2007 Desarrollo Profesional

Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein)

Instructores

Essy Levy, M.S.Coordinadora de Programas de Hughes Scholars

UCSD, San Diego CA

Julie MathernBioEducation Product ManagerBio-Rad Laboratories, Hercules CA

¿Para que enseñar la transformación genética?

• Una herramienta poderosa para el aprendizaje

• Parte de los estándares nacionales curriculares

• Varias extensiones de practicas de laboratorio

• Conexiones con el mundo real

• Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria

Dogma Central de la Biología Molecular

ADN ARN Proteína Característica

Conexiones con el mundo real

• GFP es un marcador visual

• Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas)

• Localización y regulación de la expresión de un gen

• Movimiento celular

• El destino celular durante el desarrollo

• Formación de los diferentes órganos

• Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad

• Basado en los estándares curriculares

• Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento

• Compatible con un periodo de clase de 50 minutos

• Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo)

• Costo económico

• Resultados exitosos en las manos de los estudiantes

• Seguro para uso en el aula

• ¡Resultados tangibles!

Procedimiento Transformación

Day 1

Day 2

Horario para el Taller de GFP

• Introducción

• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO

• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

¿Que es una transformación?

Absorción deADN exógeno;frecuentemente un plásmido circular

GFP

Lactamasa beta

Resistencia a la

Ampicilina

¿Que es un plásmido? Un pedazo circular deADN que se replica autónomamente

Evolucionado originalmente enbacterias

Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede

ser modificado paraexpresar una proteína de interés

Las diferentes caras de un plásmido

Micrografía de transmisión de electrones

Gel de agarosaRepresentación Grafica

Plásmido pGLO

• Lactamasa Beta -Resistencia a la

ampicilina

• La proteína GFP (Green Fluorescent Protein)– Aequorea victoria

gen de medusa

• araC: Regulador Regula la trascripción de GFP

Transformación con pGLO

Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)

Plásmidos de pGLO

Cromosoma Bacteriano (ADN)

Pared celular

GFP

ADN Bacteriano

Plásmido de ADN

Célula de Bacteria

ADN Geonómico

Regulación de Trascripción

•Operón de lactosa

•Operón de Arabinosa

•Plásmidos de pGLO

Regulación de Trascripción

B A DaraC

B A DaraC

ARN Polimerasa

Efector (Arabinosa)

araC B A D

Operón ara

ARN Polimerasa

Z Y A

Z Y ALacI

Efector (Lactosa)

Z Y ALacI

Operón lac

Regulación de la expresión del gen

ARN Polimerasa

araC

Operón GFP

Gen de GFP

araC Gen de GFP

araC Gen de GFP

Efector (Arabinosa)

B A DaraC

B A DaraC

ARN Polimerasa

Efector (Arabinosa)

araC B A D

Operón ara

Métodos de Transformación

• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que

la célula sea permeable al plásmido ADN

• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente

competentes absorben el ADN después del choque térmico

Proceso de Transformacion

• Suspender las colonias en la Solución de Transformación

• Añadir el plásmido pGLO ADN

• Incubar los tubos en hielo ice

• Choque térmico a 42°C y colocar en hielo

• Incubar con caldo nutriente LB

• Extienda la suspensión por la superficie de las placas

¿Porque es importante cada paso de la transformación?

1. La solución de transformación = CaCI2

La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN

Ca++

Ca++

OCH2

O

P O

O

OBase

CH2

O

P

O

O

O

Base

OH

Azúcar

Azúcar

OCa++

¿Porque es importante cada paso de la transformación?

2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular

3. Choque térmico -incrementa la

permeabilidad de la membrana celular

4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta

Lactamasa Beta(resistencia a ampicilina)

Pared Celular

GFP

¿Que es el caldo nutriente de LB?

• Caldo Luria-Bertani (LB)

• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés

– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– Sales– Vitaminas

¿Crecer? ¿Brillar?

Siga el protocolo

¿En que placas crecerán colonias?

¿Que colonias brillarán?

Medida de Volumen