Dr. Sergio Sandoval - Dr. Adolfo La roche

CELULAS TRONCALES MESENQUIMALES

CELULAS TRONCALES MESENQUIMALES

Stem cells (SCs)

8 DE AGOSTO DE 2015 DIPLOMADO CELULAS MADRES

ULAC

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LA CLULA TRONCAL MESENQUIMAL

Dr. Sergio Sandoval y Dr. Adolfo La Roche

INTRODUCCIN

Las clulas troncales o stem cells (SCs) se definen como aquellas clulas totipotentes con capacidad

de expandirse indefinidamente y de diferenciarse en ms de un fenotipo. Por lo tanto, son clulas

no especializadas que son capaces, cuando se dividen, de dar origen contemporneamente a una

clula troncal igual a s misma y a una clula precursora (ms diferenciada) e una progenie celular

que a su vez dar origen a otra clula madre. Estas clulas son: totipotentes, porque pueden

desarrollarse en clulas de cualquier especializacin y se pueden encontrar en cualquier tejido;

multipotentes, porque poseen limitada especializacin y pueden encontrarse en unos pocos tejidos;

unipotentes, porque pueden originar un solo tipo de clulas y encontrarse en un solo tejido

No hace muchos aos, se crea que estas clulas se originaban solamente de algunas estructuras

orgnicas de embriones en sus fases iniciales, mientras que ahora se sabe que se pueden encontrar

y extraer tambin de rganos maduros como: mdula sea (MO), sangre perifrica (SP) y sangre

extrada el cordn umbilical y del lquido amnitico.

En estos ltimos tiempos se vio tambin que podan ser obtenidas de otras numerosas estructuras

menos diferenciadas, como por ejemplo el tejido adiposo, y tambin encontrarse en rganos

maduros con la posibilidad de permanecer indiferenciadas durante toda la vida del organismo.

Las SCs que residen en los tejidos mantienen su integridad, especialmente en aquellos que poseen

la caracterstica de proliferar activamente, como la MO, el tracto gastrointestinal, la piel o bien en

otros tejidos que se caracterizan por poseer limitada capacidad regenerativa o de reparacin, como

el sistema nervioso central y el msculo cardaco.

Una pregunta interesante desde el punto de vista biolgico y mdico es: son equivalentes a las SCs

embrionarias? A lo largo del desarrollo podra suceder que estas clulas persistan en estado

embrionario indiferenciado

durante la vida adulta del organismo, o bien que se observen solamente in vitro y que un artefacto

de tcnica durante el perodo prolongado en cual las clulas permanecen en cultivo indujera a

algunas a regresar a estado ms primitivo, con la particularidad de ser reprogramadas a adquirir

propiedades de SCs embrionarias .

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Uno de los tejidos donde mayormente se encuentran estas SCs es MO adulta, a la que llegan en los

ltimos estadios del desarrollo embrionario. Aqu poseen la caracterstica de multipotencialidad que

retienen a largo de su vida, adonde se encuentran junto a clulas ms diferenciad; cuya

potencialidad de desarrollo es ms limitada. Estas clulas normalmente estn programadas para

sustituir a clulas especficas de la MO donde residen, pero en determinadas situaciones pueden

transdiferenciarse y adquirir caractersticas de otros tejidos u rganos. Esto implica una

reprogramacin gentica dentro del ncleo, si bien no se entiende totalmente cul mecanismo

molecular sera el responsable de estos fenmenos.

Generalmente se acepta que una clula comprometida hacia una determinada lnea permanece

estable, manteniendo ese fenotipo bien definido, no pudiendo convertirse en otra lnea ms

especfica. Esto vale tanto para las clulas que se encuentran en un determinado rgano o tejido,

como para aquellas que proliferan in vitro. Sin embargo, hay numerosos ejemplos en los que las

clulas troncales hemopoyticas pueden ser inducidas in vitro a convertirse, bajo ciertos estmulos,

de una lnea a otra, es decir, de originar linajes celulares que no son normalmente encontrados en

ese lugar.

A lo largo de la vida fetal las SCs inician su existencia en primer lugar en el saco vitelino, pasan luego

a las regiones paraartica-esplenopleural y artica-gonadal-mesonfrica, al hgado y bazo, para

establecerse definitivamente, antes del nacimiento, en la MO, donde permanecen durante toda la

vida.

PLASTICIDAD

Las clulas stem poseen una caracterstica importante que se denomina plasticidad. Este fenmeno

consiste en la reprogramacin dentro de la clula de su camino evolutivo normal, que da origen a

nuevos tipos de clulas. Esto se comprueba con la demostracin de que una clula totipotentes,

alojada en un determinado tejido, puede experimentar un cambio clonal es decir puede pasar de

un tipo de tejido a otro diferente espontneamente, contradiciendo el paradigma clsico de que la

diferenciacin de las SCs est restringida a un rgano especfico. Este concepto ha sido sustituido

ahora por la evidencia de que las clulas totipotentes adultas, a lo largo de su existencia, retienen

un cierto grado de plasticidad de desarrollo que les permite dirigirse hacia otras muchas direcciones

de acuerdo a las situaciones en las cuales se encuentra el tejido que las aloja.

Sin embargo, podemos preguntarnos: todos estos hechos son debidos a la plasticidad de las clulas

troncales, o bien ellas se alojan dentro de los tejidos a travs de la circulacin, actuando como

contaminantes? Se ha observado, para citar un ejemplo, que el tejido muscular del esqueleto,

adems de contener progenitores hemopoyticos, tiene tambin clulas neuronales u otro tipo de

clulas que son semejantes a las que se encuentran dentro de la MO y la SP.

As, se ha determinado en los ltimos tiempos, por hallazgos experimentales, que clulas de un

tejido adulto pueden cambiar su fenotipo a otro diferente del tejido en el cual se encuentran,

sugiriendo su capacidad de ser reprogramadas hacia un nuevo destino.

Krause (2001) da un ejemplo en el que se puede observar un esquema de plasticidad de las SCs

alojadas dentro del sistema hemopoytico. Se ve cmo los progenitores linfoides pueden originar

clulas granulocticas y cmo los progenitores granulocticos pueden originar, adems de

granulocitos y macrfagos, eritrocitos y megacariocitos, y los progenitores eritroides ser

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diferenciados adems en granulocitos. Esto explicara, en grandes lneas, por qu las clulas

progenitoras que estn desarrollndose in vitro, en presencia de estimulantes adecuados, pueden

transdiferenciarse y originar otras nuevas lneas celulares.

Hay otros ejemplos en los que las clulas totipotentes circulantes son desviadas de la sangre hacia

rganos slidos para generar tejidos especficos. Los mecanismos implicados en estos fenmenos,

sin embargo, no son conocidos totalmente. Se podra pensar que la injuria que puede afectar a un

tejido que constituye un determinado rgano podra causar cambios en su microambiente haciendo

que las clulas troncales intrnsecas a ese tejido fueran inducidas a reemplazar a las clulas

necrticas endgenas. Este mecanismo podra agotar a estos progenitores y en tal caso a las SCs

circulantes, presentes en la sangre, respondiendo a un estmulo exgeno. stas seran las

encargadas de dirigirse a ese rgano y reparar el tejido daado.

Las conclusiones formuladas en base a los resultados de los estudios recientes sobre la plasticidad

de las SCs adultas contradicen sin embargo los aceptados hasta ahora, segn los cuales la

diferenciacin de una clula progenitora estara restringida solamente a una determinada lnea de

maduracin. Estos conceptos estn dando lugar as a controversias entre diferentes autores.

ADHERENCIA AL SUSTRATO DE LAS CLULAS MESENQUIMALES

En la actualidad, la definicin bsica de SC deriva de su capacidad de autorrenovarse y originar uno

o ms tipo de progenies diferenciadas. Esto vale tanto que ellas se encuentren in vivo o bien in vitro.

En cuanto a su comportamiento in vitro, se ha demostrado que estas clulas, al sembrarlas en

relativa baja concentracin, tienen la capacidad de proliferar, permaneciendo en un estado de

indiferenciacin y de expandirse a travs de numerosas divisiones y repiques celulares; pero al ser

sometidas al proceso de diferenciacin permanecen en ese estado diferenciado solo durante un

corto perodo de tiempo.

Al cultivar MO se observ que algunas clulas, aparentemente de morfologa heterognea, se

adhieren al plstico y forman focos de 2-4 clulas. A los pocos das comienzan a multiplicarse

rpidamente, formando una capa de clulas que luego de varios pasajes adquieren una morfologa

ms homognea. Al principio, las clulas hemopoyticas son elevadas, pero a los pocos das

desaparecen. Las clulas se adhieren a la superficie porque sintetizan una matriz extracelular

constituida por colgeno tipo I, fibronectina, colgeno tipo IV y laminina. Una pequea fraccin de

clulas sintetiza factor VIII asociado al antgeno, pero se cree que probablemente stas sean clulas

endoteliales. Estas clulas adherentes son secretoras de citoquinas de las cuales las ms

importantes son: IL7, IL 8, IL 11 y c-Kit ligando o SCF (Stem Cell Factor). Se pueden cultivar durante

ms de 120 duplicaciones. Su fenotipo es negativo para CD34, CD44, CD 45, c-kit ligando y para el

complejo mayor de histocompatibilidad clase 1 y 2. Las de origen murino tienen similar fenotipo

que las humanas pero requieren la presencia del factor inhibidor leucmico (LIF) para, mantener su

estado indiferenciado in vitro. A estas clulas adherentes al plstico se las denomina: clulas

troncales mesenquimales (MSCs).

La presencia de SCs no hemopoyticas en MO fue sugerida aproximadamente hace 40 aos, pero

solo recientemente se logr hacer proliferar SCs extradas de MO que no posee criterios de clulas

hemopoyticas, sino de clulas ms primitivas de tipo embrionario, a las que se denomina

mesenquimales.

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En el compartimiento de la MO, entre las numerosas poblaciones celulares de morfologa y entidad

bien definida, se encuentran unas clulas especiales indiferenciadas, que poseen la capacidad de

diferenciarse en numerosos otros tipos celulares, como clulas adipognicas, osteognicas,

condrognicas, miognicas, etc., que derivan de las primitivas MSCs, alojadas en la MO.

Se sabe ahora que adems de la MO, el lquido amnitico, en el segundo trimestre del embrin

humano, es un gran proveedor de estas clulas, las que junto con las obtenidas de la sangre de

cordn umbilical (SCU), luego del nacimiento, pueden utilizarse para cotrasplante en los casos de

ciertas enfermedades hematolgicas.

La ventaja de poder obtener y utilizar clulas autlogas multiplicadas in vitro en gran cantidad es

muy grande dado que, adems de poder ser mantenidas in vitro durante un largo perodo sin alterar

aparentemente su pluripotencialidad, pueden diferenciarse en las mltiples lneas celulares que se

necesite en ese momento.

Hay autores que tratan adems de cultivar e identificar clulas extradas de placenta o cordn

umbilical, que poseen tambin la capacidad de diferenciarse en MSCs. Ellos observan, sin embargo,

que el nmero inicial de clulas obtenidas es bajo, as como su potencial de expansin y eficiencia

de diferenciacin in vitro, respecto de las clulas mesenquimales obtenidas de MO, lo cual hace

dificultosa su utilizacin en las varias enfermedades donde se requiere gran nmero de clulas. Pero

todo esto es promisorio debido a que se podran disponer de un nmero ms o menos elevado de

clulas de origen autlogo, en los casos donde se necesite ese tipo de trasplante.

A la capa de clulas de MO que se adhieren al plstico se la llama tambin estroma medular; aqu

las clulas, luego de varios repiques, adquieren una uniformidad morfolgica cuyo valor se acerca

al 98%. Las MSCs tienen la capacidad de expandirse rpidamente duplicando, en cultivo, varias veces

su nmero preservando, sin embargo, su pluripotencialidad. A travs del contacto clula a clula y

en presencia de varios factores de crecimiento, ellas mantienen la viabilidad y la capacidad de

proliferar indefinidamente y de diferenciarse. Se describen, sin embargo, casos donde ellas pueden

transformarse espontneamente en clulas no adherentes con fenotipo CD34+ no mesenquimales..

La poblacin de MSCs, cuyo nmero es muy bajo en diferentes tejidos en la MO adulta tiene una

frecuencia muy elevada, aproximadamente del 0,001%-0,01% de las clulas presentes, decreciendo

con la edad del organismo del cual se las obtiene, lo cual hace que la MO joven sea el ms importante

proveedor de estas clulas.

Hace poco tiempo se ha descubierto que adems de la MO, la SP no es solamente una distribuidora

de SCs hemopoyticas, sino que constituye un sistema que provee clulas con capacidad de

desarrollarse dentro de varios tejidos no hemopoyticos y hasta, en caso de injuria, de reparar

tejidos slidos.

Las MSCs han sido obtenidas y cultivadas en el hombre y en otras especies de mamferos: gatos,

ratas, ratones, perros, cerdos, monos y conejos. Adems de obtenerse de la MO, de la SP, de SCU y

del tejido adiposo, pueden ser obtenidas de numerosos tejidos fetales. Su enriquecimiento se puede

alcanzar cultivndolas, luego de su adhesin al plstico, en un medio simple con una relativa

deprivacin, es decir en un medio bsico sin el agregado de factores de crecimiento.

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Luego de varios repiques, estas clulas, supuestamente mesenquimales, de morfologa uniforme y

con pocos marcadores no especficos, son sometidas a preinduccin y luego de unos das a

diferenciacin utilizando factores especficos de acuerdo al tipo de clula que se quiera obtener.

Son pocos los marcadores que expresan las MSCs. Ellas son negativas para numerosas molculas de

superficie, como CD44, CD49 y CD62, siendo positivas para MHCl y Sea 1. Dado que stos son

heterogneos entre especies, en las clulas crecidas en cultivo se observa una expresin variable de

CD90 (Thi-1), CD117 (c-Kit), SH2 (CD105), SH3 o SH4 (CD73) y STRO-1 que vara adems entre

diferentes laboratorios. Estas discrepancias podran ser debidas a los diferentes mtodos de

aislacin de las clulas, a las diferentes condiciones de cultivo o a las distintas especies animales

utilizadas. Por ello es evidente que los criterios morfolgicos o fenotpicos habituales no pueden ser

utilizados para identificar a estas diferentes clulas, siendo por lo tanto mejor utilizar las

caractersticas funcionales.

Las interacciones entre los receptores de superficie y sus ligandos son necesarias para la adhesin,

la comunicacin y la funcionalidad de estas clulas, mientras que las interacciones clula-clula y

clula-matriz son necesarias para la migracin, el crecimiento y la sobrevida de las mismas, las que

en todos los casos estn influenciadas por la protena integrina.

Hay autores que describen que dentro de la poblacin de MSCs hay una baja proporcin de clulas

con capacidad de diferenciacin triple, mientras que la mayora de la poblacin posee una nica o

bien doble capacidad. Se piensa que las clulas pierden su multipotencialidad a lo largo de los

numerosos pasajes a los cuales estn sometidas in vitro, y la mayora de ellas son clulas de

transicin. Es posible considerar que esto es un fenmeno de senectud, dado que se observ que

las MSCs humanas experimentan senectud aproximadamente a los 40 repiques; pero este

fenmeno no se advierte en clulas de rata.

TERAPIA GNICA

Las MSC son fcilmente transducibles para una variedad de vectores y pueden considerarse como

vehculos para transferir o reparar genes o bien ser utilizadas como factores para reparar protenas

en desrdenes como, por ejemplo, la hemofilia. Uno de los objetivos importantes de stas tcnicas

es su utilizacin en terapia celular para la reposicin de tejidos daados, o para insertar vectores

gnicos en los tratamientos de enfermedades oncohematolgicas, congnitas, neurodegenerativas

y de inmunodeficiencias, y en aqullas condrales, cardacas y hepticas. Esto constituir la medicina

del futuro, porque al utilizar clulas troncales autlogas en la regeneracin de tejidos daados o

enfermos se evitarn los graves problemas que acarrea el rechazo inmunolgico.

Existen dos formas de utilizar los productos gnicos en el tejido blanco: la terapia gnica in vivo y la

terapia gnica ex vivo. La primera se lleva a cabo, por ejemplo, en el cerebro, con el tratamiento

directo in situ con vectores virales o no virales que expresan el gen o los genes de inters teraputico

y la terapia gnica ex vivo, en la que se utilizan, por ejemplo, clulas de origen neural o no neural

modificadas genticamente in vitro con la expresin deseada, que luego se implantarn en el

sistema nervioso central (SNC).

La transferencia gnica in vivo en las clulas de SNC, empleando vectores virales, constituye una

alternativa importante en el tratamiento de las enfermedades neurolgicas. Una de las ventajas de

este tipo de metodologa es que las clulas del SNC estn mejor equipadas para producir las

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protenas deseadas, ya que poseen los cofactores apropiados, maquinarias necesarias para realizar

las modificaciones postranscripcionales de los productos gnicos y la capacidad de secretar

neurotransmisores u otros compuestos neuroactivos.

CONSIDERACIONES FINALES

A pesar de todas las experiencias realizadas y del gran inters clnico mostrado en los ltimos aos,

nuestros conocimientos sobre la entidad de las MSCs son todava rudimentarios. Es por eso que

varios autores no se ponen de acuerdo: en primer lugar, sobre la definicin de las MSCs, dado que

sus caractersticas difieren entre cada laboratorio y entre especies, y en segundo lugar porque no

se han descubierto todava marcadores especficos que determinen con exactitud su identidad.

Si bien en general se utiliza la misma terminologa, todava no est claro si las clulas obtenidas in

vitro son iguales entre s, y si la capacidad que poseen de permanecer in vitro por largo perodo y

de poder regenerar las mismas clulas al ser transplantadas in vivo en determinadas enfermedades

o carencias es suficiente para incluirlas en la misma categora biolgica. El problema fundamental -

todava no aclarado es la imposibilidad de aislarlas de cualquier tejido y que puedan ser

caracterizadas con exactitud.

Adems, queda la duda acerca de si las clulas obtenidas en un determinado laboratorio son iguales

a las obtenidas en otro, debido a que en general y muy frecuentemente, cada laboratorio sigue un

protocolo diferente, ya sea para aislar a las clulas, como para cultivarlas y conseguir su

diferenciacin. No hay todava certeza acerca de que las MSCs, aisladas con la tcnica de adherencia

al plstico, difieren de aquellas aparentemente similares, que proliferan in vitro en un medio ms

completo y conforman una capa heterognea de clulas llamada capa adherente (feeder layer), que

funciona como un microambiente necesario para el crecimiento y desarrollo de otras SCs, como por

ejemplo las hemopoyticas.

Hay ensayos que muestran que las MSCs aisladas de MO como de SP poseen gran afinidad para los

linfocitos T, de un modo mayor que para los B, demostrando la conveniencia de utilizar las MSCs y

un soporte estromal, para la regeneracin, por ejemplo, del tejido seo, donde estn implicados los

linfocitos T. Esto introduce a un nuevo concepto sobre la interaccin de las MSCs y los linfocitos T,

lo cual evidencia que existe un importante mecanismo para que las clulas funcionen correctamente

y se comuniquen entre s.

La facultad de poder trasplantar clulas mesenquimales autlogas, luego de haber sido inducida su

proliferacin in vitro, confiere grandes ventajas teraputicas, porque se evitan los problemas del

rechazo inmunolgico. Adems, la MO, de la cual se extrae la mayor cantidad de estas clulas, es un

tejido accesible y fcil de obtener con un mtodo incruento y sin riesgo, convirtiendo este tejido en

un proveedor ilimitado de clulas en los casos de querer solucionar defectos o injurias en diferentes

tejidos, sean autlogos o heterlogos. El estroma mesenquimal provee adems una poblacin de

clulas renovable, que crece rpidamente en cultivo y que puede producir diferentes tipos de

clulas utilizando un simple protocolo de diferenciacin.

Las expectativas del beneficio teraputico de todo lo que hemos descripto a partir de la MO son

muy favorables, tanto en la utilizacin de clulas mesenquimales extradas de ella y expandidas in

vitro, como en el trasplante directo de clulas troncales hemopoyticas, cuyo nmero es muy

elevado. Sin embargo, hasta la fecha no se conoce exactamente si todo esto es posible y si con el

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tiempo no se producen efectos colaterales indeseables. En la actualidad, slo contamos con la

posibilidad de la experimentacin in vitro, lo que no invalida los logros, sino que se sigue

considerando a estas tcnicas como muy novedosas y promisorias.

ABREVIATURAS

c- Kit Ligando o SCF Stem cell factor FL feeder layer o estroma medular IL7 Interleuquina 7 IL8 Interleuquina 8 IL 11 Interleuquina 11 LA Lquido amnitico LIF Factor inhibidor leucmico MO Mdula sea MSC Clulas troncales mesenquimal SC Clulas troncales SCU Sangre de cordn umbilical SNC Sistema nervioso central SP Sangre perifrica

REFERENCIA

-Medicina Regenerativa y stem cells. De la Terapia regenerativa a la ingeniera de tejidos. Pablo Argibay. Universidad Nacional de Quilmes Editorial 2005 -http://www.eurostemcell.org/es Clulas madre mesenquimales: las "otras" clulas madre de la mdula sea, 20 Jun 2012