manual de prácticas de laboratorio
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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
LICENCIATURA EN NUTRICIÓN
Campus Marina Cuitláhuac
Materia: Biología Celular y Genética
Elaboró: Mtro. Gustavo Limón Camacho
Ciencias de la Salud
Primer cuatrimestre
2
LICENCIATURA EN NUTRICIÓN
BIOLOGIA CELULAR Y GENÉTICA 1° cuatrimestre
Índice Página
OBJETIVO……………………………………………………………………………………………………..………..…………………… 3
PRÁCTICA 1. USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y PREPARACIÓN DE TINCIÓN SIMPLE …………………………… 4
PRÁCTICA 2. BIOMEMBRANAS ……………………………………………………………………………………………………..10
PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN DE ADN …………………………………………………………………………………………….…14
PRÁCTICA 4. OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS ……………………………………………………………………………...19
Fecha de elaboración: Septiembre 2011
Fecha de revisión: Junio 2012
Responsable: Dra. Paola Bernal Rosales
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Objetivo Objetivo general del curso. Al finalizar el curso el alumno será capaz de:
• Describir la estructura y función básica de los componentes celulares, así como los mecanismos de crecimiento, duplicación y control celular.
• Identificar los mecanismos de desarrollo de patologías y enfermedades hereditarias, así como analizar las alternativas y probables consecuencias de la intervención génica en enfermedades.
A continuación se mencionan las prácticas de la materia, señalando tiempo invertido por cada una y tiempo sugerido para llevarse a cabo.
A continuación se detalla el nombre de la práctica y sugerencia de semana de aplicación:
Práctica Semana de aplicación
1. Uso del microscopio óptico y preparación de tinción simple A partir de semana 3
2. Biomembranas A partir de semana 5
3. Extracción de ADN A partir de semana 9
4. Observación de cromosomas A partir de semana 11
Es obligatorio el uso de bata
LABORATORIO DE
BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
Práctica No. 1
Uso del microscopio óptico y
preparación de tinción simple
Preparado por:
Prof. Gustavo Limón C.
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INTRODUCCIÓN
La observación microscópica de especímenes biológicos constituye
una de las herramientas más poderosas en las ciencias biológicas.
Desde sus orígenes, la microscopía ha aportado innumerables detalles
sobre la estructura de virus, células y tejidos. Estas observaciones han
sido importantes no sólo para conocer detalles morfológicos de los
organismos, sino que revelan datos importantes sobre localización y
tránsito de moléculas en el contexto celular y han permitido por tanto
estudiar los cambios morfológicos que una célula experimenta durante
su diferenciación y en estadios anormales tales como anomalías
genéticas, infecciones, cáncer, respuestas ante estímulos del medio
ambiente como presión osmótica, pH, temperatura, etc.
Existen distintos tipos de microscopio (óptico, confocal, electrónico, a
efecto de tunel, etc.) y cada uno ofrece distinto poder de resolución
según sea le material por observar.
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• Identificar las distintas partes del microscopio óptico.
• Manejar el microscopio óptico para observaciones en campo seco
e inmersión.
• Preparar tinciones simples en células eucariónticas y
procariónticas.
• Distinguir diferencias morfológicas entre eucariontes y
procariontes.
Objetivos de aprendizaje
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
Materiales provistos por el laboratorio
• 1 microscopio óptico.
• 1 portaobjetos.
• 1 cubreobjetos.
• 1 asa bacteriológica.
• 1 mechero con manguera.
• 2 laminillas con preparación histológica.
• Cultivo bacteriológico en agar.
• Etanol-éter para limpieza de objetivos.
• Solución de azul de metileno.
• 1 gotero con agua destilada.
• Aceite de inmersión.
• Papel para limpieza de objetivos.
Fuente de la imagen: http://www.onepoint.es/los_seres_vivos/ud1/photos/img_12.jpg
Anatomía del microscopio óptico
Descripción de las partes de un microscopio óptico
I. Sistema óptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del
objetivo.
Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplia la imagen de
dicha preparación.
Condensador: Lente que concentra los rayos de luz sobre la preparación.
Foco o fuente de luz: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador
I. Sistema mecánico
Soporte: Mantiene la parte óptica y consta de pie o base y el brazo.
Platina: Lugar donde se coloca la preparación.
Revólver: Contiene los objetivos que son intercambiables.
Tornillos macro y micrométrico: Permiten acercar la platina para variar
la distancia de los lentes respecto a la muestra.
Manejo del microscopio óptico
1. Manejarlo siempre de forma vertical sosteniéndolo con una mano bajo
el pie del microscopio y con otra mano sujetando el brazo.
2. Transportarlo y colocarlo con cuidado sobre la mesa sin arrastrarlo,
golpearlo o inclinarlo.
3. Antes y después de su uso, limpiar los objetivos con papel fotográfico
humedecido con una mezcla de alcohol-éter.
4. Una vez que la muestra se coloca sobre la patina, girar el tornillo
macrométrico para acercarla hacia el objetivo. Realizar esta operación
observando de frente al microscopio para evitar que la muestra toque el
objetivo.
5. Observando a través de los oculares, girar el tornillo micrométrico
hasta lograr una imagen nítida.
6. Para observación en el rango de micras, las muestras requieren
observarse con un objetivo de 100x, el cual requiere de aceite de
inmersión: Preparar la muestra sobre el portaobjetos, colocar un
cubreobjetos sobre el espécimen y a continuación una gota de aceite de
inmersión sobre el cubreobjetos. Proseguir como en el punto 5 pero
esta vez asegurándose de que la gota de inmersión entre en contacto
con el objetivo. A partir de este momento se enfoca la imagen con el
tornillo micrométrico.
1. Colocar una gota de agua sobre un cubreobjetos limpio. Flamear el asa
bacteriológica, dejar enfriar y tomar con ella una pequeña porción del cultivo
bacteriano extendiéndolo sobre la gota de agua en el portaobjetos.
2. Fijar la muestra pasando rápidamente la parte inferior del portaobjetos sobre la
flama. Verificar que la temperatura no sea excesiva colocando la preparación
sobre el dorso de la mano. Si se siente muy caliente, es posible que las células se
hayan dañad, en cuyo caso se debe repetir el paso 1.
3. Colocar una gota de solución de azul de metileno sobre las bacterias fijadas en
el portaobjetos y enjuagar con agua destilada vertiéndola gota a gota con el
portaobjetos inclinado (no verter el agua directamente sobre la muestra).
4. Colocar un portaobjeto sobre la muestra y una gota de aceite de inmersión sobre
el cubreobjetos.
5. Observar el especimen con el objetivo de 100x y dibujar lo observado.
I. Preparación de célula procarióntica
1. Observar las preparaciones de corte histológico en objetivo de 75x y 100x
(inmersión). Dibujar lo observado y comparar los tamaños de células
procariónticas vs eucariónticas.
II. Observación de especímen eucarióntico.
PROCEDIMIENTO
Cuestionario para el
reporte
1. ¿Cuál es el rango de tamaño de las bacterias y en qué
unidades se miden?
2. Defina los conceptos: unicelular, pluricelular y
multicelular.
3. Porqué las muestras para microscopía óptica requieren
ser muy pequeñas o bien cortarse en secciones muy
delgadas?
4. ¿Cuál es el tamaño mínimo de especímenes que pueden
observarse con un microscopio óptico y cuál para un
microscopio electrónico?
5. ¿Cómo se define el poder de resolución de un
microscopio?
LABORATORIO DE
BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
Práctica No. 2
Biomembranas
Preparado por:
Prof. Gustavo Limón C.
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INTRODUCCIÓN
Las biomembranas, o membranas biológicas, son estructuras
compuestas esencialmente de fosfolípidos dispuestos en doble capa,
con los extremos hidrofílicos orientados hacia el citoplasma y el
exterior de la célula.
Adicionalmente a los lípidos, las biomembranas tienen incrustadas
numerosas moléculas de proteínas, carbohidratos y glicoproteínas,
entre otras. Todos estos compuestos juegan un papel esencial en la
función principal de la biomembrana que es contener y permitir el paso
selectivo de materiales hacia y desde el citoplasma mediante
mecanismos como la difusión y el transporte activo, regulando con ello
el flujo de nutrimentos, agua, electrolitos, hormonas y un sinfín de
compuestos que determinan el estado fisiológico de la célula.
El estudio de las biomembranas reviste gran importancia dado que
constituyen el límite entre la célula y su entorno y, en el caso de los
eucariontes, forman también el límite entre los organelos y el citosol.
• Comprender de forma práctica el concepto de permeabilidad de
membrana.
• Identificar las condiciones osmóticas ideales que permiten a una
célula mantener su turgencia.
Objetivos de aprendizaje
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Materiales provistos por el laboratorio
• 1 tramo de bolsa de diálisis (5 cms).
• Solución acuosa de almidón al 2% p/v.
• 2 clips de mariposa pequeños.
• 75 ml Solución de Iodo al 0.5%
• 1 vaso de precipitados de 100 ml.
• 1 lanceta estéril para toma de sangre.
• Algodón y etanol para desinfección.
• 1 microscopio óptico.
• 2 portaobjetos.
• 4 cubreobjetos.
• Solución de NaCl al 0.85% P/V.
• Solución de NaCl al 3.0% P/V.
• Agua destilada.
1. Cerrar un extremo de la bolsa de diálisis con un clip y llenarla con la solución
de almidón a ¾ de su capacidad. Eliminar el aire empujando con los dedos el
extremo abierto y cerrar la bolsa con el segundo clip.
2. Enjuagar muy bien el exterior de la bolsa con agua destilada y secar sobre toalla
de papel.
3. Colocar la bolsa de diálisis dentro de la solución de Iodo en el vaso de
precipitados.
4. Después de 30 minutos, retirar la bolsa de diálisis, enjuagar y secar sobre papel.
Anotar el color del almidón y de la solución de Iodo y explicar en el reporte las
razones de los cambios que ocurran en la solución de iodo y de almidón.
I. Estudio de permeabilidad
PROCEDIMIENTO
1. Limpiar bien los portaobjetos con alcohol y etiquetarlos comose indica:
1er portaobjetos: Control negativo y agua destilada.
2º portaobjetos: NaCl al 3.0% y NaCl al 0.75%
II. Estudio de presión osmótica.
2. Colocar en cada portaobjeto las soluciones respectivas en forma de gotas
separadas (el control no llevará ninguna solución).
4. Colocar una gota de sangre en cada portaobjetos al lado de la solución
respectiva (control, agua, NaCl al 3% o NaCl al 0.75%)
3. Desinfectar la yema del dedo de uno de los integrantes del equipo con un
algodón impregnado de alcohol y obtener sangre con la ayuda de la lanceta estéril
5. Mezclar la sangre con cada solución, cubrir con un portaobjetos y dejar así
durante 4 minutos. Observar al microscopio en campo 100X (con aceite de
inmersión). Dibujar lo observado y explicar las diferencias en función de la
solución a la que fueron expuestas las células sanguíneas.
Cuestionario para el
reporte
1. ¿Cómo se define una célula turgente y una célula plasmolizada?
2. ¿Porqué a la solución de NaCl se le llama también “solución salina
fisiológica?
3. ¿Cuál es la diferencia entre permeabilidad y permeabilidad
selectiva?
4. ¿Porqué se dice que las biomembranas son estructuras dinámicas y
qué papel juega el colesterol en las membranas de células animales?
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LABORATORIO DE
BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
Práctica No. 3
Extracción de ADN
Preparado por:
Prof. Gustavo Limón C.
INTRODUCCIÓN
Existen muchas técnicas que permiten aislar al ADN a partir de
células eucariónticas y procariónticas. Las variaciones de dichas
técnicas se realizan en función del ácido nucléico por extraer: ADN
nuclear, mitocondrial o plasmídico, ARN total, mRNA, etc.
Esencialmente, la extracción de ácidos nucleicos inicia con la
desintegración de membranas y otras estructuras como pared celular,
cápsula bacteriana, etc (según sea el organismo en estudio), mediante
detergentes, sales, álcalis y enzimas. A este proceso se le conoce como
lisis celular.
Posteriormente, el homogenizado es filtrado para eliminar restos de
membrana y tejido que no alcanzó a lisarse.
Finalmente, los ácidos nucleicos pueden purificarse mediante solventes
orgánicos, esferas magnéticas o simplemente por precipitación con
etanol frío.
En esta práctica realizaremos un protocolo sencillo para extraer ADN
nuclear a partir de fresas empleando sal, detergente y etanol.
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• Conocer los principios de la extracción físico-química de ácidos
nucleicos a partir de células eucariónticas.
• Identificar el papel de los detergentes y sales iónicas en la
disrupción de biomembranas con el fin de obtener ADN como paso
elemental para análisis genómicos y biotecnológicos.
Objetivos de aprendizaje
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
• 1 pipeta graduada de 5ml.
• 5 ml de detergente alcalino.
• ½ cucharadita de sal.
• ½ taza de agua.
• 20 ml de etanol frío (4 C).
• 1 vaso de precipitados de 250 ml.
• 1 varilla de vidrio.
• Papel negro (10x10 cms).
Materiales provistos por el
laboratorio
• 3 fresas.
• 1 bolsa tipo “ziplock”
• 1 filtro para café.
• Papel negro (10x10 cms).
Materiales provistos por el alumno
PROCEDIMIENTO
1. Macerar tres fresas en una bolsa ziplock durante dos minutos.
2. Preparar la solución de lisis con 1/2 taza de agua , 5 ml de
detergente alcalino y 1/2 cdita. de sal.
3. Añadir la solución de lisis al puré de fresas, homogenizar con
las manos y dejar reposar por 2 minutos.
4. Filtrar el homogenizado por papel filtro para café sobre el vaso
de precipitados. Descartar lo que queda en el filtro.
5. Añadir al lisado lentamente y en ángulo de 45 , 20 ml de etanol
frío (a 4 C).
6. Dejar reposar por 5 minutos. El ADN precipita con el etanol
formando filamentos blancos mucosos.
7. Retirar el ADN de la interfase (zona entre el lisado y el etanol)
con una varilla de vidrio y pasarlo al papel negro.
8. Tomar una fotografía del ADN extraído e incluirla en el reporte.
Cuestionario
para el
reporte
1. ¿Qué papel desempeñan la sal y el detergente en la
extracción del ADN?
2. ¿Cuántas copias del genoma contiene la fresa (diploide,
triploide, etc)?
3. ¿Porqué el ADN precipita con el etanol? Explíquelo en
términos químicos.
4. Mencione otros dos procedimientos para extraer ADN.
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LABORATORIO DE
BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA
Práctica No. 4
Observación de Cromosomas
Preparado por:
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INTRODUCCIÓN
Los cromosomas son estructuras de Ácido Desoxirribonucléico de
doble cadena y constituyen el elemento principal del genoma de un
organismo (los plásmidos son también parte del genoma pero de forma
circular y más pequeños en longitud).
Los cromosomas procariónticos son circulares y su longitud es de
algunos millares de pares de bases, mientras que los cromosomas
eucariónticos son moléculas abiertas y contienen millones de pares de
bases y requieren estructurarse en forma de nucleosomas y bucles para
evitar que el ADN se dañe y también como mecanismo de regulación
génica, silenciando así genes que no requieren expresarse en un
momento dado.
Adicionalmente al ADN, los cromosomas y proteínas que se asocian
por sus cargas positivas al ADN (de carga negativa). Dichas proteínas
varían en tipo y número según se trate de cromosomas procariónticos o
eucariónticos.
Para visualizar los cromosomas, se prefiere estudiarlos en fase mitótica
ya que es cuando se hallan replicados presentando al menos dos
cromátidas según sea la ploidía de la célula estudiada.
• Preparar células eucariónticas a partir de tejido vegetal para
observación de distintas fases del ciclo celular.
• Realizar tinción histológica para identificación de cromosomas en
fase mitótica.
Objetivos de aprendizaje
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
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Materiales provistos por el laboratorio
• 1 microscopio óptico.
• 3 portaobjetos.
• 1 cubreobjetos.
• 1 pinzas.
• 1 navaja de disección.
• HCl 1N.
• 1 tubo de ensayo pequeño.
• Pinzas para tubo de ensayo.
• Vaso de precipitados de 100 ml.
• Mechero con manguera.
• Soporte para vaso de precipitado.
• Agua destilada en gotero.
• Solución de Feulgen comercial o preparada en
laboratorio (ver fórmula y preparación en el apéndice.
1. Con ayuda de las pinzas y la navaja, cortar la punta de dos germinados de soya
( Aprox. 1 cm).
2. Colocar los cortes en un tubo de ensayo pequeño y añadir HCl 1N hasta
cubrirlos. Llevar a baño de agua durante 12 minutos
3. Remover los cortes de germinado y con las pinzas transferirlos cuidadosamente
a un portaobjetos y enjuagar 3 veces con agua destilada gota a gota..
4. Añadir a cada germinado una gota de tinción de Feulgen e incubar a
temperatura ambiente durante 12 minutos. Las puntas del germinado pueden
tornarse rojas por la incorporación del colorante a los cromosomas.
PROCEDIMIENTO
Materiales provistos por el alumno
• 3 brotes de germinado de soya
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5. Enjuagar los brotes 3-4 veces cuidadosamente con agua destilada gota a gota.
6. Transferir 2 brotes a otro portaobjetos limpio (un brote por portaobjeto) y con
la navaja cortar la parte no teñida y descartarla.
8. Observar al microscopio iniciando con el objetivo 10x hasta el 100x (de
inmersión), dibujando lo observado.
7. Colocar un cubreobjetos sobre el brote y oprimir la muestra suavemente contra
el portaobjetos (NO GIRAR EL CUBREOBJETOS).
Cuestionario para el
reporte
1. Explique en términos químicos porqué los cromosomas fijan a la
Fuschina básica que es el colorante de la solución de Feulgen.
2. ¿Cómo influye el que un cromosoma sea abierto o cerrado en cuanto
a su degradación por nucleasas?
3. Mencione dos agentes (sustancias) que puedan colorear cromosomas,
distintos al empleado en esta práctica.
Fuente: http://www.marietta.edu/~biol/introlab/Onion%20root%20mitosis.pdf
Apéndice
Preparación se la solución de Feulgen
1. Pesar 150 mg de Fuchsina básica y transferir a un vaso de
precipitados de 250ml.
2. Añadir 30 ml de agua hirviente a la Fuchsina y agitar hasta
disolución total.
3. Enfriar a 50 C y filtrar por papel Whatman No. 1.
4. Añadir 4.5 ml de HCl 1N y mezclar bien.
5. Añadir 0.45 g de K2S2O5 (metabisulfito de potasio) a la
solución de Fuchsina-HCl.
6. Dejar la solución en reposo y obscuridad durante 24 hrs.
7. Decantar la solución a un gotero ámbar y mantener en
refrigeración.
Fuente: http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/Root_tip_chromosomes/Feulgen_Stain.htm
Estructura de la Fuchsina básica