lineamientos para la vigilancia por … · de tos ferina el 40 al 80% de los miembros de la familia...

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Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR

LABORATORIO DE

TOS FERINA Y SINDROME COQUELUCHOIDE

InDRE – RNLSP 2012

México, DF.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

SECRETARIA DE SALUD

SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG SECRETARIO DE SALUD

DR. PABLO KURI MORALES

SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN

QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA

QC. ISRAEL PARRA ORTEGA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y

VALIDACIÓN DE PRUEBAS

Q.B.P. MONICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS JEFE DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS

Y PERTUSSIS

Q.B.P. GUADALUPE ADRIANA GALICIA JEFE DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR

M EN C. ILIANA ALEJANDRA CORTÉS ORTIZ JEFA DEL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Contenido

1. Introducción

2. Objetivo General

3. Vigilancia de la Tos ferina y Síndrome coqueluchoide por el laboratorio

4. Situación Actual y organización de la RNLSP para el Diagnóstico de la tos ferina

5. Consideraciones generales para el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina

6. Diagnóstico por laboratorio de la tos ferina

7. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de muestras

clínicas.

8. Nuevo Algoritmo para el Diagnóstico de tos ferina por PCR

9. Análisis de la información

10. Recursos

11. Evaluación del desempeño

12. Colección de cepas

13. Sistema de información

14. Referencias

15. Anexos

1. Introducción

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

La tos ferina es una enfermedad con tasas de morbilidad del 90 al 100% en contactos domésticos

que no han sido vacunados, se presenta en cualquier época del año especialmente en niños, donde

los lactantes menores de un año de edad ocupan el 41% de los casos declarados de tos ferina y el

78% de los fallecimientos debido a esta enfermedad. Entre adolescentes y adultos cercanos a casos

de tos ferina el 40 al 80% de los miembros de la familia desarrollan anticuerpos contra B. pertussis y

estos solo el 50% presentan signos y síntomas compatibles con esta enfermedad. En la actualidad se

acepta que adolescentes y adultos sintomáticos no diagnosticados, representan una fuente de

transmisión a lactantes y niños, así como un mecanismo de perpetuación de la enfermedad en la

población en general.

Por otra parte, en estudios realizados en brotes de tos ferina, sugieren que la inmunidad protectora

inducida por la vacuna tiene una duración determinada, de tal forma que el biológico elaborado con

la bacteria completa solo ofrece protección, aproximadamente durante 12 años, esto hace necesario

que en las zonas endémicas se mantenga una vigilancia epidemiológica permanente.

En México, como producto de la aplicación de la vacuna anti-pertussis, la morbilidad de la tos ferina

ha tenido una baja significativa, así en 1950 la tasa de morbilidad era de 130 por 100,000

habitantes, a 1980 disminuyó a menos de 10 por 100,000 habitantes, sin embargo a partir del año

2008 se ha presentado un notable incremento en el número de casos y en este año se presentaron

162 casos de este padecimiento a nivel nacional con una incidencia global de 0,15 por 100,000

habitantes. Durante el 2009 se confirmaron por laboratorio 185 casos (21%) de 879 estudiados y se

estudiaron un total de 2060 contactos y en 76 (3.8%) se detectó la presencia de Bordetella pertussis

y en 2010 se estudiaron un total de 722 casos de los cuales 46 (6.37%) fueron confirmados por el

laboratorio como positivos, de ahí la importancia de la búsqueda de portadores que son los que

favorecen la transmisión de esta enfermedad, a pesar de existir, la prevención a través de la

vacunación.

2. Objetivo general

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Establecer las directrices para realizar el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina y el Síndrome

coqueluchoide a través de la RNLESP de forma estandarizada, estableciendo los flujos de

información adecuados de los datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia

epidemiológica.

3. Vigilancia de la Tos ferina.

La Vigilancia Epidemiológica de la tos ferina y el Síndrome coqueluchoide consiste en producir y

difundir la información generada en el laboratorio, que contribuya a la prevención y control de estos

padecimientos; mediante el estudio y confirmación de casos probables o sospechosos así como el

de sus contactos intradomiciliarios,

El principal objetivo es caracterizar la etiología del síndrome coqueluchoide bacteriana y determinar

la frecuencia con que se presenta Bordetella pertussis y B. parapertusis, como agentes etiológicos

de este síndrome, y que al encontrar la presencia de estas bacterias deja de llamarse como tal y se

confirma como Tos ferina.

Las actividades a realizar para esta vigilancia son las siguientes:

Análisis de las muestras de exudado nasofaríngeo para la búsqueda de Bordetella

pertussis y B. parapertussis.

( anexo 1).

Envío del 100% de los aislamientos de Bordetella pertussis , B. parapertussis, u otras

especies de Bordetella spp, que se aíslen de los casos y sus contactos, al Instituto de

Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos que provienen de los diferentes niveles de salud

y de todas las Instituciones que forman parte del sistema Nacional de salud.

Envío del 100% de muestras positivas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras

especies de Bordetella spp por PCR Tiempo Real (TR) o PCR Punto final (PF) de casos

de Tos ferina y sus contactos para control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas

del InDRE

Envío del 10% de muestras negativas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras

especies de Bordetella spp, por PCR TR o PCR PF de casos con Sx coqueluchoide para

control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas del InDRE.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Informe de los resultados al epidemiólogo de la unidad solicitante del estudio

(dependiendo del nivel).

4. Situación Actual y organización de la RNLSP para el Diagnóstico de Tos ferina

La Red para el diagnóstico de tos ferina está formada por 26 laboratorios: Aguascalientes, Baja

California, Baja California sur, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Edo de México, Guanajuato,

Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo león, Oaxaca, Puebla, Querétaro,

Quintana roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas, los

cuales declaran en su marco analítico que realizan el cultivo para Bordetella pertussis y otras

especies, la mayoría de los LESP (83.8%) ya realizan este diagnóstico sin embargo, es necesario que

el 100% de los laboratorios participen en esta Red para fortalecer la vigilancia epidemiológica

continua de la tos ferina a nivel Nacional.

Los 26 laboratorios que pertenecen a la Red de Tos ferina realizan solamente la técnica de

aislamiento por cultivo e identificación bioquímica.

Los LESP de los estados de Campeche, Colima, Durango, Tamaulipas y Yucatán no están

incorporados a la Red.

Analizando la participación de estos 26 LESP, en el Programa Caminando a la Excelencia, que nos

permite evaluar el desempeño de los estados en relación a los programas prioritarios en salud; en los

últimos tres años tenemos que, de los 26 laboratorios que realizan el diagnóstico de Tos ferina,

específicamente en el indicador de Concordancia del Boletín Caminando a la Excelencia solo 10 de

26 laboratorios (38.46%) envían cepas para control de calidad de Bordetella pertussis y desde esta

perspectiva es difícil comparar la concordancia obtenida en las cepas enviadas para confirmar al

InDRE (control de calidad indirecto) y la concordancia obtenida en el panel de eficiencia, dado que la

mayoría de los participantes a pesar de tener muy buena correlación en el panel de eficiencia, no

envían cepas para el control de calidad, esto habla de que los laboratorios si tienen la infraestructura

suficiente, tanto en recursos humanos y materiales para llevar a cabo con calidad este diagnóstico,

sin embargo por la complejidad en el manejo de estos microorganismos “fastidiosos” y por el costo

que esto representa, aunado a la baja demanda de éste diagnóstico en los estados, se dificulta aún

más su implementación.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) para el Diagnóstico de tos ferina

La red la integran 26 Laboratorios

Faltan de integrarse a la red de tos ferina

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InDRE

5. Consideraciones generales para el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina

El diagnóstico en el laboratorio se basa en métodos directos e indirectos. El diagnóstico directo

consiste en identificar a B. pertussis, B. parapertussis, u otras especies de Bordetella spp por cultivo

o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El diagnóstico indirecto esencialmente es por serología y consiste en detectar anticuerpos específicos

contra los componentes de la bacteria de un paciente infectado.

El cultivo es considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el estándar de oro

para la confirmación de casos por laboratorio. Sin embargo este método es poco sensible desde el

punto de vista de recuperación del microorganismo que no va más allá del 60%. Se ha reportado que

la mayor recuperación se da en infantes y niños no vacunados. El éxito del cultivo que es un

diagnóstico más específico se basa en la oportunidad de la toma de la muestra, que debe ser dentro

de las dos a tres primeras semanas de iniciada la tos. La PCR es más sensible que el cultivo

bacteriano y ofrece resultados en menor tiempo, sin embargo es importante seguir realizando el

cultivo, para analizar la evolución de este patógeno y vigilar eventuales variantes que puedan ser

antigénicamente diferentes a las cepas vacunales. Las tinciones de inmunofluorescencia directa con

anticuerpos específicos a partir de secreciones nasofaríngeas no es recomendada por la alta

frecuencia de resultados falsos positivos y negativos.

El diagnóstico indirecto (serología) consiste en la detección de anticuerpos específicos en el suero de

individuos infectados y por mucho tiempo se había requerido de una muestra inicial en la fase aguda

de la enfermedad y de una segunda muestra en la fase de convalecencia. Sin embargo hoy en día

existen diferentes inmuno ensayos dirigidos contra diferentes factores de virulencia de B. pertussis

entre ellos están la Hemagluitinina filamentosa, la pertactina, y la toxina Pertussis, este último

antígeno ,ha demostrado en diferentes investigaciones realizadas por el CDC de Atlanta, ser el

inmunógeno más sensible y específico comparado con los otros factores de virulencia de B. pertussis

La presencia de altos niveles de anticuerpos IgG anti-toxina pertussis en el suero de pacientes no

vacunados indica infección.

Inicialmente las pruebas serológicas para la tos ferina fueron diseñadas para la evaluación de la

respuesta de anticuerpos contra diferentes componentes de las vacunas, pero actualmente estos

inmunoenyayos son de gran utilidad para confirmar el diagnóstico de tos ferina, especialmente

cuando los resultados de PCR y /o cultivos no son determinantes para el diagnóstico, sobre todo

cuando se da tratamiento con antibióticos previo a la toma de la muestra situación que impacta

directamente la recuperación de B. pertussis por cultivo , por esta razón la serología puede ser

empleada como una herramienta diagnóstica en individuos incluso que tienen como antecedente

haber recibido vacunación reciente, un año previo, debido a que la cantidad de IgG en contra de la

toxina pertussis tiene un patrón único alcanzando su máximo nivel rápidamente justo a las dos

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

semanas de iniciada la tos y luego decae, por lo tanto se puede dar un diagnóstico de una infección

reciente siempre y cuando la toma de la muestra se realice en el momento oportuno.

Sin embargo existen grupos de edad más vulnerables menores de dos meses en donde la serología

no es ampliamente recomendable por su sensibilidad en infantes, debido a que su sistema inmune

es inmaduro y existe la interferencia de anticuerpos maternos adquiridos vía transplacentaria..

El criterio para la elección de la técnica diagnóstica dependerá la evolución de la enfermedad, de la

edad del paciente y de su estado inmunológico: de tal forma que en

menores de 2 meses: Se recomienda más el cultivo y el PCR .

En niños ≥ de 2 meses: Se debe hacer Cultivo y/o PCR en niños con o sin vacunación reciente, pero

la toma debe ser dentro los primeros días de iniciada la tos.

Adultos: el cultivo se recomienda si la muestra es tomada en la fase catarral o hasta la primera

semana de la fase paroxística; el PCR y la Serología se recomienda para aquellos pacientes que se

encuentran ya en fases tardías de la enfermedad.

6. Diagnóstico por laboratorio de la tos ferina

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Para la toma de muestras es importante considerar las definiciones operacionales de caso

probable, caso sospechoso y portador asintomático ( Anexo 4 ),

La obtención de las muestras se hará en todos aquellos pacientes con evidencia clínica de Tos

ferina en el laboratorio de la unidad hospitalaria, centro de salud o jurisdicción correspondiente. Las

muestras deben ser tomadas durante el episodio agudo de la enfermedad a fin de tener la mayor

posibilidad de aislamiento del agente etiológico.

El laboratorio del hospital, del centro de salud o jurisdiccional procesará las muestras clínicas y todos

los aislamientos presuntivos de Bordetella spp y los remitirá al Laboratorio Estatal de Salud Pública.

Solo en caso de que el hospital no cuente con laboratorio o recursos para procesar las muestras

clínicas, deberá tomar las muestras y enviarlas al Laboratorio Estatal de Salud Pública.

Los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) recibirán las muestras clínicas o los aislamientos

sugestivos de Bordetella pertussis o Bordetella spp procedentes de las unidades hospitalarias a fin

de que se realice el diagnóstico o se confirmen las cepas. Los LESP se encargaran de transportar las

cepas confirmadas como positivas (en medio de transporte de AMIES con carbón) al Instituto de

Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) con la información solicitada (formato único de

envío de muestras con los resultados obtenidos y formato acional de estudio Epidemiológico de

caso). Los LESP deberán apoyar a los laboratorios de las unidades hospitalarias y jurisdiccionales en

aquellas situaciones en que se requiera y de acuerdo a los recursos disponibles a fin de realizar los

estudios de las muestras y enviará los resultados al laboratorio correspondiente.

El InDRE será el laboratorio responsable de recibir las muestras para diagnóstico de los hospitales

del área metropolitana ó las cepas de Bordetella pertussis o Bordetella spp. procedentes de los

LESP.

En el InDRE se llevará a cabo el estudio de confirmación y enviará los resultados por RED a los

LESP y a la Dirección General Adjunta de Epidemiología.

6.1 Cultivo

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

El aislamiento de Bordetella pertussis por cultivo bacteriano, es la prueba más específica para

confirmar un caso de tos ferina. Todos los pacientes con cultivo positivo a B. pertussis, que

presentan tos con más de 14 días de evolución o inclusive menos, deben reportarse como casos

confirmados.

6.1.2. Recolección y transporte de muestras clínicas.

La recolección y transporte de muestras clínicas es muy importante para el diagnóstico de los

agentes bacterianos causantes de la tos ferina.

Bordetella pertussis y B. parapertussis se adhieren a los cilios del epitelio que recubre la nasofaringe

y estas bacterias pueden aislarse a partir de exudados nasofaríngeos o aspirados nasofaríngeos.

Por la dificultad y el tipo de material para la toma del aspirado nasofaríngeo, en la mayoría de los

casos se prefiere la toma del exudado nasofaríngeo (ExNF).

6.1.3. Toma de exudado nasofaríngeo para cultivo y PCR

Exudado Nasofaríngeo (ExNF)

Esta es la muestra de elección para el estudio de casos probables y sospechosos de tos ferina, así

como de sus contactos para la búsqueda de Bordetella en portadores asíntomáticos; debido a que

esta bacteria se adhiere a los cilios del epitelio del tracto respiratorio superior del hombre.

Se utiliza un hisopo rayón o dacrón con mango flexible (alambre de aluminio o plástico) para no

lastimar al paciente. Si el estudio solicitado es cultivo la toma de la muestra puede ser con hispo de

alginato de calcio, rayón o dacrón.

Para el estudio de PCR la muestra debe ser tomada con hisopo de rayón o dacrón, nunca de

alginato de calcio ya que este inhibe la actividad de la Taq polimerasa y se pueden obtener

resultados falsos negativos.

Si se van a solicitar cultivo y PCR se deben tomar dos muestras, la muestra destinada para cultivo

debe ser depositada en el medio de transporte Regan Lowe y la muestra para PCR en el medio de

transporte solución salina con cefalexina a una concentración final de 40µg/mL, cada tubo debe ser

perfectamente etiquetado con la solicitud del estudio “Para cultivo”, para PCR y las dos muestras

deben transportarse en red fría.

6.1.4. Condiciones para la toma de las muestras

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrás y se introduce el hisopo

de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta

aproximadamente 10cm, cuidando tocar sólo el extremo posterior del mango y evitar tocar los

cornetes. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo, se pide al

paciente que tosa y se retira con cuidado para que no se contamine. (Figura 1)

Depositar la muestra cultivo en el medio de transporte Regan Lowe y cortar con tijeras el excedente

del mango de aluminio que queda fuera del tubo, el mango de aluminio no debe enrrollarse dentro del

tubo para evitar contaminación de la muestra; si la muestra se va a procesar de inmediato dejar los

hisopos en el medio de transporte durante 15 a 30 minutos para inhibir la flora asociada y después

sembrar la muestra por duplicado en Agar Bordet Gengou (ABG) y en Agar Bordet Gengou con

cefalexina o también puede utilizarse Agar charcoal con sangre de carnero al 15% o sangre de

caballo al 10% (Agar Regan Lowe) (ARL) y también se utilizan dos placas una sin antibiótico y otra

con antibiótico e incubar en aerobiosis y en bolsas plásticas las placas sembradas, (para evitar la

desecación del medio de cultivo) a 37°C. Realizando una primera lectura a las 72 horas de

incubación. En caso de que no se pueda inocular inmediatamente la muestra, en los medios de

cultivo para el primoaislamiento; depositarla en el en medio de transporte y trasladarla lo más

pronto posible al laboratorio, en red fría, para que se procese la muestra. Anexo 1

Las muestra destinadas para el PCR debe introducirse en el medio de transporte de solución salina

con cefalexina y transportarse en red fría. El área donde se toman las muestras para el cultivo en el

caso de los centros de salud u hospitales debe ser un área independiente del área en donde se

aplican las vacunas contra la Tos ferina (DPT o la vacuna acelular contra Pertussis)

Figura 1.- Toma de Exudado nasofaríngeo

Fuente: Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-

preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/

7. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de

muestras clínicas.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

La detección específica de los ácidos nucleicos de B. pertussis y B. parapertussis presentes en

muestras clínicas se describió desde 1985, desde entonces se han empleado diferentes iniciadores

para esta detección, hoy en día se emplean diferentes oligonúcleótidos para la detección de este

patógeno que derivan de cuatro regiones cromosómicas del genoma de B. pertussis, estás incluyen

1) la región promotora que codifica para la toxina pertussis (PT), 2) una región upstream del gen

porina, 3) las secuencias de inserción repetitiva IS481 para B.pertussis e IS1001 para B.

parapertussis y 4) la región que codifica para la producción de la toxina adinilato ciclasa (ACT), con

excepción del gen ACT estas sondas son específicas de especie, algunas pruebas de PCR son

específicas para B. pertussis, otras permiten la detección de B. pertussis y B. parapertussis y otras la

detección de estas últimas dos además de B. bronchiséptica, a pesar de esta gran diversidad de

iniciadores disponibles, la sensibilidad reportada para cada una de ellas es similar.

La técnica de la PCR a partir de exudados y aspirados nasofaríngeos es un método alternativo más

sensible y rápido que el cultivo para el diagnóstico de la tos ferina por el laboratorio.

Otras consideraciones importantes son:

a) La PCR ofrece mayor posibilidad que el cultivo y la serología en la detección de infección en

pacientes con sintomatología no definida o en los asintomáticos, incluyendo aquellos individuos

previamente inmunizados, lo que permitirá definir con más claridad la epidemiología de la tos ferina.

b) La PCR permite detectar la infección por B. pertussis inclusive en aquellos individuos que ya

tienen tratamiento antimicrobiano previo.

Diferentes organismos internacionales como la OMS y el CDC recomiendan el empleo de esta

técnica, sin dejar de realizar el cultivo, por qué un aislamiento representa la posibilidad de realizar

pruebas de sensibilidad y la tipificación molecular.

La recomendación internacional es que la PCR no se realice a partir del mismo hisopo, con el que se

realiza el cultivo, esta práctica puede generar resultados falsos positivos, debido a que el hisopo

puede estar expuesto a una contaminación ambiental con el ADN de B. pertussis, que se produce

en la inoculación de los medios de cultivo empleados para el primo aislamiento.

8. Nuevo Algoritmo para el Diagnóstico de tos ferina por PCR en la RNLSP

Numerosos estudios a nivel internacional, han demostrado el gran potencial de ésta técnica molecular

para mejorar la sensibilidad del diagnóstico de la tos ferina, por esta razón, la propuesta de incluir la

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

PCR PF y PCRTR para el diagnóstico de Tos ferina dentro del marco analítico de la RNLESP, está

fundamentada en dos aspectos importantes:

1) Mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio con respecto a los casos probables

2) La necesidad de mejorar el estándar de servicio, disminuyendo el tiempo en la emisión de

resultados, para mejorar la vigilancia epidemiológica basada en la evidencia generada por el

laboratorio, la cual apoyará en la mejor toma de decisiones para el manejo y control de esta

enfermedad.

Actualmente el InDRE cuenta con dos técnicas moleculares las cuales estarán a disposición de la

Red de acuerdo a la disponibilidad de su infraestructura y recursos.

1.- La PCR TR o la PCR PF se debe realizar en todos los casos clínicos que cumplen con la

definición operacional de casos probables o sospechosos de tos ferina y en sus contactos.

La PCR PF utilizada en el InDRE detecta la presencia de un elemento repetidor de 424 pares de

bases (pb) éste, es una región específica repetitiva del genoma de Bordetella pertussis, y se utilizan

los siguientes iniciadores:

Bp168 5’ – GACTTCGTCTTCGTGGCCAT- 3’

Bp169 , 5’ – TCGTCCAGGTTGAGTCTGGA- 3’

El producto esperado es una banda de aproximadamente 424 pares de bases, y solo en las muestras

en la que se detecta esta banda se les realiza el análisis de restricción con la enzima Alu 1.

Esperando la amplificación de dos bandas de 200 y 224 pb.

Las muestras aceptadas para realizar la PCR TR y PF son exudado o aspirado nasofaríngeo, el

medio de transporte debe ser solución salina con cefalexina a una concentración final de 40µg/mL., y

la muestra debe ser tomada con hisopo de rayón o dacrón. (No emplear hisopos de alginato de

calcio debido a que se inhibe la acción de la DNA polimerasa y se pueden obtener resultados

falsos negativos).

2.- El tiempo de transporte no debe exceder más de 3 días.

3.-Las muestras deben ser tomadas de la misma forma en la que se realiza para el cultivo y deben

ser transportadas en red fría. La muestra de exudado nasofaríngeo puede ser almacenada en:

refrigeración por 0 – 7 días, más de 7 días en congelación a -20°C.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Negativo a: B. pertussis

* Muestra clínica (ExNF para el diagnóstico *molecular de Bordetella pertussis

Extracción de ADN( QiaAmp)

Secuencia de inserción repetitiva de Bordetella pertussis.

(primers Bp 168 y Bp 169) producto esperado de aproximádamente 400 pb

Amplificación positiva

Reportar Positivo a B.

pertussis

Análisis de restricción con Enzima Alu1 producto esperado: dos bandas

de aproximadamente 200 y 224 pb

Dx . difer encial con virus respiratorios:

Reportar positivo

Positivo Negativo

Reportar negativo

Reportar negativo

Amplificación del producto esperado

4.- En el laboratorio de IRAs bacterianas se reciben las dos muestras, se les asigna el número

de identificación PR correspondiente, y una se lleva al área de proceso de cultivos y la otra al área de

extracción de DNA.

6.- La extracción se realiza empleando las columnas de QIAamp® DNA Mini and Blood Kit de la

marca QIAGEN.

7.- Una vez realizada la extracción del DNA, es canalizada al laboratorio de Bacteriología molecular,

en donde se hace el corrimiento de la PCR PF y el análisis de restricción correspondiente.

Las muestras que no amplifican se reportan como negativo a Bordetella pertussis.

8.- Las muestras que amplifican un producto de aproximadamente 400pb, son tratadas con la enzima

de restricción Alu 1 y aquellas que amplifican dos bandas de 200 y 224 pb se reportan como

positivas a Bordetella pertussis (Anexo 6)

Las muestras que no amplifican se reportan como negativas a Bordetella pertussis y se sugiere

hacer diagnóstico diferencial para determinar si la etiología es viral.

Algoritmo para el diagnóstico de Tos ferina por PCR punto final

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Existen otras pruebas moleculares como la PCR TR que ofrecen mayores ventajas sobre las pruebas

moleculares convencionales. En cuanto sensibilidad, rapidez y seguridad para el operador.

La PCR TR utilizada en el InDRE es una PCR TR múltiple “multi-target” en donde se utilizan

iniciadores y sondas específicos, trazable al CDC de Atlanta. En esta se emplean dos “targets”:

IS481 y ptX1 que son positivos para B. pertussis. La secuencia IS481 es una secuencia de inserción

que se encuentra en múltiples copias (50 a 238) por cada célula de B. pertussis. El amplicon

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

generado es de 66 pares de bases. El ensayo de ptx1 es específico para una región de

aproximadamente 400 pares de bases que codifica para la subunidad 1 de la toxina pertussis,

conocida como el gen ptxA y genera un amplicón de 55 pares de bases y solo se encuentra una copia

por cada célula de B. pertussis, estas dos targets nos permiten detectar a B. parapertussis como se

muestra en la siguiente tabla:

Criterios de interpretación:

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

*ptxS1 PCR:CT<40 ciclos es considerado como una reacción positiva.

** Requiere confirmación por otras pruebas (cultivo, serología o vinculación epidemiológica)

Algoritmo para el diagnóstico de Tos ferina por PCR TR

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

9. Análisis de la información

Todos los casos se deben de notificar inmediatamente a la DGE (dentro de las primeras 24 horas de

conocido el caso incluso antes de tener resultados de laboratorio), de acuerdo con la NOM-017-

SSA2-1994 y la Ley General de Salud a través del correo electrónico [email protected].

-El correcto y oportuno intercambio de información, es la base de la interacción interna de la RNLSP y a la que debe tener con sus respectivos niveles técnico-administrativos. -Los resultados de laboratorio del InDRE se envían directamente al LESP de la entidad federativa de la que proviene la muestra, la que a su vez es el responsable de hacer llegar el resultado al destinatario final y a la jurisdicción correspondiente. Este mismo procedimiento es aplicable a los resultados de los estudios que realiza cada LESP o laboratorio local.

Muestra clínica

Extracción de ADN, manual o automatizada

PCR en tiempo real “multiplex” Resultado

Reportar negativo

Diagnóstico diferencial con virus respiratorios

Reportar

PCR en tiempo real para toxina “ptx1”

Reportar de acuerdo al criterio de interpretación

Negativo

Positivo

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

-Los resultados producidos a nivel nacional o estatal deben ser enviados por este nivel a su homónimo de las otras instituciones del sector salud.

-En el nivel central la notificación de resultados de laboratorio la realiza el InDRE por vía electrónica al Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica, a la Dirección General de Epidemiología y a la máxima autoridad de salud en cada entidad federativa con la frecuencia establecida para cada padecimiento de las vías respiratorias ya mencionados. -Si las circunstancias lo ameritan, el informe de los resultados de los estudios realizados para el diagnóstico del Síndrome coqueluchoide y la tos ferina en cualquiera de los tres niveles de laboratorios deben ser enviados en forma inmediata y directa al responsable de la solicitud del examen, con el objeto de administrar el tratamiento oportuno y adecuado, llevando a cabo el seguimiento de los contactos y convivientes para evitar la posible aparición de brotes. Con la caracterización de la etiología de la Tos ferina y el Sx. coqueluchoide se podrá conocer su

distribución por grupo de edad, área geográfica, en el tiempo y de esta manera poder ofrecer

información útil a los servicios de salud para la elección de las mejores medidas de prevención y el

tratamiento adecuado de los casos.

10. Recursos

10.1 Infraestructura

Dependiendo del nivel, la unidad debe contar con las siguientes áreas: Toma o recepción de

muestras, área de bacteriología, área de pruebas moleculares que esté separada del área de

cultivos bacterianos, área de lavado y acondicionamiento de material de laboratorio, área de

preparación de medios de cultivo, área de almacenamiento temporal de residuos peligrosos

biológico infecciosos (RPBI), entre otras.

10.2 Funciones de los diferentes niveles

Nivel Local: Este nivel incluye los laboratorios de centro de salud, jurisdiccionales y algunos

laboratorios de hospitales de primer nivel.

Estos laboratorios deberán realizar la toma y manejo y transporte de muestras

-Los laboratorios locales tienen las siguientes funciones:

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

-Realizar las pruebas mínimas para el diagnóstico en muestras humanas que requieren únicamente equipo básico de laboratorio. -Referir muestras al LESP de su entidad para el control de calidad y para la realización de pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen. -Llevar a cabo la toma de muestras de los contactos de un caso probable o sospechoso de tos ferina. -Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos confirmados de tos ferina. -Mantener el flujo de información a los niveles estatal y nacional (LESP e InDRE).

PROCEDIMIENTOS DE MANEJO Y ANALISIS DE MUESTRAS EN LA RNLSP. -El envío de cada muestra, junto con el formato correspondiente, debe ser directamente del responsable de la toma al laboratorio que la va a procesar, debe mandar copia del formato al responsable de la unidad de vigilancia epidemiológica y debe notificar al nivel inmediato superior de acuerdo a los procedimientos especificados en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-1994, para la vigilancia epidemiológica. -La toma, el manejo, el envío de muestras y los procedimientos de laboratorio para el estudio de los casos de tos ferina sujetos a vigilancia epidemiológica deben cumplir los requisitos mínimos de definición operacional y las condiciones de calidad (temperatura, esterilidad, cantidad, etc.) descritas en estos lineamientos. -La clasificación de las pruebas que se realizan en apoyo a la vigilancia epidemiológica las define el InDRE según su nivel de complejidad en pruebas mínimas, generales y especializadas o de referencia. -Las muestras que no cumplan con los requisitos anteriores técnicos y administrativos correspondientes no se procesarán y se dará aviso a las instancias correspondientes, para que anexen los requisitos faltantes o envíen nuevamente la muestra adecuada, en los condiciones solicitadas. -Los LESP y laboratorios locales que no tengan capacidad técnica para el aislamiento y caracterización de los microorganismos causantes de los casos de tos ferina y S{indrome coqueluchoide, pueden solicitar el apoyo total o parcial en cualquiera de las fases de un estudio al InDRE, especialmente en lo que se refiere a la confirmación de el microorganismo involucrado en el proceso infeccioso estudiado.

Nivel Estatal

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

Constituido por los LESP y son sus funciones: -Participar en actividades de vigilancia epidemiológica mediante la realización de pruebas mínimas y generales en el diagnóstico de la tos ferina -Centro de referencia de la Red Estatal de Laboratorios Locales de Salud Pública. -Coordinar, asesorar y supervisar las actividades de la red estatal de laboratorios de diagnóstico. -Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológicas y de diagnóstico por el laboratorio a nivel estatal. -Realizar investigaciones seroepidemilógicas y bacteriológicas sobre la prevalencia de la tos ferina a nivel estatal. -Colaborar en el seguimiento y control de casos y contactos de pacientes con infecciones respiratorias sujetas a vigilancia epidemiológica. -Promover la utilización adecuada de las pruebas diagnósticas ya estandarizadas , así como la interpretación de los resultados obtenidos en apoyo a las actividades de vigilancia epidemiológicas de la tos ferina y la aplicación de medidas de prevención y control correspondientes al ámbito estatal. -Diseñar programas de capacitación al personal de la red de laboratorios locales para lel manejo de muestras, así como en el aislamiento y caracterización de Bordetella pertussis y B. parapertussis. -Promover y apoyar programas de control de calidad para el mejoramiento integral de los laboratorios locales. -Participar en la elaboración y actualización de los manuales de procedimientos referente al diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.). -Notificar al órgano normativo correspondiente los casos confirmados de Tos ferina -Coordinar el flujo de información de la red estatal al nivel nacional

Nivel Nacional

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

El InDRE, para el estudio de la tos ferina, es la institución de referencia a nivel nacional y desempeña las siguientes funciones: -Llevar a cabo actividades de diagnóstico y análisis diversos en muestras de seres humanos en apoyo a la vigilancia epidemiológica. -Participar en el desarrollo, estandarización, adaptación y validación de técnicas y procedimientos de laboratorio para pruebas mínimas, generales y especializadas. -A nivel nacional realizar estudios de referencia y control de calidad de los LESP. -Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológica y diagnóstico de la tos ferina a nivel nacional. -Realizar investigaciones seroepidemiológicas y bacteriológicas que permitan conocer directa o indirectamente la prevalencia de la tos ferina en poblaciones que viven en zonas endémicas del país. -Establecer la utilización de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE , en apoyo a la vigilancia epidemiológica de la tos ferina. -Capacitar al personal de los LESP (Químicos y técnicos) en las técnicas y procedimientos para el diagnóstico de la tos ferina en las instalaciones del InDRE. -Establecer programas de supervisión continua a las actividades de la red -Orientar a los LESP en la preparación, compra de reactivos y de patrones de referencia para el aislamiento de los agentes etiológicos del síndrome coqueluchoide y la tos ferina. -Elaborar y mantener actualizados los manuales de procedimientos y técnicas de laboratorio para el diagnóstico de estas enfermedades. -Organizar y participar en reuniones científicas donde se aborden temas relacionados con procesos infecciosos de las vías respiratorias. -Coordinar el flujo de información de la RNLSP y notificar al órgano normativo de vigilancia epidemiológica correspondiente los casos confirmados de los padecimientos ya señalados que se presenten.

11. Evaluación del desempeño

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

La evaluación del desempeño se hará dos veces al año a través de paneles de cepas o muestras. El

InDRE enviará paneles al LESP y éste a su vez a los laboratorios de hospital. Cuando sea necesario

se realizará la supervisión en cascada.

A partir de la introducción del Programa de Evaluación Externa del Desempeño en la RNLSP , el

Laboratorio de IRAs bacterianas y Pertussis a enviado ocho paneles de eficiencia; de 2005 a 2010,

inicialmente se envió un panel por año y en 2008 considerando los resultados obtenidos por la red de

laboratorios para el diagnóstico de IRAS Bacterianas en este periodo, se propuso hacer una

modificación de este esquema (un panel por año) y privilegiar el envío de paneles de eficiencia como

una mejor herramienta para la evaluación del desempeño.

Para evaluar el desempeño de la RNLESP se propuso comparar la concordancia de los resultados

obtenidos en la identificación bacteriana obtenida por los laboratorios participantes con los

resultados del Laboratorio coordinador considerando los siguientes criterios a partir del 2010:

a) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación

entre 9.0 y 10.0 en el PEED, se clasifican como SOBRESALIENTES

b) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación

entre 8.0 y 8.9 en el PEED, se clasifican como SATISFACTORIOS

c) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación

entre 6.0 de 7.9 en el PEED, se clasifican como MINIMOS

d) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación

menos 5.9 en el PEED, se clasifican como PRECARIOS

Es importante mencionar que los criterios empleados durante los años 2005 al 2009 que se

emplearon para evaluar el desempeño de los paneles del primero al séptimo, fueron modificados a

partir del 2010 con el fin de mejorar el desempeño de los LESP participantes

La clasificación del desempeño se realizó empleando los criterios que se especifican en la siguiente

tabla:

CONCORDANCIA

(%) 2005-2009

CONCORDANCIA

(%) 2010

CLASIFICACIÓN

DEL

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

DESEMPEÑO

90-100 90-100 SOBRESALIENTE

70-89 80-89 SATISFACTORIO

50-69 60-79 MINIMO

< 50 < 59 PRECARIO

Atendiendo a estos criterios de clasificación, de los 26 laboratorios que integran esta red para el

diagnóstico de Tos ferina conforme a los resultados del PEED 2010, 17 fueron clasificados como

sobresalientes, cuatro como mínimo y como 5 como precarios.

Estados que envían cepas de B. pertussis y B. parapertussis para control de calidad 7/26 que integran la red

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

12. Colección de cepas

Una vez caracterizadas las cepas aisladas y enviadas al InDRE, y después de la emisión del

informe correspondiente; se conservarán a mediano y a largo plazo el 100% de las cepas de B.

pertussis y B. parapertussis o alguna otra especie aislada de casos probables de tos ferina, con el

objetivo de crear un banco biológico para:

● El monitoreo de cambios fenotípicos o genotípicos de cepas circulantes a nivel Nacional, en

apoyo a la Vigilancia epidemiológica de este padecimiento

● Evaluar impacto de las vacunas disponibles en el país.

● Desarrollar proyectos de investigación en colaboración con instituciones que permita un

fortalecimiento de los participantes de la RNLESP, manteniendo cada Estado la propiedad de

sus colecciones.

Todas las cepas serán conservadas, a excepción de las que no cumplan los criterios de inclusión

para ingresar a la colección de cepas del InDRE.

Criterios de inclusión:

Cepas caracterizadas que han sido aisladas y relacionadas con la aparición de brotes

Cepas resistentes a los antibióticos primera elección (mácrolidos) que se emplean para el

tratamiento de la tos ferina

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

REFERENCIAS

1.-Koneman, E.W.; Allen, S.D.; Janda, W.M.; Schreckenberger, P.C.; Winn, W.C. Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas color. 5a ed. Ed Panamericana . 2003 pp. 416-424

2.-Harrison. Principios de Medicina Interna. 14ª. Ed. Mc Graw-Hill. Interamericana de España. SAU.1998. pp. 1066-1070.

3.- Nennig M.E. Prevalence and Incidence of Adult Pertussis in an urban Population. JAMA.1996. 275:1672

4.-NOM-024-SS2-1994. Para la Prevención y Control de las Infecciones Respiratorias Agudas en la Atención primaria a la Salud. Diario Oficial de la Federación. 11 de Abril de 1996.

5.-NOM-017-SSA2.1994. Para la Vigilancia Epidemiológica. Diario Oficial de la Federación. 11 de Octubre de 1999. 6. Gilligan,P.H. Importance of culture in Laboratory Diagnosis of Bordetella pertussis infections.J of clinical

Microbiol.vol 20 no 5,1984 . pp 891-893.

7. -Manual para el control de enfermedades transmisibles. Publicación científica No. 564. Organización Mundial de la Salud. Abram S. Benenson. Editor, Decimosexta edición. Washington, D. C. 1997. pp. 90, 307, 312, 335, 446.

8. - Publicación Técnica del InDRE No. 5 Bordetella pertussis. Microbiología y Diagnóstico. InDRE/SSA. 1991.

9. - Manual de Técnicas de Laboratorio. Vol. I Virología y Bacteriología. InDRE/SSA. 1995. pp. 49-78. 10. -Infecciones Respiratorias Agudas 2008. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Epidemiología. No. 52, Vol. 17, Semana 52. 200. 10.- Kristin Brown, MPH; Pam Cassiday, MS; Maria Lucia Tondella, PhD; Amanda Cohn, MD; Kris Bisgard, DVM, MPH. Pertussis: Chapter 10-1 in VPD Surveillance Manual, 4th Edition, 2008.

11.-Hallander HO, Reizenstein E, Renemar B, Rasmuson G, Mardin L, Olin P. Comparison of nasopharyngeal aspirates with swabs for culture of Bordetella pertussis. J Clin Microbiol 1993;31:50–2.

12.- Halperin SA, Bortolussi R, Wort AJ. Evaluation of culture, immunofluorescence, and 13. serology for the diagnosis of pertussis. J Clin Microbiol 1989; 7:752–7.

13.- Morrill WE, Barbaree JM, Fields BS, et al. Effects of transport temperature andmedium on recovery of Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs. J Clin. Microbiol 26:1814-7. 14.- Meade BD, Bollen A. Recommendations for use of the polymerase chain reaction in the diagnosis of Bordetella pertussis infections. J Med Microbiol 1994;41:51-5.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

15.- Preston NW. Technical problems in the laboratory diagnosis and prevention of whooping-cough. Lab Pract 1970;19:482-6. 16.- Trudy Murphy, MD, Kris Bisgard, DVM, MPH, and Gary Sanden, MS, PhD Revised June 2000 Chapter 2 Diagnosis and Laboratory Methods in Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for the Control of Pertussis Outbreaks. CDC, 2000. 17.- Hewlett EL: Bordetella species. En: Mandel GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases (5ª edición). Philadelphia. Churchill Linvinsgtone. 2000: 2414-2422). 18.- Benenson AS. Manual para el control de las enfermedades transmisibles. AS Benenson Ed. 16 º. Ed. Washington DC.: OPS, 1997. 19.- Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/

20.- World Health Organization , Department of immunization, Vaccins and Biologicals. Laboratory Manual for

Diagnosis of Whooping cough caused by Bordetella pertussis /Bordetella parapertussis. WHO/IVB/04.14. CH-

1211 Geneva 27, Switzerland.March 2007

21.- World Health Organization , Department of Vaccins and Biologicals. Generic protocol for estimating the

burden of pertussis in young children. WHO/IVB/05.15. CH-1211 Geneva 27, Switzerland.March 2005.

22.- McLaffferty M, Harcus D, Hewlett E. Nucleotide Sequence and Characterization of a Repetitive DNA Element from the Genome of Bordetella pertussis with Characteristics of an Insertion Sequence. J Gen Micro 1988; 134:2297-2306. 23.- Baughman, A. L., K. M. Bisgard, K. M. Edwards, D. Guris, M. D. Decker, K. Holland, B. D. Meade, and F. Lynn. 2004. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol 11:1045-53. 24.- Marchant, C. D., A. M. Loughlin, S. M. Lett, C. W. Todd, L. H. Wetterlow, R. Bicchieri, S. Higham, P. Etkind, E. Silva, and G. R. Siber. 1994. Pertussis in Massachusetts, 1981-1991: incidence, serologic diagnosis, and vaccine effectiveness. J Infect Dis 169:1297-305. 25.- Meade, B. D., A. Deforest, K. M. Edwards, T. A. Romani, F. Lynn, C. H. O'Brien, C. B. Swartz, G. F. Reed, and M. A. Deloria. 1995. Description and evaluation of serologic assays used in a multicenter trial of acellular pertussis vaccines. Pediatrics 96:570-5. 26.- Tondella, M. L., G. M. Carlone, N. Messonnier, C. P. Quinn, B. D. Meade, D. L. Burns, J. D. Cherry, N. Guiso, E. L. Hewlett, K. M. Edwards, D. Xing, A. Giammanco, C. H. Wirsing von Konig, L. Han, L. Hueston, J. B. Robbins, M. Powell, C. M. Mink, J. T. Poolman, S. W. Hildreth, F. Lynn, and A. Morris. 2009. International Bordetella pertussis assay standardization and harmonization meeting report. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, United States, 19-20 July 2007. Vaccine 27:803-14.

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

ANEXO 1

CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVÍO AL LABORATORIO.

Exudado Nasofaríngeo

Muestras de Exudado nasofaríngeo para la búsqueda de Bordetella pertussis Estas muestras se

procesarán de acuerdo al algoritmo del Anexo 3. Este tipo de muestra se recomienda para el

diagnóstico de Tos ferina y la búsqueda de contactos intradomiciliarios..

Condiciones para la toma del exudado nasofaríngeo:

Se utiliza un hisopo de rayón o dacrón (para cultivo y/o PCR) con mango flexible (alambre de aluminio

pero de preferencia de plástico) para no lastimar al paciente y evitar interferencia con la PCR.

La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrás y se introduce el hisopo

de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta

aproximadamente 10 cm, cuidando tocar sólo el extremo posterior del mango y evitar tocar los

cornetes. Una vez tocando el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo y se retira con

cuidado para que no se contamine.

Volumen: Se recomienda que el volumen del medio de transporte no sea mayor de 1 ml para evitar

la dilución de los microorganismos presentes en la muestra.

Transporte: Depositar el hisopo con la muestra en medio de transporte de solución salina con

cefalexina a una concentración de 40 µg/ml y trasladarlo lo más pronto posible al laboratorio en red

f`ría sin congenlar

Nota: El tiempo de viabilidad de este microorganismo en la muestra en red fría es de 48 a 72 hrs.

Información requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el nombre del

paciente, edad, fecha de toma, tipo de muestra, si es primera o segunda toma y diagnóstico

solicitado.

Las muestras deben ser enviadas con el oficio de solicitud del estudio, acompañada de él formato

único de envío de muestras biológicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos

ferina y contactos intradomiciliarios (IRAB-F-89), o copia del Formato del Sistema Nacional de Salud

de estudio epidemiológico de caso de tos ferina.

La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa el

rechazo definitivo. sin embargo si el rechazo es de índole administrativo e notificará al usuario y

contará con un periodo de 2 días, para enviar la documentación complementaria, pero si el rechazo

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EPIDEMIOLOGÍA

InDRE

es debido a la calidad de la muestra se solicitará la nueva muestra en las condiciones adecuadas, de

no ocurrir así, se rechazará definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.

Las muestras de suero y exudados nasofaríngeos, de casos y contactos serán resguardadas durante

un periodo de dos meses como máximo, para efectos de cualquier repetición que sea requerida y

con el fin de crear un banco de muestras positivas para la creación de paneles.

Suero Condiciones: Volumen: Se requiere de 1 a 3 ml para la prueba, el suero, no debe estar hemolizado, lipémico ó contaminado. Transporte: Estas muestras deben ser recolectadas en un tubo estéril, sin anticuagulante y deben transportarse en red fría. Información requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el nombre del paciente, edad, sexo, fecha de toma, tipo de muestra, y con la fecha de inicio de tos, es muy importante que la muestra serológica sea tomada a partir de las dos semanas o más de iniciada la tos , pero no antes. Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio. La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa el rechazo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de ocho días, para enviar la documentación complementaria, de no ocurrir así, se rechazará definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.

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InDRE

ANEXO 2

Criterios para aceptación y Rechazo de muestras o cepas para el diagnóstico, control de

calidad y Referencia de Tos ferina

CRITERIOS PARA LA ACEPTACIÓN DE MUESTRAS EXUDADO NOSOFARÍNGEO

1. Se aceptarán las muestras que cumplan con las definiciones operacionales caso para el

diagnóstico de tos ferina ( caso probable, caso sospechoso, caso atípico y contacto)

2. Muestras registradas en el InDRE

3. Muestras con volumen suficiente 1 ml de solución salina con cefalexina para PCR y medio de

transporte Regan Lowe con 5 mL y perfectamente etiquetadas

4. Muestras de casos que hayan sido tomadas dentro de las primeras 4 semanas de iniciados

los síntomas en pacientes.

5. Muestras de contactos para búsqueda de portadores tomadas dentro de los 10 días primeros

días de iniciado el estudio de caso probable o sospechoso.

6. Muestras que no excedan las 72 horas de transporte.

7. Muestras almacenadas a 4 -8 ºC

8. Muestras que cumplan los lineamientos del manual de toma y envío de muestras editado por

el InDRE

CRITERIOS DE RECHAZO

1. Se rechazaran las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales caso para

el diagnóstico de tos ferina (caso probable, caso sospechoso, caso atípico y contacto)

2. Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos (formato único de envío de

muestras biológicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos ferina y

contactos intradomiciliarios (F-IRAB- 89), copia del Formato del Sistema Nacional de Salud

de estudio epidemiológico de caso de tos ferina).

3. Muestras de referencia y control de calidad que no tengan resultado en formato

4. Muestras con volúmen insuficiente (menos de 1 mL) y que no están etiquetadas

adecuadamente.

5. Muestras que sean tomadas con hisopo de algodón

6. Muestras que excedan los 2 días de tránsito en áreas locales y 3 días en áreas foráneas.

7. Muestras derramadas

8. Muestras no etiquetadas.

9. Muestras que no sean enviadas con refrigerantes

10. Muestras de referencia o control de calidad que no cuenten con formatos de envío

11. Muestras de referencia o control de calidad con datos incompletos en formatos de e

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InDRE

ANEXO 3

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA ALGORITMO MAESTRO 2011 PARA EL DIAGNÓSTICO, REFERENCIA Y CONTROL DE

CALIDAD DE Bordetella pertussis y OTRAS ESPECIES Las muestras se reciben en la sección de Recepción de Muestras y son recogidas por el Laboratorio de IRAs Bacterianas en dónde se les asigna el número de registro correspondiente

Siembra en placas con medio selectivo

Positivo

Identificación por coaglutinación con antisuero específico

MUESTRAS RECIBIDAS

Exudado nasofaríngeo y/o cepas para Diagnóstico, Referencia o control de calidad

Caracterización bioquímica

Negativo

Conservación de cepas de Bordetella en congelación

Captura de resultados en INFOLAB, revisión e impresión de resultado para entrega en la sección de Recepción

de Muestras, mínimo 7 días por cultivo posterior a la recepción de la misma, 2 días para PCR PF y1 día para

PCR TR

Sin desarrollo bacteriano Con desarrollo presuntivo

muestras de exudado nasofaríngeo o cepas para extracción de DNA) para PCR PF y PCR TR, ver algoritmos

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EPIDEMIOLOGÍA

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ANEXO 4

DEFINICIONES OPERACIONALES DE CASO

PARA EL DIAGNOSTICO DE TOS FERINA

a. CASO SOSPECHOSO DE TOS FERINA: persona de cualquier edad con tos, sin importar los

días de duración y con asociación con otros casos probables o confirmados. Esta definición se usa

para la búsqueda activa de casos adicionales ante la presencia de casos probables, confirmados o

atípicos, portadores, defunciones y en brotes.

b. CASO PROBABLE DE TOS FERINA: persona de cualquier edad, con tos de 14 o más días

de evolución y dos o más de las siguientes características; tos paroxística, en accesos, espasmódica

o estridor laríngeo inspiratorio y uno o más de los siguientes datos: tos cianosante, hemorragia

(conjuntival, petequias, epistaxis), leucocitosis con predominio de linfocitos; o historia de contacto con

casos similares en las últimas 2 a 4 semanas previas al inicio del padecimiento. Nota: En esta

definición se incluyen a los MENORES DE 3 MESES que pueden manifestar sólo episodios de apnea

o cianosis con o sin tos.

c. CASO CONFIRMADO DE TOS FERINA: todo caso probable que tenga aislamiento de

Bordetella pertussis por cultivo o PCR en el caso o cualquiera de sus contactos, convivientes o

personas con asociación epidemiológica.

d. CASO DE TOS FERINA CLÍNICA: todo caso probable que no cuenta con muestra,

independientemente de sus cinco contactos.

e. CASO DE TOS FERINA ATÍPICO: todo caso sospechoso que tenga aislamiento de Bordetella

pertussis.

f. PORTADOR DE Bordetella pertussis: toda persona sin signos o síntomas de enfermedad

respiratoria a quien se tomó muestras por tener asociación epidemiológica con un caso probable o

confirmado y cuyos resultados de cultivo o PCR son positivos a Bordetella pertussis.


Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html

ANEXO 5

FORMATO PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE LA TOS FERINA

-

HOSPITAL NOTIFICANTE DEL CASO:_______________________________________________________________ JURISDICCIÓN CORRESPONDIENTE:________________________________ F-IRAB-89

TOS

PRODUCTIVA /

TOS SECA

RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBREPERDIDA DE

CONOCIMIENTO

FECHA DE

TRATAMIENTO

CON

ERITROMICINA

1a. 2a. 3a. SIN VACUNAEXUDADO

NASOFARINGEO

SANGRE O

SUEROLEUCOCITOS

LINFOCITOS

(%)

FECHA DE VACUNACIÓN CON DPT O PENTAVALENTE OBSERVACIONES

TOS

PRODUCTIVA /

TOS SECA

RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBREPERDIDA DE

CONOCIMIENTO

FECHA DE

TRATAMIENTO

CON

ERITROMICINA

1a. 2a. 3a. SIN VACUNAEXUDADO

NASOFARINGEO

SANGRE O

SUERO

No DE EXPEDIENTE CLINICO DEL CASO:____________________________________________________

DOMICILIO DEL CASO:___________________________________________________________________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DEL CASO:________________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________

RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DE LOS CONTACTOS:__________________________________________________ TELEFONO: ___________________

FECHA DE INICIO DE SINTOMAS

FECHA DE

NACIMIENTO

FECHA DE

NACIMIENTO

EDAD

EDAD

FECHA DE INICIO DE SINTOMAS

BIOMETRÍA HEMÁTICAFECHA DE VACUNACIÓN CON DPT O PENTAVALENTE

ESTUDIO DE CASO DE TOS FERINA Y CONTACTOS INTRADOMICILIARIOS

NOMBRE DEL CASO

CONTACTOS FAMILIARES

NOMBRE Y PARENTESCO

FECHA DE TOMA DE MUESTRAS

FECHA DE TOMA DE MUESTRAS

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍALABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y

PERTUSSIS

EPIDEMIOLOGÍAInDRE

Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos



ANEXO 6

DESARROLLO DE PCR PUNTO FINAL PARA LA DETECCIÓN DE

DE Bordetella perutussis, EN MUESTRAS CLÍNICAS Y CEPAS

1. PRINCIPIO La amplificación de una secuencia de inseción presente en varias copias exclusivamente

en el genoma de Bordetella pertussis por la técnica de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) en ácido desoxirribonucléico (DNA) extraído de muestras de exudado

nasofaríngeo o cultivo puro. La especificidad de la amplificación se confirma usando la

enzima de restricción Alu I.

2. OBJETIVOS

Detección de Bordetella pertussis en casos de tosferina y sus contactos utilizando la

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

3. MATERIALES Y EQUIPO

EQUIPO

Termociclador

Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A

Cabina para PCR

Cámara de electroforesis horizontal

Fotodocumentador

Fuente de poder

Congelador vertical

Refrigerador vertical

Termoagitador

Sistema de purificación de agua



Balanza analítica

Aire acondicionado

Horno de microondas

MATERIALES

Micropipeta 1-10 µL




Guantes desechables

Tubos tipo eppendorf de 0.2 ml, 0.5 ml y 1.5 ml

Puntas para micropipeta 10, 200 y 1000 µL

Tubos para centrifuga de 50 ml

Pipetas desechables 5 y 10 ml

Marcadores indelebles

Gradillas para tubos eppendorf

Bolsas de polipropileno

Contenedores para desecho de puntas

Gasas

REACTIVOS Y MATERIALES BIOLÓGICOS

Reactivos y Materiales biológicos Marca

dNTP´s (A, T, C, G) 100µM Roche

Taq polimerasa 5U/µL Roche

Bp168 5'-GAC TTC GTC TTC GTG GCC AT-3' (1) Applied biosystems

Bp169 5'- TCG TCC AGG TTG AGT CTG GA -3' (1) Applied biosystems

Endonucleasa de restricción Alu I Roche

MgCl2, 25mM Applied biosystems

Regulador 10 X Applied biosystems

Solución amortiguadora TBE

Agarosa Sigma

Bromuro de etidio

Agua destilada y desionizada MILLIPORE

Marcador de peso molecular

Naranja G

Alcohol etílico al 70%



1) Ewanowich CA, Linda W. Chui, Paranchych, Pepler, Marusyk G, Albrition W, Major Outbreak of Pertussis in Northern Alberta, Canada: Analysis of Discrepant Direct Fluorescent-Antibody and Culture Results by Using Polymerase Chain Reaction Methodology. Journal of Clinical Microbioly, 1993, 31: 1715-1725

4. METODOLOGÍA

1. El DNA de las muestras llegará al laboratorio en tubo para microcentrifuga de 1.5mL

tipo eppendorf a temperatura ambiente cuando se ha extraído recientemente y

congelado cuando tenga más de 2h de haberse extraído.

2. El almacenamiento de la muestra de DNA debe será a -20ºC

CONSIDERACIONES ANTES DE INICIAR LA PCR.

1. Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando

el sanitizante asignado.

2. Colocarse el equipo de seguridad. (Ver punto 6).

3. Mantener las muestras en hielo listas para la PCR.

4. Descongelar previamente los reactivos para la PCR.

5. Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar.

PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN.

1. Esta se hará en el área Blanca del laboratorio.

2. El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a

diagnosticar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la

mezcla de reacción homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30

veces, finalmente adicionar 20 µL de esta mezcla en el fondo de cada tubo.

3. En el área de templados, adicionar 5 µL del DNA extraído de cada muestra en el

tubo correspondiente.



FORMATO DE TRABAJO PARA PCR

FECHA: ANALISTA:

NUMERO DE TUBO

CLAVE DE LA MUESTRA

COMENTARIOS

1

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LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA MOLECULAR



HOJA DE TRABAJO DE PCR PARA Bordetella pertussis FECHA:___________________ ANALISTA:_________________

NUMERO DE TUBO

CLAVE DE LA MUESTRA OBSERVACIONES

1

2

3

4

5

6

7

8

SOLUCIÓN MADRE I

FECHA:___________________ ANALISTA:_________________ uientes cantidades de

reactivos y solucion s tampón:

REACTIVOS [ Stock ] [ final ]

Volumen por

muestra (

Volumen total (

dH2O estéril 7.25

Buffer 10 X 1 X 2.5

MgCl2 25 mM 3 mM 4.0

Bp 168 1:50 1.0

Bp 169 1:50 1.0

dNTP´s 4.0

Taq polimerasa 0.25 0.5

Vaselina ---- 10 ---- --------

DNA 5 50

Multiplicar las cantidades señaladas por el número de muestras a procesar más una, para qu los volúmene no queden excesivamente ajustados. n + 1 = _____ n = número de muestras

Digestión:



FECHA:___________________ ANALISTA:

Enzima de restricción:______________ Temperatura de incubación:

Muestras a digerir

Inicio a:__________________ Termino a:

Comentarios:

ANALISTA:

Electroforesis en gel de agarosa al 2%:

FECHA: ANALISTA:



Correr el gel a 80 volts durante 1hora y 30 minutos

Inicio: Termino:

Peine I Peine II

N° Pozo

N° de tubo

Clave Resultado Comentario

N° Pozo

N° de tubo

Clave Resultado Comentario

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

7 7

8 8

9 9

10 10

11 11

12 12

13 13

POSITIVO= Positivo a Bordetella pertussis

NEGATIVO= Negativo a Bordetella pertussis.

Marcador de Peso Molecular (PM):_______________________________

CONTROLES

En el área de controles. Adicionar 5 µL de control positivo y negativo respectivamente.

Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella

bronchiseptica.



Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella

parapertussis.

Control positivo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella pertussis.

Control de reactivos: Utilizar 5 µL de agua inyectable o milliQ.

NOTA. Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el

contenido se evapore.

Colocar los tubos en el Termociclador, seleccionar el programa para Bordetella

pertussis y dar inicio a la corrida

Los productos de DNA obtenidos se someten a 120V por 30 minutos a electroforesis en

un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético. (Ver punto 7)

Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV

Las muestras amplificadas que presenten una banda fluorescente correspondiente al

tamaño esperado de aproximadamente 424pb comparando con el marcador de peso

molecular, deberán digerirse con la enzima de restricción Alu I por 2 horas a 37ºC para

confirmar la presencia de DNA de Bordetella pertussis. (Ver punto 8)

Al terminar el tiempo de restricción del DNA se analizará por electroforesis en gel de

agarosa al 2.5%, en el área de electroforesis se tomaran 6µL de cada muestra y controles

y se mezclaran con 2µL de Naranja G y se correra a 120V/40min.

Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV

5. INTERPRETACIÓN POR EL LABORATORIO Positivo: Presencia de la secuencia de inserción existente en varias copias exclusivas

del genoma de Bordetella pertussis digeridos con la enzima Alu I muestra bandas de 224

y 200pb

Negativo: Ausencia de DNA de Bordetella pertussis



Ausencia de bandas de 224 y 200pb después de la restricción.

6. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

a. Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos. Y

trabajarse en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de

bioseguridad tipo II 2A.

b. El analista debe vestirse con su equipo de protección personal, bata (una para cada

área del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de

seguridad.

c. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en

cada área.

d. Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con

etanol al 70% ó benzal-metanol 1:1 v/v.

e. Todo el material a utilizar deberá estar esterilizado.

f. El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma

jornada.

g. El área limpia ó área blanca está libre de toda contaminación por DNA por lo que solo

podrán manejarse reactivos.

h. El área de templados será la única donde se podrán abrir los tubos que contienen el

DNA de las muestras.

i. El área de controles será la única permitida para la colocación de el DNA control.

j. Solo en el área sucia o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cDNA y

cargarse en los geles.

k. Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones.

l. Es muy importante que cada área cuente con su material propio (puntas, guantes,

agua, etc), y éste no deberá compartirse entre áreas.

m. Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o

antes de ser removidos del laboratorio.



n. El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar.

7. ELECTROFORESIS EN GEL PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA AL 2.0% EN CHAROLA DE 15 X 25 cm2

FUNDAMENTO: La electroforesis en gel se encuentra entre los métodos más resolutivos y convenientes

empleados en la separación macromolecular, los geles más ampliamente utilizados son

los de poliacrilamida y agarosa los cuales se utilizan para separar, identificar y purificar

fragmentos

de ARN o ADN; estos tienen las características de formar poros de dimensiones

moleculares una vez que han polimerizado, en la electroforesis en gel, los ácidos

nucléicos que tienen carga negativa debido a su esqueleto de grupo fosfato se aleja del

polo negativo (cátodo) y se dirigen hacia el polo positivo (ánodo), los fragmentos

pequeños de ADN se mueven más rápido que los grandes, las bandas resultantes de la

separación por electroforesis necesitan teñirse para visualizarse, el reactivo ampliamente

utilizado es el colorante de bromuro de etidio el cual se incorpora en la solución de

agarosa.

Para lograr la separación adecuada de los fragmentos de ADN se toma en cuenta la

composición porcentual de acrilamida o agarosa para determinar que tan fácil migrarán en

el gel el ADN de diferentes tamaños, por lo tanto, la composición porcentual del gel

determinará el nivel de resolución (capacidad de separar uno del otro) de los fragmentos

de ADN.

REACTIVOS



TBE 10X (Sol. Stock)

TBE 1 X

Bromuro de Etidio

Buffer de colorante de corrida.

Marcador de peso molecular ΦX174

Agarosa en polvo

Naranja G

MATERIAL Y EQUIPO Matraz Erlenmeyer de 500 ml

Cámara de electroforesis

Balanza analítica

Fotodocumentador

Micropipeta 0.5 - 10 µL.

Puntas 1- 200 µL.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar en la balanza analítica, previamente calibrada, 2g. de agarosa. y mezcle en

100 mL. de TBE 1X en un matraz de Erlenmeyer con tapón de rosca.

2. Calentar el matraz en horno de microondas en ciclos de 20 segundos y agitar

hasta la completa dilución de la agarosa, (utilice guantes de carnaza para evitar

quemaduras), deje ligeramente flojo el tapón del matraz.

3. Permita enfriar por varios minutos.

4. Agregar a la agarosa 3.0 µL de bromuro de etidio.

5. Agitar el matraz suavemente con el tapón sellado, y vacíe la agarosa lentamente

para evitar la formación de burbujas en la charola previamente nivelada, con el

peine colocado en el lugar correspondiente.



6. Deje solidificar el gel a temperatura ambiente por espacio de 30 minutos.

7. Ya solidificado el gel retire el peine y coloque el gel en la cámara de electroforesis

con los pozos orientados al lado izquierdo de la cámara.

8. Llene la cámara de electroforesis con 1.800 mL de TBE 1X hasta cubrir el gel.

9. Prepare el ΦX174 en un pozo de una placa falcón flexible colocando 5 µl de

ΦX174.

10. En una superficie plástica y plana (parafilm) mezcle 8µL de muestra más 2 mL de

colorante de buffer, homogenice y deposite en el pozo correspondiente del gel, así

procesará todas sus muestras de acuerdo a la capacidad del No. de pozos de su

gel.

11. Coloque la tapa de la cámara ajustando los electrodos, el color negro polo (+) del

lado derecho y el color rojo polo (-) lado izquierdo.

12. Los pozos del gel deben estar orientados hacia el polo (-) el gel correrá a 120

voltios por espacio de 30 minutos.

13. Coloque su gel en un fotodocumentador de luz UV y observe sus bandas de

acuerdo a su marcador y compare sus resultados para un análisis posterior.

Nota. Durante la manipulación del gel siempre deberá usar guantes ya que el bromuro de

etidio es altamente cancerígeno.

8. ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN.

1) Pipetear 10µL de muestra proveniente de cada tubo de producto de PCR en tubos

de 500µL rotulados.

2) Adicionar 2.5µL de buffer 10X y 2.5µL de enzima Alu I (10U/ µL) a cada tubo y

10µL de agua grado PCR.

3) Asegurarse de tapar bien los tubos y mezclar.

4) Incubar a 37ºC por 2 horas.



5) Almacenar las muestras digeridas a 4ºC hasta corrimiento en gel de agarosa al

2.5%.

FORMULACIÓN DE REACTIVOS PARA EL ANÁLISIS MOLECULAR TBE 10X Tris base 108.0g Ácido bórico 27.5g EDTA 6.8g EDTA = Etilen-Diamino-Tetra-Acetato Aforar a 1L pH = 8.3

Disolver los reactivos en 950mL de agua destilada y ajustar el volumen a 1000mL

TBE 1X Diluir 100mL de TBE 10X a 1000mL con agua destilada. Colorante de carga (electroforesis)

Buffer de muestra 10X (listo para su uso)

Naranja G 0.25%

Bromuro de etidio (EtBr) 10mg/mL Pesar 50mg de bromuro de etidio y disolver en 5mL de agua destilada. Almacenar en un frasco ambar para protegerlo de la luz. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es mutagénico y cancerígeno. Usar guantes cuando maneje el polvo o la solución.

9. FUENTES DE VARIABILIDAD La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25°C. Las diferentes áreas deberán

estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la

contaminación. Ninguna otra condición ambiental afecta la PCR, puesto que toda la

reacción se realiza en el Termociclador.



ALGORITMO PARA LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Bordetella pertussis.

Negativo Ausencia de banda

característica

Positivo

Presencia de una banda de 424pb

Digestión con enzima AluI 37ºC/2 horas

Negativo

Ausencia de bandas carácterísticas

confirmación

Positivo

Presencia de secuencia de inserción evidenciada por 2 bandas características en cepas de Bordetella pertussis

INSTITUTO DE DIAGNOSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLOGICOS

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

MOLECULAR

NOM-017-SSA2-1994: Para la vigilancia epidemiológica. NOM-024-SSA2-1998, para la prevención y control de las Infecciones Respiratorias Agudas en la atención primaria a la Salud

Electroforesis en gel de agarosa

RESULTADO

Fotodocumentar Amplificación de secuencia con

iniciadores correspondientes de inserción exclusiva de Bordetella pertussis

Preparar el gel de agarosa

al porcentaje requerido

Revelar bajo luz UV

10.ALGORITMO

lineamientos para la vigilancia por … · de tos ferina el 40 al 80% de los miembros de la familia...

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