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ISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN INHIBIDOR
DE ASPÁRTICO PROTEASA VEGETAL ESPECÍFICO CONTRA LAS
ASPÁRTICO PROTEASAS DE LA BROCA DEL CAFÉ
DIANA MARÍA MOLINA VINASCO
CÓDIGO: 197933
Trabajo de grado presentado para optar al título de Doctor en Ciencias-Química
DIRIGIDO POR:
Dr. HUMBERTO ZAMORA ESPITIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Bogotá, 2010
2
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mis agradecimientos a la Universidad Nacional, que me permitió
realizar el Doctorado en química y a los profesores en especialmente al Doctor
Humberto Zamora Espítia, quienes contribuyeron en mi formación profesional y
personal.
Deseo expresar mis sinceros agradecimientos al Doctor Gabriel Cadena Gómez por su
apoyo y confianza durante su gestión como director de Cenicafé, así como a los
Doctores de la disciplina de Mejoramiento Genético, Gabriel Alvarado y Pilar
Moncada. Quiero destacar la colaboración del Dr. Hernando Cortina en la revisión de la
tesis y en los análisis estadísticos; y agradecer su gran apoyo y amistad en todos los
años de mi trabajo en Cenicafé. También agradezco al Señor Hernán Diaz, por su
colaboración en las actividades del laboratorio. De manera especial, le doy gracias al
químico Aristófeles Ortiz de la disciplina de Fisiología vegetal por su colaboración en la
purificación de las proteínas. También, agradezco a todas las personas de Cenicafé que
estuvieron directa e indirectamente vinculadas con mi trabajo y me colaboraron en el
desarrollo de la tesis: Dr. Alvaro Gaitán, Dra. Carmenza Góngora, Dr. Nestor Riaño,
Bsc. Claudia Martinez, Bsc. Leonardo Cárdenas.
Deseo agradecer a Colciencias, por la financiación de mi posgrado, que incluyó una
pasantía en el CINVESTAV (México), la cual me enriqueció profesional y
personalmente. Así mismo extiendo mis agradecimientos a los investigadores del
CINVESTAV, en especial al Doctor Alejandro Blanco-Labra quién me permitió realizar
parte de mi tesis doctoral y me dirigió durante el tiempo que estuve en este centro de
investigaciones.
Agradezco al Ministerio de Agricultura y desarrollo Rural, por la financiación del
proyecto de investigación para llevar a cabo la tesis.
3
Una mención especial de agradecimiento quiero ofrecer al ingeniero químico Oscar
Hernández, de la Universidad Nacional sede Manizales, por su tiempo y colaboración
en el análisis cinético que se realizó en la tesis.
Agradezco a mi familia: Diego, Gloria, Claudia, Milena, Víctor y Pablo por brindarme
amor, fortaleza y apoyo incondicional durante todo este tiempo los cuales fueron
esenciales en los momentos más difíciles.
Agradezco a mis amigos María de Jesús Alvarado y Ángela Jaramillo. Muy
especialmente a Dios por brindarme paciencia, tolerancia y sabiduría durante esta etapa
de mi vida.
4
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 21
2. OBJETIVOS 23
2.1 GENERAL 23
2.2 ESPECÍFICOS 23
CAPÍTULO I 24
3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 24
3.1 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS 24
3.1.1 Clasificación de las enzimas proteolíticas 25
3.1.1.1 Aspártico proteasas 25
3.2 INHIBIDORES DE PROTEASAS 26
3.2.1 Propiedades de los IPs de plantas 28
3.2.2 Distribución y localización de los IPs de plantas 29
3.2.3 Características de los IPs 31
3.2.4 Principales funciones de los IPs de plantas 32
3.2.4.1 Almacenamiento 32
3.2.4.2 Control de la proteólisis celular 32
3.2.4.3 Defensa contra plagas 33
3.2.4.3.1 Señales locales 33
3.2.4.3.2 Señales sistémicas 34
3.2.5 Modo de acción de los IPs contra insectos 36
3.2.6 Clases de inhibidores de proteinasas 39
3.2.6.1 Inhibidores de serín proteinasas 37
3.2.6.2 Inhibidores de cisteín proteinasas 38
3.2.6.3 Inhibidores de aspártico proteasas 39
5
3.3 LUPINUS (Lupinus bogotensis, Benth) 40
3.3.1 Origen de L. bogotensis 41
3.3.2 Clasificación de L. bogotensis 41
3.3.3 Descripción de L. bogotensis 41
3.3.4 Nutrientes de L. bogotensis 43
3.4 LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, Ferrari) 43
3.4.1 Origen y distribución 44
3.4.2 Ciclo de vida 44
3.4.3 Pérdidas económicas ocasionadas por H. hampei 46
4. MATERIALES Y MÉTODOS 47
4.1 ESPECIES VEGETALES 47
4.2 INSECTOS 47
4.3 REACTIVOS 47
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LAS ASPÁRTICO PROTEASAS DE H. hampei 48
4.4.1 Extracción de las aspártico proteasas de H. hampei 48
4.4.2 Actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei 48
4.4.3 Zimograma en gel de las aspártico proteasas de H. hampei 49
4.4.4 Actividad de las aspártico proteasas de H. hampei en función del pH 49
4.4.5 Inhibición de la actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei
por inhibidores de proteasas 50
4.5 EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE PROTEASAS EN LAS SEMILLAS DE PLANTAS 50
6
4.5.1 Zimogramas de inhibidores de las aspártico proteasas de semillas de plantas 51
4.5.1.1 Zimogramas del inhibidor 51
4.5.1.2 Zimogramas de inhibición en gel 52
4.5.2 Ensayos de inhibición 52
4.6 PURIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE PROTEASAS DE
L.bogotensis 53
4.6.1 Eliminación de pigmentos 53
4.6.2 Microprecipitación con (NH4)2SO4 53
4.6.3 Ultrafiltración con membrana de 30 kDa 54
4.6.4 Cromatografía de intercambio aniónico Q sepharosa 54
4.6.5 Elución del inhibidor de las aspártico proteasas a partir del gel de acrilamida 55
4.6.6 Determinación de proteína 55
4.6.7 Electroforesis 56
4.7 CARACTERIZACIÓN DE LOS INBIDORES DE ASPÁRTICO
PROTEASAS 56
4.7.1 Determinación de la masa molecular 56
4.7.2 Determinación del punto isoeléctrico (pI) del inhibidor de aspártico proteasa 56
4.7.3 Estabilidad de la actividad del inhibidor de aspártico proteasa 57
4.7.3.1 Efecto de la temperatura 57
4.7.3.2 Efecto del pH 57
4.7.4 Determinación de la presencia de carbohidratos 58
4.7.5 Secuencia de aminoácidos de los inhibidores de aspártico proteasas 58
4.7.6 Cinética de inhibición y determinación de la constante de inhibición de
IAPLb4 59
4.8 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DEL INHIBIDOR DE ASPÁRTICO PROTEASAS 59
4.8.1 Extracción de ARN total 59
4.8.2 Síntesis y clonación del ADN complementario (ADNc) 59
4.8.3 Extracción de ADN total 60
7
4.8.4 Amplificación mediante PCR del gen IAPLb4 61
4.8.5 Análisis de las secuencias 62
4.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 62
5. RESULTADOS 64
5.1 IDENTIFICACIÓN DE LAS ASPÁRTICO PROTEASAS DE H. hampei 64
5.1.1 Actividad proteolítica en el intestino medio de H. hampei 64
5.1.2 Zimograma en gel de las aspártico proteasas de H. hampei. 64
5.1.3 Actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei en función
del pH 66
5.1.4 Inhibición de la actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H.hampei por IPs 67
5.2 EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE PROTEASAS EN LAS SEMILLAS DE PLANTAS 69
5.2.1 Extracción de los IPs de los extractos de L. bogotensis y B. humidicola 69
5.2.2 Identificación de los IPs de las aspártico proteasas de H. hampei en semillas de plantas 70
5.2.3 Inhibición de las APH y pepsina por los IPs aspártico de L. bogotensis (IAPLb) 71
5.2.4 Inhibición de las APH por los IPs de Brachiaria humidicola e Hyptis
suaveolens 72
5.2.5 Zimogramas en gel para la identificación de IPs aspártico en extractos proteínicos de plantas 73
5.2.6 Zimogramas de inhibición en gel 74
5.3 PURIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LAS ASPÁRTICO
PROTEASAS DE H. hampei A PARTIR DE L. bogotensis 76
5.3.1 Eliminación de pigmentos 76
5.3.2 Microprecipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4 78
5.3.3 Ultrafiltración con membrana de 30 kDa 82
8
5.3.4 Cromatografía de intercambio aniónico Q sepharosa 84
5.3.5 Esquema de purificación del inhibidor de aspártico proteasas IAPLb4 89
5.3.6 Esquema de purificación del inhibidor de aspártico proteasas IAPLb5 91
5.4 CARACTERIZACIÓN DE LOS INBIDORES DE ASPÁRTICO
PROTEASAS 92
5.4.1 Determinación de la masa molecular 92
5.4.1.1 análisis MALDI-TOF del inhibidor de las aspártico proteasas IAPLb4 92
5.4.1.2 análisis MALDI-TOF del inhibidor de las aspártico proteasas IAPLb5 93
5.4.1.3 análisis MALDI-TOF de los inhibidores de las aspártico proteasas IAPLb6 e
IAPLb7 93
5.4.2 Determinación del punto isoeléctrico (pI) del inhibidor de las aspártico
proteasas IAPLb4 95
5.4.3 Estabilidad de la actividad del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb4 96
5.4.3.1 Efecto de la temperatura 96
5.4.3.2 Efecto del pH 96
5.4.4 Determinación de la presencia de carbohidratos de IAPLb4 98
5.4.5 Análisis de la secuencia de aminoácidos de los inhibidores de aspártico
proteasas 99
5.4.5.1 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb4 99
5.4.5.2 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb5 101
5.4.5.3 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb6 e IAPLb7 101
5.4.5.4 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb1 103
5.4.5.5 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb2 103
5.4.5.6 Análisis de la secuencia amino-terminal IAPLb3 103
5.4.5.7 Análisis de la secuencia carboxi-terminal IAPLb4 107
5.4.6 Efecto del inhibidor IAPLb4 sobre las aspártico proteasas de H. hampei 108
5.4.7 Cinética de inhibición y determinación de la constante de inhibición de
IAPLb4 110
5.5 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DEL INHIBIDOR DE
ASPÁRTICO PROTEASAS 113
9
5.5.1 Extracción de ARN total 113
5.5.2 Librerías RACE, Síntesis de ADNc y PCR para amplificar el gen del inhibidor IAPLb4 113
5.5.3 Extracción de ADN genómico y PCR del gen del inhibidor IAPLb4 118
5.5.4 Análisis de la secuencia de aminoácidos del inhibidor IAPLb4 derivada a partir de las secuencia de nucleótidos 122
6. DISCUSIÓN 123
7. CONCLUSIONES 137
8. PERSPECTIVAS 139
9. BIBLIOGRAFÍA 141
10. ANEXOS 172
9.1 Anexo 1. Análisis de contrastes de la extracción de IPs, variable UI 172
9.2 Anexo 2. Análisis de varianza de la extracción de IPs, variable UI 173
9.3 Anexo 3. Análisis de varianza de la identificación de los IPs en semillas 174
9.4 Anexo 4. Análisis de varianza de la precipitación con (NH4)2SO4 175
9.5 Anexo 5. Determinación del péptido señal 178
9.6 Anexo 6. Producción científica...............................................................................180
9.7. Anexo 7. An inhibitor from Lupinus bogotensis seeds effective against aspartic
proteases from Hypothenemus hampei An inhibitor.................................................... 182
LISTA DE TABLAS
Tabla Nombre No. de Pág.
1 Inhibidores de cisteín, aspártico y metalo proteinasas (Laskowski y Kato, 1980)
27
2
Algunas familias de proteínas que contienen IP (Reeck et al., 1997)
29
3
Actividad proteolítica de las APH.
64
4
Porcentaje de actividad proteolítica de las APH y pepsina usando
68
10
hemoglobina y BSA como sustrato.
5
Actividad inhibidora de los IPs de las semillas de L. bogotensis y B. humidicola contra las APH
69
6
Actividad inhibidora de los IPs de las semillas de L. bogotensis, B. humidicola, A. hypochondriacus e H. suaveolens contra las APH.
71
7
Actividad inhibidora del extracto crudo de L. bogotensis con y sin pigmentos contra las APH
78
8
Actividad inhibidora del extracto proteínico de las semillas de L. bogotensis, precipitado con (NH4)2SO4, contra las APH
80
9
Actividad inhibidora del extracto proteínico de L. bogotensis, separado por ultrafiltración membrana 30 kDa, contra las APH
83
10
Actividad inhibidora de IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4 e IAPLb5 aislados de L. bogotensis contra las APH
85
11
Actividad inhibidora de IAPLb6 e IAPLb7 contra las APH.
88
12 Pasos de purificación de IAPLb4 89
13
Pasos de purificación de IAPLb5
91
14
Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb4 con vicilina, precursor β-conglutina de L. albus y conglutina beta de L. angustifolius
100
Tabla
Nombre
No. de Pág.
15
Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb5 con vicilina, precursor β-conglutina de L. albus y conglutina beta de L. angustifolius
102
16
Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb6 e IAPLb7 con δ-conglutina de L. angustifolius y δ-conglutina-2-cadena pequeña Lupinus
102
17
Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb1 con vicilina, precursor β-conglutina de L. albus y conglutina beta de L. angustifolius
105
11
18 Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb2 con vicilina, precursor β-conglutina de L. albus y conglutina beta de L. angustifolius
105
19
Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb3 con vicilina, precursor β-conglutina de L. albus y conglutina beta de L. angustifolius
106
20
Alineación de la secuencia carboxi-terminal de IAPLb4 con la beta conglutina y la proteína de almacenamiento de L. angustifolius.
109
21
Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4, producto de PCR usando ADNc librería 5´ antisentido.
115
22
Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4, producto de PCR usando ADNc librería 3´ sentido.
116
23
Identidad de la secuencia de aminoácidos del gen IAPLb4
121
24
Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4
121
25
Composición de aminoácidos de IAPLb4
123
12
LISTA DE FIGURAS
Figura
Nombre
No. de Pág.
1
Vía de traducción de señales intracelulares de la expresión de los genes de IPs (Koiwa et al., 1997)
35
2
A. L. bogotensis del herbario de la Universidad de Antioquia. B. Flores de L. bogotensis. C. Hojas L. bogotensis.
42
3
Ciclo de vida de H. hampei
45
4
Actividad proteolítica de las APH, absorbancia a 280 nm en función de la concentración de proteína (g) del extracto del insecto
65
5
Actividad proteolítica de las APH, absorbancia a 280 nm en función del tiempo (min)
65
6
Zimograma de la actividad APH usando un perfil electroforético (PAGE) al 16%. A. Intestinos. B. Adultos H. hampei.
66
7
Actividad (UI ml-1) de las APH en función del pH
67
8
Porcentaje de inhibición de la actividad APH en función de la concentración de pepstatina A (M)
68
9
Porcentaje de inhibición de las APH y pepsina en función de la concentración de proteína (µg) de los IAPLb.
72
10
Porcentaje de inhibición de las APH en función de la concentración de proteína (mg) de B. humidicola y H. suaveolens
73
11
Perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% de los extractos proteínicos de las semillas de plantas
74
12
Zimograma usando un perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% de los extractos proteínicos de las semillas de plantas
75
13
Zimograma de inhibición de las APH, por IPS de los extractos proteínicos usando un perfil electroforético (PAGE) al 10%
75
14
Perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% de los IPs del extracto proteínico de L. bogotensis con pigmentos
77
15
Perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% de los IPs del extracto proteínico de L. bogotensis sin pigmentos
77
16
Microprecipitación con (NH4)2SO4 de las proteínas del extracto proteínico de L. bogotensis.
79
13
Figura
Nombre
No. de Pág.
17
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la microprecipitación con (NH4)2SO4 del extracto proteínico de L. bogotensis, saturación 20-50%.
81
18
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la microprecipitación con (NH4)2SO4 del extracto proteínico de L. bogotensis, saturación 60-80%.
81
19
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 10% de la purificación de IAPLb hasta ultrafiltración.
83
20
Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharosa de los IPs: IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4, IAPLb5.
84
21
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de IAPLb4 e IAPLb5
86
22
Zimograma de IAPLb4 e IAPLb5 usando un perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16%
87
23
Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharosa de los IPs: IAPLb6 e IAPLb7.
87
24
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de IAPLb6 e IAPLb7
88
25
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la purificación de IAPLb4
90
26
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la purificación de IAPLb5
92
27
Espectrometría de masas Maldi-Tof de IAPLb4
94
28
Espectrometría de masas Maldi-Tof de IAPLb5
94
29 Espectrometría de masas Maldi-Tof de IAPLb6 e IAPLb7 95
30 Isoelectroenfoque de IAPLb4
96
31
Porcentaje de actividad residual de IAPLb4 en función de la temperatura
97
32
Porcentaje de actividad residual de IAPLb4 en función del pH
97
33
Determinación de la presencia de carbohidratos de IAPLb4
98
34
Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16.5% de IAPLb4 digerido con Glu-C
107
14
Figura
Nombre No. de Pág.
35
Porcentaje de actividad residual de las APH en función de la concentración de IAPLb4 µg (sustrato hemoglobina).
110
36
Actividad residual de las APH en función del logaritmo de la concentración de IAPLb4 (sustrato hemoglobina)
110
37
Porcentaje de actividad residual de pepsina en función de la relación molar IAPLb4:pepsina
111
38
Gráfica Dixon constante de inhibición de pepsina por el inhibidor IAPLb4. Inverso de la velocidad de reacción en función de la concentración IAPLb4 (µM)
112
39
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de ARN total de la semilla de L. bogotensis
114
40
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de las librerías de ADNc
114
41
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de ADNc 5´ RACE ligado al vector p-GEM
115
42
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de ADNc 3´ RACE ligado al vector P-GEM
116
43
Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del gen que codifica IAPLb4 aislado de ADNc
117
44
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de ADN genómico de la semilla de L. bogotensis
119
45 Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR usando ADN con iniciadores del extremo 3´ y 5´ de ADNc del gen que codifica IAPLb4.
119
46
Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del gen que codifica IAPLb4 a partir de ADN genómico de L. bogotensis
120
15
ABREVIATURAS
ABA Ácido abscísico ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc Ácido desoxirribonucleico copia AeTI Inhibidor de tripsina-Kunitz de Archidendron ellipticum ARN Ácido ribonucleico APH Aspártico proteasas de H. hampei ApTI Inhibidor de tripsina Kunitz de Adenanthera pavonica BgPI Inhibidor Bowman-Birk de Vigna mungo BrTI Inhibidor de tripsina de Bauhinia rufa BWI-2b Inhibidor de tripsina de trigo cm Centímetro DMTI Inhibidor de tripsina de Dimorphandra mollis GEBP Proteína de unión inducida por -glucano EDTA Etilendiaminotetraacético h Hora HSTI Inhibidor de tripsina de Hyptis suaveolens IAPLb Inhibidor de aspártico proteasas de Lupinus bogotensis. ILTI Inhibidor tripsina-Kunitz de Inga Laurina IP Inhibidor de proteasas ITCp Inhibidor de tripsina de caupí kDa Kilo Dalton KI Inhibidor de tripsina Kunitz de soya LaBBI Inhibidor Bowman-Birk Lupinus albus L Litro MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight ml Milílitro MC Multicistatina MIB Manejo Integrado de Broca
16
min Minuto mm Milímetro mti-2 Gen inhibidor de tripsina de mostaza PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDI Inhibidor de catepsina D de papa PdKI-2 Inhibidor tripsina-papaina Pithecelobium dumosum PRTI Inhibidor de tripsina de Putranjiva roxburghii SaPIN2a Inhibidor de serín proteinasas de Solanum americanum SBTI Inhibidor de tripsina de soya scN Soyacistatina scN SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide gel SPC Inhibidor de quimotripsina de Schizolobium parahyba SQAPI Inhibidor de aspártico proteinasas de Cucurbita máxima SR160 Receptor superficie celular sistemina de 160 kDa TTI Inhibidor de tripsina de Tamarindos indica UI ml-1 Unidades de inhibición por ml UI Unidades de inhibición totales UI mg-1 Actividad específica UIT Unidades de inhibición de tripsina UIA Unidades de inhibición Aspártico VrAP Aspártico proteasas de Vigna radiata VrAPI Inhibidor de aspártico proteasas de Vigna radiata
17
RESUMEN
La broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) es la más grave plaga de café (Coffea
arabica) en Colombia y el mundo. Este insecto que se alimenta y crece en el
endospermo de café requiere de enzimas proteolíticas para la digestión de las proteínas
del alimento. La presencia de actividad proteolítica tipo aspártico en el intestino medio
de larvas y adultos de H. hampei, ofrece una alternativa para el control del insecto. Este
trabajo describe la identificación, purificación y caracterización del primer inhibidor de
las aspártico proteasas de H. hampei, así como la clonación del gen que codifica un
inhibidor de las aspártico proteasas de este coleóptero. Extractos de semillas de Lupinus
bogotensis, Brachiaria humidicola, Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus
acutifolius, Phaseolus coccineus, Hyptis suaveolens, Centrosema pubescens y Trifolium
repens se evaluaron con el fin de identificar inhibidores de las aspártico proteasas. La
mayor actividad inhibidora se encontró en el extracto de L. bogotensis. Los inhibidores
de proteasas aislados de las semillas de L. bogotensis, se purificaron mediante
eliminación de pigmentos, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de
intercambio aniónico y elución de la proteína del gel. Los inhibidores de las aspártico
proteasas de Lupinus bogotensis (IAPLb) se designaron como: IAPLb1, IAPLb2,
IAPLb3, IAPLb4, IAPLb5, IAPLb6 e IAPLb7. Los inhibidores IAPLb1, IAPLb2,
IAPLb3, IAPLb4, IAPLb5 están constituidos por una cadena polipeptídica, su secuencia
amino-terminal mostró identidad con vicilinas y -conglutinas de Lupinus albus. Esto
sugiere que estas proteínas podrían ser codificadas por una familia de genes. Los
inhibidores IAPLb6 e IAPLb7 están constituidos por una cadena polipeptídica con una
masa molecular de 12,86 y 16,91 kDa, respectivamente, y su secuencia amino-terminal
tiene identidad con la -conglutina de L. albus. IAPLb4 produjo la mayor inhibición de
las aspártico proteasas de H. hampei, este inhibidor tiene una masa molecular de 12,84
kDa determinada por Maldi-Tof y está compuesto por una cadena polipeptídica con un
punto isoeléctrico de 4,5. Su secuencia amino-terminal tiene una alta identidad con
proteínas de almacenamiento de las semillas, vicilinas y beta conglutinas de L. albus y
Lupinus angustifolius. La identidad de IAPLb4 con las vicilinas sugiere un posible
papel de defensa para estas proteínas de almacenamiento y que los IPs son proteínas
18
multifuncionales que no sólo inhiben las aspártico proteasas, sino que también son
capaces de unirse a las estructuras que contienen quitina en el intestino medio de
coleópteros. IAPLb4 mantuvo un 100% de actividad inhibitoria a 70 C pero fue
inestable a 100 C. También, fue estable en un amplio rango de pH 2 a 11 a 30 C. En
ensayos in vitro IAPLb4 fue altamente efectivo contra las aspártico proteasas de H.
hampei con una concentración inhibitoria media (CI50) de 2,9 g. IAPLb4 inhibe
pepsina en una relación estequiométrica 1:1 y una constante de inhibición (Ki) de 3,1
M. El gen que codifica el inhibidor IAPLb4 corresponde a un único marco de lectura
abierta de 354 nucleótidos que codifica para un polipéptido de 117 aminoácidos, como
otros inhibidores de proteasas, IAPLb4 no tiene intrones. Esta secuencia tiene un
péptido señal con el sitio de ruptura entre las posiciones AYG-EK. Probablemente esta
secuencia se pierde durante la maduración del inhibidor nativo y representa el 32% de la
proteína traducida. El gen que codifica IAPLb4 podría ser una herramienta promisoria
para producir plantas de café resistentes a H. hampei. Este trabajo confirmó la
existencia de IPs en las semillas de Lupinus spp contrario a lo que se había publicado de
la falta de actividad inhibitoria en L. albus y Lupinus luteus.
19
SUMMARY
The coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari), is the most devastating pest
affecting coffee crops (Coffea arabica) not only in Colombia but worldwide. This insect
feeds and grows on the coffee bean endosperm, needing proteolytic enzymes for
digestion. The presence of aspartic proteolytic activity in the mid-gut of H. hampei
larvae and adults offers an alternative for insect control. This work describes the
identification, purification, and characterization of the first inhibitor of aspartic
proteases of H. hampei, as well as the cloning of gene encoding an inhibitor of aspartic
proteases of this beetle. Extracts of seeds of Lupinus bogotensis, Brachiaria humidicola,
Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus, Hyptis
suaveolens, Centrosema pubescens, and Trifolium repens were evaluated to identify
aspartic protease inhibitors. The greatest inhibitory activity was found in the L.
bogotensis extract. Protease inhibitors isolated from L. bogotensis seeds were purified
by pigment elimination, precipitation with ammonium sulfate, anionic exchange
chromatography, and protein gel elution. Aspartic protease inhibitors of L. bogotensis
(LbAPI) were designated as LbAPI1, LbAPI2, LbAPI3, LbAPI4, LbAPI5, LbAPI6, and
LbAPI7. Among these, LbAPI1, LbAPI2, LbAPI3, LbAPI4, and LbAPI5 have a single
polypeptide chain and its amino-terminal sequence showed features similar to the
vicilins and -conglutins of L. albus, suggesting that these proteins could be coded by a
family of genes. LbAPI6 is composed by a polypeptide chain with a molecular mass of
12,86 kDa, and LbAPI7 by a polypeptide chain with a molecular mass of 16,91 kDa.
The amino-terminal sequence of LbAPI6 and LbAPI7 has identity with the -conglutin
of L. albus. LbAPI4 triggered the greatest inhibition of aspartic proteases of H. hampei;
this inhibitor has a molecular mass of 12,84 kDa determined by Maldi-Tof; LbAPI4 is
composed by a single polypeptide chain with an isoelectric point of 4,5. Its amino-
terminal sequence is similar with seed storage proteins, vicilins, and - conglutins of L.
albus and L. angustifolius. The identity of LbAPI4 with vicilins of L. albus suggests that
these storage proteins may play a defense role. LbAPI4 maintained 100% inhibitory
activity at 70 C, but was unstable at 100 C. It was also stable in a broad range of pH
from 2 to 11 at 30 C. In in vitro tests, LbAPI4 was highly effective against the aspartic
20
proteases of H. hampei, with a half maximal inhibitory concentration (CI50) of 2.9 g.
LbAPI4 inhibits pepsin at a stoichiometric ratio of 1:1 and an inhibition constant (Ki) of
3.1 m. The gene that codes the LbAPI4 inhibitor corresponds to a sole open reading
frame of 354 nucleotides that code for a polypeptide of 117 amino acids. Just like other
protease inhibitors, its genomic sequence does not have introns. This sequence has a
signal peptide with a cleavage site between positions AYG-EK. This sequence is
probably lost during the maturation of the native inhibitor and accounts for 32% of the
translated protein. The gene that codes LbAPI4 could be a promising tool to produce
coffee plants resistant to H. hampei. This work confirmed the existence of protease
inhibitors in Lupinus spp. seeds, contradicting former reports of the lack of protease
inhibitory activity in L. albus and Lupinus luteus.
DESCRIPTORES: Lupinus bogotensis; Leguminosae; inhibidor de aspártico proteasas;
vicilinas; Hypothenemus hampei; proteasa; defensa de plantas.
KEY WORDS: Lupinus bogotensis; Leguminosae; aspartic protease inhibitor; vicilins;
Hypothenemus hampei; protease; plant defense.
21
1. INTRODUCCIÓN
El café (Coffea spp., Rubiaceae) es el producto agrícola más importante en 70 países de
la región tropical húmeda (Baker et al., 2001). En Colombia, el cultivo de café
representa el 12,4 % del producto interno bruto agropecuario (MADR, 2008). La broca
del café Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleóptera: Curculionidae: Scolytinae) (Le
Pelley, 1968) es el insecto que causa las pérdidas económicas más graves en la
producción de café (Duque y Baker, 2003).
Muchos caficultores dependen del control de H. hampei con insecticidas como
endosulfan, clorpirifos, pirimifos metil y fenitrothion (Villalba et al. 1995). La creciente
preocupación ambiental y el incremento de la resistencia de H. hampei a los insecticidas
(Brun et al. 1989; Navarro et al. 2010) han estimulado la búsqueda de estrategias de
control amigables con el medio ambiente (Jaramillo et., 2006). Entre estas estrategias,
diversas proteínas vegetales tienen potencial para el control de insectos incluyendo las
lectinas, las proteínas de inactivación de ribosomas, los inhibidores de proteasas (IPs),
los inhibidores de -amilasas y las proteínas de almacenamiento de las semillas,
vicilinas, leguminas y arcelinas (Macedo et al., 2007a; Bertholdo-Vargas et al., 2009;
Prasad et al., 2010; Silva et al., 2007; Uchoa et al., 2006; Velten et al., 2007). Un
inhibidor de α-amilasa extraído de las semillas de Phaseolus vulgaris L., fue activo
contra las α-amilasas de H. hampei (Valencia et al., 2000).
Las aspártico proteasas se han encontrado en especies del orden coleóptera tales como:
Callosobruchus maculatus (Silva y Xavier-Filho, 1991), Zabrotes subfasciatus (Lemos
et al., 1990; Silva y Xavier-Filho, 1991), Leptinotarsa decemlineata (Wolfson y
Murdock, 1987); Acanthoscelides obtectus (Wieman y Nielsen, 1987), Tribolium
castaneum (Blanco-Labra et al., 1996), Diabrotica undecimpunctata howardi (Liu et
al., 2004), e H. hampei (Preciado et al., 2000). En estos insectos el pH ácido del
intestino medio proporciona un ambiente favorable para estas proteasas (pH óptimo 3-
5). Los IPs aspártico se caracterizan porque tienen dos residuos de ácido aspártico en su
centro reactivo y actúan a pH bajo (Ryan, 1990). La habilidad de los IPs para interferir
22
con el crecimiento y desarrollo de los insectos ha sido atribuida a su capacidad para
unirse al sitio activo de las proteasas digestivas y bloquear, alterar o impedir el acceso al
sustrato, interfiriendo con la disponibilidad de aminoácidos de las proteínas del
alimento (Ryan, 1973; Richardson, 1991).
A pesar del interés en el empleo de IPs para obtener plantas resistentes a insectos
mediante ingeniería genética (Vila et al., 2005), hasta el momento no se conocen
estudios que hayan explorado el uso de inhibidores de aspártico proteasas para el
control de H. hampei; por esta razón este trabajo se encaminó a identificar, purificar y
caracterizar inhibidores de proteasas aislados de L. bogotensis Benth, los cuales
representan los primeros IPs con actividad inhibitoria contra las aspártico proteasas de
H. hampei y clonar el gen que codifica uno de estos inhibidores. Estos IPs son una
herramienta promisoria para el control del insecto.
23
2. OBJETIVOS
2.1 GENERAL
Caracterizar inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei y clonar el gen que
codifica uno de estos inhibidores.
2.2 ESPECIFICOS
Aislar inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei.
Identificar inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei.
Purificar inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei.
Caracterizar parcialmente inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei.
Clonar el gen que codifica un inhibidor de las aspártico proteasas de H. hampei.
24
CAPÍTULO I
3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
3.1 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
Las enzimas proteolíticas catalizan la ruptura de los enlaces peptídicos en las proteínas,
están involucradas en muchos aspectos de la fisiología y el desarrollo de las plantas que
incluyen desde la movilización de las proteínas de almacenamiento durante la
germinación de las semillas hasta la iniciación de la muerte celular y los programas de
senescencia (Schaller, 2004). Su acción puede dividirse en dos categorías: proteólisis
limitada y proteólisis ilimitada.
En la primera la proteasa rompe sólo uno o un número limitado de enlaces peptídicos
necesarios para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Esta proteólisis tiene varias
funciones entre las cuales se encuentran: la maduración de enzimas, el ensamblaje de
proteínas, la modificación pos-traduccional de proteínas en sitios específicos y el
control de la actividad de enzimas, proteínas reguladoras y péptidos (De Leo et al.,
2002).
La segunda se caracteriza por la degradación de las proteínas en sus aminoácidos; estos
usualmente se conjugan con múltiples moléculas del polipéptido ubiquitina. Esta
modificación los identifica para su hidrólisis por el proteosoma en presencia de ATP.
Otra vía es la compartimentación de las proteínas y péptidos en los lisosomas, donde
sufren una degradación rápida por efecto de las proteasas (Fan y Xu, 2005).
La proteólisis ilimitada es necesaria para la degradación de proteínas dañadas, mal
plegadas y potencialmente perjudiciales para la planta, proporcionando los aminoácidos
para la síntesis de nuevas proteínas. La ruptura selectiva de proteínas reguladoras por la
vía ubiquitina/proteosoma controla aspectos claves del crecimiento, desarrollo y defensa
de las plantas (Fan y Xu, 2005).
25
3.1.1 Clasificación de las enzimas proteolíticas
Las proteasas se clasifican según su mecanismo catalítico en cuatro clases: serín, cisteín,
aspártico y metalo proteasas. Las primeras tres clases reciben su nombre de acuerdo con
los aminoácidos que hacen parte de la conformación de su sitio activo y las metalo
proteasas requieren iones metálicos para su actividad (Barrett, 1986). Posteriormente, se
describieron la treonín y la glutámico proteasa que utilizan treonina y ácido glutámico,
respectivamente, para formar la tríada catalítica (Rawlings et al., 2008).
3.1.1.1 Aspártico proteasas
Las aspártico proteasas se han encontrado en un amplio grupo de organismos, entre los
cuales están virus, hongos, parásitos, animales y plantas (Sarkkinen et al., 1992; Dreyer
et al., 1985; Guevara et al., 1999). Estas proteasas catalizan la ruptura de enlaces
peptídicos entre residuos hidrofóbicos, son inhibidas por pepstatina A y tienen un pH
ácido óptimo de 3 a 5 (Davies, 1990). El mecanismo catalítico de estas enzimas es
mediante catálisis básica y tienen dos residuos de ácido aspártico en su centro activo
involucrados en este proceso. (Davies, 1990). Existen enzimas extracelulares como
pepsina y renina y enzimas intracelulares como catepsina D y catepsina E (Bond y
Butler, 1987).
El conocimiento del papel de las aspártico proteasas en la digestión de los insectos es
más limitado que para las cisteín y serín proteasas (Ryan, 1990). Las aspártico proteasas
se han encontrado en especies del orden hemíptera (Houseman y Downe, 1983), y en
coleópteros como: L. decemlineata (Wolfson y Murdock, 1987) C. maculatus (Silva y
Xavier-Filho, 1991), Z. subfasciatus (Lemos et al., 1990; Silva y Xavier-Filho, 1991),
A. obtectus (Wieman y Nielsen, 1987), T. castaneum (Blanco-Labra et al., 1996), D.
undecimpunctata howardi (Liu et al., 2004), e H. hampei (Preciado et al., 2000).
El pH ácido del intestino medio de muchos miembros del orden coleóptera y hemíptero,
es óptimo para la actividad de las aspártico proteasas, en contraste con el pH básico
26
(pH8-11) de lepidópteros y dípteros, donde las aspártico y cisteín proteasas no son
activas (Ryan, 1990). El intestino medio de H. hampei tiene un pH ácido, en el cual las
aspártico proteasas son activas (Ossa et al., 2000). Estas enzimas digieren las proteínas
del alimento en el tracto digestivo del insecto y su inhibición proporciona una estrategia
promisoria para el control de H. hampei.
3.2 INHIBIDORES DE PROTEASAS
Los inhibidores de proteasas (IPs) son proteínas de bajo peso molecular, divididos en 67
familias según la identidad de las secuencias de aminoácidos o el tipo de proteasa con la
cual interactúan: serín, cisteín, aspártico, metalo, glutámico y treonín proteasa
(Rawlings et al., 2004; Rawlings, 2010). Estas familias se clasificaron en 38 clanes
según comparaciones de estructura terciaria (Rawlings, 2010).
Los IPs están presentes en plantas, animales y microorganismos (Richardson, 1991). En
las plantas los IPs representan una forma de proteína de almacenamiento (Richardson,
1991; Mosolov et al., 2001) o están involucrados en los mecanismos de defensa contra
plagas y enfermedades (Ryan, 1990; Macedo et al., 2003; Valueva y Mosolov, 2004;
Ramos et al., 2009; Parde et al., 2010). Además de sus funciones biológicas naturales,
los IPs podrían utilizarse en el tratamiento de patologías humanas relacionadas con la
coagulación sanguínea, hemorragias, inflamación y cáncer (Oliva et al., 2000; García et
al., 2002).
Los IPs comparten la propiedad de formar complejos reversibles proteína-proteína con
proteasas animales y de algunas plantas, ocasionando la inhibición competitiva de sus
funciones catalíticas (Ryan, 1973; Richardson, 1991; Laskowski y Kato, 1980). La tabla
1, presenta algunos inhibidores de cisteín, aspártico y metalo proteasas (Laskowski y
Kato, 1980).
Los IPs tienen un sitio reactivo que es la parte de la molécula del inhibidor que entra en
contacto molecular directo con el centro activo de la proteasa afín, para la formación del
27
complejo inhibidor-proteasa. Cerca del sitio reactivo del inhibidor se ubica un residuo
de aminoácido que es específicamente reconocido por el sitio de unión de la proteasa.
Este residuo de aminoácido es denominado P1, el residuo adyacente a P1 es nombrado
como P´1. El enlace peptídico que une estos dos residuos se denomina enlace peptídico
del sitio reactivo (Laskowski y Kato, 1980).
Tabla 1. Inhibidores de cisteín, aspártico y metalo proteasas (Laskowski y Kato, 1980).
Enzima inhibida Fuente del inhibidor Peso Molecular
Cisteín proteasas Bromelaina Tallos de piña 5.600 Papaina, ficina y bromelaina
Semillas de Bauhinia 24.000
Aspártico proteasas Catepsina D Papa 27.000 Pepsina Semillas de Bauhinia 24.000 Pepsina Cultivos celulares de Scopolia japonica 4.000 Metalo proteasas Carboxipeptidasa A y B Papa 4.300
La mayoría de los IPs interactúan con las proteasas de acuerdo con un mecanismo
estándar, caracterizado por la interacción del enlace peptídico del inhibidor y el
aminoácido del centro activo de la enzima. En el complejo estable enzima-inhibidor, el
centro reactivo del inhibidor permanece intacto. Aunque el contacto ocurre en una
pequeña porción de la enzima y el inhibidor, el ajuste es excelente con la formación de
numerosas interacciones de van der Waals, enlaces hidrofóbicos, y puentes salinos, por
esto la conformación de residuos alrededor del enlace peptídico del centro reactivo es
similar a la de un sustrato óptimo. El inhibidor imita un sustrato normal para la enzima,
pero inhibe el mecanismo de ruptura del enlace peptídico con la disociación del
producto (Laskowski y Kato, 1980).
28
3.2.1 Propiedades de los IPs de plantas
En general los IPs de plantas presentan una masa molecular entre 4 a 85 kDa, la
mayoría están en el rango de 8 a 20 kDa (Ryan, 1990). Estos inhibidores tienen
usualmente un alto contenido de residuos de cisteína que forman puentes disulfuro, lo
cual los hace resistentes al calor, a pH extremo y a la proteólisis (Richardson, 1991;
Greenblatt et al., 1989; Fan y Xu, 2005).
Estudios de la biosíntesis de varios IPs de plantas han mostrado que los inhibidores
almacenados en las vacuolas de hojas o en los lisosomas de tomate son sintetizados
como pre-proteínas 2 - 3 kDa más grandes que los inhibidores maduros (Graham et al.,
1985a). La presencia de secuencias polipeptídicas adicionales en los nuevos inhibidores,
indica que estas secuencias pueden ser péptidos señal necesarios en el proceso de
transporte de los inhibidores del citoplasma a los compartimentos vacuolares de las
células de hojas de tomate (Nelson y Ryan, 1980). La introducción del inhibidor de
proteinasa de papa II a Nicotiana tabacum confirmó que la secuencia señal amino-
terminal es removida y el inhibidor se acumula como una proteína del tamaño esperado
(21 kDa). También, se identificó un péptido de aproximadamente 5.4 kDa como un
producto foráneo del gen en las plantas transgénicas de tabaco. Esto indica que algunos
péptidos son derivados in vivo del procesamiento pos-traduccional de IPs (McManus et
al, 1994).
Otra propiedad importante de los inhibidores es la presencia de diferentes dominios. En
la familia de IPs de papa tipo II se han identificado seis dominios que inhiben las
proteasas digestivas de varias especies de insectos, es probable que la ventaja de
producir IPs con precursores multidominios sea la inhibición eficiente de una gran
cantidad de proteínas en un período de tiempo relativamente corto (Miller et al., 2000).
Recientemente, se identificó la secuencia responsable del efecto tóxico del inhibidor de
tripsina de Bauhinia rufa (BrTI) contra C. maculatus, que corresponde al motivo RGE
(Sumikawa et al., 2010). Lo cual sugiere que otro atributo de los IPs de plantas es la
29
presencia de motivos funcionales que pueden inducir diversas señales de defensa
(Sumikawa et al., 2010).
3.2.2 Distribución y localización de los IPs de plantas
De acuerdo con la secuencia de aminoácidos y de proteasas diana se reconocen 67
familias de inhibidores (Rawlings, 2010). En la tabla 2 se presentan 22 familias de IPs
donde las proteínas de cada familia no tienen una función similar, por ejemplo algunas
de las proteínas que componen la familia serpina no son inhibidores de proteasas.
Tabla 2. Algunas familias de proteínas que contienen IP (Reeck et al., 1997).
Nombre de la familia Tamaño aproximado
dominio (residuos)
Número de dominios
1. Inhibidor tripsina pancreática bovina 60 1 2. Inhibidor proteasa Kazal serín 55 Hasta 7 3. Inhibidor tripsina Kunitz soya 180 1 4. Inhibidor Bowman –Birk 35 2 5. Inhibidor de papa I 70 1 6. Inhibidor de papa II 50 1 o 2 hasta 8 7. Inhibidor de calabaza 30 1 8. Inhibidor tripsina de cebada 120 1 9. Traumatina 200 1 10. Inhibidor tripsina Ascaris 60 1 11. Inhibidor locust 35 1 o 2 12. Ecotina 140 2 subunidades 13. Serpina 400 1 14. Inhibidor subtilisina Streptomyces 110 1 15. Hirudina 65 1 16. Cistatina 110 Hasta 8 17 Calpastatina 140 4 18. Inhibidor carboxipeptidasa papa 40 1 19. Inhibidor carboxipeptidasa Ascaris 40 1 20. inhibidor colagenasa 200 1 21. Inhibidor pepsina Ascaris 150 1 22. -2 macroglobulina 1500 2 o 4 subunidades
También, en la familia del inhibidor de tripsina de cebada se han encontrado proteínas
que son inhibidores de -amilasas, pero no inhiben las proteasas (Ryan, 1990;
30
Richardson, 1991). Obviamente, no es posible inferir la actividad inhibitoria de los IPs
únicamente por similitud de las secuencias, siendo necesario determinar las propiedades
de inhibición de cada proteína (Reeck et al., 1997).
La mayoría de los estudios de IPs de plantas se han realizado en plantas cultivadas,
debido posiblemente al gran número de especies en estas familias importantes para la
alimentación. Por esto, la mayoría de los IPs caracterizados son de las familias
Gramineae (Poaceae), Leguminoceae (Fabaceae) y Solanaceae (Richardson, 1977;
Laskowski y Kato, 1980; Richardson, 1991; Brzin y Kidic, 1995; Shewry, 1999; Carlini
y Grossi-de-Sá, 2002).
Las bases de datos de IPs de plantas contienen información de 495 inhibidores
identificados en 129 plantas diferentes (De Leo et al., 2002). Esto muestra que es
necesario ampliar la investigación de IPs de plantas en especies que no tienen
importancia económica, que hasta el momento han sido poco estudiadas (Konarev et al.,
2004).
Los IPs están ampliamente distribuidos en el reino vegetal, y son particularmente
abundantes en las semillas y órganos de almacenamiento, representando
aproximadamente entre el 1 al 10% del contenido total de proteína (Richardson, 1977).
La mayoría de las plantas acumulan IPs en sus órganos de almacenamiento en
cantidades mayores a las requeridas para inhibir las proteasas endógenas. Esto
demuestra que su actividad inhibitoria es específica contra las proteasas de insectos
(Lawrence y Koundal, 2002).
Los IPs se han identificado en flores, raíz, hojas y frutos (Brzin y Kidric, 1995; Sin y
Chye, 2004; Damle et al., 2005). También, estas proteínas se localizan en el floema de
tallos, raíz y hojas (Xu et al., 2001). Algunos IPs de plantas se han encontrado
intracelularmente en los cuerpos proteicos vacuolares, la pared celular, los espacios
31
intercelulares, en las células del citosol y el núcleo de los cotiledones (Richardson,
1977; Kapur et al., 1989).
3.2.3 Características de los IPs
Los inhibidores de proteasas se caracterizan por que:
1. En el complejo enzima-inhibidor todas las actividades enzimáticas hacia todos los
sustratos se anulan completamente (Ryan, 1973; Richardson, 1977).
2. La inhibición es competitiva (Richardson, 1991).
3. El centro reactivo de un inhibidor particular determina su especificidad (Richardson,
1991).
4. La especificidad de inhibición es altamente variable: algunos inhiben sólo una o dos
proteasas relacionadas estrechamente, mientras que otros presentan una especificidad
amplia siendo activos contra enzimas de diferentes clases (Ryan, 1973; Richardson,
1977; Laskowski y Kato, 1980; Richardson, 1991; Rawlings et al., 2004; Rawlings et
al., 2008). Se han aislado proteínas bifuncionales que inhiben eficientemente enzimas
que pertenecen a clases completamente diferentes (Richardson et al., 1987).
5. Los inhibidores mantienen su actividad a pesar del reemplazo del residuo P1 del
centro reactivo. En algunos casos, esta sustitución produce un cambio predecible en la
actividad inhibidora, como el reemplazo de Arg63 por Trp63 en el inhibidor de tripsina
de soya (Kunitz) que lo convierte en inhibidor de quimotripsina (Laskowski y Kato,
1980). Estos cambios ocurren durante la evolución, así dentro de cada familia de
inhibidores el residuo P1 no es conservado, y cambios frecuentes originan variaciones
en la especificidad inhibidora; estos cambios pueden estar relacionados con la defensa
de las plantas contra el ataque de herbívoros (Ryan y Pearce, 1998).
32
3.2.4 Principales funciones de los IPs de plantas
3.2.4.1 Almacenamiento
Los IPs de las semillas actúan como una forma de almacenamiento de proteínas que no
son digeridas hasta cuando son requeridos durante la germinación (Hou y Lin, 2002).
Esto es posible ya que la mayoría de inhibidores son particularmente resistentes a calor,
a pH extremo y a enzimas proteolíticas. Además, el alto contenido de cisteínas de
muchos inhibidores de plantas podría señalarlos como depósitos de azufre (Greenblatt et
al., 1989; Richardson, 1991).
Los inhibidores de serín proteinasas se acumulan durante la maduración de las semillas,
facilitando el almacenamiento de las proteínas de reserva, debido a que disminuyen la
actividad de las proteasas. Este proceso también es un indicador de su función de
defensa, porque la integridad de estos órganos es esencial para la supervivencia de las
especies (Koiwa et al., 1997).
3.2.4.2 Control de la proteólisis celular
La función fisiológica más probable de los IPs en las plantas, es regular la proteólisis
celular mediante la inhibición de proteasas endógenas y de esta manera controlar el
cambio y metabolismo de las proteínas (Richardson, 1977; Ryan, 1989; Ojima et al.,
1997; Xu et al., 2001; Sin y Chye, 2004).
Muchas semillas particularmente las de leguminosas, que tienen proteínas como la
principal reserva de alimento, se caracterizan por niveles elevados de IPs. Posiblemente,
las enzimas proteolíticas en las semillas se mantienen inactivas por la presencia de IPs.
Durante la germinación, cuando el contenido de inhibidores disminuye, las reservas
alimenticias son traslocadas por la activación de las proteasas endógenas (Richardson,
1977). Es así como la expresión del gen que codifica el inhibidor de arroz OSPI8-1 se
incrementa en las células epiteliales entre el embrión y el cotiledón, tres días después
33
del inicio de la germinación, contrarrestando el efecto de las peptidasas sobre las
proteínas del embrión (Wang et al., 2008).
Recientemente, se purificó un inhibidor de aspártico proteasas de semillas de Vigna
radiata (VrAPI), el cual regula la expresión de una aspártico proteasa (VrAP) (Kulkarni
y Rao, 2007) y su subsiguiente papel en los eventos tempranos de la germinación
(Kulkarni y Rao, 2009). La expresión de VrAPI es máxima en las semillas en fase de
dormancia, mientras que la expresión de VrAP predomina en las semillas germinando
(Kurkarni y Rao, 2009).
3.2.4.3 Defensa contra plagas
El papel de los IPs en la defensa de las plantas fue mostrado inicialmente en 1947
cuando Mickel y Standish observaron que las larvas de Tribolium confusum y T.
castaneum fueron incapaces de desarrollarse en productos de soya. Luego, se encontró
que los inhibidores de tripsina presentaron toxicidad contra las larvas de T. confusum
(Lipke et al., 1954).
Existen dos vías de traducción de señales involucradas en la regulación de los genes de
IPs, las señales locales y sistémicas (Koiwa et al., 1997; Ryan y Pearce, 2001).
3.2.4.3.1 Señales locales
Cuando hay lesión mecánica, los fragmentos de polisacáridos de pectina liberados a
partir de la pared celular de la planta por endopoligalacturonasas actúan posiblemente
como inductores extracelulares de la vía de señalización, induciendo la expresión de los
genes de IPs. Estos polisacáridos no son móviles dentro de la planta, esto muestra que
estas moléculas sólo intervervienen en la inducción local de la expresión de genes de
IPs; la activación de estos genes es regulada por la vía octadecanoide (Green y Ryan,
1972). La magnitud de esta respuesta de defensa es mayor en plantas atacadas por
insectos que en plantas con daño mecánico (Koiwa et al., 1997).
34
3.2.4.3.2 Señales sistémicas
Las primeras observaciones de la función de los IPs de plantas como moléculas de
defensa contra el ataque de insectos fueron registradas por Green y Ryan (1972). Los
autores observaron que las lesiones producidas por insectos en hojas de solanáceas,
especialmente tomate y papa, inducían una rápida acumulación del inhibidor de
proteinasa I, en las hojas dañadas y también en las hojas dístales sin daño (Green y
Ryan, 1972).
Después del ataque por insectos se liberan diversas moléculas de señalización de la
lesión las cuales incluyen el ácido oligogalacturónico, quitosán, señales físicas
(hidráulicas y eléctricas), ácido abscisico (ABA) y un polipéptido de 18 aminoácidos
denominado sistemina (AVQSKPPSKRDPPKMQTD) que es liberado a partir de un
precursor prosistemina mediante procesamiento proteolítico; estas moléculas son
transportadas desde el sitio de la lesión a través del xilema al floema como consecuencia
de la dispersión hidráulica (Ryan y Pearce, 2001).
Posteriormente, estas moléculas se unen a receptores de membrana plasmática como:
una proteína de unión inducida por -glucano (GEBP), una fosfoproteína de 34 kDa
(pp34) y un receptor de superficie celular de sistemina, el cual es una proteína quinasa
rica en leucina (SR160) (Schilmiller y Howe, 2005); iniciando una cascada de
reacciones intracelulares, que incluyen las actividades de una MAP quinasa, una
fosfolipasa, una proteína quinasa dependiente de calcio y la liberación de ácido
linolénico a partir de las membranas (Koiwa et al., 1997;).
La señal de la lesión es traducida por una lipasa que facilita la liberación de ácido
linolénico a partir de los lípidos de membrana, un proceso estimulado por ABA (Figura
1). La volicitina originada a partir de la secreción oral de los insectos puede funcionar
como el ácido linolénico. El gen Def1 regula la conversión del ácido 13(S)-
hidroperoxilinolénico (HPOTrE) a ácido 12-oxo-fitodienóico (12-oxo-PDA) (Koiwa et
al., 1997).
35
Figura 1. Vía de traducción de señales intracelulares de la expresión de los genes de IPs
(Koiwa et al., 1997).
Señales sistémicas lesión
Señales físicas
Sistemina
Señales locales lesión
Oligosacáridosinductores
Secreción oral insectos
Volicitina
lípido membrana
Ruptura
Vía octadecanoide
Acido linolenico
Lipoxigenasa
Oxido aleno sintasa
Oxido aleno ciclasa
Oxido aleno
Reductasa
oxidación
Proteína quinasa
Acido salicílico
Acido jasmónico
Fosfatasa
Etileno
Factores transcripción
Expresión genes inhibidores proteasas
Señales sistémicas lesión
Señales físicas
Sistemina
Señales locales lesión
Oligosacáridosinductores
Secreción oral insectos
Volicitina
lípido membrana
Ruptura
Vía octadecanoide
Acido linolenico
Lipoxigenasa
Oxido aleno sintasa
Oxido aleno ciclasa
Oxido aleno
Reductasa
oxidación
Proteína quinasa
Acido salicílico
Acido jasmónico
Fosfatasa
Etileno
Factores transcripción
Expresión genes inhibidores proteasas
36
El ácido linolénico es convertido en ácido jasmónico (AJ), un mensajero para la
activación de genes de señalización (prosistemina, poligalacturonasa, aleno oxido
sintasa y lipoxigenasa). La actividad catalítica de la poligalacturonasa guía a la
generación de peróxido de hidrógeno que actúa como un segundo mensajero para la
activación de los genes de defensa (el inhibidor de proteinasa I y II, la polifenol oxidasa,
el inhibidor de aspártico proteinasa catepsina D y el inhibidor de carboxipeptidasa)
(Kreft et al., 1997; Ryan y Pearce, 1998; Orozco-Cárdenas et al., 2001; Ryan y Pearce,
2001). El AJ es la señal de defensa predominante contra insectos masticadores. Además,
el etileno es un importante regulador de la defensa en diferentes especies, actuando
concomitantemente o secuencialmente con el AJ (Aimura et al., 2000; Stotz et al.,
2000).
Estudios recientes sugieren que la señalización de jasmonato involucra la conjugación
de proteínas reguladoras con el polipéptido ubiquitina mediante la acción de una ligasa
ubiquitina-E3 asociada a una proteína de la caja-F coronatina insensible1 (COI1)
denominada (SCFCOI1), estas proteínas controlan la transcripción de los genes que
responden a jasmonato (Koo y Howe, 2009). En hojas sin daño, los niveles bajos de AJ-
Ile favorecen la acumulación de proteínas con dominio ZIM jasmonato (JAZ) que
inhiben la transcripción de los genes blanco. Mientras que cuando hay lesión en el
tejido, la rápida acumulación de AJ-Ile estimula la degradación de las proteínas JAZ por
SCFCOI1 vía ubiquitina/proteosoma, con la subsiguiente activación de los genes de
defensa (Howe y Jander, 2008).
3.2.5 Modo de acción de los IPs contra insectos
Se han propuesto varios modelos para explicar los efectos de los IPs en el crecimiento y
desarrollo de insectos plaga.
El primero se basa en la inhibición de las proteasas digestivas por la acción de los IPs,
en este modelo los inhibidores actúan como sustratos específicos para estas enzimas y
forman un complejo estable en el cual la proteólisis es limitada y extremadamente lenta;
37
esto reduce la digestión de las proteínas de la dieta y la disponibilidad de aminoácidos
esenciales, dando como resultado una disminución en la asimilación de nutrientes;
ocasionando un retardo en el crecimiento e incluso la muerte del insecto (Jongsma y
Bolter, 1997; Gatehouse et al., 1999; Lawrence y Koundal, 2002).
El segundo mecanismo señala que la disminución del crecimiento de los insectos se
debe a una producción excesiva de proteasas para compensar su falta de actividad por la
acción de los IPs, en detrimento de los aminoácidos esenciales necesarios para la
producción de nuevas proteínas, afectando importantes procesos fisiológicos y
bioquímicos de los insectos; tales como la activación proteolítica de enzimas y la muda
(Broadway et al., 1986; Jongsma y Bolter, 1997; Michaud et al., 1996; Lawrence y
Koundal, 2002)
3.2.6 Clases de Inhibidores de proteasas
3.2.6.1 Inhibidores de serín proteasas
Las serín proteasas incluyen dos familias no relacionadas genéticamente: tripsina y
subtilisina, las primeras se encuentran en microorganismos, plantas y animales;
mientras que las segundas sólo se encuentran en bacterias (Barrett, 1986). Inhibidores
de ambas enzimas han sido muy estudiados (Reeck et al., 1997). El número de
inhibidores de serín proteasas bien caracterizados y descritos es mayor que el de otros
inhibidores (Rawlings, 2010).
Varios estudios muestran el efecto de inhibidores de tripsina en la actividad proteolítica,
el crecimiento y el desarrollo de insectos. Los inhibidores Bowman-Birk de Cajanus
cajan L. Millisp (RgPI) y Vigna mungo (BgPI) se probaron contra lepidópteros
encontrando que RgPI redujo significativamente el peso del cuerpo y el porcentaje de
supervivencia de las larvas de Achaea janata en comparación con BgPI. En contraste,
BgPI redujo significativamente el peso del cuerpo de las larvas de Spodoptera litura
comparado con RgPI (Prasad et al., 2010). También, dos inhibidores de tripsina y
38
quimotripsina de Capsicum annum inhibieron la actividad proteolítica de Helicoverpa
armigera y en los bioensayos retardaron el crecimiento y desarrollo de las larvas de este
lepidóptero; estos inhibidores retrasaron el período de pupa y redujeron
significativamente la fecundidad y fertilidad del insecto (Tamhane et al., 2005). De
igual manera, el inhibidor de tripsina de soya (SBTI) in vivo redujo el peso de las larvas
y produjo la muerte de Ceratitis capitata (Silva et al., 2006).
El inhibidor Bowman-Birk de Vigna unguiculata inhibió in vitro e in vivo la actividad
proteolítica tripsina y quimotripsina de Anthonomus grandis (Franco et al, 2003).
Además, el inhibidor de tripsina de Tamarindus indica (TTI) inhibió in vitro la
actividad serín proteinasa de los coleópteros C. maculatus, Z. Subfasciatus y A. grandis
(Araújo et al., 2005). Los ensayos in vivo mostraron que el inhibidor produjo mortalidad
de las larvas de C. maculatus y C. capitata (Araújo et al., 2005). El inhibidor de
proteinasa Bowman-Birk de Phaseolus coccineus inhibió in vitro las enzimas tipo
tripsina de H. hampei (Pereira et al., 2007).
3.2.6.2 Inhibidores de cisteín proteasas.
Estos inhibidores forman una superfamilia de proteínas subdivididas en cuatro familias:
las estefinas, las cistatinas, los quininógenos y las fitocistatinas (Turk y Bode, 1991).
Las estefinas de 11 kDa, son proteínas predominantemente intracelulares que carecen de
enlaces disulfuro; las cistatinas de 11 - 13 kDa contienen dos enlaces disulfuro en el
extremo carboxi-terminal del polipéptido; los quininógenos de 60 - 120 kDa están
compuestos de tres cistatinas tipo 2 unidas en tándem y las fitocistatinas entre 5 - 87
kDa con características similares a las encontradas en las subfamilias de las cistatinas
(Turk et al., 1997).
Numerosos estudios sugieren que las cisteín proteasas realizan el papel más importante
en la digestión de las proteínas en el intestino medio de coleópteros, debido a que su
inhibición afecta la digestión de las proteínas y la asimilación de aminoácidos esenciales
(Botella et al., 1996).
39
Varias investigaciones demuestran el papel de defensa de los inhibidores de cisteín
proteasas, algunos ejemplos incluyen al inhibidor de cisteín proteasa de soya
recombinante (soyacistatina scN) que inhibió el crecimiento y desarrollo de larvas de
Diabrotica virgifera interfiriendo con la proteólisis digestiva de catepsina L (Koiwa et
al., 2000). El mismo inhibidor (scN) incrementó la mortalidad y redujo el crecimiento
de larvas de D. undecimpunctata howardi, su efecto fue más severo en estados
tempranos del desarrollo de este coleóptero (Liu et al., 2004). Una combinación de los
inhibidores scN y pepstatina A bloquearon la actividad proteolítica de las principales
cisteín y aspártico proteasas de C. maculatus (Amirhusin et al., 2007).
El inhibidor de tripsina-Kunitz aislado de Adenanthera pavonica (ApTI) inhibió in vitro
la actividad papaina de C. maculatus, A. obtectus y Z. subfasciatus y en bioensayos
produjo 50% de mortalidad de C. maculatus cuando se incorporó en una dieta artificial
al 0,5% (Macedo et al., 2004). Además, el inhibidor tripsina-papaina de Pithecelobium
dumosum (PdKI-2) inhibió la actividad proteolítica de Z. subfasciatus y C. maculatus en
74,5% y 70%, respectivamente (Oliveira et al., 2007).
3.2.6.3 Inhibidores de aspártico proteasas.
Los inhibidores de aspártico proteinasas se caracterizan porque actúan a pH bajo y
tienen dos residuos de ácido aspártico en su centro reactivo (Ryan, 1990). Estos
inhibidores son escasos en la naturaleza y se han aislado de pocas plantas entre las
cuales están: Scopolia japonica (Sakato et al., 1975); Tritucum aestivum (Galleschi et
al., 1997); Solanum lycopersicum (Cater et al., 2002); Solanum tuberosum (Mares et al.,
1989; Ritonja et al., 1990; Maganga et al., 1992), Cucurbita maxima (SQAPI)
(Christeller et al, 1998), Anchusa strigosa (Abuereish, 1998) y V. radiata (VrAPI)
(Kulkarni y Rao, 2009). Esto contrasta con el gran número de inhibidores de serín y
cisteín proteinasas que han sido descubiertos (Richardson, 1991; Bhattacharyya et al.,
2006; Macedo et al., 2007b; Ramos et al., 2009).
40
Entre los inhibidores de las aspártico proteasas el mejor caracterizado es el inhibidor de
catepsina D de papa (PDI), este inhibidor tiene similitud con la familia del inhibidor de
tripsina de soya (Mares et al., 1989). Varios trabajos mostraron que PDI consiste de
varias isoformas, las cuales han sido clonadas y secuenciadas (Ritonja et al., 1990;
Maganga et al., 1992). El inhibidor de levadura (Schu y Wolf, 1991), bloquea la
aspártico proteinasa de levadura, pero no otras aspártico proteinasas (Dreyer et al.,
1985), este inhibidor no tiene similitud con PDI o los inhibidores de nemátodos
(Martzen et al., 1990).
Los inhibidores de aspártico proteasas se unen a la hendidura del sitio activo de la
enzima mediante enlaces de hidrógeno formados entre el oxigeno carbonilo de los
aminoácidos de la enzima D-T-G-S y los grupos amida de los aminoácidos del enlace
escindible del inhibidor (Pearl, 1987). La protonación del péptido amida escindible se
produce junto con la destrucción del estado de transición tetraédrico. El oxianión es
estabilizado por enlaces de hidrógeno entre el oxigeno carbonilo del inhibidor y el
grupo amida de G76 y D77. La liberación de los productos neutros y la unión de una
nueva molécula de agua restaura la actividad de la enzima (Davies, 1990). Hasta el
momento existe muy poca información de la cinética de unión, estructura tridimensional
y las funciones in vivo de los inhibidores de aspártico proteasas (Christeller et al.,
1998). Además, no es claro si estos inhibidores usan el mecanismo estándar de
inhibición característico de otras clases de IPs (Laskowski y Kato, 1980).
3.3 LUPINUS (Lupinus bogotensis, Benth).
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida
Orden: fabales
Familia: Fabaceae
Subfamilia: Faboideae
41
Tribu: Genisteae también ubicada en la tribu Papilonaceae
Género: lupinus
Nombre común: chochitos, altramuz, chocho, lupín o lupino.
Lupinus es un género botánico de leguminosas con alrededor de 200 especies
originarias del Mediterráneo (subgénero Lupinus) y de América (subgénero Platycarpos
(Watson, Kurl.) (Turner, 1995).
3.3.1 Origen de L. bogotensis
Las especies de América se originan en la parte sur, y en los departamentos de
Antioquia, Cundinamarca y el occidente de Colombia, Además, se encuentra en
Ecuador y Bolivia.
3.3.2 Clasificación de L. bogotensis
L. bogotensis está clasificado como una especie vegetal promisoria, la cual es
fundamentalmente nativa de la subregión andina y tiene potencialidades económicas a
corto, largo y mediano plazo.
3.3.3 Descripción de L. bogotensis
Son plantas de tallo erecto, que habitualmente miden entre 50 cm y 2 m de altura. Sus
hojas están formadas por un número impar de foliolos y su aspecto es semejante al de
una mano (Figura 2). En las especies silvestres y las cultivadas con propósitos
ornamentales, las flores se reúnen en largas y vistosas inflorescencias.
En las semillas del género lupinus se han reportado cuatro globulinas principales
designadas como: , , y -conglutinas. las -conglutinas o leguminas están
compuestas por cuatro tipos de subunidades (53, 60, 66 y 70 kDa) (Melo et al., 1994).
42
Figura 2. A. L. bogotensis del herbario de la Universidad de Antioquia. B. Las flores de
L. bogotensis agrupadas en largas y vistosas inflorescencias. C. Las hojas de
L. bogotensis de aspecto semejante al de una mano.
Las conglutinas o vicilinas son proteínas de reserva que pertenecen a la familia de las
globulinas 7S (Derbyshire et al., 1976). Las vicilinas son los componentes principales
de las globulinas, formados por 10 a 12 subunidades con masas moleculares entre 15 a
72 kDa, estas globulinas no poseen enlaces disulfuro (Melo et al., 1994). Las
conglutinas representan cerca del 5% del total de las proteínas de la semilla madura de
lupinus (Duranti et al., 1981), estas globulinas son proteínas oligoméricas, cada
monómero tiene dos subunidades de 30 kDa y 17 kDa unidas por enlaces disulfuro y la
cadena pesada es glicosilada (Scarafoni et al., 2001). La conglutina glicosilada tiene la
capacidad de unirse a carbohidratos en la presencia de iones metálicos; esto sugiere que
tiene un papel en la semilla como una lectina (Duranti et al., 1995). Las conglutinas
A B
C
A B
C
43
son proteínas heterodiméricas con subunidades de 9 y 4 kDa (Lilley y Inglis, 1986). Las
subunidades de las cuatro clases de globulinas mencionadas se producen por
degradación proteolítica (Derbyshire et al., 1976).
La información sobre la presencia de inhibidores en las semillas de Lupinus es muy
escasa. Los primeros registros mostraron que las semillas de Lupinus albus y de
Lupinus luteus carecían de actividad de inhibición de proteasas (Gallardo et al., 1974).
Sin embargo, en un estudio reciente se encontró un inhibidor de tripsina en las semillas
de L. albus (Scarafoni et al., 2008).
3.3.4 Nutrientes
La mayoría de las especies de Lupinus poseen semillas con un alto contenido proteico
de 43%, una proporción de fibra de 25,5%, un porcentaje de azúcares de 13,5% y
minerales principalmente cobalto, fósforo y potasio de 5,5%. La semilla de esta
leguminosa es un excelente candidato para emplearse como fuente de proteína para la
alimentación (Magni et al., 2007). Las semillas sirven de alimento al ganado e incluso
para el ser humano. Sin embargo, su consumo debe ser moderado ya que poseen
alcaloides y otras substancias que pueden afectar la salud humana.
3.4 LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, Ferrari).
Filo:Arthropoda
Clase: Insecta
Orden: Coleoptera
Superfamilia: Curculionidae
Familia: Curculionidae
Subafamilia: Scolytinae
Género: Hypothenemus
Especie: hampei
44
3.4.1 Origen y Distribución
La broca del café H. hampei es originaria de la zona central de África. Se introdujo al
continente americano a través de Brasil en 1913, en semillas importadas de África y
Java (Bergamin, 1943). En Colombia se registró por primera vez en 1988, en el sur del
departamento de Nariño. Su dispersión fue rápida porque las condiciones favorables de
clima y la continuidad de la zona cafetera, le aseguraron a esta plaga un suministro
permanente de alimento (Bustillo et al., 2008).
3.4.2 Ciclo de vida
El ciclo de vida de la broca ha sido estudiado por Bergamin (1943) y Baker et al.
(1992), el adulto hembra de H. hampei una vez emerge tarda 4 días para reproducirse;
su período de oviposición es de 20 a 30 días y coloca entre 2 a 3 huevos por día. En
promedio una hembra puede ovipositar 74 huevos durante su vida. La incubación del
huevo dura 8 días (23C) y el estado de larva dura 15 días para los machos y de 19 días
para las hembras, la prepupa 2 días y la pupa 6.4 días (25.8C). El ciclo total del huevo
a emergencia del adulto se estima en 27.5 días a 24.5C (Figura 3). El tiempo que tarda
en iniciarse otra generación del insecto, bajo condiciones de campo, se estima para la
zona cafetera colombiana en 45 días a 21C y de 60 días para una temperatura de 18 C.
La relación de sexos es de 1:10 a favor de las hembras (Bustillo et al., 2008).
El macho completa su ciclo de vida antes que la hembra, y copula con las hembras que
van emergiendo, el adulto macho solo tiene una función reproductora, es incapaz de
perforar un fruto y debido a que los músculos de sus alas se encuentran atrofiados no
puede volar por lo que siempre se encuentra en el interior de los frutos. Este
comportamiento explica porque no es posible el uso de atrayentes sexuales para el
manejo de este insecto. Una vez que la hembra colonizadora inicia su oviposición,
permanece en el interior del fruto de café hasta su muerte, cuidando de su progenie
(Bustillo et al., 1998).
45
Figura 3. Ciclo de vida de H. hampei.
Inicio de copula 4 – 10 días
5 – 9días
10 – 26 días
2 – 3 días
4 – 10días
Larva
Adulto
Huevo
Ciclo 23 - 35 días
pupa
prepupa
46
Bajo condiciones de la zona central cafetera colombiana se ha determinado que en un
fruto de café desde el momento que es susceptible al ataque de la broca hasta la época
de cosecha, se pueden producir dos generaciones del insecto (Bustillo et al., 2008). Las
hembras fertilizadas vuelan en búsqueda de frutos de café para perforarlos, depositar
huevos e iniciar un nuevo ciclo. Se estima que solo el 65% de todos los adultos
emergidos están fertilizados y sólo éstos son capaces de colonizar los frutos de café
(Bustillo, 2008).
El mayor daño es causado cuando el fruto de café está en el estado de semi-consistencia
(más de 20% de peso seco), cuando los frutos alcanzan entre 100 y 150 días de
desarrollo después de la floración, dependiendo de la latitud (Montoya y Cárdenas,
1994). En esta etapa el endospermo ofrece un sustrato apropiado para la oviposición, la
alimentación de los adultos y el desarrollo de los estadios inmaduros (Decazy, 1988).
3.4.3 Pérdidas económicas ocasionadas por H. hampei
La broca del café es una plaga compleja que causa diferentes tipos de pérdidas, las
cuales se pueden clasificar en tres tipos: caída de frutos inmaduros, pérdidas en el peso
de la almendra y pérdidas en calidad (Duque, 2000). Los granos de café de menos de 90
días pueden caer fácilmente si son atacados por H. hampei. Además, la cantidad de café
cereza maduro requerida para obtener cierta cantidad de café pergamino varía y cuando
los niveles de infestación son altos, grandes cantidades de café cereza maduro son
necesarias para conseguir 1 kg de café pergamino (Saldarriaga, 1994). Un grano
brocado es defectuoso y causa disminución de la calidad organoléptica en sabor y aroma
(Puerta, 2000). Cuando una muestra de granos tiene 25% de perforaciones, y estos
granos perforados han pérdido hasta 30% de su peso total, se produce un marcado
deterioro en el sabor del café (Puerta, 2000). Una estimación de las pérdidas
económicas, las cuales en Colombia son producidas por los esfuerzos para controlar la
broca del café, muestra que si la broca del café no fuera controlada en toda Colombia,
habría al menos 25% de granos dañados, lo cual equivale a una pérdida de US$180
millones anuales (Duque y Baker, 2003).
47
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 ESPECIES VEGETALES
Las semillas de L. bogotensis, Centrosema pubescens, Trifolium repens y Brachiaria
humidicola fueron adquiridas en la empresa Semicol (Bogotá, Cundinamarca). Las
semillas de Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus e
Hyptis suaveolens fueron suministrados por el Dr. Alejandro Blanco, laboratorio de
mecanismos de defensa de plantas, Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados
(Cinvestav), Irapuato, México.
4.2 INSECTOS
Los insectos adultos de la broca del café (H. hampei F.) fueron proporcionados por la
unidad de cría de Cenicafé (Chinchiná, Caldas), los insectos fueron criados en café
pergamino seco con una humedad del 45% y mantenidos bajo condiciones controladas a
una temperatura de 27C con una humedad relativa del 65-75%, los insectos empleados
para la extracción estaban recién emergidos de las semillas de café.
4.3 REACTIVOS
Se utilizó agua desionizada, todos los reactivos fueron grado analítico, NaCl, HCl,
(NH4)2SO4, cloroformo, metanol y ácido acético fueron obtenidos de Merck (Darmstadt,
Germany). Los reactivos como hemoglobina bovina, albúmina sérica bovina (BSA),
pepsina (EC 3.4.23.1), pepstatina A, tripsina (EC 3.4 21.4), N -benzoyl-L-arginine
ethyl ester (BAEE), N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (BTEE), fenilmetilsulfonilo
fluoruro (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), trans epoxisuccinilo-l-
leucilo-amida (4) guanidino butano (E-64), Tris, dodecilsulfato sódico (SDS), glicerol
fueron obtenidos de la casa comercial Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La
solución de Bradford, la solución de acrilamida-Bis-acrilamida, persulfato de amonio
48
fueron obtenidos de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). La resina de exclusión Bio-Gel® P-
6DG empacada en una columna Econo-Pac® 10DG de Bio-Rad (Hercules, CA, USA).
La resina de intercambio iónico Q Sepharose high performance y la columna K9/30 de
Amersham Pharmacia (Uppsala, Sweden). Las membranas de ultrafiltración de 30 kDa
(Amicon, Millipore) y el dispositivo de filtración centrifuga Centriprep, membrana
Ultracel YM-3, limite de peso molecular nominal 3 kDa (Amicon, Millipore) (Beverly,
MA, USA). Las membranas de diálisis de 3,5 kDa (Spectra/Por®) (Broadwick Street,
CA, USA).
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LAS ASPÁRTICO PROTEASAS DE H. hampei.
4.4.1 Extracción de las aspártico proteasas de H. hampei.
Para la extracción de las aspártico proteasas se maceraron 100 g de insectos adultos con
5 volúmenes de 0.2 M de buffer succínico pH 6.0 a 4C; el homogeneizado se
centrifugó a 18.000 rpm por 30 min en una centrifuga marca Beckman Coulter, modelo
AllegraTM 21R, Rotor 0850, refrigerada a 4 C. El sobrenadante se dializó tres veces
cada 6 h contra 5 L de agua con 100 ml de buffer succínico 20 mM pH 6.0 utilizando
una membrana de diálisis de 3,5 kDa (Spectra/Por, Broadwick Street, USA), el
dializado se liofilizó en un equipo marca Labconco; el liofilizado se pesó y distribuyó
en tubos de microcentrifuga, 0.5 g en cada tubo, los cuales se almacenaron a - 20C y se
utilizaron como fuente de enzima.
4.4.2 Actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei.
La actividad proteolítica del extracto crudo del insecto se determinó según el método de
Lenney (1975). Las aspártico proteasas presentes en el extracto proteínico se incubaron
en 0.2 M de buffer citrato pH 2.5. Se adicionaron 1.3 ml de hemoglobina al 1% como
sustrato. A las 2 h se adicionaron 2.5 ml de ácido tricloroacético 0.34 N para detener la
reacción. Después de permanecer en un baño frío a 4 C durante 20 min, los tubos se
centrifugaron por 20 min a 14000 × g en una microcentrífuga. La absorbancia del
49
sobrenadante se determinó a 280 nm en un espectrofotómetro UV/VIS marca
UNICAM. El control de la enzima tiene todos los componentes de la reacción, pero el
ácido tricloroacético 0.34 N se adicionó antes que el sustrato. Una unidad de actividad
enzimática fue definida como la cantidad de enzima que cataliza un incremento en 0.01
unidades de absorbancia a 280 nm.
4.4.3 Zimograma en gel de las aspártico proteasas de H. hampei.
El extracto crudo de adultos de H. hampei se adicionó a un gel de poliacrilamida al 10%
de 8 cm de longitud y un diámetro de 0.75 mm; las proteínas se separaron en
condiciones nativas según Laemmli (1970), utilizando el equipo para electroforesis
Miniprotean III (Bio Rad), con una fuente de poder de Bio-Rad a 120 V durante 2 h a 4
C. El gel se incubó en una solución de 1% de hemoglobina en buffer citrato 0.2 M pH
2.5 durante 1 h a 4C. Luego, el gel se lavó con agua desionizada y se incubó durante 3
h en 0.2 M de buffer citrato pH 2.5 a 30 C. Después, el gel se coloreó con azul de
Coomassie durante 30 min, el exceso de colorante se eliminó con ácido acético al 10%
durante 1 h. Las aspártico proteasas se observaron como bandas claras sobre fondo azul.
4.4.4 actividad de las aspártico proteasas de H. hampei en función del pH
Para determinar la estabilidad de las aspártico proteasas en función del pH, el extracto
proteínico crudo de adultos de H. hampei (1 mg/ml) se diluyó con igual volumen de
varios buffer (100mM): citrato de sodio (pH 2-4), acetato de sodio (pH 5), fosfato de
sodio (pH 6-7), Tris-HCl (pH 7.5). Después de la incubación en cada buffer durante 30
min a 37 C, se ajustó el pH a 2.5 para evaluar la actividad inhibidora contra las
aspártico proteasas de H. hampei según Lenney (1975). Los resultados representan el
promedio de tres pruebas independientes.
50
4.4.5 Inhibición de la actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei
por inhibidores de proteasas.
La actividad de los inhibidores de proteasas fue determinada preincubando los
inhibidores de proteasas con las aspártico proteasas de H. hampei, durante 60 min a 30
C. Los inhibidores usados fueron: E-64 para cisteín proteasas (Oliveira et al., 2002);
EDTA para metaloproteinasas; PMSF para serín proteinasas (Schwertz y Takenaka,
1955) y pepstatina A (Lenney, 1975) para aspártico proteinasas. Una concentración
final de 1 mM se utilizó para todos los inhibidores con la excepción de pepstatina A, el
cual se usó en una concentración final de 1 M.
4.5 EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE
PROTEASAS EN LAS SEMILLAS DE PLANTAS.
Para la extracción de los inhibidores de aspártico proteasas se utilizaron semillas de
cinco especies de leguminosas: C. pubescens, L. bogotensis, T. repens, P. acutifolius, P.
coccineus, una lamiacea: H. suaveolens, una amaranthacea: A. hypochondriacus, y una
gramínea: B. humidicola. Para la identificación de estos inhibidores se realizaron
ensayos enzimáticos y zimogramas.
Se tomaron 200 g de semillas secas de C. pubescens, L. bogotensis, T. repens y B.
humidicola, se molieron en un molino criogénico marca Restch, la harina se tamizó a
través de dos mallas de 1.4 mm y 0.85 mm en un separador estándar. La fracción más
fina se desgrasó utilizando una mezcla de cloroformo: metanol 4:1; se adicionaron 5 ml
de la mezcla de solventes por cada gramo de harina; la harina se lavó tres veces con los
solventes en agitación orbital durante 40 min a temperatura ambiente en cámara de
extracción marca Labconco. Los solventes se eliminaron por filtración al vacío a través
de papel filtro Whatman Número 4 utilizando un embudo Büchner. La harina se secó
durante 12 h en cámara de flujo laminar marca Ifalpac Ltda. Con la harina de C.
pubescens, L. bogotensis y B. humidicola la extracción se realizó con una relación de 1
51
g de harina por cada 5 ml de agua (1:5) o 0.2 M de buffer succínico pH 4.5. Mientras
que con T. repens la relación fue de1 g de harina por cada 10 ml de agua (1:10) o 0.2 M
de buffer succínico pH 4.5, debido a que el extracto es muy viscoso. La extracción se
realizó durante 12 h en un agitador orbital marca Corning. El homogeneizado se
centrifugó en una centrifuga marca Beckman Coulter, modelo AllegraTM 21R, Rotor
0850, refrigerada a 4 C a 18.000 rpm por 30 min. El sobrenadante se filtró a través de
papel filtro Whatman Número 4 y se utilizó como fuente de inhibidor.
Se utilizó harina desgrasada y no desgrasada de las semillas de C. pubescens, L.
bogotensis, T. repens y B. humidicola, extrayendo las proteínas con agua y 0.2 M de
buffer succínico pH 4.5. Se evaluó la actividad inhibidora de los extractos crudos de las
semillas contra H. hampei siguiendo el método de Lenney (1975); con la finalidad de
seleccionar las mejores condiciones para la extracción de los inhibidores de las aspártico
proteasas del insecto.
Para la evaluación de la actividad inhibidora de las semillas de L. bogotensis, B.
humidicola, A. hypochondriacus, H. suaveolens, P. acutifolius y P. coccineus se utilizó
harina desgrasada y la extracción de las proteínas con agua, siguiendo el mismo
procedimiento de extracción descrito anteriormente.
4.5.1 Zimogramas de los inhibidores de las aspártico proteasas de las semillas de
plantas.
4.5.1.1 Zimograma del inhibidor
Los extractos proteínicos de las semillas se fraccionaron mediante ultrafiltración con
una membrana de 30 kDa y se adicionaron a un gel de poliacrilamida al 16% de 8 cm de
longitud y un diámetro de 0.75 mm; las proteínas se separaron en condiciones
denaturantes durante 2 h a 4 C según Schägger y von Jagow (1987), utilizando el
equipo para electroforesis Miniprotean III (Bio Rad), con una fuente de poder de Bio-
52
Rad a 120 V. El gel se adicionó a una solución de 1% de hemoglobina bovina en 0.2 M
de buffer citrato pH 2.5 durante 1 h a 4 C. Luego, el gel se lavó con agua desionizada y
se incubó en una solución con 10 mg/ml de extracto proteínico de H. hampei, durante 4
h a 30 C. Después, el gel se lavó con agua desionizada y se coloreó con azul de
Coomassie durante 30 min, el exceso de colorante se eliminó con ácido acético al 10%
durante 1 h. Los inhibidores de aspártico proteasas se observaron como bandas azules
sobre un fondo claro, las aspártico proteasas digieren la hemoglobina presente en el gel,
a excepción del lugar donde la banda (inhibidor) está localizada en el gel.
4.5.1.2 Zimograma de inhibición en gel
Para verificar la inhibición de las aspártico proteasas de la broca del café, las proteínas
de los extractos de adultos del insecto se incubaron con los IPs de las semillas de L.
bogotensis, A. hypochondriacus, B. humidicola e H. suaveolens durante 30 min a 30 C.
Posteriormente, se adicionaron a un gel de poliacrilamida al 10% de 8 cm de longitud y
un diámetro de 0.75 mm; las proteínas se separaron en condiciones nativas según
Laemmli (1970), utilizando el equipo para electroforesis Miniprotean III (Bio Rad), con
una fuente de poder de Bio-Rad a 120 V durante 2 h a 4 C. El gel se adicionó a una
solución de 1% de hemoglobina bovina en 0.2 M de buffer citrato pH 2.5 durante 1 h a
4 C. Luego, el gel se incubó en buffer citrato durante 4 h a 30 C. Por último, el gel se
coloreó con azul de Coomassie durante 30 min; el gel se destiñó con ácido acético al
10% durante 1 h. La presencia de inhibición se identificó por la ausencia de las bandas
de actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei.
4.5.2 Ensayos de inhibición
El inhibidor se incubó con el extracto proteínico de H. hampei, en 0.2 M de buffer
citrato pH 2.5 durante 60 min a 30 C. Posteriormente, se siguió el procedimiento
descrito para la determinación de la actividad proteolítica de las aspártico proteasas
(Lenney, 1975). Una unidad de inhibición se definió como la cantidad de inhibidor que
53
disminuye 0.01 unidades de absorbancia a 280 nm de actividad proteolítica de la enzima
del insecto. Las variables medidas fueron: las unidades de inhibición por ml de extracto
(UI ml-1), las unidades de inhibición por gramo de tejido (UI g-1), las unidades de
inhibición totales (UI) y la actividad específica, unidades de inhibición por miligramo
de tejido (UI mg-1).
El extracto crudo de la semilla que produjo la mayor inhibición de las proteasas de H.
hampei se seleccionó para la purificación y caracterización bioquímica del inhibidor de
aspártico proteasa.
4.6 PURIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE PROTEASAS DE L. bogotensis.
4.6.1 Eliminación de pigmentos.
El extracto liofilizado se disolvió en agua desionizada y la concentración de proteína se
ajustó a 3 mg/ml. Se tomaron 3 ml del extracto de L. bogotensis y se adicionaron a una
columna de exclusión por tamaño Econo-Pac 10DG, empacada con Bio-Gel P-6DG
para eliminar los pigmentos presentes en la muestra.
4.6.2 Microprecipitación con (NH4)2SO4
A 10 ml del extracto proteínico de L. bogotensis libre de pigmentos se adicionó sulfato
de amonio, tamizado a través de muselina para obtener un polvo homogéneo, hasta
obtener 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80% de saturación con (NH4)2SO4. Luego, los tubos de
microcentrifuga se centrifugaron a 14.000 × g en una microcentrífuga durante 10 min y
los precipitados se resuspendieron en buffer de extracción Tris-HCl 20 mM pH 8.0.
Después, los sobrenadantes y precipitados de la saturación con (NH4)2SO4, se dializaron
utilizando una membrana de 3,5 kDa (Spectra/Por, Broadwick Street, USA), se
hicieron seis cambios, cada 5 h contra 1 L de agua con 100 ml de buffer Tris-HCl 20
54
mM pH 8.0. El dializado se liofilizó en un equipo Labconco y se utilizó para evaluar la
actividad inhibidora en los porcentajes de saturación probados.
Las proteínas de los precipitados y sobrenadantes de la saturación con (NH4)2SO4 se
separaron mediante electroforesis en condiciones denaturantes en geles de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) al 16% siguiendo el método descrito
por Schägger y von Jagow (1987).
4.6.3 Ultrafiltración con membrana de 30 kDa.
El extracto proteínico liofilizado, sin pigmentos y precipitado con (NH4)2SO4, se
resuspendió en 10 ml de buffer Tris-HCl 20 mM pH 8.0 y se aplicó en un equipo de
ultrafiltración (Amicon) con una membrana de 30 kDa (Millipore, Billerica, MA, USA).
Después, la membrana se lavó con 60 ml de buffer Tris-HCl 20 mM pH 8.0, las
proteínas eluídas se concentraron utilizando el dispositivo Centriprep límite de
exclusión 3 kDa, hasta un volumen de 2 ml, para continuar la purificación.
4.6.4 Cromatografía de intercambio aniónico Q Sepharosa
48 mg de proteína en 2 ml de buffer Tris-HCl pH 8.0 del extracto proteínico libre de
pigmentos, precipitado con (NH4)2SO4, separado por ultrafiltración con una membrana
de 30 kDa, se aplicaron a una columna Amersham Pharmacia® tipo 9/30 (9 mm DI x 30
cm) empacada con el intercambiador aniónico Q Sepharosa Amersham Pharmacia® con
un volumen de lecho de 20 ml. Para ajustar el flujo y el gradiente lineal, la columna se
equilibró con buffer Tris-HCl 20 mM pH 8, se aplicó un flujo de 0.8 ml/min y se
recolectaron fracciones de 8 ml para la fracción no retenida y de 1.5 ml para la fracción
retenida.
Las proteínas retenidas por la matriz se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a
0.4 M en buffer Tris-HCl 20 mM pH 8. Después de aplicar el gradiente lineal de 0 a 0.4
M se continuó la elución con un gradiente de 0.4-1 M de NaCl en buffer Tris-HCl 20
mM pH 8. A cada fracción se le determinó la concentración de proteína y la actividad
inhibidora contra las aspártico proteasas de H. hampei según el método de Lenney
55
(1975); las fracciones con actividad inhibidora fueron dializadas contra 50 ml de buffer
Tris-HCl 20 mM pH 8.0, utilizando el dispositivo Centriprep®, límite de exclusión 3
kDa. Después de desalinizar las fracciones se liofilizaron.
4.6.5 Elución del inhibidor de aspártico proteasa a partir del gel de acrilamida.
Los inhibidores de aspártico proteasas se adicionaron a un gel de poliacrilamida al 10%
de 20 cm de longitud y se separaron en condiciones denaturantes según Schägger y von
Jagow (1987), utilizando el equipo para electroforesis Protean II xi (Bio Rad), con una
fuente de poder de Bio-Rad a 180 V durante 16 h a 4 C. Después de la separación, una
parte del gel se coloreó con azul de Coomassie durante 30 min, el exceso de colorante
se eliminó con ácido acético al 10% durante 1 h. Con la otra parte del gel se cortó la
banda que corresponde al inhibidor de aspártico proteasa. El inhibidor se eluyó del gel
en un electro elutor Model 422 marca Bio-Rad a 48 mA a 4 C durante 6 h. Después de
la elución, la proteína se dializó contra 50 ml de agua desionizada utilizando el
dispositivo Centriprep®, membrana de 3 kDa. La proteína desalinizada se liofilizó y
utilizó para realizar la caracterización del inhibidor de aspártico proteasas de L.
bogotensis.
4.6.6 Determinación de proteína
La proteína se cuantificó mediante el método de Bradford modificado por Zor y
Selinger (1996), utilizando un patrón de albúmina sérica bovina para preparar una curva
de calibración por triplicado utilizando volúmenes de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 ml de
extracto proteínico. Se adicionaron 0.8 ml del reactivo de Bradford a 0.2 ml de cada una
de las fracciones obtenidas después de cada paso de purificación. La mezcla de reacción
se agitó fuertemente, después de 5 min se midió la absorbancia a 450 nm y 590 nm,
utilizando como blanco agua desionizada.
56
4.6.7 Electroforesis
La pureza del inhibidor se determinó por electroforesis SDS-PAGE al 16% de 8 cm de
longitud y diámetro de 0.75 mm, según el método descrito por Schägger y von Jagow
(1987) utilizando una unidad de electroforesis Miniprotean (Bio Rad), durante 1 h y 45
min a 120 voltios a 4 C. Después de la electroforesis el gel se coloreó con azul de
Coomassie brillante G-250 y el exceso de colorante se eliminó con ácido acético glacial
al 10%.
4.7 CARACTERIZACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE ASPÁRTICO
PROTEASAS
4.7.1 Determinación de la masa molecular
Se determinó la masa molecular de los inhibidores empleando el equipo de Matrix
assisted laser desorption ionization/time of flight (MALDI-TOF), el análisis de
espectrometría de masas fue realizado usando un ABI PerSeptive DE-Pro MALDI-Tof
mass spectrometer (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). 1 L de cada
inhibidor se colocó en un plato y se mezcló con la matriz (ácido sináptico, 40%
acetonitrilo/1% ácido trifluoroacético en agua). El espectrómetro de masas MALDI-
TOF se calibró usando una mezcla de calibración Saquazyme (Applied Biosystems) que
incluye insulina bovina (5.734 Da), tioredoxina de Escherichia coli (11.674 Da) y
apomioglobina de caballo (16.952 Da), previo al análisis de las muestras. Este análisis
se realizó en el laboratorio de Commonwealth Biotechnologies Inc. Richmond,
Virginia, USA.
4.7.2 Determinación del punto isoeléctrico (pI) del inhibidor de aspártico proteasa
La determinación del pI del inhibidor de aspártico proteasa puro se realizó mediante
isoelectroenfoque en el equipo Phast-System, usando un Phast Gel IEF 3-9 con un
57
rango de PH de 3-9. Las muestras fueron separadas en el gel como describe Pharmacia
(Técnica de Separación Archivo No. 100). Después del IEF, las bandas fueron
detectadas por la coloración de Fast Coomassie método para el sistema Phast System
(Técnica de coloración Archivo No. 200). Los marcadores de punto isoeléctrico
incluyeron tripsinógeno (pI 9,30) lectina de lenteja banda básica (pI 8,65), lectina de
lenteja banda intermedia (pI 8,45), lectina de lenteja banda ácida (pI 8,15), banda básica
de mioglobina (pI 7,35), banda ácida de mioglobina (pI 6,85), anhidrasa carbónica
humana B (pI 6,55), anhidrasa carbónica bovina B (pI 5,85) y -lactoglobulina A (pI
5,20).
4.7.3 Estabilidad de la actividad del inhibidor de aspártico proteasa.
4.7.3.1 Efecto de la temperatura
La estabilidad del inhibidor de aspártico proteasa en función de la temperatura, se
determinó en una solución de inhibidor (1 mg/ml) incubando durante 30 min en baño
maría a diferentes temperaturas (37-100 C) y enfriando a 0 C antes de evaluar la
actividad inhibidora residual contra las aspártico proteasas de H. hampei según el
método de Lenney (1975). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los
resultados son el promedio de tres ensayos.
4.7.3.2 Efecto del pH
Para determinar la estabilidad del inhibidor de aspártico proteasa en función del pH, se
tomó una solución del inhibidor (1 mg/ml) en igual volumen de diferentes soluciones
buffer (100mM): citrato de sodio (pH 2-4), acetato de sodio (pH 5), fosfato de sodio
(pH 6-7), Tris-HCl (pH 8) y bicarbonato de sodio (pH 9-10). Después de la incubación
en cada buffer por 30 min a 37 C, el pH fue ajustado a pH 2.5 para evaluar la actividad
inhibidora residual contra las aspártico proteasas de H. hampei, según el método de
Lenney (1975). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados son
el promedio de tres ensayos.
58
4.7.4 Determinación de la presencia de carbohidratos
Para determinar la presencia de carbohidratos totales de los inhibidores de aspártico
proteasas se utilizó el Kit ECL Glycoprotein (Amersham, Pharmacia). Los
carbohidratos se oxidaron con metaperiodato de sodio para formar aldehídos los cuales
reaccionan espontáneamente con hidrácidas. Biotina-X-hidrácida se usó para unir
biotina sobre los carbohidratos oxidados. Las proteínas biotiniladas se detectaron por la
adición de estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano usando luminol. Como
control positivo se utilizó transferrina y como control negativo BSA.
4.7.5 Secuencia de aminoácidos de los inhibidores de aspártico proteasas.
La secuencia amino-terminal de los inhibidores puros fue determinada usando ciclos
repetidos del método de degradación de Edman en un Applied Biosystems Procise
cLC Protein Sequencer, Model 491 cLC, la secuenciación de proteínas se realizó en las
instalaciones de Commonwealth Biotechnologies, Inc. Richmon, Virginia, USA.
Este procedimiento marca y remueve únicamente el aminoácido amino-terminal del
péptido, dejando el resto de los enlaces peptídicos intactos. Los aminoácidos reaccionan
con fenilisotiocianato para formar el péptido feniltiocarbamilado. Luego de lavar el
exceso de fenilisotiocianato, se aplicó un medio ácido y el tiocarbamoilo
correspondiente formó aminoácidos feniltiohidantoina, los cuales fueron detectados a
269 nm después de la separación en una columna de HPLC Wakosil Watopack (4,6 mm
x 25 cm) Shimadzu, bajo condiciones isocráticas, usando 40% de acetonitrilo, 20 mM
de ácido acético y 0.014% de SDS como fase móvil a una velocidad de flujo de 1.0
ml/min a 40 C.
Las secuencias obtenidas fueron sometidas a búsqueda de similitudes con proteínas
registradas en la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes (nr) de NCBI
(The National Center for Biotechnological Information, National Institutes for Health,
USA), y el algoritmo blastp (proteína-proteína BLAST).
59
4.7.6 Cinética de inhibición y determinación de la constante de inhibición de
IAPLb4
Para determinar la cinética de inhibición del inhibidor IAPLb4 contra pepsina se
utilizaron dos concentraciones del sustrato hemoglobina: 0.075 y 0.15 mM. Las
muestras fueron preparadas para alcanzar una concentración de inhibidor de: 0, 3, 4,5, y
6 M. La pendiente inicial v se determinó para cada concentración de inhibidor. El
reciproco de la velocidad (1/v) contra la concentración del inhibidor [IAPLb4] para cada
concentración de sustrato se graficó (gráfica Dixon). Se obtuvo una única línea de
regresión para cada concentración de sustrato y la constante de inhibición (Ki) se calculó
a partir de la interacción de las dos líneas. Para calcular la concentración inhibitoria
media (IC50), se graficó la actividad enzimática residual de las proteasas de H. hampei
contra el logaritmo de la concentración del inhibidor IAPLb4.
4.8 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DEL INHIBIDOR DE
ASPÁRTICO PROTEASA IAPLb4
4.8.1 Extracción del ARN total.
Para la extracción del ARN total de las semillas de L. bogotensis se utilizó el Kit
Rneasy Plant Maxi (QIAGEN, Maryland USA), siguiendo las instrucciones del
fabricante. El ARN total se cuantificó por fluorometría utilizando el kit de
cuantificación de ARN Ribogreen (Molecular Probes) en un equipo Turner
Biosystems 380 Ex/Em 500/525. Se utilizó un patrón de ARN ribosomal 16s
(Invitrogen) para preparar la curva de calibración por triplicado.
4.8.2 Síntesis y clonación del ADN complementario (ADNc).
Se utilizó el kit SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech, California, USA)
para obtener la longitud completa del gen que codifica el inhibidor IALb4. 1 g de
60
ARN total de las semillas de L. bogotensis se utilizó para producir la primera cadena de
ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ADNc se utilizó como molde
para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores degenerados
sentido y antisentido diseñados a partir del extremo amino-terminal del inhibidor (5´-
GARCARGARGARTAYGAYCCNCGNCARCAR-3´) y (5´-
YTGYTGNCGNGGRTCRTAYTCYTCYTGYTC-3´). La amplificación se realizó en
un termociclador PTC-200 BioRad, usando Taq Advantages 2 Polymerase (Clontech,
CA, USA) bajo las siguientes condiciones: 24 ciclos a 94 C 30 s, 60 C 30 s y 72 C
por 3 min.
4.8.3 Extracción de ADN total
Se adicionaron 3 ml de buffer de extracción (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA,
1,5 M NaCl, 2,5% bromuro de hexadeciltrimetilamonio, 0.2% -mercaptoetanol (v/v) y
1% polivinilpirrolidona (p/v) ) a 1 g de semillas de L. bogotensis, la mezcla se incubó a
37 °C durante 12 h a 200 rpm en un agitador Innova 40 marca New Brunswick
Scientific. Luego, a la solución se adicionaron 3 ml de una mezcla cloroformo: alcohol
isoamilico (24:1 v/v) y se centrifugó a 8.000 rpm en una centrifuga marca Beckman
Coulter, modelo AllegraTM 21R, Rotor 0850, por 10 min a 30 °C. Al sobrenadante se le
adicionaron 1,5 ml de NaCl 5 M y 0.6 volúmenes de isopropanol, la mezcla se incubó a
temperatura ambiente por 1 h y luego se centrifugó en una centrifuga marca Beckman
Coulter, modelo AllegraTM 21R, Rotor 0850 a 10.000 rpm, 30 °C durante 10 min. El
precipitado se lavó con etanol al 80% y se secó a temperatura ambiente. Después, se
resuspendió en 0.5 ml de buffer TE, se le adicionaron 5 l de Rnasa A y se incubó a 37
°C durante 30 min en un agitador Innova 40 marca New Brunswick Scientific.
Posteriormente, se adicionó un volumen igual de alcohol isoamilico (24:1 v/v), la fase
acuosa se precipitó por centrifugación en una centrifuga marca Beckman Coulter,
modelo AllegraTM 21R, Rotor 0850 a 10.000 rpm durante 10 min a 30 °C, utilizando
dos volúmenes de etanol frío. El precipitado seco se resuspendió en 200 l de agua
estéril.
61
4.8.4 Amplificación mediante PCR del gen que codifica el inhibidor de aspártico
proteasa
Para la verificación de la longitud completa del gen se diseñaron cebadores específicos
sentido y antisentido a partir de los extremos de la secuencia deducida de la
amplificación con el ADNc (5’-CGAATATGGCTATGATGAGAGGAAGGCTTC-3) y
(5'-CTCCTGCTGTCCAGGGTG TGACTGTT-3'), utilizando como molde ADN
genómico, la amplificación se realizó en un termociclador PTC-200 BioRad, usando
Taq Advantages 2 Polymerase (Clontech, CA, USA) bajo las siguientes condiciones: 95
C 5 min, 34 ciclos de 94 C 1 min, 59 C 30 s, 72 C 2 min 30 s y una extensión de 72
C 5 min.
Los productos de PCR amplificados fueron clonados en el vector pGEM-T Easy
(Promega, Madison, USA), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial. Para la
transformación se utilizaron células competentes E. coli One Shot Mach1-T1
(Invitrogen). Las bacterias fueron sembradas en medio Luria-Bertani (LB) agar con X-
gal y ampicilina (100 mg/ml). Para la verificación de la presencia de los insertos, las
colonias blancas se depositaron en un tubo de microcentrífuga de 0.5 ml se agregaron
30 l de agua nanopura y se realizó lisis bacteriana por choque térmico a 95 ºC durante
5 min seguido de inmersión en hielo.
Los insertos se amplificaron por PCR agregando para una reacción: 5 l de Buffer Taq
10X, 5 l de MgCl2 (10mM), 0.5 l de dNTP’s, 0.2 l de cada cebador universal SP6 y
T7 (10 mM), 0.4 l de Taq Advantages 2 Polymerase (Clontech, CA, USA) y 3,9 l de
agua nanopura. La amplificación se realizó en un termociclador PTC-200 BioRad, bajo
las siguientes condiciones: 35 ciclos de 95 ºC 3 min, 94 ºC 30 s, 60 ºC 30 s, 72 ºC 2
min, 94 ºC 3 min, 52 ºC 30 s y 72 ºC 30 s y una extensión final de 72 ºC 10 min. Se
cargaron 20 l del amplificado en gel de agarosa al 1.5% por 30 min a 90 V. Para la
extracción de los plásmidos se empleó el kit QIAprep Spin Miniprep (Quiagen)
siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los clones recombinantes fueron
62
secuenciados en ambas direcciones en el secuenciador 3730 xl DNA analyzer (Applied
Biosystems).
4.8.5 Análisis de las secuencias.
Las secuencias fueron analizadas por medio del programa Codon Code Aligner v1.5.2
(Code Corporation) para Macintosh, la calidad de las bases fue estimada con un 99% de
confianza (calificación por PHRED de al menos 30) donde se descartaron secuencias
con menos de 50 pb, se eliminaron las secuencias del vector con similitud del 100% y
las secuencias de los adaptadores del kit SMART RACE ADNc; se confirmó la
presencia de los cebadores con similitud del 100%. Las secuencias obtenidas fueron
sometidas a búsqueda de similitud con proteínas y nucleótidos utilizando Blastx y
Blastn, respectivamente; en la base de datos de proteínas no redundantes (nr) del NCBI.
Los parámetros empleados para la búsqueda fueron: tamaño de plabra: 3, e-value: 10,
matriz: BLOSUM62, penalidad por gap: existencia 11 y extensión 1. Para la predicción
del marco de lectura abierto más probable se utilizó el programa ORF Finder (Open
reading Frame Finder) del NCBI, utilizando la secuencia completa de los dos extremos
3’ RACE y 5’RACE.
4.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la determinación de las mejores condiciones de extracción de los IPs se utilizó un
experimento multifactorial, los tratamientos evaluaron el empleo o no de desgrase y la
extracción con agua o 0.2 M de buffer succínico pH 4.5. el diseño experimental fue
completamente al azar y el número de repeticiones fueron 3. Para la identificación de la
semilla que produce la mayor inhibición de las aspártico proteasas de H. hampei se
realizó un experimento unifactorial, el diseño experimental fue completamente al azar y
el número de repeticiones fueron 3. Para la determinación del porcentaje de saturación
de (NH4)2SO4 que produce la mayor inhibición de las aspártico proteasas del insecto se
realizó un experimento unifactorial, el diseño experimental fue completamente al azar y
el número de repeticiones fue 3. La unidad experimental fue un tubo conteniendo las
63
aspártico proteasas de H. hampei, el inhibidor de aspártico proteasas, el sustrato y ácido
tricloroacético.
A los experimentos se les aplicó un análisis descriptivo: se estimaron el promedio y la
varianza para las unidades de inhibición totales (UI). Se comprobó la homogeneidad de
varianza y se realizó el análisis de varianza, bajo un diseño completamente al azar. La
comparación de medias se realizó mediante la prueba de Duncan al 5%. Los datos
fueron procesados en un computador IBM con el programa SAS versión 9.1.
64
5. RESULTADOS
5.1 IDENTIFICACIÓN DE LAS ASPÁRTICO PROTEASAS DE H. hampei.
5.1.1 Actividad proteolítica en el intestino medio de H. hampei.
La actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei (APH) se determinó
empleando de 0 hasta 80 g de proteína de extracto crudo después de 120 min de
iniciada la reacción, encontrando que la digestión de hemoglobina fue lineal hasta una
concentración de 40 g de proteína como fuente de enzima (Figura 4). La actividad
proteolítica máxima se obtuvo con una concentración de 60 g de proteína y la
actividad específica fue de 123,8 U mg-1 (Tabla 3). Con relación al tiempo, la digestión
de hemoglobina fue lineal entre 5 a 20 min después del comienzo de la reacción (Figura
5).
Tabla 3. Actividad proteolítica de las APH.
Muestra Actividad
proteolítica U ml-1
Actividad
proteolítica total U
Proteína
(mg ml-1)
Actividad específica
(U mg –1)
Extracto crudo
247,7 3.715 2,0 123,8
5.1.2 Zimograma en gel de las aspártico proteasas de H. hampei
Los zimogramas mostraron dos bandas de actividad proteolítica tipo aspártico proteasa
en los extractos de intestinos (Figura 6, carril A) y de adultos completos de H. hampei
(Figura 6, carril B). Previamente, se encontraron tres bandas de actividad proteolítica
tanto en brocas adultas como en intestinos (Preciado et al., 2000), corroborando la
presencia de aspártico proteasas en intestinos y adultos del insecto. La actividad
aspártico proteasa en el intestino del insecto confirma su función digestiva.
65
Figura 4. Actividad proteolítica de las APH, absorbancia a 280 nm en función de la
concentración de proteína (g) del extracto del insecto.
Figura 5. Actividad proteolítica de las APH, absorbancia a 280 nm en función del
tiempo (min).
y = -0.0003x2 + 0.0324x + 0.4084
R2 = 0.8333
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
11.11.21.31.41.5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Tiempo (min)
Absorb
ancia
280 n
m
y = -0.0002x2 + 0.0176x + 0.0345
R2 = 0.9632
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 20 40 60 80 100
concentración proteína ug/mL
Ab
sorb
anci
a 28
0 n
m
66
Figura 6. Zimograma de la actividad APH usando un perfil electroforético no
denaturante al 16%. A. extracto crudo de intestino. B. extracto crudo de
adultos de H. hampei.
Con base en esta información y teniendo en cuenta que el tamaño del insecto es de 1.4 a
1.6 mm de longitud (Bustillo, 2008), se utilizaron extractos proteínicos de adultos
completos de H. hampei, que representan la actividad aspártico proteasa, para obtener la
cantidad suficiente de enzima para los ensayos de actividad proteolítica y de inhibición.
Del mismo modo, extractos completos de H. hampei reflejan la actividad de las -
amilasas intestinales y se utilizaron para identificar inhibidores de -amilasas de plantas
específicos contra estas enzimas (Valencia et al., 2000).
5.1.3 Actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei en función del
pH.
La actividad proteolítica de los extractos proteínicos de H. hampei se evaluó en un
rango de pH de 2 a 7.5 con hemoglobina bovina como sustrato. Se evidenció la
presencia de enzimas proteolíticas activas en el rango de pH ácido de 2 a 5, con una
67
actividad proteolítica máxima a pH 2.5 (Figura 7). Una característica particular de las
aspártico proteasas es su rango óptimo de actividad a pH de 2-5, que coincide con el pH
ácido del intestino medio de H. hampei (Ossa et al., 2000).
Figura 7. Actividad (U ml-1) de las APH en función del pH.
5.1.4 Inhibición de la actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei
por IPs.
El inhibidor de aspártico proteasa: pepstatina A (Barrett, 1977), inhibió la actividad
proteolítica de las APH en concentraciones de 0.1 hasta 1 M; al aumentar la
concentración de pepstatina A se incrementó la inhibición de las aspártico proteasas y
con 1 M de pepstatina A la inhibición fue de 83,3% (Figura 8); mientras que el
inhibidor de serín proteinasa: PMSF (1 mM), el inhibidor de cisteín proteinasa: E-64 (1
mM) y el inhibidor de metaloproteinasa: EDTA (1 mM), no inhibieron la actividad
enzimática de las proteasas de H. hampei.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8pH
Ac
tiv
ida
d (
Un
ida
de
s/m
L)
68
Figura 8. Porcentaje de inhibición de la actividad APH en función de la concentración
de pepstatina A (M).
Se evaluó la actividad proteolítica de las aspártico proteasas de H. hampei usando
hemoglobina y BSA como sustrato, con la finalidad de diferenciar entre pepsina y
catepsina D. Las proteasas de H. hampei digirieron 100% de hemoglobina y 10% de
BSA, esto demostró que son catepsina D (Tabla 4).
Tabla 4. Porcentaje de actividad proteolítica de las APH y pepsina usando hemoglobina
y BSA como sustrato.
Enzima
% Actividad proteolítica
Hemoglobina Albúmina sérica bovina Aspártico proteasa de H. hampei 100 10 Pepsina 100 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.1 0.2 0.4 0.8 1
µM Pepstatina A
% in
hib
ició
n
69
5.2 EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE LAS
ASPÁRTICO PROTEASAS DE H. hampei EN SEMILLAS DE PLANTAS.
5.2.1 Extracción de los IPs de los extractos proteínicos de L. bogotensis y B.
humidicola.
Se realizó la extracción de las proteínas de los extractos de L. bogotensis y B.
humidicola, con agua y buffer succínico 0.2 M pH 4.5 a partir de harina desgrasada y
sin desgrasar. Para la identificación de IPs se determinaron las unidades de inhibición
por ml (UI ml-1), las unidades de inhibición totales (UI) y la actividad específica (UI
mg-1) (Tabla 5). La comparación entre las dos especies mostró que el extracto de L.
bogotensis produjo una inhibición significativamente mayor (P < 0.0001) de las
aspártico proteasas de H. hampei (5.230 UI) que el extracto proteínico de B. humidicola
(1.626 UI) (Anexo 1).
Tabla 5. Actividad inhibidora de los IPs de las semillas de L. bogotensis y B.
humidicola contra las APH.
Especie
Tratamiento
Buffer
UI ml-1
Actividad inhibición
total UI
Actividad específica UI mg-1
L. bogotensis Desgrasado Agua ** 219,1 8.764 97,4
L. bogotensis Desgrasado B succínico 0.2 M pH 4.5 123,3 4.314 47,9
L. bogotensis Sin desgrasar Agua 109,8 4.391 48,8
L. bogotensis Sin desgrasar B succínico 0.2 M pH 4.5 88,4 3.449 38,3
B. humidicola Desgrasado Agua 73,5 2.426 27,0
B. humidicola Desgrasado B succínico 0.2 M pH 4.5 52,7 1.633 18,1
B. humidicola Sin desgrasar Agua 42,7 1.280 14,2
B. humidicola Sin desgrasar B succínico 0.2 M pH 4.5 34,3 1.167 13,0
** = P 0.0001
70
El extracto acuoso de L. bogotensis obtenido a partir de harina desgrasada presentó
8.764 UI y una actividad específica de 97,4 UI mg-1, siendo esta inhibición
significativamente superior al resto de los tratamientos probados, según la prueba de
Duncan al 5% (Anexo 2). Del mismo modo, el extracto acuoso de B. humidicola
producido a partir de harina desgrasada mostró una inhibición mayor con 2.426 UI, en
comparación a los demás tratamientos (Tabla 5).
El empleo de harina sin desgrasar, independiente de la extracción con agua o con buffer
succínico 0.2 M pH 4.5, produjo una inhibición significativamente menor (P < 0.0001)
de las APH (2.572 UI) que la harina desgrasada (4.284 UI) (Anexo 1). Esto indica que
la grasa interfiere con la determinación de la actividad inhibidora de las aspártico
proteasas del insecto (Valdes et al., 1993; Rodríguez et al., 2007; Harsulkar et al., 1999;
Rassam y Laing, 2006); por esto es necesario desgrasar la harina antes de extraer las
proteínas de las semillas.
La extracción de los IPs fue mejor con agua, obteniéndose una inhibición mayor de las
proteasas de H. hampei (4.215 UI) que con buffer succínico 0.2 M pH 4.5 (2.641 UI)
(Anexo 1). Con base en estos resultados se seleccionó para la extracción de los
inhibidores de aspártico proteasas harina desgrasada y agua en una relación 1:5.
5.2.2 Identificación de los IPs de las aspártico proteasas de H. hampei en semillas
de plantas
Se seleccionaron las semillas de C. pubescens, L. bogotensis, T. repens, B. humidicola
porque mostraron efectos antinutricionales contra H. hampei (Gonzales, 1999).
También, se analizaron las semillas de A. hypochondriacus, P. acutifolius, P. coccineus
e H. suaveolens porque IPs de estas especies inhiben in vitro la actividad proteolítica de
coleópteros como: C. maculatus, Z. subfasciatus, Prostephanus truncatus, T. castaneum
y A. obtectus (Campos et al., 1997; Chagolla et al., 1994; Shade et al, 1987; Valdes et
al., 1993).
71
Los extractos proteínicos de P. coccineus, P. acutifolius, T. repens y C. pubescens no
inhibieron la actividad aspártico proteasa de H. hampei. El extracto de L. bogotensis
produjo la mayor inhibición de las proteasas de H. hampei con 5.560 UI y una actividad
específica de 74,1 UI mg-1, en comparación con H. suaveolens, B. humidicola y A.
hypochondriacus, que fueron significativamente iguales (Tabla 6), prueba de Duncan al
5% (Anexo 3).
Tabla 6. Actividad de los IPs de las semillas de L. bogotensis, B. humidicola, A.
hypochondriacus e H. suaveolens contra las APH.
Especie UI ml-1 Actividad inhibición total UI
UI g-1 Actividad específica UI mg-1
L. bogotensis 139,0 5.560 A 556,0 74,1
B. humidicola 58,0 1.380 B 1380 18,6
H. suaveolens 29,6 1.392 B 139,0 18,4
A. hypochondriacus 16,8 673,3 B 67,3 9,0
Promedios seguidos por la misma letra son iguales (p<0.0001).
5.2.3 Inhibición de las APH y pepsina por los inhibidores de las aspártico proteasas
de L. bogotensis (IAPLb).
Los inhibidores de las aspártico proteasas de L. bogotensis (IAPLb) inhibieron las APH
y pepsina (Figura 9). Utilizando 10 g del extracto proteínico se inhibió 25% de la
actividad de las APH, para obtener una inhibición igual de pepsina fue necesario una
cantidad mayor del extracto de L. bogotensis.
Se encontró que 100 g del extracto conteniendo los IAPLb disminuyeron en 100% y
90% la actividad de pepsina y de las APH, respectivamente (Figura 9) esto indica que el
10% de la actividad de las APH fue insensible a los inhibidores de L. bogotensis. Estos
resultados son promisorios ya que se inhibió la actividad de las APH con una
concentración muy baja de IAPLb. De forma similar, una concentración de 160 g de
extracto crudo de Momordica charantia L., mayor a la empleada en este trabajo, inhibió
72
el 84% de la actividad de las proteinasas del intestino de H. armigera. Esto indica que el
16% de la actividad de las serín proteinasas de este insecto son insensibles a los
inhibidores de M. charantia (Telang et al., 2003). Mientras que una concentración diez
veces mayor de extracto crudo de P. vulgaris L. y Amaranthus sp. sólo inhibió la
actividad -amilasa de H. hampei en un 80% y 40%, respectivamente (Valencia et al.
2000).
Figura 9. Porcentaje de inhibición de las APH y pepsina en función de la concentración
de proteína (µg) de los IAPLb.
5.2.4 Inhibición de APH por los inhibidores de proteasas de B. humidicola e H.
suaveolens
Los extractos proteínicos de B. humidicola e H. suaveolens mostraron una inhibición
menor de las APH que L. bogotensis (Tabla 6). Con estos extractos fue necesario 1 mg
de extracto crudo para inhibir la actividad de las APH en 60% y 70%, respectivamente
(Figura 10). De forma similar, 1 mg de extracto crudo de Amaranthus cruentus inhibió
80% de la actividad amilasa de H. hampei (Valencia et al., 2000).
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Concentración proteína (µg)
% In
hib
ició
n
IALb vs APH IALb vs Pepsina
73
Figura 10. Porcentaje de inhibición de las APH en función de la concentración de
proteína (mg) del extracto proteínico de B. humidicola y H. suaveolens.
Las diferencias en los porcentajes de inhibición podrían deberse a la selectividad que los
inhibidores de plantas han desarrollado para reconocer enzimas específicas de insectos,
la susceptibilidad de los IPs a la inactivación por las proteasas digestivas y a variaciones
en afinidad entre los IPs y las enzimas digestivas (Michaud, 1997; Koiwa et al., 1998;
Zhu-Salzman et al., 2003).
5.2.5 Zimogramas en gel para la identificación de inhibidores de aspártico
proteasas en extractos proteínicos de plantas.
Los ensayos de inhibición evalúan la inhibición cuantitativa de las aspártico proteasas
de H. hampei por los IPs de extractos de plantas, en contraste los zimogramas son
determinaciones cualitativas, que se utilizaron para identificar cuántos IPs están
presentes en los extractos proteínicos. Este método ha sido usado con éxito para la
detección de inhibidores de -amilasas de P. vulgaris y de C. cajan (Valencia et al.,
2007; Giri y Kachole, 1998).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentración proteína (mg)
% in
hib
ició
n
H. suaveolens B. humidicola
74
La separación de las proteínas de las semillas en condiciones denaturantes presentó
bandas en un rango de masa molecular entre 6 a 30 kDa (Figura 11). El zimograma
mostró que las proteínas de los extractos de B. humidicola, H. suaveolens, L. bogotensis
y A. hypochondriacus son resistentes a la digestión por las APH del insecto; esto indica
que son inhibidores de aspártico proteasas (Figura 12). Mientras que las proteínas de los
extractos de C. pubescens, T. repens, P. acutifolius y P. coccineus, son digeridas por las
aspártico proteasas de H. hampei; confirmando los resultados obtenidos en los ensayos
de inhibición.
Figura 11. Perfil electroforético (SDS-PAGE) 16% de los extractos proteínicos de las
semillas de plantas. 1: Marcador de peso molecular. 2: B. humidicola. 3: H.
suaveolens. 4: L. bogotensis. 5: A. hypochondriacus. 6: C. pubescens. 7: T.
repens. 8: P. acutifolius. 9: P. coccineus.
5.2.6 Zimograma de inhibición en gel
El zimograma de inhibición en gel (Figura 13) mostró que los IPs de los extractos
proteínicos de L. bogotensis (Carril 2), B. humidicola (Carril 3), H. suaveolens (Carril
4) y A. hypochondriacus (Carril 5) se unen al sitio activo de las aspártico proteasas de
H. hampei bloqueando la actividad de la enzima, lo cual se refleja en la desaparición de
las dos bandas de actividad proteolítica.
1 2 3 4 5 6 7 8 921011882
6
31
40
17
kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 921011882
6
31
40
17
kDa
75
Figura 12. Zimograma usando un perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% de los
extractos proteínicos de las semillas de plantas. 1: Marcador de peso
molecular. 2: B. humidicola. 3: H. suaveolens. 4: L. bogotensis. 5: A.
hypochondriacus. 6: C. pubescens. 7: T. repens. 8: P. acutifolius. 9: P.
coccineus.
Figura 13. Zimograma de inhibición de las APH por IPs de los extractos proteínicos
usando un perfil electroforético (PAGE) al 10%. 1: Control, extracto de
adultos de H. hampei. 2: L. bogotensis. 3: B. humidicola. 4: H. suaveolens.
5: A. hypochondriacus.
82
210
6
31
40
118
17
1 2 3 4 5 6 7 8 9
kDa
82
210
6
31
40
118
17
1 2 3 4 5 6 7 8 9
kDa
1 2 3 4 51 2 3 4 5
76
Debido a que hasta el momento los inhibidores de aspártico proteasas han sido poco
estudiados y se han aislado de un número reducido de plantas, los resultados del
presente trabajo son promisorios porque se identificaron inhibidores de las aspártico
proteasas de H. hampei en las semillas de L. bogotensis, H. suaveolens, B. humidicola y
A. hypochondriacus. Se seleccionó la semilla de L. bogotensis para la purificación de
IPs porque produjeron la mayor inhibición de las aspártico proteasas.
Recientemente, se encontró que los IPs de Diplotaxis muralis y Diplotaxis tenuifolia
expresados en Pichia pastoris inhibieron la actividad tripsina de los intestinos de larvas
de Helicoverpa zea pero mostraron una reducida actividad contra tripsina bovina. Esto
muestra la importancia de estudiar la actividad de IPs de plantas contra las proteasas
blanco (Volpicella et al., 2009). Por lo anterior en este trabajo se realizaron todos los
ensayos de inhibición contra las aspártico proteasas de H. hampei.
5.3 PURIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE LAS ASPÁRTICO PROTEASAS
DE H. hampei A PARTIR DE LAS SEMILLAS DE L. bogotensis.
5.3.1 Eliminación de pigmentos.
El extracto proteínico de la semilla de L. bogotensis presentó una pigmentación amarilla
que interfirió con la separación electroforética, utilizando entre 5 a 20 g de proteína de
extracto crudo se observaron bandas gruesas y agrupadas, e incluso la menor
concentración de proteína no mostró bandas individuales (Figura 14, Carril 2).
El extracto proteínico de L. bogotensis (3 mg/ml) se pasó a través de una columna de
exclusión por tamaño Econo-Pac 10DG empacada con una matriz de Bio-Gel P-
6DG con el fin de eliminar los pigmentos; esta columna excluyó los solutos con una
masa molecular inferior a 6 kDa, incluyendo la mayoría de los pigmentos del extracto
crudo de la semilla. La separación electroforética de 20 g de proteína del extracto de L.
bogotensis sin pigmentos mostró bandas individuales (Figura 15, carril 2).
77
Figura 14. Perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% del extracto proteínico de L.
bogotensis con pigmentos. 1: Marcador de peso molecular. 2: L. bogotensis
(5 g). 3: L. bogotensis (10 g). 4: L. bogotensis (20 g)
Figura 15. Perfil electroforético (SDS-PAGE) al 16% del extracto proteínico de L.
bogotensis sin pigmentos. 1: Marcador de peso molecular. 2: L. bogotensis
libre pigmentos (20 g). 3: BSA.
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4
82
210
6
31
40
118
17
kDa
78
El extracto proteínico de L. bogotensis con pigmentos produjo una inhibición menor de
las aspártico proteasas de H. hampei con 3.446 UI y una actividad específica de 86,2 UI
mg-1. En comparación, con el extracto sin pigmentos que mostró una inhibición de
3.912 UI y una actividad específica de 97,8 UI mg-1 (Tabla 7).
Tabla 7. Actividad inhibidora del extracto crudo de L. bogotensis con y sin pigmentos
contra las APH.
Extracto crudo UI ml-1 Actividad inhibición total UI
Actividad específica UI mg-1
Con pigmentos 172,3 3.446 86,2
Libre de pigmentos 195,6 3.912 97,8
De acuerdo con estos resultados se incluyó en la purificación de los IAPLbs la
eliminación de los pigmentos del extracto proteínico para evitar la interferencia en la
detección de la actividad inhibitoria y favorecer la separación electroforética de las
proteínas del extracto crudo. Además, se eliminaron proteínas de masa molecular
inferior a 6 kDa que no inhiben las APH.
5.3.2 Microprecipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4.
El extracto proteínico libre de pigmentos se precipitó con (NH4)2SO4 desde el 20 hasta
el 80% (p/v) (Figura 16), con la finalidad de separar las proteínas por solubilidad
diferencial, seleccionar el porcentaje de saturación que presentó la mayor inhibición de
las APH y concentrar las proteínas en un volumen fácil de manipular para los siguientes
pasos de purificación (Saxena et al., 2007). Las unidades de inhibición por ml (UI ml-1),
las unidades de inhibición totales (UI) y la actividad específica (UI mg-1) de los
sobrenadantes y precipitados del fraccionamiento con (NH4)2SO4 se aprecian en la tabla
8.
79
Figura 16. Microprecipitación con (NH4)2SO4 de las proteínas del extracto proteínico
de L. bogotensis.
Los sobrenadantes del 20 al 70% de saturación con (NH4)2SO4 inhibieron las APH con
1.530 a 3.304 UI (Tabla 8). Entre éstos el de 50% presentó la mayor inhibición con
3.304 UI y una actividad específica de 206,5 UI mg-1 (Anexo 4). La separación
electroforética mostró que las proteínas entre 6 a 30 kDa predominaron con respecto a
las de masa molecular superior (Figura 17, carril 8).
Los precipitados del 20 al 70% de saturación produjeron una inhibición menor de las
APH entre 34,5 a 1.575 UI comparados con los sobrenadantes (Tabla 8). El precipitado
del 80% mostró la mayor inhibición de las APH con 3.382 UI y una actividad específica
de 153,7 UI mg-1 (Anexo 4). En el precipitado del 80% abundaron las proteínas de masa
molecular inferior a 30 kDa (Figura 18, carril 6).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 20 40 60 80 100
% Saturación (NH4)2SO4
Pro
teín
a m
g/m
L
Sobrenadante Precipitado
80
Tabla 8. Actividad inhibidora del extracto proteínico de L. bogotensis, precipitado con
(NH4)2SO4, contra las APH.
% saturación
(NH4)2SO4
UI ml-1 Actividad inhibición
total UI
Actividad específica
UI mg-1
Precipitado 20% 105 1.575 G 157,5
Sobrenadante 20% 102 1.530 G 69,5
Precipitado 30% 96 1.440 H 120,0
Sobrenadante 30% 110 1.650 F 82,5
Precipitado 40% 50 750 J 53,6
Sobrenadante 40% 170 2.550 C 141,7
Precipitado 50% 2,3 34,5 K 2,2
Sobrenadante 50% 220,3 3.304 B 206,5
Precipitado 60% 60 900 I 50,0
Sobrenadante 60% 160 2.400 D 171,4
Precipitado 70% 60 900 I 45,0
Sobrenadante 70% 155 2.325 E 193,8
Precipitado 80% ** 225,5 3.382 A 153,7
Sobrenadante 80% 0,34 5,0 K 0,5
Promedios seguidos por la misma letra son iguales (p<0.0001).
La separación electroforética de los sobrenadantes del 40% al 70% de saturación con
(NH4)2SO4 mostró el predominio de las proteínas de masa molecular inferior a 30 kDa
(Figura 17, carriles 6 y 8. Figura 18, carriles 3 y 5); en comparación con los precipitados
correspondientes donde abundaron las proteínas de masa molecular superior a 30 kDa
(Figura 17, carriles 5 y 7; Figura18, carriles 2 y 4).
81
Figura 17. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la microprecipitación con
(NH4)2SO4 del extracto proteínico de L. bogotensis. 1: Marcador de peso
molecular. 2: Precipitado 20%. 3: Precipitado 30%. 4: Sobrenadante 30%.
5: Precipitado 40%. 6: Sobrenadante 40%. 7: Precipitado 50%. 8:
Sobrenadante 50%.
Figura 18. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la microprecipitación con
(NH4)2SO4 del extracto proteínico de L. bogotensis. 1: Marcador de peso
molecular. 2: Precipitado 60%. 3: Sobrenadante 60%. 4: Precipitado 70%.
5: Sobrenadante 70%. 6: Precipitado 80%. 7: Sobrenadante 80%.
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
82
210
6
31
40
118
17
1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
82
210
6
31
40
118
17
1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
82
Con base en esta información se realizó el fraccionamiento con (NH4)2SO4 en dos
pasos: primero adicionando (NH4)2SO4 hasta una saturación de 50% y en segundo lugar
precipitando las proteínas del sobrenadante con (NH4)2SO4 hasta el 80%. De esta forma,
se concentraron las proteínas de masa molecular entre 6 a 30 kDa, que produjeron la
mayor inhibición de las APH. Además, la actividad específica (153,4 UI mg-1) fue
mayor con relación al paso previo de purificación; por la eliminación de proteínas que
no inhiben las aspártico proteasas del insecto.
El fraccionamiento con (NH4)2SO4 se ha empleado para la purificación de varios IPs
como ejemplo: el inhibidor de pepsina de Ascaris lumbricoides (Abuereish y Penasky,
1974), el inhibidor de tripsina-Kunitz de Archidendron ellipticum (AeTI)
(Bhattacharyya et al., 2006) y el inhibidor de serín proteinasas de Solanum americanum
(SaPIN2a) (Wang et al., 2007). El extracto proteínico sin pigmentos saturado con
(NH4)2SO4 al 50% y 80% se desalinizó con una membrana de diálisis de 3,5 kDa y se
liofilizó para continuar con la purificación.
5.3.3 Ultrafiltración con membrana de 30 kDa.
El extracto proteínico liofilizado se fraccionó por ultrafiltración con una membrana de
30 kDa. Las proteínas de masa molecular inferior a 30 kDa mostraron 3.754 UI y una
actividad específica de 469,3 UI mg-1, mayor que en el paso previo de purificación
(Tabla 9). Esto se debió a la eliminación de proteínas de masa molecular superior a 30
kDa que no inhiben las aspártico proteasas, las cuales quedaron retenidas en la
membrana de ultrafiltración (Figura 19).
En este paso de purificación se seleccionaron las proteínas con masa molecular entre 6 a
30 kDa, que inhibieron las aspártico proteasas de H. hampei. Estas proteínas se
concentraron utilizando el dispositivo Centriprep con un límite de exclusión de 3 kDa
hasta un volumen de 5 ml.
83
Tabla 9. Actividad inhibidora del extracto proteínico de L. bogotensis, separado por
ultrafiltración membrana de 30 kDa, contra las APH.
Extracto L. bogotensis
libre de pigmentos
UI ml-1 Actividad inhibición
total UI
Actividad específica
UI mg-1
Ultrafiltración
membrana 30 kDa
250,3 3.754 469,3
Figura 19. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 10% de la purificación de IAPLb
hasta ultrafiltración. 1-2: Marcador peso molecular. 3: Extracto crudo. 4:
Extracto crudo sin pigmentos. 5: Sobrenadante (NH4)2SO4 al 50%. 6:
Precipitado (NH4)2SO4 al 80%. 7: Proteínas ultrafiltración 30 kDa.
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
84
5.3.4 Cromatografía de intercambio aniónico.
48 mg del extracto proteínico de L. bogotensis separado mediante ultrafiltración se
sometieron a intercambio aniónico en un soporte de Q Sepharosa Amersham
Pharmacia®, el volumen muerto fue de 16 ml, las fracciones que no fueron retenidas
por el soporte cromatográfico no inhibieron las aspártico proteasas de H. hampei. El
gradiente lineal de 0-0.4 M de NaCl separó la fracción retenida en ocho picos, cinco de
los cuales inhibieron las aspártico proteasas de H. hampei (Figura 20). Estas proteínas
fueron designadas como inhibidor de aspártico proteasa de L. bogotensis: IAPLb1,
IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4 e IAPLb5.
Figura 20. Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharosa de los IAPLb:
IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4 e IAPLb5. Línea rosada, proteína
expresada en g/ml; línea azul actividad inhibidora contra las APH
(UI/ml); línea punteada gradiente lineal de 0-0.4 M de NaCl.
0
200
400
600
800
1000
1200
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171
No. Fracción
Pro
teín
a µ
g/m
L
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
UI/m
L
0.1
0.2
0.3
0.4
0-0
.4 m
ol
L-1
Gra
die
nte
Na
Cl
0
IAPLb1IAPLb2
IAPLb3
IAPLb4
IAPLb5
0
200
400
600
800
1000
1200
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171
No. Fracción
Pro
teín
a µ
g/m
L
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
UI/m
L
0.1
0.2
0.3
0.4
0-0
.4 m
ol
L-1
Gra
die
nte
Na
Cl
0
IAPLb1IAPLb2
IAPLb3
IAPLb4
IAPLb5
85
El inhibidor IAPLb4 eluído con 0.13 M de NaCl produjo la mayor inhibición de las
aspártico proteasas del insecto con 5.775 UI y una actividad específica de 15.608 UI
mg-1; seguido por el inhibidor IAPLb5 eluído con 0.14 M de NaCl con una inhibición
total de 2.700 UI y una actividad específica de 9.000 UI mg-1 (Tabla 11). Mientras que
los inhibidores IAPLb1, IAPLb2 e IAPLb3 eluídos con 0.07, 0.1 y 0.12 M de NaCl,
respectivamente; mostraron una inhibición menor de las aspártico proteasas del insecto
(Tabla 10).
Tabla 10. Actividad inhibidora de IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4 e IAPLb5 contra
las APH.
Inhibidor Aspártico
L. bogotensis (IALb)
Proteína mg
UI ml-1 Actividad inhibición total UI
Actividad específica UI mg-1
IAPLb1 0,37 245,0 2.573 6.953
IAPLb2 0,35 255,0 2.678 7.650
IAPLb3 0,30 175,0 1.838 6.125
IAPLb4 0,37 550,0 5.775 15.608
IAPLb5 0,30 300,0 2.700 9.000
La separación electroforética en condiciones denaturantes de los picos IAPLb4 e
IAPLb5 obtenidos en la cromatografía de intercambio aniónico con la resina Q
Sepharosa Amersham Pharmacia® se aprecia en la figura 21. IAPLb4 muestra una
banda principal (carril 2) con una masa molecular aproximada de 12 kDa, que
posiblemente corresponde a la proteína con actividad inhibitoria, lo cual pudo
comprobarse en el zimograma. Mientras que IAPLb5 muestra dos bandas principales de
masa molecular aproximada de 11 y 12 kDa, y otras bandas de masa molecular inferior
menos definidas (carril 3).
86
Figura 21. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de IAPLb4 e IAPLb5. 1:
Marcador peso molecular. 2: IAPLb4. 3: IAPLb5.
El zimograma confirmó que la banda principal de IAPLb4 corresponde a un inhibidor
de aspártico proteasa (Figura 22, Carril 2); porque tiene una actividad que es resistente a
la digestión por las APH; en contraste, a las otras proteínas que son digeridas por la
enzima. El zimograma también mostró que las dos bandas de proteína de IAPLb5
corresponden a IPs porque son resistentes a la digestión por las APH (Figura 22, Carril
3). Debido a la cercanía de las dos bandas fue difícil eluirlas del gel de manera
independiente.
La fracción retenida fue eluída en un único pico con un gradiente de 0.4-1 M de NaCl
(Figura 23). La electroforesis mostró la presencia de dos bandas predominantes
designadas como IAPLb6 e IAPLb7 con una masa molecular aproximada de 12 y 18
kDa, respectivamente (Figura 24, Carril 2).
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
87
Figura 22. Zimograma de IAPLb4 e IAPLb5 usando un perfil electroforético (SDS-
PAGE) al 16%. 1: Marcador peso molecular. 2: IAPLb4. 3: IAPLb5.
Figura 23. Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharosa de los IPs: IAPLb6
e IAPLb7. Línea rosada, proteína expresada en g/ml; línea azul actividad
inhibidora contra las APH (UI/ml); línea punteada gradiente lineal de 0.4-1
M de NaCl.
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3
82
210
6
31
40
118
17
kDa
0
200
400
600
800
1000
1200
1 12 23 34 45 56 67 78 89 100
111
122
133
144
155
166
177
188
199
210
221
No. Fracción
Pro
teín
a µ
g/m
L
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
UI/
mL
0.5
1.0
0.4
-1.0
m
ol
L-1
Na
Cl
0
IAPLb1
IAPLb2
IAPLb3
IAPLb4
IAPLb5
IAPLb7
IAPLb6
0
200
400
600
800
1000
1200
1 12 23 34 45 56 67 78 89 100
111
122
133
144
155
166
177
188
199
210
221
No. Fracción
Pro
teín
a µ
g/m
L
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
UI/
mL
0.5
1.0
0.4
-1.0
m
ol
L-1
Na
Cl
0
IAPLb1
IAPLb2
IAPLb3
IAPLb4
IAPLb5
IAPLb7
IAPLb6
88
Figura 24. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de IAPLb6 e IAPLb7. 1:
Marcador peso molecular. 2: IAPLb6 e IAPLb7.
IAPLb6 e IAPLb7 se eluyeron del gel mostrando una actividad específica de 2.275 y
2.152 UI mg-1, respectivamente (Tabla 11). Estas proteínas mostraron una inhibición
menor de las APH que el resto de inhibidores purificados por cromatografía de
intercambio aniónico (Tabla 10).
Tabla 11. Actividad inhibidora de IAPLb6 e IAPLb7 contra las APH.
Inhibidor aspártico proteasa
L. bogotensis (IAPLb)
Proteína
mg
UI ml-1 Actividad
inhibición total
UI
Actividad
específica
UI mg-1
IAPLb6 0,60 130,0 1.365 2.275
IAPLb7 0,61 125,0 1.312 2.152
1 2
IALb6
IAPLb7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2
IALb6
IAPLb7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
89
Para continuar con la purificación de los IAPLbs, las proteínas fueron desalinizadas y
concentradas utilizando el dispositivo Centriprep con un límite de exclusión de 3 kDa
hasta un volumen de 0.7 ml.
5.3.5 Esquema de purificación del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb4.
La purificación de IAPLb4 se llevó a cabo determinando su actividad inhibitoria contra
las APH durante el proceso de purificación, al avanzar en la purificación de IAPLb4
disminuyeron las unidades inhibitorias totales hasta 96% y el contenido de proteína
hasta 99% por la eliminación de proteínas que no inhiben las APH; incrementándose la
actividad específica de 81,6 a 15.800 UI mg-1 (Tabla 12). En el último paso de
purificación, la proteína pura eluída del gel presentó una recuperación de 3,9% de la
actividad original, con una purificación del orden de 193,7 veces, según la actividad
específica (Tabla 12).
Tabla 12. Pasos de purificación de IAPLb4.
Pasos purificación Actividad
inhibidora
total UI g-1
Proteína
mg
Actividad
específica
UI mg-1
Purificación
(veces)
Recuperación
(%)
E. crudo 20.450 250,7 81,6 1,0 100
Econo-Pac 16.520 167,6 98,9 1,2 80,8
Fraccionamiento
(NH4)2SO4
14.900 89,0 167,4 2,0 72,9
Ultrafiltración 12.420 30,0 414,0 5,1 60,7
Q-Sepharosa 5.775 0,37 15.608 191,3 28,2
Elución gel 790,0 0,05 15.800 193,7 3,9
El grado de purificación se evaluó mediante electroforesis denaturante en presencia y
ausencia de agente reductor. En la figura 25, se observan las bandas presentes en el
90
extracto crudo libre de pigmentos (carril 2). El sobrenadante al 50% (carril 3). En el
precipitado al 80% (carril 4) se aprecian las mismas bandas del paso anterior mejor
definidas porque se concentraron las proteínas de masa molecular inferior a 30 kDa. El
inhibidor IAPLb4 (carril 5) se observa como una banda. IAPLb4 eluído del gel en
condiciones no reductoras, aparece como una banda con una masa molecular estimada
por SDS-PAGE de 12 kDa (carril 6); IAPLb4 mostró la misma banda en condiciones
reductoras (carril 7). Esto muestra que IAPLb4 esta compuesto de una sola cadena
polipeptídica.
Figura 25. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la purificación de IAPLb4. 1:
Marcador peso molecular. 2: Extracto crudo sin pigmentos. 3: Sobrenadante
50% (NH4)2SO4. 4: Precipitado 80% (NH4)2SO4. 5: IAPLb4-Q Sepharosa.
6: IAPLb4 eluído del gel. 7: IAPLb4 con -mercaptoetanol.
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4 5 6 7
82
210
6
31
40
118
17
kDa
91
5.3.6 Esquema de purificación del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb5.
La purificación de IAPLb5 se llevó a cabo determinando la actividad inhibitoria contra
las APH durante el proceso de purificación. Los pasos de purificación del inhibidor
IAPLb5 fueron los mismos que para el inhibidor IAPLb4, en el último paso de
purificación se eluyeron las dos bandas de IAPLb5, ya que por su cercanía no fue
posible hacerlo por separado. IAPLb5 mostró una recuperación de 0,68% de la actividad
original y una purificación del orden de 113,3 veces, basándose en la actividad
específica (Tabla 13). Estas bandas de proteína tienen una masa molecular estimada por
SDS-PAGE de 11 y 12 kDa (Figura 26, carril 5).
Tabla 13. Pasos de purificación de IAPLb5.
Pasos purificación Actividad
inhibidora
total UI g-
1
Proteína
mg
Actividad
específica
UI mg-1
Purificación
(veces)
Recuperación
(%)
E. crudo 20.450 250,7 81,6 1,0 100
Econo-Pac 16.520 167,6 98,9 1,2 80,8
Fraccionamiento (NH4)2SO4 14.900 89,0 167,4 2,0 72,9
Ultrafiltración 12.420 30,0 414,0 5,1 60,7
Q-Sepharosa 2.700 0,3 9.000 110,3 13,2
Elución gel 138,6 0,015 9.240 113,3 0,68
El inhibidor IAPLb4 fue más efectivo para inhibir las aspártico proteasas de H. hampei
con relación a los demás inhibidores purificados, por esto se prosiguió con su
caracterización bioquímica. De los inhibidores IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb5,
IAPLb6 e IAPLb7, se secuenciaron los aminoácidos del extremo amino- terminal y se
determinó la masa molecular por MALDI-TOF.
92
Figura 26. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16% de la purificación de IAPLb5. 1:
Marcador peso molecular. 2: Extracto crudo sin pigmentos. 3: Sobrenadante
50% (NH4)2SO4. 4: Precipitado 80% (NH4)2SO4. 5: IAPLb5 eluído del gel.
5.4 CARACTERIZACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LAS ASPÁRTICO
PROTEASAS DE H. hampei.
5.4.1 Determinación de la masa molecular
5.4.1.1 Análisis MALDI-TOF de IAPLb4.
El análisis Maldi-Tof de IAPLb4 mostró la presencia de un pico principal con un valor
de 12,84 kDa, que representa la única molécula con una masa molecular igual a la
relación masa: carga (Figura 27). La masa molecular calculada por MALDI-TOF tiene
1 2 3 4 5
82
210
6
31
40
118
17
kDa
1 2 3 4 5
82
210
6
31
40
118
17
kDa
93
muy buena correspondencia con la masa molecular estimada por SDS-PAGE de 12 kDa
(figura 24, carril 5). Resultados similares fueron obtenidos para los inhibidores SQAPI
con masas moleculares de 10,55 y 10,52 kDa (Christeller et al., 1998). En contraste, el
inhibidor de aspártico proteinasa aislado de papa tiene una masa molecular de 20,45
kDa (Ritonja et al., 1990; Mares et al., 1989) y el inhibidor de aspártico proteinasa de
tomate presenta una masa molecular de 20.78 kDa (Cater et al., 2002).
5.4.1.2 Análisis MALDI-TOF de IAPLb5.
La determinación de la masa molecular por MALDI-TOF de IAPLb5, mostró varios
picos con valores de 5,27; 6,11; 6,71; 9,11; 10,39 y 13,73 kDa. Los picos de 9,11; 10,39
y 13,73 kDa probablemente representan las únicas moléculas con masas moleculares
iguales a la relación masa: carga. Los iones de 5,27 y 6,71 kDa representan especies
doblemente cargadas de las moléculas con masas de 10,39 y 13,73 kDa,
respectivamente (Figura 28). La masa molecular calculada por MALDI-TOF de los
picos de 10,39 y 13,73 kDa tiene buena correspondencia con la masa molecular
estimada por SDS-PAGE de 11 y 12 kDa (Figura 26, carril 5). Mientras que la proteína
de 9,11 kDa probablemente es una proteína contaminante.
5.4.1.3 Análisis MALDI-TOF de IAPLb6 e IAPLb7.
La determinación por MALDI-TOF de la masa molecular de IAPLb6 e IAPLb7
presentó dos picos con una relación masa: carga de 12,86 y 16,91 kDa que representan
las únicas moléculas con masas moleculares iguales a la relación masa: carga (Figura
29). Estas masas moleculares tienen muy buena correspondencia con la masa molecular
estimada por SDS-PAGE de 12 kDa y 18 kDa (Figura 24, carril 2).
94
Figura 27. Espectrometría de masas MALDI-TOF de IAPLb4.
Figura 28. Espectrometría de masas MALDI-TOF de IAPLb5.
95
Figura 29. Espectrometría de masas MALDI-TOF de IAPLb6 e IAPLb7.
5.4.2 Determinación del punto isoeléctrico pI del inhibidor de aspártico proteasas
IAPLb4
El inhibidor IAPLb4 puro aparece como una única banda en la electroforesis
denaturante, con un punto isoeléctrico de 4,5 (Figura 30), esto indica la posible ausencia
de isoformas. La marcada acidez de IAPLb4 encaja muy bien con su alto contenido en
residuos de ácido glutámico/glutamina (E/Q) y de ácido aspártico/asparragina (D/N), 40
y 3, respectivamente. La naturaleza ácida es una característica común de inhibidores
tripsina-Kunitz como AeTI (Bhattacharyya et al., 2006) y el inhibidor de tripsina de
Dimorphandra mollis (DMTI) (Macedo et al., 2000; Macedo et al., 2002). También, los
inhibidores de proteinasas de Hevea brasiliensis (Sritanyarat et al., 2006), el inhibidor
de tripsina de H. suaveolens (HSTI) (Aguirre et al., 2004) y el inhibidor de -amilasa
de P. acutifolius (Blanco et al., 1996b) tienen pI ácidos.
96
Figura 30. Isoelectroenfoque de IAPLb4. 1-5: Mezcla de proteínas estándar de pI. 2-4:
IAPLb4 puro.
5.4.3 Estabilidad del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb4
5.4.3.1 Efecto de la temperatura
La estabilidad del inhibidor IAPLb4 puro se evaluó midiendo la actividad inhibidora
residual después de realizar una preincubación de 30 min a temperaturas entre 30 a 100
C. La actividad inhibitoria de las aspártico proteasas se mantuvo en 100% entre 30 a 70
C; por encima de los 80 C, la actividad de IAPLb4 experimentó un fuerte descenso y a
100 C el inhibidor fue inestable ya que la actividad se redujo en 60% (Figura 31).
5.4.3.2 Efecto del pH.
La estabilidad del inhibidor IAPLb4 puro fue determinada midiendo la actividad
inhibidora residual, después de preincubar 30 min a diferente pH. IAPLb4 fue estable en
5.2
5.85
6.556.857.35
8.158.45
IAPLb4
1 2 3 4 5
Punto aplicación
5.2
5.85
6.556.857.35
8.158.45
IAPLb4
1 2 3 4 5
Punto aplicación
97
Figura 31. Porcentaje de actividad residual de IAPLb4 en función de la temperatura.
el rango de pH de 2.5 a 6.5 manteniendo su actividad inhibidora por encima de 90% y a
pH 7 a 11 la actividad inhibitoria fue mayor de 80% (Figura 32).
Figura 32. Porcentaje de actividad residual de IAPLb4 en función del pH.
0
20
40
60
80
100
120
30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura (°C)
(%)
Act
ivid
ad r
esid
ual
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
% A
cti
vid
ad
re
sid
ua
l
98
5.4.4 Determinación de la presencia de carbohidratos del inhibidor de aspártico
proteasa IAPLb4.
El inhibidor IAPLb4 no es una glicoproteína (Figura 33). Al igual que la mayoría de los
IPs estudiados, entre los cuales están: SQAPI (Christeller et al., 1998), DMTI (Macedo
et al., 2000), HSTI (Aguirre et al., 2004), TTI (Araújo et al., 2005); AeTI (Battacharyya
et al., 2006), el inhibidor de tripsina-Kunitz de Inga laurina (ILTI) (Macedo et al.,
2007b) y el inhibidor Bowman-Birk de L. albus (LaBBI) (Scarafoni et al., 2008).
Mientras que el inhibidor de -amilasas de P. acutifolius es una glicoproteína y la
fracción de carbohidratos está compuesta principalmente de glucosa y manosa (Blanco
et al, 1996b).
Figura 33. Determinación de la presencia de carbohidratos de IAPLb4. A.
Electroforesis (SDS-PAGE) al 10%. B. Western Blot. 1: Marcador peso
molecular. 2: IAPLb4. 3: Transferrina (control positivo). 4: BSA (control
negativo).
1 2 3 4 1 2 3 4
Transferrina
210
82
40
31
17
6
118
kDa
A B1 2 3 4 1 2 3 4
Transferrina
210
82
40
31
17
6
118
kDa
A B
99
5.4.5 Análisis de la secuencia de aminoácidos de los inhibidores de aspártico
proteasas.
5.4.5.1 Análisis de la secuencia amino-terminal de IAPLb4
La secuenciación del extremo amino-terminal se obtuvo a través de 22 ciclos de
secuenciación, los 22 aminoácidos del extremo amino-terminal del inhibidor de
aspártico proteasa IAPLb4 son: HESPEEREQEEYDPRQQSHHVE.
Esta secuencia presenta un alto contenido de residuos ácidos, 7 de ácido glutámico y
uno de ácido aspártico (8 de 22), al igual que la secuencia del inhibidor de tripsina de
trigo (BWI-2b) (Park et al., 1997), SQAPI (Christeller et al., 1998), el inhibidor de
quimotripsina de Schizolobium parahyba (SPC) (Souza et al., 1995), HSTI (Aguirre et
al., 2004) y el inhibidor de subtilisina de V. radiata (Kapur et al., 1989). También, las
vicilinas de L. albus presentan un número alto de residuos de ácido glutámico (Duranti
et al., 1981). De forma similar, el ácido aspártico en la posición 13 es similar al
encontrado en la posición 11 del extremo amino-terminal del inhibidor cisteín de
Manduca sexta (Miyaji et al., 2007).
La búsqueda en BLAST mostró que la secuencia amino-terminal de IAPLb4 tiene una
alta identidad de 76% con la vicilina y la -conglutina de L. albus y de 71% con la
conglutina beta de L. angustifolius, las cuales son proteínas de almacenamiento de las
semillas (Tabla 14).
100
Tabla 14. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb4 con la vicilina de L. albus, el precursor β-conglutina de L. albus, y
la conglutina beta de L. angustifolius. Letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de aminoácidos
idénticos.
Secuencia Posición % Identidad Número de accesión
IAPLb4 1:22 H E S P E E R E Q E E Y D P R Q Q S H H V E Vicilina L. albus 38:54 76% CAI84850.2 H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q precursor - conglutina L. albus
38:54 76% AAS97865.1 H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q
Conglutina beta L. angustifolius
41:54 71% ABR21772.1 P K E R E E E E H E P R Q Q
La secuencia de los últimos cinco aminoácidos no mostró identidad con la misma región de vicilinas y conglutinas beta de otras especies de Lupinus.
101
5.4.5.2 Análisis de la secuencia amino-terminal del inhibidor IAPLb5.
Del inhibidor IAPLb5 compuesto por dos bandas, se identificaron únicamente cuatro
residuos de aminoácidos del extremo amino-terminal de la banda inferior (11 kDa):
SPES. Mientras que de la banda superior (13 kDa) del inhibidor IAPLb5, se
identificaron 23 residuos del extremo amino-terminal:
SHEPEPSRQEGRQERYDRPQEQE.
La búsqueda en BLAST mostró que la secuencia amino-terminal de 23 residuos de
IAPLb5 tiene una identidad de 44% con la vicilina y la -conglutina de L. albus y de
26% con la conglutina beta de L. angustifolius, las cuales son proteínas de
almacenamiento de las semillas (Tabla 15).
5.4.5.3 Análisis de la secuencia amino-terminal de los inhibidores IAPLb6 e
IAPLb7.
La secuencia amino-terminal del inhibidor IAPLb6 obtenida a través de 36 ciclos de
secuenciación es: RSGEQQFIEKSLQIQQVNLKHIYEITIQHRARLQRS y la
secuencia del inhibidor IAPLb7 obtenida a través de 26 ciclos secuenciación es:
RSGEQIEKSQIQQVNLKHIYEITIQR. Estos análisis mostraron que las secuencias
son casi idénticas.
La búsqueda en BLAST mostró que las secuencias amino-terminales de 23 residuos de
IAPLb6 e IAPLb7 tienen una identidad de 43% con la conglutina de L. albus, la
conglutina de L. angustifolius y la conglutina 2 de cadena pequeña de lupinus (Tabla
16).
102
Tabla 15. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb5 con la vicilina de L. albus, el precursor β-conglutina de L. albus, y
la conglutina beta de L. angustifolius Las letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de aminoácidos
idénticos.
Secuencia Posición % Identidad
Número accesión
IAPLb5 1:34 S H E - P E - - - - - - - - P S R Q - - E G R Q E R Y D R P Q E Q E Vicilina L. albus
37:70 44% CAI84850.2
S H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q R P Q S R R E - - E R E Q E Q E
Precursor - conglutina L. albus
37:70 44% AAS97865.1
S H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q R P Q S R R E - - E R E Q E Q E
Conglutina beta L. angustifolius
52:70 26% ABR21772.1
S R R - - E E R E E R - - - - - E Q E
Tabla 16. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb6 e IAPLb7 con la conglutina de L. albus, conglutina L.
angustifolius, y conglutina-2 de cadena pequeña de lupinus. Las letras blancas en un fondo oscuro representan los
residuos de aminoácidos idénticos.
Secuencia Posición % Identidad
Número de accesión
IAPLb6 e IAPLb7 1:23 K S Q I Q Q V N L - - - - K H I Y E I T I Q R conglutina L. albus 31:52 43% CAJ42100.1 K R Q L Q Q V N L R H C E N H I D Q R I Q Q Q conglutina L. angustifolius
31:52 43% CAA37598.1 K R Q L Q Q V N L R H C E N H I A Q R I Q Q Q
conglutina 2 cadena pequeña Lupinas
31:52 43% ABR21772.1 K R Q L Q Q V N L R H C E N H I D Q R I Q Q Q
103
5.4.5.4 Análisis de la secuencia amino-terminal del inhibidor IAPLb1.
Residuos únicos fueron detectados en todos los ciclos de secuenciación, los 20
aminoácidos del extremo amino-terminal del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb1
son: PESHEGREQEEYDPRQQPLP. La búsqueda en BLAST mostró que la
secuencia amino-terminal de 17 residuos de IAPLb1 tiene una identidad de 47% con la
vicilina de L. albus y el precursor de -conglutina de L. albus y de 39% con la
conglutina beta de L. angustifolius (Tabla 17).
5.4.5.5 Análisis de la secuencia amino-terminal del inhibidor IAPLb2.
Residuos únicos fueron detectados en todos los ciclos de secuenciación, los 22
aminoácidos del extremo amino-terminal del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb2
son: HESPEERGQEEYDPRQEQESHP. La búsqueda en BLAST mostró que la
secuencia amino-terminal de IAPLb2 tiene una identidad de 48% con la vicilina de L.
albus y el precursor de conglutina de L. albus y de 22% con conglutina beta de L.
angustifolius (Tabla 18).
5.4.5.6 Análisis de la secuencia amino-terminal del inhibidor IAPLb3.
Residuos únicos fueron detectados en todos los ciclos de secuenciación, los 20
aminoácidos del extremo amino-terminal del inhibidor de aspártico proteasa IAPLb3
son: HESPEERGQEEYDPRQQSHP.
La búsqueda en BLAST mostró que la secuencia amino-terminal de IAPLb3 tiene una
identidad de 70% con la vicilina de L. albus y el precursor de conglutina de L. albus y
de 58% con la conglutina beta de L. angustifolius (Tabla 19).
105
Tabla 17. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb1 con la vicilina de L. albus, el precursor β-conglutina de L. albus, y
la conglutina beta de L. angustifolius. Las letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de aminoácidos
idénticos.
Secuencia Posición % Identidad Número de accesión
IAPLb1 1:23 P E S H E - - - G R E Q E E Y D P R Q Q P L P Vicilina L. albus 37:54 47% AI84850.2 S H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q precursor - conglutina L. albus
37:54 47% AAS97865.1 S H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q
Conglutina beta L. angustifolius
41:52 39% ACB05815.1 R E E E E H E P R Q Q P
Tabla 18. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb2 con la vicilina de L. albus, el precursor β-conglutina de L. albus, y
la conglutina beta de L. angustifolius Las letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de aminoácidos
idénticos.
Secuencia Posición % Identidad
Número accesión
IAPLb2 1:31 H E S P E E R G Q E E Y D P R - - - - - - - - - - - - Q E Q E Vicilina L. albus
38:68 48% CAI84850.2
H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q R P Q S R R E E R E Q E Q E
Precursor - conglutina L. albus
38:68 48% AAS97865.1
H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q R P Q S R R E E R E Q E Q E
Conglutina beta L. angustifolius
39:50 22% ABR21772.1
P K E R E E E E H E P R Q Q P R P R Q Q E E Q E
106
Tabla 19. Alineación de la secuencia amino-terminal de IAPLb3 con la vicilina de L. albus, el precursor β-conglutina de L. albus, y
la conglutina beta de L. angustifolius. Las letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de aminoácidos
idénticos.
Secuencia Posición % Identidad Número de accesión
IAPLb3 1:20 H E S P E E R G Q E E Y D P R Q Q S H P Vicilina L. albus 38:54 70% CAI84850.2 H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q precursor - conglutina L. albus
38:54 70% AAS97865.1 H E R P E E R E Q E E W Q P R R Q
Conglutina beta L. angustifolius
39:55 58% ACB05815.1 P K E R E E E E H E P R Q Q P R P
107
5.4.5.7 Análisis de la secuencia carboxi-terminal de IAPLb4.
El extremo carboxi-terminal se digirió con la endoproteinasa Glu-C aislada de
Staphylococcus aureus V8, la cual corta los residuos de ácido glutámico del extremo
carboxi-terminal. El producto de la digestión se cargó en un gel y las cuatro bandas
principales se cortaron y eluyeron del gel (Figura 34). Posteriormente, las bandas se
cargaron en una membrana de secuenciación y se sometieron a 11 ciclos de degradación de
Edman para determinar su secuencia. La digestión con Glu-C de la banda número 3
permitió la identificación de una secuencia de 11 residuos de aminoácidos:
PRQQPLLRRQQ.
Figura 34. Perfil electroforético (SDS- PAGE) al 16.5% de IAPLb4 digerido con Glu-C. 1:
Marcador Polipéptido estándar. 4-11: IAPLb4 digerido con Glu-C. 14:
Marcador Polipéptido estándar.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
kDa
26.6
17.0
14.4
6.5
3.51.4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
kDa
26.6
17.0
14.4
6.5
3.51.4
108
La búsqueda en BLAST mostró que la secuencia carboxi-terminal de IAPLb4 tiene
similitud con dos regiones de la conglutina de L. angustifolius; en la primera región,
residuos 49:58, la identidad fue de 75% y en la segunda región, residuos 125:134, la
identidad fue de 41%, esta región coincide con el extremo carboxi-terminal de IAPLb4
según la masa molecular del inhibidor (12.84 kDa) (Tabla 20). La secuencia carboxi-
terminal de IAPLb4 también tiene 50% de identidad con una región entre los residuos
116:121 de una proteína de almacenamiento de L. angustifolius (Tabla 20).
5.4.6 Efecto del inhibidor IAPLb4 sobre las aspártico proteasas de H. hampei.
La especificidad del inhibidor IAPLb4 contra las aspártico proteasas de H. hampei se
aprecia en la figura 35; la inhibición de las aspártico proteasas fue de 70% con 5 g de
IAPLb4 y con 10 g la inhibición fue de 90%. Esto muestra que las aspártico proteasas son
fuertemente inhibidas por IAPLb4; la actividad proteolítica que no fue inhibida por este
inhibidor podría deberse a la presencia de enzimas proteolíticas de otras clases como cisteín
proteasas. El extracto conteniendo las aspártico proteasas de H. hampei fue inhibido por
IAPLb4 con una concentración inhibitoria media (CI50) de 2,9 g (Figura 36).
Considerando que la secuencia amino-terminal de IAPLb4 presenta una alta identidad con
la vicilina de L. albus, podría ser posible que el papel de defensa registrado para las
vicilinas esté asociado con su capacidad para inhibir las aspártico proteasas en el intestino
medio de coleópteros como H. hampei. IAPLb4 es promisorio para emplearse en el control
de H. hampei, porque inhibe las aspártico proteasas del insecto a una concentración baja.
109
Tabla 20. Alineación de la secuencia carboxi-terminal de IAPLb4 con la conglutina beta de L. angustifolius y la proteína
de almacenamiento de L. angustifolius. Las letras blancas en un fondo oscuro representan los residuos de
aminoácidos idénticos.
Secuencia Posición % Identidad Número de accesión IAPLb4 1:12 P R Q Q P L L R - R Q Q Conglutina beta L. angustifolius 49:58 75% ACB05815.1 P R Q Q P - - R P R Q Q Conglutina beta L. angustifolius 125:134 41% ABR21772.1 R Q R P Q S R - R E E Proteína almacenamiento semilla L. angustifolius
116:121 50% ACN39600.1 R Q Q - - - - - R Q Q
110
Figura 35. Porcentaje de actividad residual de las APH en función de la concentración de
IAPLb4 µg (sustrato hemoglobina).
Figura 36. Actividad residual de las APH en función del logaritmo de la concentración de
IAPLb4 µg (sustrato hemoglobina).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
IAPLb4 (µg)
(%)
Ac
tiv
ida
d r
es
idu
al
y = -81.141x + 88.252
R2 = 0.9635
0
20
40
60
80
100
120
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Log IAPLb4 (µg)
(%)
Ac
tiv
ida
d r
es
idu
al
111
5.4.7 Cinética de inhibición y determinación de la constante de inhibición de IAPLb4
La curva de titulación para pepsina fue lineal hasta 90% de inhibición, por un mecanismo
de prueba de unión con una estequiometría de 1:1 (Figura 37). Esta curva mostró que el
100% de inhibición no ocurrió.
Figura 37. Porcentaje de actividad residual de pepsina en función de la relación molar
IAPLb4:pepsina.
La gráfica de Dixon mostró que la inhibición es de tipo competitivo, con una constante de
inhibición de 3,1 M para pepsina utilizando hemoglobina como sustrato (Figura 38). De
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Relación molar de inhibidor/enzima
(%)
Act
ivid
ad r
esid
ual
112
forma similar, SQAPI inhibió pepsina con una constante de inhibición de 2 nM y las
aspártico proteasas secretadas a partir del hongo Glomerella cingulata con una constante de
inhibición de 20 nM, utilizando caseína fluorescente como sustrato (Christeller et al.,
1998). Del mismo modo, el inhibidor ApTI inhibió papaina con una constante de inhibición
de 10 M, utilizando azocaseína como sustrato (Macedo et al., 2004).
Figura 38. Gráfica de Dixon de la constante de inhibición de pepsina por el inhibidor
IAPLb4. Inverso de la velocidad de reacción en función de la concentración del
IAPLb4 (M). El valor de Ki se obtuvo de la intersección de las líneas con dos
concentraciones de sustrato hemoglobina.
0
5
10
15
20
25
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
IAPLb4 [μM]
1/v
0 [
OD
28
0/1
0m
in/m
L]-
1
Hemoglobina( 0.075 mM) Hemoglobina ( 0.15 mM)
113
Otros inhibidores de tripsina también actúan como inhibidores competitivos, la constante de
inhibición para el inhibidor de tripsina de Putranjiva roxburghii (PRTI) es de 1.4 x 10-11, lo
cual indica su fuerte inhibición contra tripsina bovina (Chaudhary et al., 2008). En otros
estudios se han registrado constantes de inhibición de 5.3 x 10-10 para inhibidores de
tripsina de D. mollis (DMTI-II) (Macedo et al., 2000), 4.0 x 10-10 para inhibidores de
Peltophorum dubium (Macedo et al., 2003), 2.5 x 10-10 para AeTI (Bhattacharyya et al.,
2006) y 1.7 x 10-9 M para un inhibidor de tripsina de D. mollis (Mello et al., 2001).
5.5 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DEL INHIBIDOR DE
ASPÁRTICO PROTEASA IAPLb4.
5.5.1 Extracción de ARN total.
Se obtuvieron 2.4 g/l de ARN total de las semillas de L. bogotensis su integridad se
evaluó por la presencia de las bandas correspondientes a las subunidades ribosomales 18S y
28S (Figura 39).
5.5.2 Librerías RACE, síntesis de ADNc y PCR para amplificar el gen que codifica el
inhibidor IAPLb4 a partir de ADNc.
Para aislar el gen que codifica el inhibidor de las aspártico proteasas (IAPLb4) se sintetizó
la primera cadena del ADNc a partir del ARN total, y este ADNc se utilizó como molde
para la amplificación por PCR de las librerías RACE 5´ y RACE 3´ sentido y antisentido
utilizando iniciadores degenerados basados en la secuencia amino-terminal de IAPLb4:
HESPEEREQEEYDPRQQSHHVE. Los extremos 5´ sentido y antisentido presentaron una
banda de aproximadamente 250 pb. El extremo 3´ sentido presentó un barrido y antisentido
una banda de aproximadamente 600 pb (Figura 40).
114
Figura 39. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del ARN total de la semilla de L.
bogotensis. 1: Marcador de peso molecular. 2: ARN total.
Figura 40. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de las librerías de
ADNc. 1-7: Marcador de peso. 2: ADNc 5´ sentido. 3: ADNc 5´ antisentido. 4:
ADNc 3´ sentido. 5: ADNc 3´ antisentido. 6: Control negativo.
1 21 2
1 2 3 4 5 6 7
100
500850
2000
1000
1 2 3 4 5 6 7
100
500850
2000
1000
115
Se confirmó la presencia del gen que codifica IAPLb4 mediante lisis bacteriana y PCR con
los iniciadores SP6 y T7. El producto de PCR de los clones 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13,
15, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 30 de la librería 5´ antisentido del ADNc mostró una banda
de aproximadamente 400 pb (Figura 41). La secuencia de 190 nucleótidos de estos clones,
después de eliminar el vector pGEM, presentó una identidad de 98.6% y 82.6% con la
vicilina de Lupinus albus y la conglutina beta de L. angustifolius, respectivamente; según
análisis de tblastx (NCBI) (Tabla 21).
Figura 41. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR del ADNc 5´
RACE ligado al vector p-GEM. 1: Marcador de peso. 2-31: clones con el gen
IAPLb4. 32: Control negativo.
Tabla 21. Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4, producto
de PCR usando ADNc librería 5´ antisentido.
Accesión Descripción Valor E Identidad
máxima
AJ966470.2 ARNm vicilina L. albus 3 e-19 98.6%
EU352876.1 ARNm conglutina beta L. angustifolius 2 e-14 82.6%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
100
500
850
16501000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
100
500
850
16501000
116
El producto de PCR de los clones 1, 2 y 3 de la librería 3´ sentido del ADNc mostró una
banda de 300 pb aproximadamente (Figura 42). La secuencia de 257 nucleótidos de estos
clones, después de eliminar el vector pGEM, mostró una identidad de 88% y 81% con la
vicilina y el precursor de la conglutina beta de L. albus, respectivamente; según el análisis
de tblastx (NCBI) (Tabla 22).
Figura 42. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de ADNc 3´
RACE ligado al vector P-GEM. 1: Marcador de peso. 2-4: Clones el gen
IAPLb4.
Tabla 22. Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4, producto
de PCR usando ADNc librería 3´ sentido.
Accesión Descripción Valor E Identidad
máxima
EU352876.1 ARNm beta conglutina L. angustifolius 5e-65 81%
EF455725.1 ARNm beta conglutina L. angustifolius 5e-65 81%
AJ966470.2 ARNm vicilina L. albus 3e-44 88%
1 2 3 4
100
500
850
2000
1000
1 2 3 4
100
500
850
2000
1000
117
Las secuencias de los extremos 3’ y 5’del ADNc se alinearon en la región de los
iniciadores, la secuencia que codifica el gen IAPLb4 corresponde aun único marco de
lectura abierta de 322 nucleótidos según el programa ORF Finder, que codifica para un
polipéptido de 107 aminoácidos (Figura 43).
Figura 43. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del gen que codifica IAPLb4
aislado de ADNc.
El codón de iniciación que corresponde a metionina se encontró en el nucleótido 29 y el
codón de terminación se encontró en el nucleótido 352; la señal de poliadenilación se
encontró en el extremo 3’. El número de aminoácidos deducidos a partir de la secuencia de
nucleótidos tiene muy buena correspondencia con el número de aminoácidos inferido según
la masa molecular de IAPLb4 (12,84 kDa) para un total de 117 aminoácidos. La secuencia
118
de aminoácidos del inhibidor tiene el extremo amino-terminal a partir del cual se diseñaron
los iniciadores degenerados: HESPEEREQEEYDPRQQSHP.
5.5.3 Extracción de ADN genómico y PCR para amplificar el gen que codifica el
inhibidor IAPLb4.
Se obtuvieron 1.242 ng/l de ADN genómico de las semillas de L. bogotensis su calidad e
integridad se evaluó en gel de agarosa al 0.8% (Figura 44).
El gen que codifica el inhibidor IAPLb4 se amplificó mediante PCR usando como molde
ADN genómico de L. bogotensis y cebadores diseñados con base en los extremos 5´ y 3´ de
la secuencia del gen obtenida de ADNc. El PCR mostró una banda de aproximadamente
380 pb del gen de IAPLb4 (Figura 45).
La secuencia del gen IAPLb4 corresponde aun único marco de lectura abierto de 354
nucleótidos, según el programa ORF Finder, que codifica para un polipéptido de 117
aminoácidos (Figura 46). El codón de iniciación que corresponde a metionina se encontró
en el nucleótido 37 y el codón de terminación se encontró en el nucleótido 390; la señal de
poliadenilación se encontró en el extremo 3’. El número de aminoácidos deducidos a partir
de la secuencia de nucleótidos es igual al número de aminoácidos inferido según la masa
molecular de IAPLb4, 117 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del inhibidor
IAPLb4 tiene el extremo amino-terminal HESPEEREQEEYDPRQQSHP, a partir del cual
se diseñaron los iniciadores degenerados. Como otros inhibidores de proteasas, IAPLb4 no
tiene intrones.
119
Figura 44. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de ADN genómico de la semilla de L.
bogotensis. 1: Marcador de peso molecular. 2: ADN genómico.
Figura 45. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR, usando ADN con
iniciadores del extremo 3 y 5´ de ADNc del gen que codifica IAPLb4. 1:
Marcador de peso molecular. 2-3: gen IAPLb4.
1 2
100
500
2000
12000
650
850
1 2
100
500
2000
12000
650
850
1 2 3
100
500
650
850
1 2 3
100
500
650
850
120
Figura 46. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del gen que codifica IAPLb4 a
partir de ADN genómico de L. bogotensis.
37 atggctatgatgagaggaaggcttccaacgctagtgttgctacta M A M M R G R L P T L V L L L82 ggaatagtattcctcatggcaatgtcaattggtattgcttacggt G I V F L M A M S I G I A Y G127 gaaaaaggtgtgataaagaatcatgagagtcctgaggaaagagag E K G V I K N H E S P E E R E172 caagaggagtatgacccaagacaacagtcacacccccgccagcag Q E E Y D P R Q Q S H P R Q Q217 gagcagcaagaaagagagcataggagagaggaggagcgtgatcgt E Q Q E R E H R R E E E R D R262 gagccttcacgtcgaaggagcgagagcgaagaaaggcaagaggaa E P S R R R S E S E E R Q E E307 gagcgtgaacaaaggagagaacctcgtagggagagggagcaagaa E R E Q R R E P R R E R E Q E352 caacaatctcgacctggaaggagacaggaggaaagataa 390 Q Q S R P G R R Q E E R *
121
Las diferencias en el tamaño del gen IAPLb4 deducido a partir de ADNc y ADN podría
deberse a que los genes que codifican los inhibidores de proteasas comprenden familias de
múltiples genes y a pesar que éstos son altamente homólogos muestran una considerable
diversidad en la secuencia primaria (De Leo et al., 2006; Jiménez et al., 2008) y su
expresión es regulada temporal y espacialmente (Tamhane et al., 2009).
La secuencia de aminoácidos de IAPLb4 tiene 78,2% de identidad con la vicilina de L.
albus y 64,3% de identidad con la beta conglutina de L. angustifolius (Tabla 23).
Tabla 23. Identidad de la secuencia de aminoácidos del gen que codifica IAPLb4.
Accesión Descripción Valor E Identidad
máxima
EmbCAI84850.2 Vicilina de L. albus 3 e-13 78,2
GbAAS97865.1 Precursor de conglutina beta de L. albus 3 e-13 78,2
GbABR21772.1 Conglutina beta de L. angustifolius 4e-09 64.3
GbACB05815.1 Conglutina beta L. angustifolius 2e-09 64.3
La secuencia de nucleótidos del inhibidor IAPLb4 mostró un 90,4% de identidad con la
secuencia de la vicilina de L. albus y el precursor de la beta conglutina de L. albus (Tabla
24).
Tabla 24. Identidad de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica IAPLb4
Accesión Descripción Valor
E
Identidad
máxima
AJ966470.2 ARNm vicilina LaJCMC675 L. albus 6e-16 90,4%
GbAY500372.1 ARNm precursor beta conglutina L. albus 6e-16 90,4 %
GbEF455724.1 ARNm precursor beta conglutina UWA220 L. albus 8e-08 63,4 %
122
5.5.4 Análisis de la secuencia de aminoácidos del inhibidor IAPLb4 deducida a partir
de la secuencia de nucleótidos.
La masa molecular teórica del inhibidor IAPLb4 deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos es de 14,43 kDa y el punto isoeléctrico teórico es de 5,79; estos valores son
muy cercanos al valor de 12,84 kDa determinado por MALDI-TOF y de pI de 4,5
determinado mediante IEF. La tabla 25 muestra la composición de aminoácidos de IAPLb4
inferida a partir de la secuencia de nucleótidos. El número total de cargas positivas de los
residuos de arginina y lisina es de 26 y el número total de cargas negativas de ácido
aspártico y ácido glutámico es de 29. Además, IAPLb4 no tiene cisteínas.
La secuencia completa del inhibidor IAPLb4 deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos reveló la presencia de una secuencia amino-terminal de 37 aminoácidos que no
se encuentra en la proteína nativa. Esta secuencia contiene un segmento típico de un
péptido señal (programa SignalP 3.0, Anexo 5) con el sitio de ruptura entre las posiciones
30-31: AYG-EK (Figura 46). Es posible que esta secuencia de 37 aminoácidos que
representa el 32% de la proteína traducida se pierda pos-transduccionalmente, durante o
después del transporte del inhibidor a la vacuola central como ocurre con otros inhibidores
aislados de papa y tomate (Graham et al., 1985a; Graham et al., 1985b; Nelson y Ryan,
1980; Sanchez-Serrano et al., 1986).
123
Tabla 25. Composición de aminoácidos de IAPLb4 inferida a partir de la secuencia de
nucleótidos.
.Aminoácido Número de
aminoácidos
% de aminoácidos
Arg (R) 24 20.5
Asn (N) 1 0.9
Asp (D) 2 1.7
Cys (C) 0 0
Gln (Q) 13 11.1
Glu (E) 27 23.1
Gly (G) 6 5.1
His (H) 3 2.6
Ile (I) 4 3.4
Leu (L) 6 5.1
Lys (K) 2 1.7
Met (M) 5 4.3
Phe (F) 1 0.9
Pro (P) 7 6
Ser (S) 7 6
Thr (T) 1 0.9
Trp (W) 0 0
Tyr (Y) 2 1.7
Val (V) 3 2.6
124
6. DISCUSIÓN
Para la identificación de inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei, se utilizaron
extractos proteínicos de adultos completos del insecto que representan la actividad
aspártico proteasa. De forma similar, extractos de las larvas del coleóptero T. castaneum se
emplearon para purificar la aspártico proteinasa tipo catepsina D, debido a que los
zimogramas mostraron tres bandas principales de actividad proteolítica en intestinos y
larvas, demostrando la naturaleza digestiva de esta enzima (Blanco et al., 1996a). En otra
investigación la actividad de las -amilasas del coleóptero P. truncatus varió en los
diferentes estados de desarrollo, la máxima actividad se encontró en larvas de segundo
instar, la actividad se redujo drásticamente en el estado de pupa y se incrementó
nuevamente en el estado adulto (Mendiola et al., 2000). Los zimogramas mostraron que el
contenido del intestino de la larva, el extracto del intestino macerado y los extractos de
larvas y adultos tienen el mismo patrón de actividad -amilasa. Esto indica que las -
amilasas están presentes en todos los estados de desarrollo (Mendiola et al., 2000).
Además, la actividad de -amilasa y de tripsina de P. truncatus fue más alta en adultos que
en larvas, probablemente porque las larvas están en contacto con la estructura interna del
maíz, compuesta por el almidón y las proteínas del endospermo y el embrión; mientras que
el adulto tiene que degradar el alimento más complejo, por esto tiene una actividad
enzimática mayor para maximizar la eficiencia de la digestión; lo cual sugiere que es mejor
utilizar adultos para evaluar el efecto de inhibidores de estas enzimas (Vásquez et al.,
1999).
Las aspártico proteasas de H. hampei presentaron un rango óptimo de actividad a pH 2-5.
De manera similar, otros coleópteros como C. maculatus, T. castaneum, P. truncatus,
Hypera postica, Z. subfasciatus, L. decemlineata y D. virgifera, que utilizan aspártico
proteasas para la digestión de las proteínas del alimento, tienen una actividad proteolítica
óptima en un rango de pH de 3 a 6 (Silva y Xavier-Filho, 1991; Blanco et al., 1996a;
125
Vásquez et al., 1999; Wilhite et al., 2000; Lemos et al., 1990; Wolfson y Murdock, 1987;
Liu et al., 2004). Las aspártico proteasas se han encontrado en insectos del orden hemíptera
y coleóptero que se caracterizan por el pH ácido del intestino medio (Houseman y Downe,
1983). Mientras que las cisteín proteasas tienen un rango de actividad óptimo a pH entre 4-
7 y las serín y metalo-proteinasas a pH de 7-9 (Barrett, 1977).
El inhibidor de aspártico proteasas de H. hampei pepstatina A inhibió el 83.3% de la
actividad proteolítica de las aspártico proteasas del insecto a concentraciones 1 M.
Pepstatina A ha sido utilizado para identificar aspártico proteasas en el intestino medio de
varios coleópteros como T. castaneum, C. maculatus y Z. subfasciatus, por la pérdida de la
actividad proteolítica de la enzima (Blanco et al., 1996a; Silva y Xavier-Filho, 1991). La
actividad aspártico proteasa del intestino medio de las larvas de Z. subfasciatus fue inhibida
completamente con el empleo de 14 M de pepstatina A (Lemos et al., 1990). Del mismo
modo, la actividad proteolítica del intestino medio de H. postica se redujo en 50% por la
adición de pepstatina A y PDI (Mares et al., 1989). El inhibidor SQAPI, que inhibe pepsina
pero no catepsina D (Christeller et al., 1998), no inhibió la actividad proteolítica de H.
postica, esto confirmó que catepsina D es la principal aspártico proteinasa de este gorgojo
(Wilhite et al., 2000).
Las aspártico proteasas de H. hampei son catepsina D porque digieren 100% de
hemoglobina mientras que BSA sólo en un 10%. De forma similar, la enzima aislada de T.
castaneum se clasificó como catepsina D porque digiere únicamente hemoglobina (Blanco
et al., 1996a). También, la aspártico proteinasa presente en el intestino medio de las larvas
de C. maculatus es catepsina D porque digiere 100% de hemoglobina y 30% de BSA (Silva
y Xavier-Filho, 1991). Catepsina D es una de las aspártico proteasas mejor estudiadas en
vertebrados y artrópodos; esta enzima es responsable de la digestión intracelular y
extracelular de proteínas en el lumen del intestino medio de muchos coleópteros donde las
cisteín proteasas son las enzimas digestivas más importantes (Silva y Xavier-Filho, 1991;
126
Terra y Ferreira, 1994; Blanco-Labra et al., 1996a; Matsumoto et al., 1997; Brunelle et al.,
1999; Ahn y Zhu-Salzman, 2009). En Aedes aegypti esta involucrada en la producción de
vitelogenina (Cho y Raickel, 1992). En C. capitata su actividad coincide con la hidrólisis
del cuerpo graso (Rabossi et al., 2004). En Bombix mori su acción en la muerte celular
programada es clave en la metamorfosis para la transformación de pupa a larva (Lee et al.,
2009). Esta enzima también participa en la digestión de la sangre en ácaros y garrapatas
(Boldbaatar et al., 2006). Esta catepsina hace parte de los sistemas de defensa, debido a que
elimina proteínas extrañas (Johnson y Jiang, 2005).
En C. maculatus y Z. subsfasciatus las aspártico y cisteín proteasas son las enzimas
responsables de la digestión de las proteínas del alimento (Silva y Xavier-Filho, 1991).
Aunque hasta el momento no se ha reportado la presencia de cisteín proteasas en el
intestino medio de H. hampei, es probable que estas enzimas junto con las aspártico
proteasas son responsables de la proteólisis en el intestino medio de este insecto como
ocurre en otros coleópteros, debido a que las cisteín proteasas son activas en un rango de
pH entre 5-7, cercano al de H. hampei. El conocimiento del papel de los diferentes tipos de
proteasas en el tracto digestivo del insecto, ayudará a entender los sitios de vulnerabilidad
bioquímica, por esto es necesario continuar con la identificación de las enzimas digestivas
de la broca del café.
Las mejores condiciones para la extracción de los inhibidores de las aspártico proteasas de
semillas de plantas fueron el empleo de agua y de harina desgrasada. La extracción con
agua ha sido empleada para aislar inhibidores de Cicer arietanum, C. cajan, Gossypium
arboreum, Arachis hypogea, Psophocarpus tetragonolobus, S. tuberosum e H. suaveolens
(Harsulkar et al., 1999; Patankar et al., 2001; Giri et al., 2003; Aguirre et al., 2004).
También, para la extracción de IPs de M. charantia, los cuales inhibieron el crecimiento y
desarrollo de H. armigera y S. litura (Telang et al., 2003). Al igual que para la extracción
del inhibidor de tripsina de P. acutifolius (TBPI) (Campos et al., 1997) y el inhibidor de -
127
amilasa de la misma especie (Blanco et al., 1996b). El procedimiento de desgrase se ha
utilizado con éxito para la identificación y purificación de IPs en las semillas de A.
hypochondriacus, I. laurina, C. arietanum, Cicer echinospermum, A. hypogea, G.
arboreum, Cajanus scaraboides, P. tetragonolobus y de globulinas de Actinidia deliciosa
(Valdes et al., 1993; Rodríguez et al., 2007; Harsulkar et al., 1999; Rassam y Laing, 2006).
Se identificaron inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei en las semillas de L.
bogotensis, B. humidicola, H. suaveolens y A. hypochondriacus, estos IPs bloquean la
digestión de las proteínas del alimento en el intestino medio; por esto podrían utilizarse
para el control del insecto. La broca del café es monófaga, sugiriendo que su mecanismo de
defensa podría ser menos complejo y más vulnerable a la acción de IPs de plantas no-
huésped que los insectos polífagos. Sin embargo, los estudios con IPs han mostrado que
cuando se inhiben las proteasas más importantes para la digestión de las proteínas del
alimento en el intestino medio, se incrementa la actividad de otras enzimas insensibles al
inhibidor y que en su ausencia no están sobre-expresadas. Esto permite la digestión de las
proteínas de la dieta en presencia del inhibidor y es fundamental para la supervivencia de
los insectos (Zhu-Salzman et al., 2003; Amirhusin et al., 2007). En consecuencia, para una
inhibición efectiva de las enzimas digestivas de los insectos es necesaria la expresión de IPs
de las diferentes clases de proteasas digestivas (Jonsgma y Bolter, 1997).
En los insectos polífagos que tienen hábitos de alimentación generalizada, la actividad
proteolítica involucra la expresión de las diferentes clases de enzimas digestivas en
respuesta a los IPs de las plantas huésped; por esto la estrategia para el control de estos
insectos requiere la co-expresión de múltiples IPs que bloquean la actividad de las
proteasas digestivas, disminuyendo la digestión de las proteínas del alimento (Orr et al.,
1994; Broadway, 1996; Jonsgma y Bolter, 1997).
Para mejorar la defensa de los IPs de plantas contra insectos se han utilizado diferentes
estrategias que incluyen el empleo de IPs específicos contra las proteasas del insecto
128
(Michaud, 1997; Koiwa et al., 1998), IPs resistentes a la degradación proteolítica que se
expresen en altas concentraciones y con una constante de inhibición que favorezca la
interacción con la proteasa del insecto (Orr et al., 1994; Michaud et al., 1996; Michaud,
1997; Jongsma y Bolter, 1997), la combinación de IPs contra diferentes proteasas (Oppert
et al., 1993; Orr et al., 1994; Jongsma y Bolter, 1997; Amirhusin et al., 2007) y la selección
de IPs de especies no relacionadas genéticamente con la planta huésped. Debido a que en la
mayoría de los casos las enzimas digestivas de un insecto particular son resistentes a los IPs
de las plantas-huésped y susceptibles a los IPs de las plantas no-huésped (Jongsma et al.,
1996; Harsulkar et al., 1999; Pompermayer et al., 2001; Zhu-Salzman et al., 2003).
Hasta el momento la mayoría de estudios han expresado IPs únicos en plantas transgénicas,
sin embargo, la probabilidad de éxito puede mejorarse significativamente combinando IPs
que interfieran con enzimas proteolíticas de diferentes clases; en este escenario será mucho
más fácil reducir el crecimiento de los insectos o incluso ocasionar su muerte. Por esto, es
necesario identificar IPs con diferentes mecanismos de acción contra las proteasas del
intestino medio de un insecto particular (Jongsma et al., 1996). También, es posible
mejorar la expresión de los IPs mediante el uso de promotores inducibles por lesión, para
asegurar la toxicidad de las plantas transgénicas contra sus predadores (Duan et al., 1996).
Para conseguir resistencia durable contra H. hampei, los IPs de las semillas de L.
bogotensis, H. suaveolens y B. humidicola pueden transferirse a café mediante ingeniería
genética para producir plantas trangénicas con variaciones en la resistencia contra este
insecto. Plantas de tabaco que expresan genes del inhibidor de proteinasa de tomate I
(fuerte inhibidor de quimotripsina y débil de tripsina) y II (fuerte inhibidor de tripsina y
quimotripsina) mostraron diferencias en la especificidad contra M. sexta (Johnson et al.,
1989). El crecimiento de las larvas de M. sexta que se alimentaron de las hojas de tabaco
transformadas con el inhibidor de proteinasa II se redujo significativamente en
comparación con el crecimiento de las larvas que se alimentaron de las hojas sin
transformar. Mientras, que el inhibidor de proteinasa I tuvo poco efecto en el crecimiento
129
de las larvas de este lepidóptero (Johnson et al., 1989). Estos resultados muestran la
importancia de identificar nuevos IPs con variaciones en la especificidad contra diferentes
enzimas de los insectos (Mendiola et al., 2000).
Otro estudio confirmó que la combinación de inhibidores de cisteín y serín proteinasas en
bioensayos retardo el crecimiento de las larvas de T. castaneum (Oppert et al., 2003).
También, la combinación de scN, pepstatina A y el inhibidor de tripsina Kunitz de soya
(KI) en dietas artificiales, produjeron un efecto de sinergia contra las proteasas de C.
maculatus; la toxicidad de los tres inhibidores para retardar el desarrollo del insecto fue
mayor que el efecto de scN o pepstatina A solos (Amirhusin et al., 2007).
Los inhibidores presentes en el extracto crudo de L. bogotensis produjeron la mayor
inhibición de las aspártico proteasas de H. hampei. Estos resultados sugieren que los
IAPLbs podrían ser buenos candidatos para transferir a café mediante ingeniería genética
para producir plantas resistentes a H. hampei, ya que inhiben las enzimas del insecto a bajas
concentraciones y al pH encontrado en el intestino medio del insecto. Además, esta
leguminosa no ha estado expuesta a H. hampei, proporcionando nuevos y más potentes
inhibidores de las proteasas de este insecto. Esto coincide con investigaciones previas que
muestran que los IPs de plantas no-huésped son mejores para inhibir las proteasas de un
insecto particular que los inhibidores de las plantas huésped (Harsulkar et al., 1999).
A través del proceso de co-evolución, los insectos cambian sus enzimas digestivas para
vencer el efecto de IPs de las plantas huésped. Por ejemplo, los coleópteros se alimentan de
leguminosas que tienen un alto contenido de compuestos tóxicos, mientras que otros
insectos no utilizan estas semillas como fuente de alimento (Sales et al., 2005). Otros
insectos que normalmente se alimentan de dicotiledóneas o monocotiledóneas son sensibles
a los IPs de otros tipos de plantas (Duan et al., 1996). Esta asociación es altamente
específica, por esto las semillas de muy pocas especies sirven de alimento para un insecto
particular.
130
H. hampei y C. arabica coevolucionaron favoreciendo la adaptación del insecto a los
compuestos tóxicos de la planta. Los IPs de L. bogotensis, H. suaveolens y B. humidicola,
plantas no-huésped de la broca del café, inhiben las proteasas del insecto; mientras que los
inhibidores de la planta huésped no bloquean las proteasas del insecto. Otros estudios han
mostrado que los IPs de A. hypogaea, P. tetragonolobus y S. tuberosum, plantas no-
huésped de H. armigera, inhiben las isoproteinasas y el crecimiento de las larvas de este
lepidóptero, en comparación con los IPs de las plantas huésped (Harsulkar et al., 1999; Giri
et al., 2003). De igual manera, el inhibidor de tripsina de M. charantia, planta no-huésped
de H. armigera y S. litura, afectó la fertilidad y fecundidad de las larvas de ambos insectos
(Telang et al., 2003). También, las vicilinas de leguminosas no-huésped de C. maculatus
como P. vulgaris, Phaseolus lunatus, Canavalia ensiformis y Glicine max retardaron el
desarrollo de las larvas del insecto (Yunes et al., 1998). Mientras que las vicilinas de Vigna
angularis, una especie genéticamente cercana a la planta huésped V. unguiculata, no
afectaron el desarrollo de las larvas de este insecto (Yunes et al., 1998). Estos resultados
muestran la importancia de evaluar IPs de plantas no-huésped contra las enzimas de
insectos en la búsqueda del control de plagas vía transgénesis.
Los IAPLb designados como: IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3, IAPLb4, IAPLb5, IAPLb6 e
IAPLb7 purificados en este trabajo inhibieron las aspártico proteasas de H. hampei. En
contraste, los primeros trabajos realizados por Gallardo et al. (1974) reportaron la ausencia
de actividad antitríptica en los cotiledones de las semillas de L. albus y L. luteus.
Posteriormente, se encontraron pequeñas cantidades de inhibidores de proteasas en las
semillas de L. angustifolius y L. luteus (Birk, 1993). Recientemente, se purificó y
caracterizó LaBBI el cual presentó 12.700 unidades de inhibición de tripsina (UIT) por
gramo de semilla, un valor que corresponde a 29 UIT/mg de proteína en la semilla seca
(Scarafoni et al., 2008), considerando un contenido de proteína de 42% de materia seca
(Egaña et al., 1992). Este valor representa el 10% de las UIT encontradas en las semillas de
soya (Duranti et al., 2003) y tres veces la actividad inhibitoria encontrada en las semillas de
guisantes de jardín y fríjol común (Hove y King, 1979; Birk, 1993). En este trabajo el
131
extracto crudo de L. bogotensis presentó 20.450 unidades de inhibición aspártico proteasa
(UIA) por gramo de semilla, un valor que corresponde a 34,5 UIA, similar al encontrado en
las semillas de L. albus para LaBBI (Scarafoni et al., 2008). El rendimiento del inhibidor
IAPLb4 fue de 50 g de proteína por g de semilla, representando el 0.02% del contenido de
proteína con relación a la materia seca de la semilla. Estos resultados demostraron que las
semillas de Lupinus spp tienen IPs en cantidades comparables a otras leguminosas, en
contraste con las investigaciones iniciales que mostraron que no existían IPs en las semillas
de este género.
Los inhibidores IAPLb4, IAPLb5, IAPLb6 e IAPLb7 tienen masas moleculares entre 10,3 y
16,9 kDa, las cuales están dentro del rango que se ha reportado para la mayoría de
inhibidores de proteasas (3 - 20 kDa) (Ryan, 1990). Entre los cuales están: el inhibidor de
tripsina de Amaranthus hypochondriacus de 7,4 kDa (Valdes et al., 1993), HSTI de 8,7
kDa (Aguirre et al., 2004), TTI de 21,4 kDa (Araújo et al., 2005), PdKI-2 18,1 kDa
(Oliveira et al., 2007), ILTI de 20 kDa (Macedo et al., 2007b) y LaBBI de 6,8 kDa
(Scarafoni et al., 2008).
El inhibidor IAPLb4 mostró la mayor inhibición de las aspártico proteasas de H. hampei
con una CI50 de 2,9 g. También, inhibió pepsina con una Ki de 3,1 µM y la inhibición fue
de tipo competitivo, esto podría sugerir que los inhibidores de las aspártico proteasas actúan
por un mecanismo de inhibición similar al de los inhibidores de serín proteasas.
IAPLb4 fue estable entre 30 a 70 C durante 30 min y en un rango de pH de 2-11. La termo
estabilidad es una característica de los IPs que podría estar asociada a la presencia de
puentes disulfuro, debido a que a estos enlaces se les atribuye la resistencia al calor, a pH
extremo y a la proteólisis (Richardson, 1991; Greenblatt et al., 1989). Es así como SPC que
presenta dos puentes disulfuro y mantiene su actividad inhibitoria a 70 C por 1 h a pH 7
(Souza et al., 1995); TBPI compuesto por 14 cisteínas que forman siete enlaces disulfuro,
132
es activo después de 60 min a 96 C (Campos et al., 1997); AeTI con dos cadenas
polipeptídicas unidas por uno o más puentes disulfuro, es estable a temperaturas de 0 a 60
C y a pHs de 1-10 (Bhattacharyya et al., 2006); SaPIN2a tiene 8 puentes disulfuro y
mantiene su actividad inhibidora después de hervir por 10 min a pHs de 3-11 (Wang et al.,
2007) y LaBBI tiene 14 residuos de cisteína en una posición conservada siendo estable
después de calentar durante 3 min a 80 C (Scarafoni et al., 2008). Sin embargo, los
isoinhibidores de H. brasiliensis que tienen solamente un residuo de cisteína son
completamente activos después de 2 h de incubación a 80 C a pHs de 3-11 (Sritanyarat et
al., 2006). De igual manera, IAPLb4 es termoestable y no presenta cisteínas. Esto podría
sugerir que los puentes disulfuro no son los únicos responsables de la estabilidad estructural
de los inhibidores de proteasas al calor y al pH extremo.
La secuencia amino-terminal de IAPLb4 tiene identidad con la vicilina y la -conglutina de
L. albus y L. angustifolius, proteínas de almacenamiento de las semillas. El extremo
carboxi-terminal de IAPLb4 tiene identidad con la -conglutina de L. angustifolius. Otros
inhibidores de proteinasas han mostrado similitud con proteínas de almacenamiento de la
semilla. BWI-2b tiene identidad con las proteínas de almacenamiento del tipo vicilina 7S
(Park et al., 1997). BWI-2b mostró 14 residuos idénticos en 29% de las posiciones
comparadas y en un número considerable de otras posiciones se encontraron residuos
similares a la región amino-terminal del primer exón del gen de la vicilina de algodón
(Gossypium hirsutum L.) (Chaln et al., 1986; Park et al., 1997). De forma similar, los
inhibidores de tripsina-Kunitz, tales como el inhibidor de tripsina de Erythrina variegata
(Kouzuma et al., 1992), el inhibidor de tripsina de Prosopsis juliflora (Negreiros et al.,
1991) y el inhibidor ILTI (Macedo et al., 2007b), tienen identidad con las proteínas de
almacenamiento de las semillas esporamina y miraculina. Del mismo modo, el inhibidor de
catepsina D aislado de papa muestra muchos residuos idénticos a los de miraculina (Ritonja
et al., 1990).
133
La secuencia amino-terminal de IAPLb4 no mostró similitud con ninguno de los
inhibidores de aspártico proteasas conocidos. Al igual que la secuencia amino-terminal de
SQAPI, lo cual indica que este inhibidor probablemente pertenece a una nueva familia de
inhibidores (Christeller et al., 1998). Algunos inhibidores de tripsina tampoco tienen
similitud con inhibidores reportados en las bases de datos como el inhibidor PRTI,
perteneciente a la familia Euphorbiaceae (Chaudhary et al., 2008) y HSTI (Aguirre et al.,
2004). Hasta el momento los inhibidores de aspártico proteasas han sido poco estudiados y
sólo se han aislado de un número reducido de plantas, por esto la disponibilidad de
estructuras primarias depositadas en los bancos de datos son escasas, lo cual dificulta el
hallazgo de similitud con inhibidores de este tipo (Rawlings et al., 2004). En contraste a los
inhibidores de serín proteinasas que son ampliamente estudiados y se han clasificado en 16
familias basados en el mecanismo de unión y la similitud en la secuencia y topología
(Laskowski y Kato, 1980). Según la clasificación de la base de datos MEROPS
(http://merops.sanger.ac.uk/) las peptidasas e IPs son asignadas a familias por homología de
secuencias. Sin embargo, debido a que las familias pueden ser muy diversas, la relación no
puede establecerse únicamente por comparación de su estructura primaria, siendo necesario
estudios de la estructura terciaria y cuaternaria (Rawlings et al., 2004).
La identidad entre IAPLb4 y la vicilina de L. albus, podría sugerir que el papel de defensa
de las vicilinas este asociado con su capacidad para inhibir las aspártico proteasas en el
intestino medio de coleópteros como H. hampei. En otro estudio se reportó que la
resistencia de las semillas de caupí variedad Tvu 2027 contra C. maculatus se debió a los
niveles elevados de inhibidores de tripsina tipo Bowman-Birk (Gatehouse et al., 1979;
Gatehouse y Boulter, 1983). Sin embargo, otras investigaciones demostraron que esta
resistencia no está relacionada con inhibidores de serín y de cisteín proteinasas (Xavier-
Filho et al., 1989; Baker et al., 1989; Fernandes et al., 1993; Zhu et al., 1994), ni tampoco
con inhibidores de -amilasas (Reis et al., 1997). Estudios posteriores establecieron que la
resistencia de las semillas de caupí (IT81D-1045) a C. maculatus se debe probablemente a
134
la presencia de vicilinas en su fracción globulina (Macedo et al., 1993). Las investigaciones
químicas e inmunológicas han mostrado que las vicilinas se unen a los ápices de las células
epiteliales y a las estructuras que contienen quitina en el intestino medio de las larvas de C.
maculatus (Firmino et al., 1996; Yunes et al., 1998; Sales et al., 2001). También, las
vicilinas se unen a la membrana peritrófica de las larvas de Diatraea saccharalis
reduciendo significativamente su tasa de supervivencia (Mota et al., 2003). Uchoa y col.
(2006) también demostraron que las vicilinas de caupí se unen a los órganos internos y los
tejidos de C. maculatus, como los cuerpos grasos y los tubos de Malpigio. Sin embargo, el
mecanismo exacto de antibiosis ocasionado por estas proteínas aún se desconoce (Sales et
al., 2000), porque tanto las vicilinas de líneas de caupí resistentes y susceptibles a C.
maculatus, se unen a la quitina en el intestino medio de las larvas y no se han observado
señales de daño de las células (Sales et al., 2001). De forma similar, las fracciones ácidas
de vicilinas parcialmente puras de variedades de caupí susceptibles (CE-31) y resistentes
(IT81D-1045) afectaron el desarrollo y la supervivencia de C. maculatus, lo cual indica que
las vicilinas tóxicas para insectos se expresan en ambas variedades aunque a diferentes
niveles (Mota et al., 2002).
En C. maculatus la actividad aspártico proteasa se incrementó cuando el inhibidor de
cisteín proteasa de soya (scN) se incorporó en la dieta de los insectos, lo cual sugiere que
las aspártico proteasas se vuelven fundamentales para la supervivencia del insecto cuando
las principales enzimas digestivas son inhibidas. Lo más probable es que la resistencia de
las aspártico proteasas a scN le permite al insecto continuar con el procesamiento de las
proteínas del alimento en presencia del inhibidor (Zhu-Salzman et al., 2003; Amirhusin et
al., 2007). Está documentando ampliamente que las vicilinas retardan el crecimiento de este
coleóptero, lo cual podría deberse a que estas proteínas de almacenamiento inhiben las
aspártico proteasas interfiriendo con la asimilación de las proteínas del alimento, retardando
el crecimiento del insecto. Estos resultados indican que los IPs son proteínas
multifuncionales que no sólo inhiben las aspártico proteasas, sino que también son capaces
de unirse a las estructuras que contienen quitina en el intestino medio de coleópteros. Ha
135
sido postulado que los IPs podrían estar involucrados en una compleja interacción entre el
valor nutricional de las plantas y la fisiología digestiva de los insectos, considerando
altamente improbable que la inhibición de las aspártico proteasas sea la única función de
estas proteínas en el intestino medio de los insectos (Broadway et al., 1986, Gatehouse et
al., 1992).
El extremo amino-terminal de los inhibidores IAPLb1, IAPLb2 e IAPLb3 tienen muchos
residuos similares al inhibidor IAPLb4. Estas proteínas inhiben las aspártico proteasas de
H. hampei, tienen similitud con la vicilina y la -conglutina de L. albus. Además, su masa
molecular es inferior a la reportada para las subunidades de las vicilinas de guisante (47 a
50 kDa) (Shewry et al., 1995) y de caupí (45 a 66 kDa) (Sales et al., 2001). Es probable que
estos inhibidores se produjeron por modificaciones pos-transduccionales de proteólisis
dando lugar a las subunidades de masas moleculares entre 10,3 y 16,9 kDa purificadas en
este trabajo. La similitud entre los inhibidores de las aspártico proteasas de L. bogotensis y
las vicilinas, sugiere una nueva función de defensa para estas proteínas de reserva.
Los inhibidores IAPLb6 e IAPLb7 tienen similitud con la -conglutina de L. albus y L.
angustifolius. De igual forma, el inhibidor de -amilasa C-III de trigo tiene similitud con
una región rica en cisteínas de la conglutina de L. angustifolius (Lilley y Inglis, 1986). Es
probable que el gen o los genes que codifican para la conglutina de L. angustifolius
evolucionaron a partir de un gen o genes ancestrales, los cuales dan lugar a otras proteínas
de semillas de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como: dominios no
repetidos de prolaminas, inhibidores de proteinasas Bowman-Birk y de tripsina de cereales,
inhibidores de -amilasas, y proteínas de almacenamiento tipo globulinas 2S de Ricinus
communis y Brassica napus (Lilley y Inglis, 1986). Esto sugiere que los inhibidores de
proteasas y las conglutinas podrían originarse a partir de un gen ancestral común (Lilley y
Inglis, 1986). Lo cual podría explicar la homología entre las conglutinas y los inhibidores
136
de proteasas IAPLb6 e IAPLb7, proteínas de almacenamiento que inhiben las aspártico
proteasas de H. hampei.
La secuencia del gen IAPLb4 corresponde aun único marco de lectura abierta de 354
nucleótidos, que codifica para un polipéptido de 117 aminoácidos. IAPLb4 no tiene
intrones, al igual que el gen que codifica el inhibidor de proteinasa de papa (Maganga et al.,
1992). En contraste, la secuencia del gen del inhibidor de tripsina de mostaza (mti-2) que
codifica el inhibidor de proteasa de D. muralis y D. tenuifolia posee un intrón (Volpicella et
al., 2009). El gen de IAPLb4 tiene un péptido señal de 37 aminoácidos que no se encuentra
en la proteína nativa. Esta secuencia representa el 32% de la proteína traducida y se pierde
pos-traduccionalmente, durante o después del transporte del inhibidor a la vacuola central
como ocurre con otros inhibidores aislados de papa y tomate (Graham et al., 1985a;
Graham et al., 1985b; Nelson y Ryan, 1980; Sanchez-Serrano et al., 1986).
137
7. CONCLUSIONES
H. hampei presenta dos bandas de actividad aspártico proteasas con pH óptimo de 2.5. Las
aspártico proteasas fueron inhibidas por pepstatina A. En contraste, los inhibidores de serín,
cisteín y metaloproteinasas probados, no inhibieron la actividad de estas proteasas
digestivas. Esta enzima es una catepsina D porque digirió hemoglobina en un 100%.
Se identificaron inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei en semillas L.
bogotensis, los cuales produjeron mayor inhibición de las aspártico proteasas del insecto en
comparación con los IPs de H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus. Los IPs se
unen al centro activo de la enzima bloqueando su actividad proteolítica. Esto muestra que
los IPs de plantas no-huésped pueden suministrar nuevos y más potentes inhibidores de las
proteasas de H. hampei.
Por primera vez se aisló, purificó y caracterizó, un inhibidor de las aspártico proteasas de
H. hampei de L. bogotensis que produjo la mayor inhibición de las aspártico proteasas de
H. hampei (IAPLb4). Este inhibidor tiene una masa molecular de 12,84 kDa, y esta
compuesto de una cadena polipeptídica con un punto isoeléctrico de 4,5. IAPLb4 fue
estable a temperaturas entre 30 a 70C a pH 2.5 e inestable a 100C. También fue estable
en un amplio rango de pH, de 2 a 11 a 30 C.
In vitro IAPLb4 fue altamente efectivo contra las aspártico proteasas de H. hampei con una
CI50 de 2.9 µg; inhibe pepsina en una relación estequiométrica de 1:1 y esta inhibición es de
tipo competitivo con un Ki de 3.1 M. Su secuencia amino-terminal presentó 76% de
identidad con las proteínas de almacenamiento de las semillas de L. albus: vicilina y -
conglutina. Esto sugiere que este inhibidor puede actuar como una proteína de reserva en
138
las semillas y el papel de defensa de las vicilinas contra insectos estar asociado a la
inhibición de las aspártico proteasas del intestino medio de coleópteros.
Los IPs IAPLb1, IAPLb2, IAPLb3 e IAPLb5 están constituidos por una cadena
polipeptídica, su secuencia amino-terminal es similar a IAPLb4, y mostraron identidad con
las vicilinas y conglutinas de L. albus. Esto sugiere que son codificados por una familia
de genes.
Los IPs IAPLb6 e IAPLb7 están constituidos por una cadena polipeptídica con una masa
molecular de 12.86 y 16.91 kDa, respectivamente. La secuencia amino-terminal de IAPLb6
e IAPLb7 tiene similitud con la conglutina.
Este trabajo junto con el de Scarafoni et al. (2008) confirma la existencia de inhibidores de
proteinasas en las semillas de Lupinus spp contrario a lo que se había publicado de la falta
de actividad inhibitoria de las proteasas de L. albus y L. luteus (Gallardo et al., 1974).
El gen que codifica el inhibidor IAPLb4 corresponde a un único marco de lectura abierta de
354 nucleótidos que codifica para un polipéptido de 117 aminoácidos. El número de
aminoácidos deducidos a partir de la secuencia de nucleótidos es igual al inferido según la
masa molecular de IAPLb4. Como otros inhibidores de proteasas, IAPLb4 no tiene
intrones. Este inhibidor mostró una secuencia amino-terminal de 37 aminoácidos que no se
encuentra en la proteína nativa y representan el 32% de la proteína traducida, esta región
corresponde a un péptido señal con el sitio de ruptura entre las posiciones AYG-EK. Esta
secuencia probablemente se pierde durante la maduración del inhibidor nativo.
IAPLb4 no tiene cisteínas y su composición de aminoácidos inferida a partir de la
secuencia de nucleótidos mostró que el número de cargas positivas de los residuos de
arginina y lisina es de 26 y el número de cargas negativas de ácido aspártico y ácido
139
glutámico es de 29. Esto sugiere que los puentes disulfuro no son los únicos responsables
de la estabilidad estructural de los inhibidores de proteasas al calor y a los pHs extremos.
Finalmente, este trabajo contribuye al conocimiento de las enzimas digestivas de H. hampei
y sus IPs y abre la posibilidad de emplear inhibidores de las aspártico proteasas de H.
hampei, en el programa de manejo integrado de la broca (MIB).
140
8. PERSPECTIVAS
El conocimiento del papel de las diferentes clases de proteasas en el tracto digestivo del
insecto, ayudará a entender los sitios de vulnerabilidad bioquímica de H. hampei, por esto
es necesario continuar con la identificación de las enzimas digestivas de la broca del café.
Producir el inhibidor de las aspártico proteasas mediante un sistema de expresión de
proteína recombinante para evaluar el efecto de IAPLb4 en el crecimiento y desarrollo de
este coleóptero.
Evaluar el efecto del inhibidor de aspártico proteasa (IAPLb4) en plantas genéticamente
transformadas.
141
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10. ANEXOS 9.1 Anexo 1. Análisis de contrastes de la extracción de los IPs, variable UI. Procedimiento GLM Información de nivel de clase Clase Niveles Valores ESPECIE 2 B L EXTRAC 2 a s DESNG 2 g s Número de observaciones leídas 24 Número de observaciones usadas 24 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 7 132420553.9 18917222.0 122.63 <.0001 Error 16 2468128.2 154258.0 Total correcto 23 134888682.0 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UTOTAL Media 0.981702 11.45561 392.7569 3428.513 Cuadrado de Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F ESPECIE 1 77898661.76 77898661.76 504.99 <.0001 EXTRAC 1 14869578.37 14869578.37 96.39 <.0001 DESNG 1 17593540.08 17593540.08 114.05 <.0001 ESPECIE*EXTRAC 1 7546797.80 7546797.80 48.92 <.0001 ESPECIE*DESNG 1 4935531.21 4935531.21 32.00 <.0001 EXTRAC*DESNG 1 6577986.92 6577986.92 42.64 <.0001 ESPECIE*EXTRAC*DESNG 1 2998457.73 2998457.73 19.44 0.0004 ---UI/mL------------- --------UI---- Nivel Número de Desviación Desviación ESPECIE observaciones Media estándar Media estándar Brachiaria 12 50.808333 17.2619634 1626.90833 570.29296 Lupinus 12 135.158333 53.2453405 5230.11667 2203.56005 ---UI/mL------------- --------UI---- Nivel Número de Desviación Desviación EXTRACTO observaciones Media estándar Media estándar agua 12 111.275000 70.5116641 4215.63750 3008.57263 B.succínico 12 74.691667 36.2216775 2641.38750 1363.56825 -----UI/mL------------- --------UI---- Nivel Número de Desviación Desviación DESENGRASE observaciones Media estándar Media estándar SIN D 12 68.816667 34.1424112 2572.32083 1491.28809 Con D 12 117.150000 67.6310714 4284.70417 2905.03951
173
9.2 Anexo 2. Análisis de varianza de la extracción de los IPs. Variable UI Procedimiento GLM Número de observaciones leídas 24 Número de observaciones usadas 24 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 9 132702054.9 14744672.8 94.40 <.0001 Error 14 2186627.1 156187.7 Total correcto 23 134888682.0 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UTOTAL Media 0.983789 11.52703 395.2058 3428.513 Cuadrado de Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F EXTRACTO 7 132420553.9 18917222.0 121.12 <.0001 REP 2 281501.1 140750.5 0.90 0.4284 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F EXTRACTO 7 132420553.9 18917222.0 121.12 <.0001 REP 2 281501.1 140750.5 0.90 0.4284 Procedimiento GLM Medias de cuadrados mínimos EXTRACTO UI/mL LSMEAN UI LSMEAN Brachiaria agua 73.516667 2426.05000 Brachiarua aguaG 42.683333 1280.50000 Brachiaria suc 52.683333 1633.18333 Brachiaria sucG 34.350000 1167.90000 Lupinus Suc 123.283333 4314.91667 Lupinus SucG 88.450000 3449.55000 Lupinus agua 219.116667 8764.66667 Lupinus aguaG 109.783333 4391.33333 Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI/mL Alfa 0.05 Error de grados de libertad 14 Error de cuadrado medio 113.4717 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones EXTRACTO A 219.117 3 Lagua B 123.283 3 LSuc B 109.783 3 LaguaG C 88.450 3 LSucG C 73.517 3 B agua D 52.683 3 Bsuc D 42.683 3 B aguaG D 34.350 3 BsucG Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI Alfa 0.05 Error de grados de libertad 14 Error de cuadrado medio 156187.7 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
174
Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones EXTRACTO A 8764.7 3 Lagua B 4391.3 3 LaguaG B 4314.9 3 LSuc C 3449.6 3 LSucG D 2426.1 3 B agua E 1633.2 3 Bsuc E 1280.5 3 B aguaG E 1167.9 3 BsucG
9.3 Anexo 3. Análisis de varianza de la identificación de los IPs en semillas de plantas variable UI. Procedimiento GLM Información de nivel de clase Clase Niveles Valores EXTRACTO 4 AH BH HS LB REP 3 1 2 3 Número de observaciones leídas 12 Número de observaciones usadas 12 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 5 45415122.67 9083024.53 41.05 0.0001 Error 6 1327656.00 221276.00 Total correcto 11 46742778.67 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UTOTAL Media 0.971597 20.89428 470.3998 2251.333 Cuadrado de Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F EXTRACTO 3 44805104.00 14935034.67 67.50 <.0001 REP 2 610018.67 305009.33 1.38 0.3217 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F EXTRACTO 3 44805104.00 14935034.67 67.50 <.0001 REP 2 610018.67 305009.33 1.38 0.3217 Procedimiento GLM Medias de cuadrados mínimos UI EXTRACTO LSMEAN AH 673.33333 BH 1380.00000 HS 1392.00000 LB 5560.00000 Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI experimentwise. Alfa 0.05 Error de grados de libertad 6 Error de cuadrado medio 221276 Número de medias 2 3 4 Rango crítico 939.8 974.0 991.0 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones EXTRACTO A 5560.0 3 LB B 1392.0 3 HS B 1380.0 3 BH B 673.3 3 AH
175
9.4 Anexo 4. Análisis de varianza de la precipitación con (NH4)2SO4. variable UI Información de nivel de clase Número de observaciones leídas 42 Número de observaciones usadas 42 Procedimiento GLM Información de nivel de clase Número de observaciones leídas 42 Número de observaciones usadas 42 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 15 44624014.88 2974934.33 2589.74 <.0001 Error 26 29867.25 1148.74 Total correcto 41 44653882.13 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UI Media 0.999331 2.086048 33.89307 1624.750 Cuadrado de Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 13 44619347.63 3432257.51 2987.84 <.0001 REP 2 4667.25 2333.63 2.03 0.1514 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 13 44619347.63 3432257.51 2987.84 <.0001 REP 2 4667.25 2333.63 2.03 0.1514
176
Procedimiento GLM Medias de cuadrados mínimos UI PRECIPIT LSMEAN P20 1575.00000 P30 1440.00000 P40 750.00000 P50 34.50000 P60 900.00000 P70 900.00000 P80 3382.50000 S20 1530.00000 S30 1650.00000 S40 2550.00000 S50 3304.50000 S60 2400.00000 S70 2325.00000 S80 5.00000 Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI Alfa 0.05 Error de grados de libertad 26 Error de cuadrado medio 1148.74 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones PRECIPIT A 3382.50 3 P80 B 3304.50 3 S50 C 2550.00 3 S40 D 2400.00 3 S60 E 2325.00 3 S70 F 1650.00 3 S30 G 1575.00 3 P20 G 1530.00 3 S20 H 1440.00 3 P30 I 900.00 3 P70 I 900.00 3 P60 J 750.00 3 P40 K 34.50 3 P50 K 5.00 3 S80 Análisis de varianza con los precipitados con (NH4)2SO4. variable UI Información de nivel de clase Clase Niveles Valores PRECIPIT 7 P20 P30 P40 P50 P60 P70 P80 REP 3 1 2 3 Número de observaciones leídas 23 Número de observaciones usadas 21 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 8 19964012.14 2495501.52 1461.46 <.0001 Error 12 20490.43 1707.54 Total correcto 20 19984502.57 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UI Media 0.998975 3.220401 41.32234 1283.143
177
Cuadrado de Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 6 19962097.07 3327016.18 1948.43 <.0001 REP 2 1915.07 957.54 0.56 0.5850 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 6 19962097.07 3327016.18 1948.43 <.0001 REP 2 1915.07 957.54 0.56 0.5850 Procedimiento GLM Medias de cuadrados mínimos UI PRECIPIT LSMEAN P20 1575.00000 P30 1440.00000 P40 750.00000 P50 34.50000 P60 900.00000 P70 900.00000 P80 3382.50000 Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI experimentwise. Alfa 0.05 Error de grados de libertad 12 Error de cuadrado medio 1707.536 Número de medias 2 3 4 5 6 7 Rango crítico 73.51 76.95 79.03 80.40 81.36 82.04 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones PRECIPIT A 3382.50 3 P80 B 1575.00 3 P20 C 1440.00 3 P30 D 900.00 3 P70 D 900.00 3 P60 E 750.00 3 P40 F 34.50 3 P50 Análisis de varianza con los precipitados con (NH4)2SO4. variable UI Información de nivel de clase Clase Niveles Valores PRECIPIT 7 S20 S30 S40 S50 S60 S70 S80 REP 3 1 2 3 Número de observaciones leídas 23 Número de observaciones usadas 21 Procedimiento GLM Variable dependiente: UI UI Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 8 19759519.50 2469939.94 3425.88 <.0001 Error 12 8651.57 720.96 Total correcto 20 19768171.07 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE UI Media 0.999562 1.365509 26.85078 1966.357 Cuadrado de
178
Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 6 19756042.07 3292673.68 4567.04 <.0001 REP 2 3477.43 1738.71 2.41 0.1317 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F PRECIPIT 6 19756042.07 3292673.68 4567.04 <.0001 REP 2 3477.43 1738.71 2.41 0.1317 Procedimiento GLM Medias de cuadrados mínimos UI PRECIPIT LSMEAN S20 1530.00000 S30 1650.00000 S40 2550.00000 S50 3304.50000 S60 2400.00000 S70 2325.00000 S80 5.00000 Procedimiento GLM Prueba del rango múltiple de Duncan para UI experimentwise. Alfa 0.05 Error de grados de libertad 12 Error de cuadrado medio 720.9643 Número de medias 2 3 4 5 6 7 Rango crítico 47.77 50.00 51.35 52.25 52.87 53.31 Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Número de Duncan Agrupamiento Media observaciones PRECIPIT A 3304.50 3 S50 B 2550.00 3 S40 C 2400.00 3 S60 D 2325.00 3 S70 E 1650.00 3 S30 F 1530.00 3 S20 G 5.00 3 S80 9.5 Anexo 5. Determinación del péptido señal. SignalP 3.0 Server - prediction resultsTechnical University of Denmark Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on eukaryotes SignalP-NN result: Sequence length = 117 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C 31 0.789 0.32 YES max. Y 31 0.772 0.33 YES max. S 18 0.988 0.87 YES mean S 1-30 0.849 0.48 YES D 1-30 0.810 0.43 YES # Most likely cleavage site between pos. 30 and 31: AYG-EK
179
SignalP-HMM result: Sequence Prediction: Signal peptide Signal peptide probability: 0.993 Signal anchor probability: 0.007 Max cleavage site probability: 0.817 between pos. 30 and 31
180
9.6 Anexo 6. Producción científica Lista de publicaciones:
Molina, D.M., Zamora, H.M., Blanco, A. 2010. An inhibitor from Lupinus bogotensis
seeds effective against aspartic proteases from Hypothenemus hampei. Phytochemistry.
71(8-9): 923-929.
Molina, D.M., Zamora, H.M., Blanco, A. 2010. Caracterización molecular de un inhibidor
de las aspártico proteasas de la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera.
Scolytinae). In: Congreso de la Sociedad Colombiana de Entomología, 37. Bogotá
(Colombia), Junio 30-2 julio, 2010. Resumenes. Bogotá (Colombia), SOCOLEN, 2010.p.
63. ISBN 978-958-99120-2-7
Molina V., D.M.; Zamora, E., H.M. 2009. Caracterización de un inhibidor de las aspártico
proteasas de la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera. Scolytinae). In:
CONGRESO de la Sociedad Colombiana de Entomología, 36. Medellín (Colombia), Julio
29-31, 2009. Resumenes. Medellín (Colombia), SOCOLEN, 2009.p. 103. ISBN 978-958-
99120-1-0
Molina, V., D.M; Zamora, E., H.M; Blanco, A. 2009. Purificación y caracterización de un
inhibidor de Lupinus bogotensis efectivo contra las aspártico proteasas de Hypothenemus
hampei. In: CONGRESO de la Sociedad Colombiana de Fitomejoramiento y Producción de
Cultivos. Palmira (Colombia), Octubre 28-30. Ponencias en disco compacto.
181
Cadena, G., Benavides, P., Cristancho, M., Moncada, P., Gongora, C., Acuña, R., Gaitán,
A., Posada, H., Villarreal, D., Molina, D., Dominguez, J., Herrera, J.C., Aldwinckle, H.,
Yepes, M. 2008. Study of the genomes of coffee (Coffea arabica), its major insect pest the
coffee berry borer (Hypothenemus hampei), and its biological control agent (Beauveria
bassiana). ICGN satellite meeting held at the Plant & Animal Genome Meeting (PAG). San
Diego, Ca.(USA), January 15.
Benavides, P., Cortina, H.A., Moncada, M del P., Gongora, C.E., Acuña, J.R., Molina,
D.M. 2008. Genomic strategies to detect genes involved in resistance to the cofee berry
borer Hypothenemus hampei. ICGN satellite meeting held at the Plant & Animal Genome
Meeting (PAG). San Diego, Ca(USA), January 12.
Molina, D.M., Zamora, H.M. 2008. Aislamiento y purificación de un inhibidor de
aspártico proteasas para el control de la broca del café Hypothenemus hampei. Congreso de
la Sociedad Colombiana de Entomologia. Cali (Colombia), Julio 16-18. ISBN: 978-958-44-
3579-8.p. 170-171.
Molina; D.M; Zamora, H; López, Y. 2005. Identificación de un inhibidor de aspártico
proteinasa de leguminosa específico contra las proteasas de broca. Congreso de la Sociedad
Colombiana de Fitomejoramiento y Producción de Cultivos. Palmira (Colombia), Mayo 11-
15. Ponencias en disco compacto.
182
9.7. Anexo 7. An inhibitor from Lupinus bogotensis seeds effective against aspartic proteases from Hypothenemus hampei An inhibitor. Phytochemistry. 71(8-9): 923-929.
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