-
Dr. Sergio Sandoval - Dr. Adolfo La roche
CELULAS TRONCALES MESENQUIMALES
CELULAS TRONCALES MESENQUIMALES
Stem cells (SCs)
8 DE AGOSTO DE 2015 DIPLOMADO CELULAS MADRES
ULAC
-
1
LA CLULA TRONCAL MESENQUIMAL
Dr. Sergio Sandoval y Dr. Adolfo La Roche
INTRODUCCIN
Las clulas troncales o stem cells (SCs) se definen como aquellas clulas totipotentes con capacidad
de expandirse indefinidamente y de diferenciarse en ms de un fenotipo. Por lo tanto, son clulas
no especializadas que son capaces, cuando se dividen, de dar origen contemporneamente a una
clula troncal igual a s misma y a una clula precursora (ms diferenciada) e una progenie celular
que a su vez dar origen a otra clula madre. Estas clulas son: totipotentes, porque pueden
desarrollarse en clulas de cualquier especializacin y se pueden encontrar en cualquier tejido;
multipotentes, porque poseen limitada especializacin y pueden encontrarse en unos pocos tejidos;
unipotentes, porque pueden originar un solo tipo de clulas y encontrarse en un solo tejido
No hace muchos aos, se crea que estas clulas se originaban solamente de algunas estructuras
orgnicas de embriones en sus fases iniciales, mientras que ahora se sabe que se pueden encontrar
y extraer tambin de rganos maduros como: mdula sea (MO), sangre perifrica (SP) y sangre
extrada el cordn umbilical y del lquido amnitico.
En estos ltimos tiempos se vio tambin que podan ser obtenidas de otras numerosas estructuras
menos diferenciadas, como por ejemplo el tejido adiposo, y tambin encontrarse en rganos
maduros con la posibilidad de permanecer indiferenciadas durante toda la vida del organismo.
Las SCs que residen en los tejidos mantienen su integridad, especialmente en aquellos que poseen
la caracterstica de proliferar activamente, como la MO, el tracto gastrointestinal, la piel o bien en
otros tejidos que se caracterizan por poseer limitada capacidad regenerativa o de reparacin, como
el sistema nervioso central y el msculo cardaco.
Una pregunta interesante desde el punto de vista biolgico y mdico es: son equivalentes a las SCs
embrionarias? A lo largo del desarrollo podra suceder que estas clulas persistan en estado
embrionario indiferenciado
durante la vida adulta del organismo, o bien que se observen solamente in vitro y que un artefacto
de tcnica durante el perodo prolongado en cual las clulas permanecen en cultivo indujera a
algunas a regresar a estado ms primitivo, con la particularidad de ser reprogramadas a adquirir
propiedades de SCs embrionarias .
-
2
Uno de los tejidos donde mayormente se encuentran estas SCs es MO adulta, a la que llegan en los
ltimos estadios del desarrollo embrionario. Aqu poseen la caracterstica de multipotencialidad que
retienen a largo de su vida, adonde se encuentran junto a clulas ms diferenciad; cuya
potencialidad de desarrollo es ms limitada. Estas clulas normalmente estn programadas para
sustituir a clulas especficas de la MO donde residen, pero en determinadas situaciones pueden
transdiferenciarse y adquirir caractersticas de otros tejidos u rganos. Esto implica una
reprogramacin gentica dentro del ncleo, si bien no se entiende totalmente cul mecanismo
molecular sera el responsable de estos fenmenos.
Generalmente se acepta que una clula comprometida hacia una determinada lnea permanece
estable, manteniendo ese fenotipo bien definido, no pudiendo convertirse en otra lnea ms
especfica. Esto vale tanto para las clulas que se encuentran en un determinado rgano o tejido,
como para aquellas que proliferan in vitro. Sin embargo, hay numerosos ejemplos en los que las
clulas troncales hemopoyticas pueden ser inducidas in vitro a convertirse, bajo ciertos estmulos,
de una lnea a otra, es decir, de originar linajes celulares que no son normalmente encontrados en
ese lugar.
A lo largo de la vida fetal las SCs inician su existencia en primer lugar en el saco vitelino, pasan luego
a las regiones paraartica-esplenopleural y artica-gonadal-mesonfrica, al hgado y bazo, para
establecerse definitivamente, antes del nacimiento, en la MO, donde permanecen durante toda la
vida.
PLASTICIDAD
Las clulas stem poseen una caracterstica importante que se denomina plasticidad. Este fenmeno
consiste en la reprogramacin dentro de la clula de su camino evolutivo normal, que da origen a
nuevos tipos de clulas. Esto se comprueba con la demostracin de que una clula totipotentes,
alojada en un determinado tejido, puede experimentar un cambio clonal es decir puede pasar de
un tipo de tejido a otro diferente espontneamente, contradiciendo el paradigma clsico de que la
diferenciacin de las SCs est restringida a un rgano especfico. Este concepto ha sido sustituido
ahora por la evidencia de que las clulas totipotentes adultas, a lo largo de su existencia, retienen
un cierto grado de plasticidad de desarrollo que les permite dirigirse hacia otras muchas direcciones
de acuerdo a las situaciones en las cuales se encuentra el tejido que las aloja.
Sin embargo, podemos preguntarnos: todos estos hechos son debidos a la plasticidad de las clulas
troncales, o bien ellas se alojan dentro de los tejidos a travs de la circulacin, actuando como
contaminantes? Se ha observado, para citar un ejemplo, que el tejido muscular del esqueleto,
adems de contener progenitores hemopoyticos, tiene tambin clulas neuronales u otro tipo de
clulas que son semejantes a las que se encuentran dentro de la MO y la SP.
As, se ha determinado en los ltimos tiempos, por hallazgos experimentales, que clulas de un
tejido adulto pueden cambiar su fenotipo a otro diferente del tejido en el cual se encuentran,
sugiriendo su capacidad de ser reprogramadas hacia un nuevo destino.
Krause (2001) da un ejemplo en el que se puede observar un esquema de plasticidad de las SCs
alojadas dentro del sistema hemopoytico. Se ve cmo los progenitores linfoides pueden originar
clulas granulocticas y cmo los progenitores granulocticos pueden originar, adems de
granulocitos y macrfagos, eritrocitos y megacariocitos, y los progenitores eritroides ser
-
3
diferenciados adems en granulocitos. Esto explicara, en grandes lneas, por qu las clulas
progenitoras que estn desarrollndose in vitro, en presencia de estimulantes adecuados, pueden
transdiferenciarse y originar otras nuevas lneas celulares.
Hay otros ejemplos en los que las clulas totipotentes circulantes son desviadas de la sangre hacia
rganos slidos para generar tejidos especficos. Los mecanismos implicados en estos fenmenos,
sin embargo, no son conocidos totalmente. Se podra pensar que la injuria que puede afectar a un
tejido que constituye un determinado rgano podra causar cambios en su microambiente haciendo
que las clulas troncales intrnsecas a ese tejido fueran inducidas a reemplazar a las clulas
necrticas endgenas. Este mecanismo podra agotar a estos progenitores y en tal caso a las SCs
circulantes, presentes en la sangre, respondiendo a un estmulo exgeno. stas seran las
encargadas de dirigirse a ese rgano y reparar el tejido daado.
Las conclusiones formuladas en base a los resultados de los estudios recientes sobre la plasticidad
de las SCs adultas contradicen sin embargo los aceptados hasta ahora, segn los cuales la
diferenciacin de una clula progenitora estara restringida solamente a una determinada lnea de
maduracin. Estos conceptos estn dando lugar as a controversias entre diferentes autores.
ADHERENCIA AL SUSTRATO DE LAS CLULAS MESENQUIMALES
En la actualidad, la definicin bsica de SC deriva de su capacidad de autorrenovarse y originar uno
o ms tipo de progenies diferenciadas. Esto vale tanto que ellas se encuentren in vivo o bien in vitro.
En cuanto a su comportamiento in vitro, se ha demostrado que estas clulas, al sembrarlas en
relativa baja concentracin, tienen la capacidad de proliferar, permaneciendo en un estado de
indiferenciacin y de expandirse a travs de numerosas divisiones y repiques celulares; pero al ser
sometidas al proceso de diferenciacin permanecen en ese estado diferenciado solo durante un
corto perodo de tiempo.
Al cultivar MO se observ que algunas clulas, aparentemente de morfologa heterognea, se
adhieren al plstico y forman focos de 2-4 clulas. A los pocos das comienzan a multiplicarse
rpidamente, formando una capa de clulas que luego de varios pasajes adquieren una morfologa
ms homognea. Al principio, las clulas hemopoyticas son elevadas, pero a los pocos das
desaparecen. Las clulas se adhieren a la superficie porque sintetizan una matriz extracelular
constituida por colgeno tipo I, fibronectina, colgeno tipo IV y laminina. Una pequea fraccin de
clulas sintetiza factor VIII asociado al antgeno, pero se cree que probablemente stas sean clulas
endoteliales. Estas clulas adherentes son secretoras de citoquinas de las cuales las ms
importantes son: IL7, IL 8, IL 11 y c-Kit ligando o SCF (Stem Cell Factor). Se pueden cultivar durante
ms de 120 duplicaciones. Su fenotipo es negativo para CD34, CD44, CD 45, c-kit ligando y para el
complejo mayor de histocompatibilidad clase 1 y 2. Las de origen murino tienen similar fenotipo
que las humanas pero requieren la presencia del factor inhibidor leucmico (LIF) para, mantener su
estado indiferenciado in vitro. A estas clulas adherentes al plstico se las denomina: clulas
troncales mesenquimales (MSCs).
La presencia de SCs no hemopoyticas en MO fue sugerida aproximadamente hace 40 aos, pero
solo recientemente se logr hacer proliferar SCs extradas de MO que no posee criterios de clulas
hemopoyticas, sino de clulas ms primitivas de tipo embrionario, a las que se denomina
mesenquimales.
-
4
En el compartimiento de la MO, entre las numerosas poblaciones celulares de morfologa y entidad
bien definida, se encuentran unas clulas especiales indiferenciadas, que poseen la capacidad de
diferenciarse en numerosos otros tipos celulares, como clulas adipognicas, osteognicas,
condrognicas, miognicas, etc., que derivan de las primitivas MSCs, alojadas en la MO.
Se sabe ahora que adems de la MO, el lquido amnitico, en el segundo trimestre del embrin
humano, es un gran proveedor de estas clulas, las que junto con las obtenidas de la sangre de
cordn umbilical (SCU), luego del nacimiento, pueden utilizarse para cotrasplante en los casos de
ciertas enfermedades hematolgicas.
La ventaja de poder obtener y utilizar clulas autlogas multiplicadas in vitro en gran cantidad es
muy grande dado que, adems de poder ser mantenidas in vitro durante un largo perodo sin alterar
aparentemente su pluripotencialidad, pueden diferenciarse en las mltiples lneas celulares que se
necesite en ese momento.
Hay autores que tratan adems de cultivar e identificar clulas extradas de placenta o cordn
umbilical, que poseen tambin la capacidad de diferenciarse en MSCs. Ellos observan, sin embargo,
que el nmero inicial de clulas obtenidas es bajo, as como su potencial de expansin y eficiencia
de diferenciacin in vitro, respecto de las clulas mesenquimales obtenidas de MO, lo cual hace
dificultosa su utilizacin en las varias enfermedades donde se requiere gran nmero de clulas. Pero
todo esto es promisorio debido a que se podran disponer de un nmero ms o menos elevado de
clulas de origen autlogo, en los casos donde se necesite ese tipo de trasplante.
A la capa de clulas de MO que se adhieren al plstico se la llama tambin estroma medular; aqu
las clulas, luego de varios repiques, adquieren una uniformidad morfolgica cuyo valor se acerca
al 98%. Las MSCs tienen la capacidad de expandirse rpidamente duplicando, en cultivo, varias veces
su nmero preservando, sin embargo, su pluripotencialidad. A travs del contacto clula a clula y
en presencia de varios factores de crecimiento, ellas mantienen la viabilidad y la capacidad de
proliferar indefinidamente y de diferenciarse. Se describen, sin embargo, casos donde ellas pueden
transformarse espontneamente en clulas no adherentes con fenotipo CD34+ no mesenquimales..
La poblacin de MSCs, cuyo nmero es muy bajo en diferentes tejidos en la MO adulta tiene una
frecuencia muy elevada, aproximadamente del 0,001%-0,01% de las clulas presentes, decreciendo
con la edad del organismo del cual se las obtiene, lo cual hace que la MO joven sea el ms importante
proveedor de estas clulas.
Hace poco tiempo se ha descubierto que adems de la MO, la SP no es solamente una distribuidora
de SCs hemopoyticas, sino que constituye un sistema que provee clulas con capacidad de
desarrollarse dentro de varios tejidos no hemopoyticos y hasta, en caso de injuria, de reparar
tejidos slidos.
Las MSCs han sido obtenidas y cultivadas en el hombre y en otras especies de mamferos: gatos,
ratas, ratones, perros, cerdos, monos y conejos. Adems de obtenerse de la MO, de la SP, de SCU y
del tejido adiposo, pueden ser obtenidas de numerosos tejidos fetales. Su enriquecimiento se puede
alcanzar cultivndolas, luego de su adhesin al plstico, en un medio simple con una relativa
deprivacin, es decir en un medio bsico sin el agregado de factores de crecimiento.
-
5
Luego de varios repiques, estas clulas, supuestamente mesenquimales, de morfologa uniforme y
con pocos marcadores no especficos, son sometidas a preinduccin y luego de unos das a
diferenciacin utilizando factores especficos de acuerdo al tipo de clula que se quiera obtener.
Son pocos los marcadores que expresan las MSCs. Ellas son negativas para numerosas molculas de
superficie, como CD44, CD49 y CD62, siendo positivas para MHCl y Sea 1. Dado que stos son
heterogneos entre especies, en las clulas crecidas en cultivo se observa una expresin variable de
CD90 (Thi-1), CD117 (c-Kit), SH2 (CD105), SH3 o SH4 (CD73) y STRO-1 que vara adems entre
diferentes laboratorios. Estas discrepancias podran ser debidas a los diferentes mtodos de
aislacin de las clulas, a las diferentes condiciones de cultivo o a las distintas especies animales
utilizadas. Por ello es evidente que los criterios morfolgicos o fenotpicos habituales no pueden ser
utilizados para identificar a estas diferentes clulas, siendo por lo tanto mejor utilizar las
caractersticas funcionales.
Las interacciones entre los receptores de superficie y sus ligandos son necesarias para la adhesin,
la comunicacin y la funcionalidad de estas clulas, mientras que las interacciones clula-clula y
clula-matriz son necesarias para la migracin, el crecimiento y la sobrevida de las mismas, las que
en todos los casos estn influenciadas por la protena integrina.
Hay autores que describen que dentro de la poblacin de MSCs hay una baja proporcin de clulas
con capacidad de diferenciacin triple, mientras que la mayora de la poblacin posee una nica o
bien doble capacidad. Se piensa que las clulas pierden su multipotencialidad a lo largo de los
numerosos pasajes a los cuales estn sometidas in vitro, y la mayora de ellas son clulas de
transicin. Es posible considerar que esto es un fenmeno de senectud, dado que se observ que
las MSCs humanas experimentan senectud aproximadamente a los 40 repiques; pero este
fenmeno no se advierte en clulas de rata.
TERAPIA GNICA
Las MSC son fcilmente transducibles para una variedad de vectores y pueden considerarse como
vehculos para transferir o reparar genes o bien ser utilizadas como factores para reparar protenas
en desrdenes como, por ejemplo, la hemofilia. Uno de los objetivos importantes de stas tcnicas
es su utilizacin en terapia celular para la reposicin de tejidos daados, o para insertar vectores
gnicos en los tratamientos de enfermedades oncohematolgicas, congnitas, neurodegenerativas
y de inmunodeficiencias, y en aqullas condrales, cardacas y hepticas. Esto constituir la medicina
del futuro, porque al utilizar clulas troncales autlogas en la regeneracin de tejidos daados o
enfermos se evitarn los graves problemas que acarrea el rechazo inmunolgico.
Existen dos formas de utilizar los productos gnicos en el tejido blanco: la terapia gnica in vivo y la
terapia gnica ex vivo. La primera se lleva a cabo, por ejemplo, en el cerebro, con el tratamiento
directo in situ con vectores virales o no virales que expresan el gen o los genes de inters teraputico
y la terapia gnica ex vivo, en la que se utilizan, por ejemplo, clulas de origen neural o no neural
modificadas genticamente in vitro con la expresin deseada, que luego se implantarn en el
sistema nervioso central (SNC).
La transferencia gnica in vivo en las clulas de SNC, empleando vectores virales, constituye una
alternativa importante en el tratamiento de las enfermedades neurolgicas. Una de las ventajas de
este tipo de metodologa es que las clulas del SNC estn mejor equipadas para producir las
-
6
protenas deseadas, ya que poseen los cofactores apropiados, maquinarias necesarias para realizar
las modificaciones postranscripcionales de los productos gnicos y la capacidad de secretar
neurotransmisores u otros compuestos neuroactivos.
CONSIDERACIONES FINALES
A pesar de todas las experiencias realizadas y del gran inters clnico mostrado en los ltimos aos,
nuestros conocimientos sobre la entidad de las MSCs son todava rudimentarios. Es por eso que
varios autores no se ponen de acuerdo: en primer lugar, sobre la definicin de las MSCs, dado que
sus caractersticas difieren entre cada laboratorio y entre especies, y en segundo lugar porque no
se han descubierto todava marcadores especficos que determinen con exactitud su identidad.
Si bien en general se utiliza la misma terminologa, todava no est claro si las clulas obtenidas in
vitro son iguales entre s, y si la capacidad que poseen de permanecer in vitro por largo perodo y
de poder regenerar las mismas clulas al ser transplantadas in vivo en determinadas enfermedades
o carencias es suficiente para incluirlas en la misma categora biolgica. El problema fundamental -
todava no aclarado es la imposibilidad de aislarlas de cualquier tejido y que puedan ser
caracterizadas con exactitud.
Adems, queda la duda acerca de si las clulas obtenidas en un determinado laboratorio son iguales
a las obtenidas en otro, debido a que en general y muy frecuentemente, cada laboratorio sigue un
protocolo diferente, ya sea para aislar a las clulas, como para cultivarlas y conseguir su
diferenciacin. No hay todava certeza acerca de que las MSCs, aisladas con la tcnica de adherencia
al plstico, difieren de aquellas aparentemente similares, que proliferan in vitro en un medio ms
completo y conforman una capa heterognea de clulas llamada capa adherente (feeder layer), que
funciona como un microambiente necesario para el crecimiento y desarrollo de otras SCs, como por
ejemplo las hemopoyticas.
Hay ensayos que muestran que las MSCs aisladas de MO como de SP poseen gran afinidad para los
linfocitos T, de un modo mayor que para los B, demostrando la conveniencia de utilizar las MSCs y
un soporte estromal, para la regeneracin, por ejemplo, del tejido seo, donde estn implicados los
linfocitos T. Esto introduce a un nuevo concepto sobre la interaccin de las MSCs y los linfocitos T,
lo cual evidencia que existe un importante mecanismo para que las clulas funcionen correctamente
y se comuniquen entre s.
La facultad de poder trasplantar clulas mesenquimales autlogas, luego de haber sido inducida su
proliferacin in vitro, confiere grandes ventajas teraputicas, porque se evitan los problemas del
rechazo inmunolgico. Adems, la MO, de la cual se extrae la mayor cantidad de estas clulas, es un
tejido accesible y fcil de obtener con un mtodo incruento y sin riesgo, convirtiendo este tejido en
un proveedor ilimitado de clulas en los casos de querer solucionar defectos o injurias en diferentes
tejidos, sean autlogos o heterlogos. El estroma mesenquimal provee adems una poblacin de
clulas renovable, que crece rpidamente en cultivo y que puede producir diferentes tipos de
clulas utilizando un simple protocolo de diferenciacin.
Las expectativas del beneficio teraputico de todo lo que hemos descripto a partir de la MO son
muy favorables, tanto en la utilizacin de clulas mesenquimales extradas de ella y expandidas in
vitro, como en el trasplante directo de clulas troncales hemopoyticas, cuyo nmero es muy
elevado. Sin embargo, hasta la fecha no se conoce exactamente si todo esto es posible y si con el
-
7
tiempo no se producen efectos colaterales indeseables. En la actualidad, slo contamos con la
posibilidad de la experimentacin in vitro, lo que no invalida los logros, sino que se sigue
considerando a estas tcnicas como muy novedosas y promisorias.
ABREVIATURAS
c- Kit Ligando o SCF Stem cell factor FL feeder layer o estroma medular IL7 Interleuquina 7 IL8 Interleuquina 8 IL 11 Interleuquina 11 LA Lquido amnitico LIF Factor inhibidor leucmico MO Mdula sea MSC Clulas troncales mesenquimal SC Clulas troncales SCU Sangre de cordn umbilical SNC Sistema nervioso central SP Sangre perifrica
REFERENCIA
-Medicina Regenerativa y stem cells. De la Terapia regenerativa a la ingeniera de tejidos. Pablo Argibay. Universidad Nacional de Quilmes Editorial 2005 -http://www.eurostemcell.org/es Clulas madre mesenquimales: las "otras" clulas madre de la mdula sea, 20 Jun 2012