche

(RCS o CMT)

Clínica: observación

visual de leche y/o

examen físico de GM 10

Cultivo bacteriológico

A nivel de cuarto, vaca o rodeo (tanque)

Información para: diagnóstico inicial, optimizar

estrategias de control, optimizar tratamientos

antibióticos, detectar reservorios

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Conocimiento del agente causal

Distintas características

patológicas y

epidemiológicas

Distintas estrategias y

programas de control

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Cultivo de leche de vaca

Mastitis clínicas: cuartos mamarios

Información histórica sobre evolución patógenos

Selección de cuartos por CMT ó RCS: aumenta

posibilidad aislamiento (cocos ambientales y S. aureus)

Programas especiales: segregación en control S. aureus,

terapia blitz Str. agalactiae

¿Cuándo es necesario? ¿Para qué?

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Procedimientos básicos del cultivo

Incubación en

ambiente aerobio

Medio de

aislamiento

primario: agar

sangre

Siembra de un

inóculo (muestra)

Identificación de organismos

Nivel mínimo de identificación

Streptococcus

Diferenciar Str. agalactiae de otros Streptococcus

Las otras especies pueden indicarse como: Streptococcus no agalactiae

Nivel mínimo de identificación

Staphylococcus

Diferenciar Staphylococcus coagulasa pos de neg

Aproximadamente el 95% de coagulasa + son S. aureus

Prueba de clumping factor Coagulasa en tubo

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Staphylococcus coagulasa negativos

Varias

especies (>40)

Colonizadores

residentes de piel de

glándula mamaria

Daño menor o

leve al tejido

mamario

Posible

permanencia en

tejido y

disminución de

producción láctea

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Coliformes

Corta duración (más del 50% menores a 10 días)

80-90% IIM en lactancia dan signos clínicos

Desde casos leves a sistémicos

Alrededor de 10% de casos clínicos resultan en peragudas (periparto) Bannerman et al (2004)

Nivel mínimo de identificación

Coliformes y otros Gram negativos

Morfología colonial y pruebas bioquímicas básicas

Es factible llegar a nivel de Género en laboratorio de rutina

Colonias en agar sangre Medio TSI

Diagnóstico bacteriológico de rutina

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También detecta

organismos ante

los cuales no se

recomienda

administración de

terapia antibiótica

o requieren

terapia no usual

Prototheca, Nocardia,

Trueperella

Bacillus cereus

Levaduras

Prototheca

Algas aclorofílicas causantes de

mastitis subclínica, clínica (aguda o

crónica)

P. zopfii y P. wickerhamii

Fuentes: suelo, plantas, aguas estancadas, corrales de espera,

heces bovinas y porcinas Diseminación: higiene pobre,

transferencia de vaca a vaca en ordeño

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Bacillus cereus

Puede causar mastitis aguda, a veces gangrenosa (Penicilina resistente)

Fuentes: suelo, agua, polvo, aire, materia fecal, vegetación, silos en mal estado, heridas,

abscesos, prácticas poco higiénicas

Bacillus cereus

Leche compuesta vs. Leche de cuartos (Reyher & Dohoo, 2011)

• Se para S. aureus y S. dysgalactiae fue de 77,1%

y 73,4% respectivamente

• Se S. uberis 62,1%

• La especificidad para patógenos mayores y

menores superó el 95%

Limitantes

23

10 – 40% muestras MC sin desarrollo

Nº organismos debajo límite

detección

Organismos no cultivables en medios estándar

(Mycoplasma)

TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO DE MASTITIS CLÍNICAS

Coliformes vs S. aureus

Bannerman et al., 2004

Vacas promediando lactancia.

Diagnóstico bacteriológico de

coliformes no siempre eficaz

Casos leves: beneficio de

uso de ATM discutido

¿Cepas crónicas?

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Limitantes

Infecciones subclínicas sin

desarrollo

Infecciones latentes

Ciclos de eliminación de patógenos

¿Es posible incrementar la recuperación de patógenos?

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Preincubación

Mayor inóculo (0.05-0.1 mL)

Congelado-preincubación

¡¡¡Posible contaminación!!!

$$$

S. aureus

Cultivo en tambo

Guía para elegir tratamiento

Fincas con alto número

casos clínicos

27 LDS (2008)

Patógenos más frecuentes

Costo beneficio positivo

Requiere entrenamiento

Métodos moleculares

Principio de reacción en cadena de la polimerasa

(PCR)

Costoso PCR separada para cada agente

Multiplex PCR (Phuektes et al.,

2003; Bottero et al., 2004)

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PCR en tiempo real

Disponible comercialmente

Resultados en pocas hs

11 patógenos de mastitis y gen de β-

lactamasa

Muestras con conservante (control

lechero) 29

PCR en tiempo real

30

Alta sensibilidad (100%) y especificidad (99%)

Mayor inversión inicial

Alto costo por muestra

Pruebas de susceptibilidad a atb (PSA)

31

PSA: desarrolladas con

objetivo terapéutico

Procedimientos

estandarizados

(CLSI u otros):

antibiograma y CIM

Escasa información

sobre criterios

interpretación

antibiograma en MV

Predecir

eficacia de

curación

¿Qué es la CIM?

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La Concentración Inhibitoria Mínima es la mínima

concentración de ATB que es capaz de inhibir in

vitro el crecimiento bacteriano en un período

determinado de tiempo

CIM90 y CIM50

Diluciones seriales

Desarrollo Sin desarrollo

Inoculación desde

CIM

a medio sin atb

CIM

CBM

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Criterios de interpretación del antibiograma

¿Cómo se establecen?

CIM de colección de cepas y datos de farmacocinética del antibiótico: selección de un

punto de corte inicial de CIM

Parámetro final: respuesta clínica con dosis aprobada (eficacia >

85%)

¿Qué criterios de interpretación usamos para patógenos de mastitis?

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GRUPO A: pirlimicina, penicilina+novobiocina y ceftiofur (datos

PSA de patógenos de mastitis y datos cinéticos obtenidos por

infusión intramamaria)

GRUPO B: ampicilina, cefalotina, cloxacilina, eritromicina,

penicilina y tetraciclina basados en criterios de interpretación

para seres humanos

Thornsberry et al (1997)

Falsos resistentes

Russi et al. (2015)

¿Hay relación entre PSA y respuesta a la terapia?

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Mayores tasas de curación

con beta lactámicos en IIM

clínicas y subclínicas por S.

aureus Pen sensibles (Ziv &

Storper, 1985; Pyörala &

Pyörala, 1998)

Falta de asociación

entre curación y PSA

frente a Streptococcus

ambientales (Catell et

al., 2001; Constable &

Morin, 2002)

Buena predicción en casos por S.

aureus y Streptococcus, pero

disminuye en casos crónicos por

S. aureus (Owens et al., 1997)

Valor del antibiograma

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Susceptibilidad in

vitro no garantiza

eficacia in vivo

(Hoe & Ruegg, 2005)

La resistencia a

antibióticos no se

considera un

problema mayor

Hay menores tasas

de curación en S.

aureus penicilino-

resistentes

Alrededor de un 50%

de los aislamientos de

S. aureus de Argentina

son penicilino-

resistentes (Gentilini

et al., 2000; Russi et

al., 2008)

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Patrones de susceptibilidad a atm

• Útiles para monitorear cambios temporales

• Uso de resultados de PSA dilución en caldo o

agar (CIM) o difusión en agar (“antibiograma”)

• Análisis para detectar emergencia de resistencia

37

Estudios sobre tendencias

38 Oliver & Murinda, 2012

Estudios sobre tendencias

39

Oliver & Murinda, 2012

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Conclusiones

El cultivo de leche de vaca brinda importante

información para establecer y monitorear programas

de control, así como para seleccionar los antibióticos

más adecuados

El antibiograma es un recurso con limitaciones para

predecir eficacia de curación, aunque puede brindar

información de utilidad para la elección del

antibiótico

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