interaciones entre productos tensoactivos y algunos

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

María Jesús Agra-Cadarso Gil

Madrid, 2015

© María Jesús Agra-Cadarso Gil, 1973

Interaciones entre productos tensoactivos y algunos

microorganismos de lodo de río

Sección de Biológicas.

BIBLIOTECA UCM

530670376X

C(Pyi.Jl:

P\Gn

INTERACCIONES ENTRE PRODUCTOS TENSOACTIVOS Y ALGUNOS MICROORGANISMOS DE LODO DE RIO

9 Jlc.Cî'rO■ vtC/ui' Oc axvo

Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de

Microbiologia de la Facultad de Ciencias de la Universidad Corn -

plutense de Madrid, bajo la direcciôn de su Catedrâtico Jefe, -

Prof. Dr. D. DIMAS FERNANDEZ-GALIANO FERNANDEZ, a quien deseo -

expresar mi mas sincere agradecimiento.

Agradezco tambien al Prof. Dr. D. José Antonio Arroyo

Merino el apoyo y la orientaciôn que en todo momento me ha dis -

pensado.

Asimismo mi gratitud a todos mis compaheros del Depar-

mento, que siempre han contribuido con incondicional y eficaz ayu

da.

- I N D I C E -Pâ£.

I.- INTRODUCCION ...................................... 2

II.- PRODUCTOS TENSOACTIVOS Y DETERGENTESII. 1.- Propiedades fisicas........................ 6

II. 2.- Constituciôn quimica............... 7II.3.- Tipos de tensoactivos............. 9

III.-BIODEGRACION DE PRODUCTOS TENSOACTIVOSIII.1.-Microbios que intervienen en estos procesos. 16111.2.-Interacciones tensoactivos-bacterias. 18111.3.-Principales mécanismes de ataque microbiano

a tensoactivos...................... 21

IV.- LOS CICLOS BIOLOGICOS DEL NITROGENO Y DEL CARBONOIV. 1.- El Ciclo del Nitrôgeno.................... 30IV. 2.- El Ciclo del Carbono...................... 37

V.- ELECCION Y OBJETO DEL TEMA................. 41

VI.- MATERIAL Y METODOS.VI.1.- Productos tensoactivos .................... 45VI. 2.- El lodo............................. 46VI.3.- Las estirpes bacterianas.................. 47VI.4.- Los aparatos............................... 50VI.5.- Los medios de cultivo............... 50

VI.6 .- Los reactivos ............................. 53VI.7 ,- Influencia de los tensoactivos sobre la -

microflora total de las nuestras de lodo... 53

VI.8 .- Tolerancia de las estirpes bacterianas aisladas frente a distintas dosis de tensoactiVOS.................... 54

VI.9 .- Influencia sobre algunos procesos delCiclo del Nitrôgeno................. 54

pâa:-

VI.10.- Influencia sobre algunos aspectos delCiclo del Carbono....................... 56

VI.11.- Cultivos en agitaciôn y obtenciôn demuestras para espectroscopia de infra-rroj os.................................. 57

VI. 12.- Espectroscopia infrarroja.............. 59

VII.- ESQUEMA DEL TRABAJO PROPUESTO.................. 60

VIII.-EXPOSICION E INTERPRETACION DE RESULTADOS VIII.1.- Influencia de la concentraciôn de ten

soactivos sobre la microflora total delas muestras de lodo.................... 64Interpretaciôn de resultados .......... 75

VIII.2.- Tolerancia de las estirpes bacterianas aisladas Trente a distintas dosis de Fe-nopon T 77 y Sodio Dodecil Sulfato 82

VIII.3.- Influencia sobre algunos procesos del Ciclo del Nitrôgeno :VIII.3.1.- Influencia sobre la Amonificaciôn y

la Nitrificaciôn.... 140VIII.3.2.- Influencia sobre la Desnitri-

f icaciôn............ 156

VIII.3.3.- Influencia sobre la Fijaciôn libre aerobia del Nitrôgeno -atmosférico.............. ... 181

VIII.3.4.- Interpretaciôn de resultados 183VIII.4.- Influencia sobre algunos aspectos del

Ciclo del Carbono :VIII.4.1.- Influencia sobre la Amilolisis 190VIII.4.2.- Influencia sobre la Celulolisis aero

bia................... 202

VIII.4.3.- Interpretaciôn de resultados... 204

' Pâ£-VIII.5. Acciôn de los microorganismos sobre

los tensoactivos utilizados............. 206Interpretaciôn de resultados.......... 222

IX.- CONCLUSIONES.................................. 229

X .- BIBLIOGRAPIA... ............... ..... 233

I. INTRODUCCION

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El empleo de los detergentes de sfntesis se ha extendi do enormemente después de la segunda guerra mundial. Estas su^ tancias comprenden una serie muy variada de productos quimicos - que el.homhre emplea fundamentaImente en operaciones de lavado y limpieza, en las que han sustituido a los jabones se puede decir que practicamente en una sola década. Este hecho puede atribuir- se principalmente a dos factores :

1) En las aguas-duras el jabôn forma sales insolubles de Calcio y Magnésie que no tienen propiedades detergentes y que ademâs se depositan sobre los materiales que se estân limpiando.

2) Los nuevos productos no sôlo son mas eficaces en - este aspecto, sinô también mas baratos.Asi, en poco tiempo, se - generalizô el uso de los tensoactivos sintéticos primero en USA y luego en todo el mundo, a medida que el avance de la tecnolo - gfa quimica lo hizo posible.

A pesar de las manifiestas ventajas de los nuevos productos, un nuevo problema se hizo gradualmente évidente : los d£ tergentes sintéticos comenzaron a acumularse y a ser notables en los desagües, aguas tratadas y recipientes de aguas a causa de - la misma propiedad que los hizo célébrés ya que retienen sus pro piedades espumantes aûn en concentraciones pequehisimas, circun_s tcuicia que plantea cuestiones técnicas importantes sobre todo en lo referente a la calidad de las aguas residuales, su toxicidad- sus tratamientos de depuraciôn etc.

El problema bâsico es el poder disponer de detergentesde estructura tal que puedan ser detenidos en un tiempo suficientemente corto por los microorganismos présentes en los cursos de yagua o en los tangues de depuraciôn. La destrucciôn de los deter

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gentes por los microorganismos podria ser définida como una"mi - neralizaciôn”, es decir una transformaciôn de las sustancias or ganicas que los componen en anhidrido carbonico y agua, y de - los restantes componentes en las bases o acidos inorganicos correspondientes. Las formas microbianas capaces de llevar a ca bo estos procesos estan ampliamente representadas en la naturaleza, pero no todas las sustancias utilizadas como detergentes - son susceptibles a la mineralizaciôn por los microorganismos, y asi se puede establecer una distinciôn entre detergentes biodégradables y no biodégradables. Estos ûltimos resisten mas amplia mente o incluse de una manera définitiva el ataque microbiano , con lo que résulta évidente que estas sustancias estân destina- das a acumularse en las aguas y su acumulaciôn en cantidad exce siva pueden ser causa de peligros considerables desde varios - puntos de vista :

a) La presencia de detergentes en los rios en cantidades excesivas tiene como efecto a menudo la formaciôn de espumas. persistantes que impiden completamente la oxigenaciôn del agua; - de ello dériva una disminuciôn o incluse desapariciôn de la f au - na fluvial y de los microorganismos.

b) En las régi ones con fuerte consume de agua ( zonas - superpobladas con mucha concentraciôn industrial ) sucede que las aguas deben ser recicladas, necesidad que ha provocado mas de una vez la acumulaciôn de detergentes en las aguas potables.

c) Es muy probable que estas mismas sustancias no bio - degradables pasen con el agua de riego a los terrenes de cultivo don^e se irian acumulando progresivamente y ejerciciendo su efecto soÈre la compleja poblaciôn de microorganismos que habita en

.Ai

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el suelo .y que son los responsables de las transformaciones -quimicas que garantizan la riqueza en nutrientes de las plantas

Vemos, pues,que, aunque los detergentes se acumulan - principalmente en las aguas, pueden también influir en gran manera en la poluciôn de los suelos.

II.- PRODUCTOS TENSOACTIVOS Y DETERGENTES

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II.1.- PROPIEDADES FISICAS

La palabra "Tensoactivo" es una forma abreviada del - término "Agentes activo de superficie" que indica la propiedad mâs sobresaliente de estos compuestos : Tienden a concentrarse en la superficie de una soluciôn acuosa y a alterar sus propiedades superficiales. En cambio se aplica el nombre de "Deter - gente " a un producto o formulaciôn destinada a la limpieza ylavado. Los modernos detergentes contienen normalmente entre -

♦ •un 10% a un 30% de tensoactivo ( a menudo denominado como "pro ducto activo"), amplios porcentajes de sales de polifosfato y un numéro de otros ingredientes en pequehos porcentajes. La ef£ cacia limpiadora de un producto convenientemente formulado es - mucho mayor que la de igual cantidad de tensoactivo puro.

Es caracterlstica comûn y necesaria a todos los ten - soactivos el poseer un radical fuertemente hidrôfilo y un radical fuertemente lipôfilo ligados en la misma molécula. Por la - presencia del radical hidrôfilo un tensoactivo es mas o menos - facilmente soluble en agua, mientras que su polo hidrôfobô es - repelido por ella y como consecùéncia, en la superficie de la - soluciôn (interfase aire-agua) las moléculas de tensoactivo se orientan con los grupos hidrôfilos en la fase acuosa y los gru pos hidrôfobos en direcciôn opuesta. El resultado de esta pel£ cula superficial orientada es la disminuciôn de la tensiôn superficial del agua y una mayor tendencia a la formaciôn de bur- bujas y espuma.

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II.2.- COÜSTITUCION QUIMICA1.- Radicales hidrôfobos

De acuerdo con la revisiôn hecha por Hutchinson (1967) el radical hidrôfobo mas usaso en los tensoactivos es una cadena hidrocarbonada con una longitud entre 10 y 20 âtomos de carbono, que puede pertenecer a los siguientes tipos :

A.- Acidos grasos : Pueden ser convertidos en jabones por -neutralizaciôn con un Alcali : RCOOH + NaOH RCOONa + HpOEl grupo carboxllixo de los acidos grasos pueden enlazar a la - cadena hidrocarbonada con un radical hidrôfilo conveniente. Al- ternativamente, el grupo carboxllico puede ser primero reducido a grupo alcohôlico para dar un alcohol graso que puede servir - de intermediario en la sintesis de otros tipos de tensoactivos:

RCOOH + 2H2 — ^ RCH2OH + H2O

B.- PARA?INAS : Tienen la desventaja de ser quimicamente poco reactivas por lo que su conversiôn directa en tensoactivos es - battante diffcil. En su lugar es preferible utilizar otros inter- mediarios, normalmente olefinas, alquilbencenos o alcoholes que contienen grupos activos (doble enlace,anillo bencénico o grupo OH ) que son mas faciles de unir a radicales hidrôfilos para - formar tensoactivos.

C.- OLEFINAS : Han sido muy utilizadas en la fabricaciôn de tensoactivos derivados del tetraprepileno ( TBS o tetrapropilen bencenosulfonatos ) _

R-CH-CH2 Ri-CH=CH-R2 ^ ^C=CH 2 '''^C=CH-R^' ^2 R2

i 1 R2 R4

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D.- ALQUILBENCENOS R ^

Utilizados como intermediaries en la producciôn de ten soactivos desde 1940, fueron empleados en la fabricaciôn de los TBS que a causa de su escasa biodegradabilidad han caido en desu so siendo sustituidos por los Alquilbencenosulfonatos de cadena lineal (LAS) .

E.- ALCOHOLES : R-CHpOH. Se han empleado alcoholes lineales - desde los primeros dias de la producciôn de tensoactivos; los - alcoholes'%amificados han empezado a utilizarse mas recientemen- te.

F.- ALQUILFBNOLES : R ^ ^ H El grupo alquilico R puede es*tar en posiciôn orto, meta o para respecte al grupo - OH.

G.- POLIOXIPROPILSNOS : Son un ejemplo de radical hidfofobo - no derivado de hidrocarburos. Son polimeros del ôxido de propi - leno :

H2O + nC-C C HO-C3H5O-C3H6O-------C3H6OH

2 . Grupos hidrôfilos _______ ____

Los grupos hidrôfilos de los tensioactivos actuales son de dos clases : Los que se ionizan en soluciôn acuosa y los que no se ionizan.

Los mâs comunes son :

a) Sulfonato -S O 3 ”

b) Sulfato -OSO3-c) Carboxilato -CO2-d) Amonio cuaternario -R 3 N+

e) Polioxie ti leno—0—CHp—CH2"“0-'CH2“CH2— ——— 0—CH2—CH—OH f f ) Polipéptido - NH-CHR-CO-NH-CHR*!- 0 0 NH-CHR2-CO2H' Los cuatro^son iônicos y los restantes no iônicos.

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II.3.- TIPOS PB TENSOACTIVOS

Los radicales hidrôfilos, los hidrôfobos y las formas de imirlos pueden ser permutadas y combinadas para originar ten soactivos de variedad ilimitada, algunos de los cuales han sido extremadamente importantes por razones cientificas y comercia - les.

En esta clasificaciôn citaremos los grupos mâs impor - tantes. Una informaciôn mâs compléta sobre este aspecto se puede obtener'en los trabajos de Swisher.

1.- Aniônicos : en soluciôn acuosa dan iones tensoactivos cargados negativamente, originando usualmente grupos sulfo - nato, sulfato o carboxilato

R S O3 Na --- > R S O3 + Na^Comercialmente son muy importantes y representan la mayor parte de tensioactivos hoy en uso y se obtienen principalmente por su_l fonaciôn o sulfaciôn de los radicales hidrôfobos. Algunos de los compuestos mâs representativos de este grupo son :

a) AlouiIbencenosulfonatos : Se obtienen por reacciôn de alquilbenceno con âcido sulfûrico o anhidrido sulfûrico para dar el âcido sulfônico que es entonces neutralizado para dar la sal d seada, frecuentemente sal de sodio :

R—^ + ^230^ --- R— ^ — SO3H + H2OR-^^ SO3H + NaOH— tR—^ SO^Na + H^O

El grupo sulfonato enlaza con el anillo predominantemente en posiciôn para. Son los tensoactivos mâs ampliamente utili - zadqs por sus excelentes propiedades detergentes y costo bajo.

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b) AIcanosulfonatos ( suifonatos alifâticos o suifonatos paraflnicos ) : No pueden formarse por sulfonaciôn directa - ya que las parafinas son relativamente inertes al âcido sulfûrico, pero su producciôn comercial es factible por suifoxidaciôn : La parafina se hace reaacionar con anhidrido sulforoso y oxlgeno para dar el âcido sulfônico que entonces es neutralizado con la base deseada :

^16^34 + SO2 + iÛ2 --- > C16H33SO3H

La reacciôn puede ocurrir en cualquiera de los hidrô - genos a lo largo de la cadena parafinica originando una mezcla - de âcidos sulfônicos isômeros.

c) Alcanosulfonatos primaries : Han sido de considéra - ble importancia en estudios cientlficos de los fenômenos de ten • soactividad ya que se sintetizan fâcilmente, por adiciôn de un - bisulfito a -olefinas lineales :

Ci4H29CH=CH2TNaHS03 > Cq4R29^^2*^^2^^3^^d) Sulfonatos de Olefinas : Estân empezando a usarse -

comercialmente por acciôn del anhidrido sulfûrico sobre -oie finas lineales con la subsiguiente neutralizaciôn. La reacciôn - es compleja y sigue varias trayectorias dando dos productos prin cipales :

Alquenosulfonato CCCCCCCCCCCC=CC-S03

Hidroxialcanosulfonato CCCCCCCCCCCCCC -S0%1OH

e) Sulfonatos de ésteres v amidas : Pueden producirse* por reacciôn de un âcido graso con âcidos hidroxisulfônicos de -- v\,

cadena. corta o âcidos aminosulfônicos :

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RCOCL + HOCH^CHgSOgNa > RC02CH2CH2S03Na

RCOCt 4- HNCH2CH2S0nNa ---> RC0NCH2CH2S03NaCHj CH3

Estos productos se conocen con el nombre de Igepon A e Igepon T respectivamente.

f) Acidos grasos sulfonados : Pueden obtenerse por - sulfonaciôn directa con anhidrido sulfûrico. El grupo sulfônico se introduce en posiciôn :

C16H33CH2COOH 4- SO3 >Ci6H33ÇHC00HSO3H

Los grupos carboxllico y sulfonato pueden ser neutra- lizados ambos, o el grupo carboxllico puede reaccionar con un -alcohol para dar un ester.

g) Alquilsulfatos primaries: Se forman por reacciôn dealcoholes primaries con ’acide sulf'urico y neutralizaciôn de -la base deseada :

______________ RCH20H-4r__H2SO4_______________________________________ _

- RCH2OSO3H 4- Na OH > RCH20S03Na 4- H2O

— . Estes productos han sido fabricados en gran volumen -desde los primeros dias de los detergentes sintéticos. Son esta- bles en soluciôn neutra o alcalina, pero en presencia de âcidos se hidrolizan fâcilmente. Los radicales hidrôfobos suelen ser - lineales.

h) Alquilsulfatos secundarios: Normalmente no son producidos a partir de los correspondientes alcoholes ya que se forman mâs fâcilmente por reacciôn directa de la correspondiente oie

■

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fina con el âcido sulfûrico. El grupo ester sulfato no se introduce necesariamente solo en la posiciôn del doble enlace, p.ej. con una olefina lineal se puede encontrar en todas las posicio- nes excepto en las primarias al final de la cadena

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C=C

H2SO4(

C—C—C—C—C—C—C~\C—C—C—C—C—Q.—c-OS03

Algunos de estos compuestos han sido fabricados en - Europa durante muchos anos bajo el nombre de Tecpol, casi siem pre en soluciôn acuosa. Como los alquilsufatos primarios se - hidrolizan por âcidos y son sensibles al calor, descomponiéndo- _se enolefina y bisulfato sôdico.

2.- Catiônicos : En soluciôn acuosa dan iones tensoactivos cargados positivamente, p.ej. derivados de Amonio Cuaternario :

RN(CH3 )3C£ ---> RN(CH3)3 + Ct“i , ■ . .11 —I .1.1 . —. - -y— A . III.. # — - —- - —- - fEoiTde interés en la in^stria de los detergentes prin- -cipalmente por sus propiedades bacteriostâticas y germicidas. Su comportamiento como detergentes es pobre y representan solo una fracciôn muy pequeha de los tensoactivos en uso.

3.- No Iônicos : Contienen grupos hidrôfilos que no - se ionizan apreciablemente en soluciôn acuosa. Algunos de los - mâs importantes comercialmente contienen un radical polieter - hidrôfobo derivado del ôxido de etileno EO). Comprenden quizâs 20-25% del volumen total de tensoactivos producidos.

* El grupo polioxietileno puede ser introducido en algûn

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radical hidrôfobo que contenga un âtomo de hidrôgeno activo, p.ej, un âtomo dé hidrôgeno uni do a uno de oxigeno como en un alcohol.- El ôxido de etileno reacciona con el hidrôgeno activo para for - mar un hidroxieter :

/ 0\ROH + CH2-CH2 ---> ROCH2CH2OH

Este producto contiene sus propios âtomos de hidrôgeno activos que puedan tambien reaccionar con el ôxido de etileno, - dando otro producto con un hidrôgeno activo y asi sucesivamente :

ROCH2CH2OH + CH2-CH2 »R0CH2CH20CH2CH20H. *Asl puede construirse una cadena de poliglicol de la -

longitud deseada simplemente por adiciôn continua de ôxido de - etileno en la reacciôn.

Los productos no iônicos que han sido usados en amplia escala comercial corresponden a cutro tipos générales :

a) Alcohol etoxilatos: Son derivados de alcoholes ali - fâticos por reacciôn con ôxido de etileno.

ROH + nCpH^O tRfOCpH^) nOH __________ El producto de cadena ramificada preparado a partir delalcohol C23 de tetrapropileno ha declinado en importancia por su resistencia a la biodegraciôn. Estâ siendo implantado por los alcoholes lineales derivados por polimerizaciôn Ziegler del etileno y por oxonaciôn de olefinas lineales.

b)Alquilfenol etoxilatos : Se hacen de acuerdo con la -ecuaciôn :

R-< > 0H + 11C2H4O » R-4 ^ (OC2H4)nOHLos derivados de alquilfenoles polipropilénicos han -

caido en desuso en la industria de los detergentes por razones de su tiodegradabilidad.

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c) Ésteres de polioxietileno : Se forman de etoxilaciôn de âcidos carboxilicos :

RCOCH + nC2H40 --- > RCOO (0C2H4)n

El âcido suele ser un âcido graso natural

d) Derivados polioxietileno-polioxiprouilénicos : Son polimeros mezclados con radicales hidrôfobos derivados del ôxido de propileno, que después se hacen reaccionar con ôxido de - etileno hasta alcanzar las propiedades deseadas. Or dinar i amen te ti_i nen un peso molecular nuy elevado, a menudo con mucho mâs de las usuales 8 - '1 5 moles de ôxido de etileno caracterlsticas de los - otros no iônicos.

III. BIODEGRACION DE PRODUCTOS TENSOACTIVOS

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III.l.- MICROORGANISMOS QUE INTERVIENEN EN ESTOS PROCESOS

Bn la mayoria de los casos la mayor parte de la biodegraciôn es llevada a cabo por bacterias, aunque Wurtz-Arlet (1964) y Klein (1964) han comprobado la degraciôn de Alquilben ceno-sulfonato (ABS) por algas. Davis (1967 ) encontrô que los Tetrapropilenbencenosulfonatos (TBS), Alquilsulfatos lineales (LAS) y algunos no iônicos eran degradables todos por algas en cultivo puro con un alcance que variaba ampliamente de unas e£ pecies a otras.

MC Kinney (1956) y Brown (1965) han estudiado los pro tozoos del lodo activo y Hawkes (1963) ha revisado y discutido estas cuestiones en detalle. Curds (1968) ha demostrado convin- centemente una marcada mejora en la transparencia de los efluen tes de lodos activos después de la introducciôn de protozoos ciliados en el sistema, mientras Calaway (1968) ha remarcado la importancia de los rotiferos.

Existen, en realidad, pocos problemas para obtener especies bacterianas apropiadas para la biodegradaciôn de tensoac- y.vos._^tân_presente en el suelo, aguas naturales, en el agua y en los residuos. Harkness (1966) ha revisado la literatura - sobre las especies bacterianas encontradas en todos los niveles del tratamiento de aguas residuales y Baars (1965) ha discutido la distribuciôn de poblaciones, su estructura y su bioquimica. Brevion (1966),trabajando con muestras de aguas residuales do - mésticas, identified nueve géneros bacterianos prédominantes e investigô los efectos de algunos nutrientes sobre la distribu - ciôn de la poblaciôn durante el crecimiento subsiguiente.

En su exâmen de lodo activo de distintas fuentes, Me. Kinne^^(1953) aislô 72 bacterias représentantes de 14 géneros. Van Gils (1964) investigô la bacteriologia del lodo activo en - detalle y Dias (1964, 1965) aislô unas 300 cepas bacteriana de

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él, observando ciertas diferencias en la distribuciôn de las cepas en el lodo activo comparada con las encontradas en las aguas residuales. Shaposhnikov (1968) describiô el aislamien- to de 132 cepas puras de bacterias y hongos a partir de lodo activo derivado del contenido de petrôleo de algunos produc - tos residuales.

El género Pseudomonas ocupa un lugar prédominante en todas estas bacterias. Sus miembros han estado relacionados con la biodegraciôn de tensoactivos desde los primeros dias, como- cuando Williams (1949) observô el crecimiento bacteriano occidental en hn champû e identified a los organismos como especies de Pseudomonas; probô 12 cultivos puros distintos de bacterias y encontrô que 7 podian crecer en champû, mientras que 5 no. Diez ahos después. Me.Kinney (1959) diô a conocer el aislamiento de - ~34 cultivos puros capaces de vivir en Tetrapropilenbencenosulfo- natos (TBS) : 15 de ellos pertenecian al género Pseudomonas, 10 a Alcaligenes y el resto estaban distribuidps entre otros 5 géneros. Como Me.Kinney,Schdnborn (1962) aislô 34 cepas por similares técnicas de enriquicimiento sobre Tetrapropilenbencenosulfon (TBS) y AlquiIbencenosulfonato lineal (LAS) : Una de ellas fué -— f A- - •- - -- - - — — — — > --- - ’■ — ---- —--- - - un tipo de hongo, otra una bacteria grampositiva y el resto eran bacterias gramnegativas. Anderson (1964) estudiô los valores del crecimiento de 10 cultivos aislados por via de enriquecimiento -■ en TBS; uno de ellos ( una especie de Alcaligenes) crecia tanbien sobre un medio con 5000 p.p.m. de TBS como sobre caido nutritivo, y los otros menos fâcilmente.

Ilisescu (1966) aislô 10 especies de Pseudomonas, y una de Aerobacter, Alcaligenes, Achromobacter y Escherichia a partir de un medio de cultivo con LAS o ABS como ûnica fuente de Carbono, despues de inocular con lodo activo aclimatado. Skinner (1959) -

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aislô una bacteria del suelo capaz de vivir sobre el alquilsulfato secundario Teepol, alquilsulfatos primarios y alcanolamidas grasas : Una Pseudomonas sin identificar la especie. Hsu (1965) obtuvo 6 cepas de Pseudomonas a partir de agua de alcantarillado, todas capaces de degradar alquilsulfatos.

Robeck (1963) examinô las poblaciones de microorganismos en varios lugares de un suelo que habia sido utilizado durante dos anos en experimentos de degradaciôn de TBS. Las especies de Pseudomonas encontradas suponian un 5% de los microorganismos encontrados hacia la superficie y un 0 ’5% de los encontrados en profundida6 ;

III. 2.- INTERACCIONES TENS0ACTIV/5S-BACTERIAS .

Dos hechos son particularmente importantes en el estudio de la biodegraciôn de tensoactivos : a) la alta concentraciôn del tensoactivo puede inhibir o dahar a las bacterias de forma que re sulten incapaces de conseguir una degraciôn que puede llevarse a cabo fâcilmente en concentraciones mâs bajas. b) el tensoactivo - puede desaparecer de la soluciôn por adsorciôn p.ej. anadiendo - -Aigm-lbeneenosu-lf onato—(-ABS )- en-^O-30-p rp ; m .— a -un sis tema bac te— riano concentrado como un lodo activo conteniendo 2000-3000 p.p.m. de mezcla de liquide y sôlido en suspensiôn, el anâlisis inmediato de la fase liquida puede mostrar sôlo 2-3 p.p.m. de ABS. Ello no significa necesariamente que haya ocurrido el 90% de la dégrada - ciôn en los primeros minutes y, asi, en un exâmen cuidadoso, el ABS desaparecido puede ser encontrado asociado con el lodo adsor- bido sobre él. Si el ABS es biodegrable, p.ej. LAS, la fracciôn adsorbida desaparece pronto, junto con la de la fase liquida. Si e poco degradable, p. e j. TBS, la porciôn sin degradar persiste tan- to en el lodo como en la soluciôn.

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Muchos de los primeros trabajos sobre las interacciones tensoactivos-bacterias fueron dirigidos hacia el desarrollo de sistemas antisépticos y desinfectantes. Algunos de los ten - soactivos son muy poderosos a este respecte bajo condiciones - apropiadas, aunque estos mismos productos bajo otras condiciones pueden ser fâcilmente atacados por las bacterias como ocurre con algunos jabones.

Los efectos de tensoactivos sobre bacterias han sido revisados por Glassman (1948), Putnam (1948), Fischer (1958) ,-James (1965), Dychdala (1968) y Swisher (19 ) entre otros. A -

*

pH neutre, los tensoactivos catiônicos son generalmente los mâs tôxicos y su eficacia aumenta a pH mâs elevado, disminuyendo en pH mâs bajo. En contraste, los aniônicos son menos efectivos en soluciôn neutra, pero aumentan su actividad a pH inferior. Los no iônicos han sido considerados generalmente como inactives fren te a las bacterias.

Las bacterias de distintas especies pueden mostrar sen- sibilidad ampliconente diferente a un tensoactivo dado. Se puede decir que, en general, las especies grampositivas son mâs susce£tibles a-les aniônicos que las gramnegativas, mientras que les--catiônicos actûan contra ambos tipos. El incremento de la longitud de la cadena de un aniônico parece hacerlo mâs efectivo.

Con el incremento del uso de tensoactivos por la indu£tria de los detergentes y su résultante apariciôn en las aguas -de alcantarillado, surgfa una consideraciôn algo diferente: Mâsque un mâximo de acciôn antibacteriana, era preferible un minimode taies efectos para que exista la menor interferencia posiblecon las bacterias implicadas en los procesos de tratamiento de -aguas residuales. Generalmente, los efectos inhibidores de los -

ftensoactivos aniônicos se hacen évidentes a valores de 100-1000

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p.p.m. El umbral varia ampliamente segûn las especies bacteria- naS; tipo de tensoactivo, presencia de nutrientes u otros materiales, concentraciôn bacteriana y grado de aclimataciôn. La - mayor resistencia de bacterias gramnegativas que grampositivas a la acciôn de tensoactivos aniônicos ha side repetidamente - observada per Fischer (1958), Hartmann (1963, 1966) Oba (1965), Lambin (1966) entre otros y asi, las concentraciones del orden de 10 a 20 p.p.m. pueden causar notables efectos en grampositi- vos como Bacillus, Sarcina y Stafilococcus, mientras que varies miles de p.p.m. pueden tener poco efecto sobre gramnegativos - como Aerob^cter aerogenes, Escherichia coli. Pseudomonas sp., - Serratia marcescens.

Los mecanismos por los que los tensoactivos inhiben - o paran las actividades bacterianas no han sido bien explorados _todavia. Indudablemente la inter acciôn con las enzimas y pro - tefnas bacterianas es un factor importante. Tales interacciones ocurren ”in vitro", y si estos componentes esenciales celula - res son alterados de tal manera dentro de la célula misma o en la pared celular, no debe sorprendernos el que se alteren los procesos vitales. Algunas investigaciones sobre especies de -ProteHts nos dan un ejemplo : Estos organismo son extremadamente môviles, e incluso en medio sôiido no permanecen en colonias fijas,por lo que a veces es necesario inhibir esta propiedad para procéder a los métodos de aislamiento. Ya en 1942, Lominsky en- contrô que los jabones y tensoactivos poseian ese efecto inhibidor haciendo desaparecer los flageles caracteristicos sin afectar a sus propiedades de crecimiento, y Kopp (196 5) mostrô el - mismos efecto sobre la movilidad de Prote&s mirabilis utilizando alquilsulfatos lineales primaries, aunque no establecio si este;fué el resultado del ataque directe sobre los flageles o - bien de la inhibiciôn de la formaciôn de flagelos. El sodiodo -

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decil sulfato (SDS) entre 100-1000 p.p.m. puede causar la ruptura o desintegracion parci&l de los flagelos de otras especies bacterianas y a 1000-2500 p.p.m. puede solubilizar las membranas ci toplasmicas aisladas de Bacillus subtilis (Bishop, 1967). SDS y otros tensoactivos han sido usados en muchos otros estudios de estructuras celulares y componentes celulares : Shafa y Salton - (i960) observaron la destrucciôn de la pared celular de Salmo - ne'lla gallinarum y otras especies gramnegativas por acciôn del - SDS sugiriendo que se produciria una interaciôn entre el tensoac tivo y la parte lipldica y lipoproteica de la pared celular. Schnaitman ,^1971) estudiô el efecto del tensoactivo no iônico - Triton X-100 sobre la membrana citoplasmica de Escherichia coli observando una solubilizaciôn de la parte proteica de la membrana, y Voldringh y Montera van Iterson (1972) han observado la - disoluciôn de la membrana y alteraciones de la ultraestructura_-_ Escherichia coli después del tratamiento con Sodiododecilsulfato. Diaz Miguel (1972) ha estudiado el efecto de varios tensoactivos aniônicos y no iônicos sobre la ultraestructura y producciôn de pigmentos de Chlamydomonas oblonga, observando que a las 48 ho - ras del tratamiento con 100 ppm de tensoactivo se produciâ la -de s ap âri cion de'las cloroflias y marcado descenso de carotenos, si—como la alteraciôn y a veces destrucciôn de las lamelas del

cloroplasto y lisis de organoides citoplasmâticos. _ _____

III.3.- PRINCIPALES MECANISMOS DE ATAQUE MICROBIANO A TENSOACTIVOS

III.3.1.- INFLUENCIA DE LA ESTRUCTURA QUIMICA EN LA BIODEGRACION

Hcimmerton (1956) sugiriô por primera vez que el fac - tor mas importante en la biodegradaciôn de tensoactivos era que el radical hidrôfobo fuera lineal, mientras que la naturaleza - quimica y la forma de uniôn del radical hidrôfilo eran sôlo ex - casamente significatives: los tensoactivos lineales son facilmen

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te biodégradables, los ampliamente ramificados no lo son .

• . Las investigaciones posteriores empleando una amplia variedad de modelos de tensoactivos sintetizados con estructuras conocidas han servido para comprobar esta generâlizaciôn. Aunque el efecto de una simple ramificaciôn metilica en una molécula - que de otra forma séria lineal es escasamente notable,el incremento de la resistencia al incrementar la ramificaciôn se observa generalmente, y la resistencia se hace excepcionalmente grande cuando hay una ramificaciôn cuaternaria al final de la cade-na en la molécula.

-* •Tanto el radical hidrôfobo como el hidrôfilo estân . implicados en una generalizaciôn enunciada en primer lugar por Huddleston y Swisher (1963). Dériva de los estudios de los efectos de la longitud de la cedana y de la posiciôn fenil a lo largo de la misma sobre la biodegradaciôn de Alquilbencenosulfona- tos.de cadena lineal (LAS) : Cuanto mayor sea la distancia entre el grupo sulfonato y el final de la cadena alquilica, mas râpi- da serâ la biodegraciôn. Los isômeros con el grupo fenilo unido cerca del extremo de la cadena desaparacen algo mâs râpidamente -que—aqueUos-^n—que—la^uni-ôn^es-mâs—eentna-l-r~Parece -que mâs- que - la simple posiciôn de enlace del anillo a la cadena, es el grupo sulfonato mismo el que estâ implicado, como viene indicado - por la menor degradaciôn de los 1-fenildodecano y tetradecano orto-sulfonatos comparados con los correspondientes isômeros "para" (Huyser, I960; Swisher 1963).

Existe también un ePecto de inhibiciôn de los tensoac tivos sobre su propia degradaciôn cuando se sobrepasa una cier- ta concentraciôn limite. Ciattoni (1968) examinô varios LAS homôlogos i de C 10 a C 15 observando que cada uno de ellos ténia una

?concentraciôn limite por encima de la cual su degradaciôn no . -

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ocurria, al menos en 50 dias, aunque las bacterias conservaban su capacidad para degradar otros sustratos normales como g lu - cosa o extracto de carne. Por debajo de esa concentraciôn, la degradaciôn de LAS tenia lugar, con periodos de inducciôn mâs pequehos cuanto menor era la concentraciôn inicial. Ciattoni - atribuyô la inhibiciôn a la interacciôn de LAS con centros - enzimâticos especificos bacterianos, de otra manera capaces de atacar la cadena alquilica. Estos resultados concuerdan bastante bien con los de Mann (1968) sobre variedades de LAS comer - cial de mayor peso molecular.

* Bn cuanto a la biodegraciôn de los Etoxilatos no iônicos, influyen dos factores principalmente : l) el numéro de unidades de ôxido de etileno en el grupo hidrôfilo y 2 ) la estructura del grupo hidrôfobo. Como han demostrado muchos investigadores, la biodegraciôn es acrecentada por disminuciôn del numéro de unidades de ôxido de etileno (Bogan 1954, Sawyer 1956, Oldham 1956 entre otros ) y por incremento de la linea - lidad del radical hidrôfobo, hecho este ûltimo de influencia - mâs pronunciada de forma que la biodegradaciôn de los alcohol etoxilatos lineales es usualmente rapida y compléta (Oldham -195^1 Huddleston 1964, Bunch 1967 Patterson 1967, Borstlat 1967

En el caso de los alquilfenol etoxilatos influye la posiciôn del grupo fenilo en el mismo sentido que hemos visto - para el LAS : Parece que la biodegradaciôn comienza facilmente cuando el fenol estâ en posiciôn terminal o casi terminal, mien tras que se hace mâs dificil cuando la uniôn es mâs central - ( Smithson 1966).

III.3.2 VTASJMETABOLICAS PRINCIPALES

t Los mecanismos quimicos usados por las bacterias pa-ra la biodegradaciôn de tensoactivos, son aquellos que ellas ya

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poseen para la utilizaciôn de los alimentos normales, mediante reacciones catalizadas enzimaticamente. La mera presencia de un compuesto orgânico estrano puede, a menudo, desencadenar - el desarrollo de enzimas modificados capaces de aceptar el nu£ vo compuesto como sustrato conduciendolo a su utilizaciôn como alimento. Asî, lo que es un compuesto quimico extrano en una - situaciôn, puede ser un alimento muy normal para alguna otra - comunidad bacteriaia en ambiente distinto. Los tensoactivos , hasta el nivel en que son biodégradables, sirven tambien como nutrientes, y en su degradaciôn es conducida. por estas mismas reacciones.

La reacciôn neta sobre todas en las bacterias es la oxidaciôn. Discutiremos brevemente très de los mecanismos - oxidativos générales que parecen ser particularmente pertinentes en la utilizaciôn bacteriana de tensoactivos :

A.- Oxidaciôn terminal, primer escalôn en la degra+ciôn del radical hidrôfobo.

B.- Proceso de Beta-oxidaciôn mediante el cual es -degradada la porciôn alifatica del radical hi -drôfobo.

C.- Oxidaciôn de aromâticos que es aplicable cuando el radical hidrôfobo contiene un anillo bencéni- co.

A).- Oxidaciôn terminal: El ataque sobre LAS y probablemente sobre muchos tensoactivos, comienza con la oxidaciôn - del grupo metilo terminal a grupo carboxilico. A falta de indicios de lo contrario, podemos suponer que los mecanismos usados son adaptados a partir de los usados en el ataque inicial sobre hidrocarburos alifaticos insustituidos.

S.

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El ataque inicial sobre n-parafinâs C 6 y mayores es predominantemente terminal en un extremo de la cadena, - produciendo los correspondientes alcohol y âcido graso como primeros productos identificables.

"''--- * - La evidencia del mecanismo exacto y los pasos interme di os es complicada, probablemente a causa de que pueden usar se varias vias diferentes dependiendo de 1 ) los microorganis - mos que.intervienen 2 ) la longitud de la cadena, 3 ) otras par- ticularidades estructurales del hidrocarburo y 4) las condicionés bajo las que se opera.

« «

Hay claros indicios de que una de las vias compren -de la adiciôn de oxîgeno molecular al hidrocarburo para dar un ;hidroperôxido primario que es convertido luego en alcohol pri- jnariq , ^]êhido_)[ âcy.<^ ca,r^cî_lico _ _ _ _ _

H H H H H H H H H H H ' 0 H H ^0———C—C—C—H— ———C—C—C—OOH— ———C—C—COH — ^———C—C— ———C—C—C

H H H H H H H H H H H H H H ÔH

Una posible segunda via comprende la deshidrogena - -ci-ôn-inicialoon^ formaciôn-de—un doble-enlace-al final-de la ■ cadena, y la posterior adiciôn de agua con formaciôn del alcohol primario :

H H H H H H H H H———C4C—C—H— — —C—C®C— —C—C—C—OH

. H"h”H " h ...H " ' h H H

Después de la formaciôn del âcido graso, los prôxi- mos escalones son usualmente los de la beta-oxidaciôn, pero - tambien se han observado otras reacciones en casos particula- res, p.ej. la formaciôn de ésteres grasos y la oxidaciôn di - terminal en que la oxidaciôn terminal se repite para los dos - extremos de la cadena, derivando âcidos dicarboxilicos susce£

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tibles de la subsiguiente beta-oxidaciôn sobre ambos extremos.

El Ciclohexano que no tiene extremo libre de la - cadena, sufre también el ataque bacteriano, siendo nuevamente el paso inicial la formaciôn de un hidroperôxido que se con - vierte en el correspondiente alcohol secundario. Los alcoho - les secundarios, o sus productos de oxidaciôn han sido encontrados también en la oxidaciôn bacteriana de hidrocarburos lineales mâs cortos. En cambio las levaduras se ha observado que también dan alcoholes secundarios a paftir de hidrocarburos de mayor longitud p.ej. Klug (1967) encontrô que Candida lipoly - tica formaba tanto 1-alcanoles primarios como 2-alcanoles secundarios casi en proporciôn 2 :1 a partir de alcanos de - C14aCl8. De forma parecida. Jones (1968) publicô una extensa formaciôn de derivados primarios y secundarios (2-hidroxi) en compuestos de variada longitud de cadena por una especie de la levadura Torulopsis, mostrando que este organismo opera intro - duciendo directamente oxigeno en o cerca del final de la cadena.

También tiene lugar el ataque central sobre la ca - dena hidrocarbonada. Abbott (1968) lo estudiô suministrando - n-hexadecano a células de Nocardia salmonicolor en crecimiento sobre glucosa, y Klein (1969) estudiô la oxidaciôn interna de n-hexadexano a cetonas por via de alcoholes secundarios con - especies de Arthrobacter. t-

Tambien tiene lugar el ataque microbiano sobre hidrocarburos ramificados, dependiendo aparentemente el grado de dificultad de los detalles estructurales de la molécula. Ne Kenna (1966) propuso que los hidrocarburos ramificados taies como el pristano pueden seguir las mismas vias metabôlicas que los li - neaïes : oxidaciôn terminal seguida de beta-oxidaciôn. Stokke

î\

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(1969) ha comprobado que la ultima puede ser realizada siempre que no ocurra una alfa-oxidaciôn cuando la ramificaciôn estâ - en un carbono beta.

B. Beta-oxidaciôn

En las células vivas los âcidos grasos son degrada- dos poir el proceso de beta-oxidaciôn. Los âcidos grasos son - componente universal de todos los organismos celulares vivien- tes y el mecanismo de la beta-oxidaciôn es utilizado en todos los tipos de animales, vegetales o microbianos.

La literatura sobre este proceso es muy extensa : La discusiôh de los principios bâsicos fué dada en detalle por - Stumpf ( I960) y en sumario por Anderson (1967) y Overath (1969). La inducciôn y represiôn de los enzimas necesarios en Escheri - chia coli ha sido estudiada por Weeks (1969).

Dada la amplia difusiôn del proceso de beta-oxidaciôn no .creemos hecesario extendernos aqui en mâs detalles sobre este mecanismo.

• C. Oxidaciôn de Aromâticos.-

"Er anillo bencénicoaparece en todos los sistemas vi- vientes. Me.Kinney (1956) explorô algunas de las vias usadas por los microorganismos del lodo activo para su oxidaciôn. Knox (1961 Evans (1963), Dagley (1965), Van der Linden (1965) y Gibson(l96£ han revisado los distintos mecanismos de degradaciôn de anillos - mientras Fuhs (1961), Foster (1962) y Me. Kenna (1965) han tra - tado mâs particularmente del ataque sobre benceno mismo y otros hidrocarburos aromâticos por bacterias y otros organismos.

Dos de las rutas comunes para la biodegraciôn del - anillo bencénico son las siguientes :

i ' r

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CCC

^ /^OH WC

C O C H o = C f c

C—o

:=0 HCCOHvt/ ^ cccH CcoK

\^^0« w'^\/ t Hi

t -o o - C-H ^

cHj

CccHpJoK Ac.beta-cetoadlpico

Acetaldehido+Ac.pirûvico

En ambos casos se ha tornado el catecol como punto de partida ya que es un intermediario comûn del mismo benceno y de muchos derivados bencénicos ( âcido benzoico, fenol, âcido sali- cilico y otros ). A partir de él el anillo puede romperse entre o adyacente a los dos grupos hidroxilicos.

En la via 1, el anillo se rompe entre los dos hidroxilos formândose un âcido dicarboxilico que es convertido en - âcido beta-cetoadipico. Este ûltimo puede ser destruido por beta- oxidaciôn para dar acetato y succinato que son ambos componen - tes celulares ordinaries.

_ En la via 2 la ruptura inicial del anillo ocurre adyacente a los dos hidroxilos a âcido fôrmico, acetaldehido y -acido piruvico, todos los cuales son metabolites celulares ce - munes.

IV.- LOS CICLOS BIOLOGICOS DEL NITROGENO Y DEL CARBONO

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IV.1. El Ciclo del Nitrôgeno

“El aprovechamiento biolôgico del Nitrôgeno es de considerable importancia econômica por ser uno de los principales nutrientes de las plantas. Este elemento sufre un gran nûmero de trasnformaciones en las que estân implicadas tanto los compuestos orgânicos como los inorgânicos. Las transformaciones - ocurren simultâneamente pero en escalones o reacciones indivi- duales con frecuencia con oposiciôn de metas. Estas reacciones pueden ser examinadas en distintos pasos de un ciclo en el que el Nitrôgeno es movido alternativamente de un lado a otro por la actividad microbiana pasando por distintos grados de oxidà ciôn, desde +5 ( como en los NO3 ) hasta -3 (como en el NH4 ). En todos estos grados se ha comprobado su utilizaciôn por di - versos microorganismos.

Dommergues y Mangenot (1970), clasifican estas tran_s formaciones en dos grupos de procesos :

I.- Procesos que regulan las ganancias y pérdidas de nitrôgeno en el suelo.

__________ A^_Procesos in duc t or e s. _ de 1. enr i que c i mi ent o ______a.- De naturaleza microbiana :

- Fijaciôn del Nitrôgeno simbiôntica y libreb.- De naturaleza no microbiana :

- Aporte de las aguas meteôricas- Irrigaciôn- Absorciôn del NH^ atmosférico

B.- Procesos inductores del empobrecimiento :a.- De naturaleza microbiana :

- Desnitrificaciôn b.- De naturaleza no microbiana :

- Volatilizaciôn del NH3- Reacciones quimicas

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- Lixiviaciôn, erosiôn y fuego

II.- Procesos reguladores de la tensiôn en nitrôgeno asimilable por las plantas.

A.- Procesos inductores al enriquecimiento del suelo en nitrôgeno minerai.a.- De naturaleza microbiana :

- Amonificaciôn y Nitrificaciônb.- De naturaleza no microbiana :

-‘Liberaciôn del nitrôgeno amoniacal fijado por las arcillas.

- Liberaciôn del nitrôgeno minerai por - desecaciôn del suelo.

B.- Procesos inductores de la disminuciôn en la tensiôn en nitrôgeno minerai.a.- De naturaleza microbiana :

- Inmovilizaciôn o reorganizaciônb.- De naturaleza no microbiana

- Reversiôn no biolôgica del nitrôgeno

Estos autores resumeh las transformaciones, en el si guiente esquema :

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Fijaciôn Simbiôntica del N2

NitrificaciônDesnitrific.Reducciôn

Fijaciôn Libre del N Inmoviliz.Inmov.

Amonific.

biomasa microbiana

NH

Plantas animales

N2 o N2O Atmosférico

materia orgânica fresca materia orgânica humificada

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IV.1.1. Mineralizaciôn del nitrôgeno orgânico.-

•incluye los procesos de amonificaciôn y nitrificaciôn . El nitrôgeno orgânico présente en las protelnas y âcidos nucie^ CCS de las plantas lo utilizan los animales transformândolo en otros compuestos y por la muer te todo el nitrôgeno orgânico es transformado en amonio por los microorganismos amonificantes.El iôn amonio es la forma preferida del nitrôgeno por los microorganismos al incorporarse en este estado a sus compuestos orgâni^ C O S. Tambien, mediante la fijaciôn del nitrôgeno atmosférico es introducido este elemento en el suelo bajo forma proteica o amoniacal.

El iôn amonio puede sufrir posteriores oxidaciones - por los microorganismos nitrif icantes y pasar a nitritos o nitrates.

La amonificaciôn aparece como primer eslabôn en el - ciclo del nitrôgeno. Este proceso es llevado a cabo por consid£ rable nûmero de bacterias, hongos y actinomicetos existentes en el suelo. Influyen favoreciéndolo el pH neutro o alcalino y las altas temperaturas, y retardandolo el pH âcido, las bajas temperaturas y la anaerobiosis. - ---- ------------ - ---- -------

El final de las reacciones implicadas en la mineral! - zaciôn se produce en el momento en que se forma amoniaco que es la forma mâs reducida de nitrôgeno inorgânico y sirve como punto de partida para la nitrificaciôn. Esta ultima comprende una serie de reacciones quimicas llevadas a cabo por microorganismos que conducen a la producciôn de nitritos y a su posterior - oxidaciôn a nitrates.

La nitrificaciôn autôtrofa es llevada a cabo por miOro organismos muy especializados que obtienen toda la energia que necesitan de la oxidaciôn del amoniaco. Son bacterias quimiosin tetizantes,, existentes en el suelo, y todas ellas pertenecien -

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tes a la familia Nitrobacteriâceas, orden Pseudomonadales, sien do los gérmenes oxidantes del amonio a nitritos Nitrosomonas , Nitrosococ’cus, Nitrosospira, Nitrosocystis y Nitrosoglea de los que sôlo Nitrosomonas se encuentra frecuentemente.

■ ■ ta oxidaciôn de nitritos a nitratos se lleva a cabo - por los géneros Nitrobacter y Nitrocystis, dependiendo fundamen talmente de la presencia de Nitrobacter en el suelo.

Existe también una nitrificaciôn heterôtrofa llevada a cabo por microorganismos que, a diferencia de los autôtrofos, no pueden utilizar la oxidaciôn de los compuestos nitrogenados como ûnica fuente de energia para sus sintesis celulares. Entre ellos, hay numerosas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomices y Nocardia, Corynebacterium y Achromobacter, y de los hongos - Aspergillus, Pénicillium y Cephalosporium.

Una vez formados, los nitratos pueden seguir en el - suelo varios dias : Ser absorbidos por las plantas superiores , perderse por lixiviaciôn , perderse por desnitrificaciôn y ser inmovilizados por la flora microbiana.

IV.1.2. Inmovilizaciôn

— - Una-parte—del--ni trôgeno minerai- exi s tente en el sueloes tomado por los microorganismos que lo utilizan para sinteti - zar sus compuestos, inmovilizândolo. Al morir devuelven una parte del nitrôgeno de sus compuestos y este sufrirâ de nuevo una mineral!zaciôn. La inmovilizaciôn es por tanto un proceso anta - gônico a la minerai!zaciôn.

IV.1.3. Desni trificaci ôn.

Se entiende por desnitrificaciôn, en sentido general , la reducciôn microbiana de los nitratos. El ion nitrato, prin - cipal^y a veces exclusiva fuente de nitrogeno para las plantas, puede seguir très vias distintas de degradaciôn microbiana :

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a.- Reducciôn compléta a amoniaco con apariciôn transitoria de nitritos en el medio. Dentro del ciclo del nitrôgeno, este proceso no séria una desnitrificaciôn, por ser el ion amo nio el compuesto nitrogenado preferido por - los microorganismos.

b.- Reducciôn incompleta con acumulaciôn de nitritos en el medio. De esta forma actûan los hongos y actinomicetos que se sirven de los ni_ tratos como fuente de nitrôgeno pero siempre en presencia de una fuente de energia.

c.- Reducciôn a nitritos con reducciones sucesi- vas hasta la formaciôn de productos gaseosos, que por volatilizaciôn pasan a la atmôsfera.- Estos microorganismos utilizan los nitratos - como fuente de oxigeno.

Los dos primeros mecanismos no constituyen una verda- dera desnitrif icaciôn, ya que durante el proceso no se produce ninguna pérdida de nitrôgeno para el suelo, sino una transfor -maciôn del nitrôgeno de una forma inorgânica (nitrato) a otra orgânica (proteina) o inorgânica mâs reducida (nitrito o amonio).

Los microorganismos que utilizan los nitratos como fuente de oxigeno en su forma especial de respiraciôn son : Thiobacillus desnitrificans, muchas especies de Pseudomonas y ôcàsionalmehte Chromobacterium, Mycoplana, Serratia, Vibrio , Bacillus y Micrococcus.

La bioquimica del proceso ha sido estudiada por Campell y Lees (1967).

La desnitrificaciôn requiere : Presencia de nitrôgenot fen forma de nitratos o nitritos, ausencia de oxigeno, aporte de

sustancids donantes de electrones, temperatura elevada y pH - neutro.

36 -

IV.1.4. Fijaciôn del nitrôgeno por microorganismos del suelo libres.-

La capacidad de los nitroorganismos para fijar nitfo geno gaseoso ha sido estudiada hace muchos ahos a causa de su importancia potencial en la fertilidad del suelo. Es llevada a cabo por bacterias heterôtrofas de los géneros Azotobacter, Cl0£ tridium y Pseudomonas, bacterias fotosintetizantes como Rhodos- pirillum y por âlgas azules, algunos hongos y otras bacterias - como Methanobacillus.

Los dos géneros .principales son Azotobacter y Clos - tridium. El’ primero de ellos estâ constituldo por bacterias aerobias que oxidan los carbolidatos para obtener energia y fi - jan el nitrôgeno cuando crecen en el suelo o en medios deficien tes en compuestos nitrogenados. El género Clostridium estâ formado por bacterias anaerobias estrictas que fijan el nitrôgeno mâs lentamente que los Azotobacter.

IV.1.5. Fijaciôn simbiôntica del nitrôgeno.-

Es llevada a cabo fundamentalmente por las bacterias-del género Rhizobium que forman nudosidades radicales en su-----simbiosis con las plantas leguminosas. Existen, ademâs, otras familias de Angiospermas que forman nudosidades radiculares - producidas por células bacteriformes o actinomicetos capaces - de fijar nitrôgeno ( Becking y Bond, 1967).

La infecciôn de la planta por las bacterias comprende varias fases : Preinfecciôn de la raiz, infecciôn y producciôn de nôdulos, madurez del nôdulo y degeneraciôn del nôdulo.

La fijaciôn del nitrôgeno tiene lugar en los nôdulos y la cantidad de nitrôgeno fijado es proporcional al volumen - del ièjido infectado.

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IV.2. El ciclo del Carbono.-

El Carbono entra a formar parte fundamental de los constituyentes de la materia viva por lo que su ciclo tiene - una extraordinaria importancia en la Naturaleza y las distintas etapas que lo componen han sido muy estudiadas, aunque no totalmente descifradas, pudiendo resumirse en el siguiente esque ma :

•H Respiraciôno•HBacterias

fotosintéticas•H Plantas

verdes

COo atmosférico

Animalesherbivores

Microorgani smos

Animalescarnivores

Formaciôn de humus

Restes orgânicos cadâveres

De acuerdo con Alexander (1961) y Dommergues y Mangenot (1971) podriamos reducir estas etapas a cuatro fundamenta- les :

l.~ En la primera de ellas este elemento pasa a formar parte de compuestos orgânicos (hidratos de carbono, proteinas etc.) gracias a la fotosin- tesis llevada a cabo por las plantas o por bac terias. La fuente de energia procédé de la luz

» que es captada por sus pigmentos y gracias aella fijan el CO2 atmosférico para edificar sus

H

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propios compuestos orgânicos, pasando el carbono de esta manera a formar parte de sustancias organicas complejas. Por supuesto las réservas de COp atmosférico se agotarian sin la existencia de un proceso de mineralizaciôn que equilibrase a lo largo del ciclo la cantidad - de COp perdido en esta primera etapa.

2.- La segunda etapa estâ constituida por los consumidores. Existen unos consumidores primarios, los animales herbivores, que utilizan los vege-

,, tales como sustratos alimenticios y otros se -cundarios que se alimentan de los herbivores.En realidad, durante esta segunda etapa se pro duce solo una transformaciôn de los compuestos orgânicos en otros similares y con elle el carbono seguirâ siendo, en su mayor parte, consti- tuyente de moléculas complejas, si bien una - parte de él revertirâ a la atmôsfera en forma de COg por la respiraciôn y otra fracciôn que- darâ en el suelo formando residues orgânicos que, eïiminados por les animales, estarân en disposiciôn de ser subsiguientemente minerali- zados.

3.- Hay una tercera etapa muy importante en que - los vegetales devuelven al suelo una parte de su propio organismo : hojas, ramas, tallos, - frutos y toda la planta si son anuales o mueren Ademâs los animales con sus excrementos y ca - dâveres aumentan tambien el contenido en materia orgânica del suelo. Estas materia orgânica es entonces transformada a través de unas cade-' Anas trôficas que se van sucediendo y que estân

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reguladas por microorganismos heterôtrofos que van descoponiendo parcialmente la materia or - gânica, de manera que los productos formados en el primer ataque sirven como sustrato alimenti- cio a otros microorganismos que elaboran con - ellos compuestos utilisables por unos terceros y asi sucesivamente. Ciertas sustancias orgâ - nicas son descompuestas muy râpidamente y por un amplio nûmero de microorganismos, mientras que otras son mâs resistentes al ataque ( celu losa, pectina, lignina) y sôlo algunos microor ganismos son capaces de hacerlo.

4.- Hay finalmente algunos componentes de los res - tos vegetales o de los productos résultantes de

■ .. su descomposiciôn por microorganismos, que sonfijados por el propio suelo combinândose con - su fracciôn arcillosa y formando nuevos y es- tables complejos conocidos como âcidos hûmicos.

Dada la naturaleza de este trabajo, la etapa de es--te- ci elo—que ma s - -nos—i ntere s aba- con sirder arera-^ta^-e on trolada----por microorganismos en la descomposiciôn de restes orgânicos y cadâveres de animales y plantas, ya que esta se lleva a cabo en el suelo y los microorganismos responsables pueden resultar - afectados de alguna manera en su actividad por la acumulaciôn de productos tensoactivos. Como citamos anteriormente, algunos de - estos compuestos orgânicos son fâcilmente atacables por un sin - nûmero de microorganismos y entre ellos podriamos citar el almi- dôn, mientras que otros son mâs resistentes a la descomposiciôn como ocurre con la celulosa. Indudablemente estos dos compuestos, almidôn y celulosa, se acumulan en gran cantidad en el suelo.El primero procédé fundamentalmente de los hidratos de carbono ani maies y vegetales y la segunda es aportada sôlo por las plantas.

- 40 -

pero en cantidad tan elevada que su presencia en el suelo es - -permanente y hace imprescindible su degradaciôn.

El almidôn es un polisacârido formado por una mezcla en proporciones variables de amilosa y amilopectina. Su degradaciôn implica una hidrôlisis catalizada por enzimas que - rompen .los enlaces glucosidicos dando dextrinas y maltosa. Son muchos los microorganismos que producen amilasas : bacterias - grampositivas y gramnegativas, aerobias y anaerobias, hongos - filamentosos y actinomicetos, aunque varia su forma de ataque a la molécula. Muchos microorganismos no utilizan la molécula mâs que después de haber sido parcialmente fragmentada, mientras otros comoClos-xtridium la atacan de una manera compléta.Se ha comprobado que el almidôn es degradado mâs o menos râpidamente segûn su origen : el de arroz es atacado por muchos - microorganismos, mientras que el procedente de patatas y maiz es mâs resistente.

En cuanto a la celulosa es el mâs importante componente de la pared celular de los vegetales. Su ataque por -microorganismos celuloliticos es una de las etapas mejor estu - -diadas-del -ciclo -del—Garbono— por-los problemas- que-ha—planteado en la industria textil, fâbricas de papel etc. Es ademâs capitule importantisimo en la microbiologia del suelo, ya que masas ehormes de celulosa son incorporadas cada aho al suelo por la - vegetaciôn.

La celulosa es un poliholôsido formado por largascadenas de glucopiranosa unidas por enlaces beta 1 - 4 .

Organismos celuloliticos se encuentran entre las - bacterias, mohos, Protozoos, pero no entre algas y levaduras .No obstante en cada uno de estos grupos sôlo un nûmero muy res- tringido de ellos son realmente celuloliticos. De un modo ge - neral podemos decir que el ataque de los mohos es mâs râpido - que el de las bacterias.

- 42 - j

Dado que el uso de los detergentes de sintesis se ha extendido considerablemente durante los ultimos ahos y que - estas sustancias no son siempre degradadas tan râpidamente como seria de desear y por tanto ee acumulan en mayor o menor cantidad en las aguas y en el suelo, hemos considerado de interés la aportaciôn de nuevos datos al estudiô de las interacciones que se establecen entre estos productos y los microorganismos pre - sentes en el suelo, observândolas bajo una doble vertiente :

1.- Influencia de los detergentes sobre los microorganismos, dentro de la cual hemos hecho mayor hincapié en la influencia sobre algunos - procesos microbianos de los ciclos del nitrôgeno y del carbono ya que hemos encontrado - una laguna de informaciôn a este respecte en la bibliografia consultada y es évidente que una amplia fracciôn de la degradaciôn es llevada a cabo en el suelo, siendo tal acciôn una parte esencial de los ciclos de carbono, nitrôgeno y otros elementos. Ademâs, el suelo, como entidad

biolôgica, se debe al equilibria entre el medio

ÎN■b

ambiente y la coexistencia de los seres vivos , cuyos procesos metabôlicos son la base de su - riqueza en nutrientes; la alteraciôn de estos procesos por cualquier factor fisico o quimico puede romper el equilibria, desencadenândose - una serie de reacciones que pueden conducir - en ûltimo término a la destrucciôn del suelo en un determinado periodo de tiempo.

2.- Influencia de los microorganismos sobre los detergentes, ya que al ser estos productos molé-

» culas orgânicas pueden servir de sustrato a una

porciôn mâs o menos grande de la microflora.

- 43 -

Como productos a ensayar para este trabajo, hemos utilizado varios tensoactivos aniônicos y no ionîcos, por ser los mâs usados en la industria y por ello tambien los que - pueden acumularse en mayor cantidad en el suelo o en las aguas. No hemos incluido ningûn compuesto del grupo de los catiônicos por ser muy escaso su volumen de fabricaciôn, estando destina - dos principalmente a su uso como désinfectantes y germicidas . Tanto los aniônicos como los no iônicos ensayados lo han sido en forma de productos activos puros facilitados por los diversos laboratorios en que son sintetizados y donde los utilizan como base para la fabricaciôn de detergentes.

VI.- MATERIAL Y METODOS

■“ 4 5 *"

VI.1.- Productos tensoactivos.

VI.1.1.- Aniônicos ;

SODIO DODECIL SULFATO. Alquilsulfato primario, polvo bianco, soluble en agua, da positiva la reacciôn con azul de Metileno.

Fôrmula Quimica ^ 2^25 -O-SOgNa, con cadena alquil^ ca lineal unida a un anillo bencénico :

R —^ ^ SOgNa

« * FENOPON T 77. Alquilsulfonato, N - metil oleil tauri- da, fôrmula quimica R->C0-N-CH2-CH2*-S03Na

CH3

Polvo bianco, soluble en agua, produce espuma abundante, parcialmente soluble en alcohol por los sulfatos inorganicos, reacciôn con Azul de Metileno positiva y negativa con Azul de bromofenol.

DOBANE JNQ. Alquilbenceno sulfonato de cadena lineal fabricado por Shell Research Limited como base para detergentes.

/ = = v_F0rmula _qui mi ca __________ estando la longitud -R2

total de la cadena alquilica, Rq+R^, comprendida entre Ci 2 y 0^5. La sustituciôn del nûcleo bencénico nunca ocurre en posiciôn 1 - fenil.

DOBANE PT : Alquilbenceno suifonato, fabricado por los mismos laboratorios que el anterior, y de estructura muy pa~ recida, pero en este caso R-| y Rg estân ampliamente ramificados, y la longitud total R^+R2 es de cerca de 012. Es un derivado del tetrâmero del propileno.

HVI. 1. 2. No iônicos :

— 46 —

LISSAPQL SNXP. Condensado el nonilfenol ( de cadena nonil esencialmente lineal ) con unas 9 ’5 mol de 6xido de et^ leno

HOCHg-CHg- [ 0 - C H 2 - C H 2 ( CH2 >7-^3

Es un liquide viscoso, sin color o escasamente colorea do soluble en agua a 209C y algo menos en algunos disoventes de hidrocarburos aromaticos. Es fabricado por I.C.I. Ltd.

LISSAPQL PS 4 4 2 9. Condensado del dodecil alcohol con 9^5 mol aproximadamente de ôxido de etileno.

CH3-(CH2)iO-CH2-ojcH2-CH2-q^CH2-CH20HProducto semisôlido, sin color o de color crema, soluble a 202 c

en agua y en disolventes de hidrocarburos. Fabricado por I.C.I. Ltd.

VI.2. El lodo.

Las muestras de lodo utilizado en este trabajo han si - do recogidas del rio Manzanares a la altura del Km.2 aproximadamente de la carretera de El Pardo. Este punto fué escogido por - existir alii una salida de alcantarillado y hemos considerado que los microorganismos se hàllàn asi aclimatados eh uh cierto grado a la presencia de los productos tensoactivos, que, resul - tantes del consume en la ciudad, se vierten a las aguas residua les. Por otra parte hemos preferido, la utilizaciôn de lodo vir- gen y no de lodo active procédante de plantas de tratamiento de aguas ya que estimâmes que de esta forma nos acercamos mas a las condiciones naturales en que deben ocurrir las interacciones entres tensoactivos y microorganismos.

La recogida de muestras se hizo durante el mes de Ju- nio utilizando material estèrilizado y se conservaron después -

Aen frigorifico. r\ i\

- 47 -

VI. 3. Las estirpes bacterianas.

• Fueron aisladas de las muestras de lodo haciendo una serie de diluciones en medio salino estéril (9 gr, de ClNa en 1000 cc. de agua destilada ). De cada diluciôn se hicieron - siembras en plaça con medio de agar comun que se cultivaron en estufa a 28 2 c. Las colonias seleccionadas fueron sembradas en tubo de agar inclinado comprobando su pureza al microscopio, y conservandose por duplicado en camara fria. Todas ellas fueron sometidas a una serie de pruebas morfologicas, fisiolôgicas y bioquimicas para su clasificaciôn.

* A.- Pruebas morfolôgicas :

-Observaciôn en vivo, realizada a las 24 h. de cul_ tivo, en la que se anotô la forma, tamaho y mov_i

_ 3L cl sl — - — ■ — — - ■ — ■ -—-Tinciôn de Gram realizada a las 48 h. en las que se observa la forma y su posible variaciôn con - la edad, la coloraciôn Grampositiva o Gramnegati- va y el tamaho.-Tinciôn de esporas

tt

B.- Pruebas fisiolôgicas :

-En caldo comùn para observar el crecimiento, turbidez, formaciôn de pelicula, sedimento y produc- ciôn de pigmentes. '

-En agar nutritive para observar la forma de la co lonia,superficie, contorno, bordes, elevaciôn, - brille y pigmentaciôn.-En agar-Eosina-Azul de Metileno para los colifor - mes.

C.- Pruebas bioquimicas :

- 48 -

-Producciôn de indol en agua peptonada. -Utilizaciôn del ion citrato en medio de Koser. -Reducciôn de nitratos.-Fermentaciôn de azûcares.-Hidrôlisis de la gelatina.-Hidrôlisis del almidôn.-Cultivo en ’’Litmus milk”.-Producciôn de sulfuro de plomo.-Oxidasa.-Catalasa.

« Ùe acuerdo con los resultados de estas pruebas y - siguiendo el manual Bergey’s las estirpes aisladas fueron cl^ sificadas de la forma siguiente :

VI. 3.1. Estirpes Grampositivas. - - - -

Fam.BacillaceaeCélulas en forma de bastôn capaces de formar endosporas cilindricas, elipticas o esféricas y centrales , subterminales o terminales. Normalmente Grampositivas

Dentro de esta familia se han aislado cinco estirpes Grampositivas ;

Estirpe A 3 ------ Bacillus pumilusEstirpe M 1 0 1 ------ Bacillus s.p.Estirpe M 41 Bacillus pantothenicusEstirpe M 24 Bacillus pulvifaciensEstirpe C 2 Bacillus licheniformis

Fam. Brevibacteriaceae :Células sin endosporas, en forma de bastôn, movilidad

» * variable, pueden atacar carbohidratos y son Gramposi- - " ' tivas.

Estirpe M 21 ------ Brevibacterium erythrogenes

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Fam. Micrococcaceae :

•Células esféricas, aisladas, raramente môviles, no - producen gas de carbohidratos, muchas producer pigmen tos no solubles en agua.

Estirpe M 26 ------Micrococcus ureae

VI.3.2. Estirpes > Gramnegativas .

Fam. Bacillaceae .

Estirpe A2 ------ Bacillus laterosporusEstirpe M4--- — ■*--- Bacillus pasteuri

. Estirpe M?S --- Bacillus sphaericusEstirpe M 1 2 S ------ Bacillus s.p.Estirpe A4----- --- Bacillus brevis

- --.Fam. Achromobacteraceae

Pequehas células, movilidad variable, no fermentan lactosa.

Estirpe Cl ------ Alcaligenes fecalisEstirpe 61--------- Achromobacter parvulus

Fam. Pseudomonadaceae

Células alargadas, rectas, môviles, suelen formar pigmentos solubles que difunden al medio, muy aerobias.

Estirpe M22-------- Pseudomonas putida

Fam. Enterobacteriaceae

Células rectas, movilidad variable, atacan la glucosa, producen nitrites a partir de los nitratos, suelen - vivir en el intestine del hombre y animales.

Estirpe M23-------- Escherichia intermediaEstirpe M63 Escherichia freundii

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VI.4. Los aparatos

Estufa de cultivo en agitaciôn "Psycrotherm", New Brunswick Scientific Co.

- Incubadora Orbital Gallenkamps- Estufa de desecaciôn Elektro Helios- Equipo de filtraciôn Millipore con membranas de 0'45

y 0 ’ 8 /n de tipo AA- Espectrocolorimetro de la casa V.E.B. Karl Zeiss Jena- Balanza monoplato Sartorius, modelo 2442- pH - métro de. la casa L. Pusl de MunieAparato de destilaciôn "Rotavapor” Afora con cazo de aceite termostatizado de 50 a 2002 c.

- Espectrôgrafo de infrarrojos modelo 457 Perkin-Elmer- Agitador de tubos Mixo-Tub, Gri-Cel.

VI.5. Los medios de cultivo.

1.- Agua peptonada

Peptona bacteriolôgica .......... lOgr.Cloruro sôdico........................ 5gr.Agua destilada ...................... lOOOcc.

2.- Soluciôn salina de Winogradsky

Fosfato bipotâsico................... 5gr.Fosfato magnésico ................... 2’5gr.Cloruro sôdico....................... 2'5gr.Suif ato férrico...................... 0 ’05gr.Suifato de manganese ................ 0 ’05gr.Agua de grifo............ lOOOcc.

3.- Soluciôn de Oligoeleinentos.

Molibdato potâsico................... 0'05grBorato sôdico...................... 0'05gr.

4 4 ,Nitrate de cobalto................... 0'05gr.Sulfate de Cadmie ................... 0'05gr.

— 51 “Sulfato de cobre ..................... 0 ’05grSulf ato de Cine ....... :....... QÔ5 grSulf ato de manganese......... ......... 0'05grPercloruro de hierro................... una gotaAgua destilada ..................... lOOOcc

4.- Extracto de tierra.

Tierra de jardin de pH neutre .... 1kgAgua de grifo......................... 1 L.

La lyiezcla se somete al autoclave durante una hora a 1302 gr.C. Cuando la temperatura desciende a 1002C se deja escapar el vapor. Se filtra y reparte en - tubos y se vuelve a esterilizar.

5.- Medio para gérmenes amonificantes

Asparagina .......................... 0 ’2grSol.sa. Winogr 50 c.c.Sol. oligoelementos .............. .. 1 c.c.Agua destilada 950 c.c.

6 .- Medio para la investigaciôn de gérmenes nitrosos

Sulfate aménico...................... 0'5grCarbonate Câlcico ..... ............ IgrSol.sal. winogr.............. 50 c.c.Agua destilada ...................... 950 .cc.

7.- Medio para la investigaciôn de gérmenes nitricos

Nitrite sôdico ...................... IgrCarbonate câlcico ................... IgrSol.sal. Winogr 50 c.c.Agua destilada 950 c.c.

8. - Medio para gérmenes desnitrificantes

Nitrate potâsico .................... 2gr.Carbonate câlcico.................... 5gr.

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Glucosa ............ ......... lOgrSol.sal. Winogr............... 50 c.c.Sol. oligoelementos........... 1 c.c.Agua destilada............. 950 c.c.

9 .-Medio para fijadores aérobics.

Manitol ..................... lOgrCarbonate câlcico........... 0'5grSol. salina Winogr 50 c.c.Extracto de tierra 10 c.c.Sol. oligoelementos.......... 1 c.c.Agua destilada....... . . .c. s.p.X)00”c.c.

10.- Medio para amilolisis.

Nitrate amônico............ 1 gr.Almidôn de arroz........... l,5gr.Extracto de tierra 10 c.c.Sol. sal. Winogr 50 c.c.Sol. oligoelementos 1 c.c.Agua destilada........c.s.p 1000 c.c.

11.- Medio para celulolisis aerobia.

Nitrate amônico 1 grExtracto de tierra 20 gr.Sol.sal. Winogr 50 c.c.Sol. oligoelementos 1 c.c.Agua destilada c.s.p.1000 c.c.

12.- Medio para el cultivo en agitaciôn.

Cloruro Amônico 3 gr.Fosfato bipotâsico 1 gr.Sulfate Magnésico crist 0'25 gr.Cloruro Potâsico........... 0*25 gr.

" Sulfate Ferroso crist 0*002 grExtracto de Levadura....... 0*3 gr.Agua destilada . . .T ....... 1 Litre

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VI.6. Los reactivos.

1.- Reactivo de Nessler (investigaciôn del amonîaco)

Soluciôn A: loduro mercûrico 50grloduro potâsico .... 36*5grAgua dest...... c.s.p 1000 c.c.

2.- Reactivo de Griess-Ilosvay (investigaciôn de nitrit

Soluciôn A: Naftilamina ........ 0 ’05grAc, acético al 30%... 100 c.c.

Soluciôn B: Ac. sulfanilico ...... 0'8grAc. acético al 30%... 250 c.c.

3.- Pifenilamina (investigaciôn de nitratos y nitritos)

Difeni lamina 1 gr.Ac. sulfurico 100 c.c.Agua destilada... 20 c.c.

VI.7. Influencia de los tensoactivos sobre la microflora total de las muestras de lodo.

Se ha determinado de la siguiente forma :Se han inoculado 10 gr. de la muestra de lodo en un -

matraz con 100 c.c. de agua fisiolègica estéril sometiehdb suspensiôn a una agitaciôn de 30 min. A continuaciôn se han inoculado O'I c.c. de dicha suspensiôn en tubos con 10 c.c. de Agua peptonada preparados son las siguientes dosis de cada tensoactivo

10 ppm 50 ppm 100 ppm 500 ppm 1000 ppm 5000 ppm 1 0 .0 0 0 ppm tomando très tubos para cada concentraciôn, ademâs de très tu - bos control que sôlo contenian el medio de cultivo.

El estudio se ha hecho por turbidimetria, midiendo la densidad ôptica a 500 myw.. Los resultados son sôlo relativos, y - aun^ue los datos han sido comprobados por repeticiôn de la prueba nOi\tienen mâs que un valor comparativo que es interesante, sin - embargo,"ya que nos indica cuales de los tensoactivos utilizados son mâs bacteriostâticos y cuales son mejor tolerados.

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VI.8. Tolerancia de las estirpes bacterianas aisladas frente a distintas dosis de tensoactivos :

Se han preparado cultivos puros de cada germen con 24 horas de incubaciôn a 282 c. A partir de ellos se ha inoculado O’l c.c. en tubos con 10 c.c. de Agua peptonada. Se han utili - zado los tensoactivos Fenopon T 77 y Sodio Dodecil Sulfato en las dosis de 10 - 50 - 100 - 500 - 1000 - 5000 - 10 .0 0 0 p.p.m., tomando tres tubos de cada concentraciôn y très tubos de con - trol.

El crecimiento se ha determinado por turbidimetria , midiendo la densidad ôptica a 50 0vYyx.. Lo mismo que en el caso anterior, los resultados sôlo tienen un valor comparativo que nos indica que tipo de bacterias resisten mejor la presencia de los tensoactivos.

VI.9. Influencia sobre algunos de los procesos del Ciclo del Nitrôgeno : .-

VI.9.1.- Procesos de Mineralizaciôn :l) Amonificaciôn.- Se basa en la investigaciôn del

amonîaco con el reactivo de Nessler en un medio llquido salino que contiene asparagina.________________________________________

Una vez preparado el medio para Amonificantes (5) se ha repartido en tubos con 10 cc cada uno y después de estirili- zado se ha sembrado 1 cc se suspensiôn-diluciôn de lodo por tubo, tomando tres tubos por diluciôn de la 10” a la lO”^^. En los casos en que el n 2 de amonificantes es muy elevado se ha tornado hasta la diluciôn 10 Las dosis de tensoactivos utiliza - das han si do de 100, 1000 y 10.000 p.p.m. La incubaciôn se ha reali zado a 282 c durante 15 dias y las lecturas se han hecho los dIas 1-23-4-5-7-9-12 y 15 echando dos gotas del reactivo - en^ " ubos que contenian respectivamente 1 cc. de cada diluciôn extraido estérilmente con pipeta Pasteur de los tubos de cultivo.

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Después del 15^ dia se ha determinado el ns de gérmenes amonificantes por gramo de lodo segûn las tablas de Mc.Crady. Se ha estimado la actividad biolôgica trazando las curvas de - amonificacién en funciôn de las diluciones médias ( nô de tubos con reacciôn positiva / ns de tubos tomados para cada diluciôn) ÿ del tiempo.

2) Nitrificaciôn.- (O. Coppier y H. de Barjac) Se basa en la investigaciôn de los g'ermenes nitrosos y de los nitricos en medios liquidos selectivos. En el primer caso, gérmenes nitrosos, se ha lefdo, después de la incubaciôn, la diluciôn - limite que contenia nitritos con la difenilamina sulfûrica. En el seguhdo caso, gérmenes nitricos, la diluciôn limite que contenia nitratos con la difenilamina sulfûrica, después de eliminar los nitritos con urea.

Los medios ( 6 y 7) se han repartido en tubos de he -molisis a razôn de Icc. por tubo y se han sembrado 0*5 cc. desuspensiôn-diluciôn de lodo por tubo, tomando 5 tubos / dilu- ciôn de la 10 a la 10 . Se han incubado a 2820 durante 30 -dias y las lecturas se han hecho los dias 10,20 y 30. Se ha -determinado el numéro de gérmenes nitrificantes / gr. de lodo con~reTacrôir‘ la's~t^bl:ers “de'" Mc7~üra'dy;---------------------------

"VI.9.2. Procesos de Desnitrificaciôn (H. de Barjac.)

Se basa en la investigaciôn de la desapariciôn de los nitratos contenidos y de los nitritos formados en un medio li- quido sembrado con una suspensiôn-diluciôn de la muestra de lodo. Para la desapariciôn de los nitratos se han hecho las lec - turas con la difenilamina sulfûrica después de haber eliminado los nitritos con urea. La desapariciôn de los nitritos se ha - investigado con el reactivo Griess-Ilosvay. El medio (8 ) se ha repartido en tubos a razôn de lOcc. por tubo y se ha sembrado Icc. de suspensiôn-diluciôn por tubo tomando 3 tubos por diluciôn de la 10 ^a la 10 ^^ o la 10 ^ S e ha incubado a 2820.- durante 15 dias y las lecturas se han hecho los dias 1-2-3-4-5

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7-9-12 y 15 sacando estérilmente unas gotas de cultivo a un tubo de hemélisis. Se han establecido las curvas de actividad biolôgica y se ha calculado el nûmero de gérmenes desnitrificantes/gr de lodo con arreglo a las tablas de Me. Crady.

VI.9.3. Fijaciôn aerobia del nitrôgeno molecular. ( T.Tchan)

Seibasa en la apreciaciôn de un cultivo de Azotobacterpor apariciôn de un velo desarrollado sobre un medio llquido -que no contiene Nitrôgeno combinado, después de la siembra consuspensi ones-diluci one s de lodo.

Una vez preparado el medio ( 9) se ha repartido en -tubos a razôn de 5cc. en cada tubo y después de esterilizado,se ha sembrado Icc. de suspensiôn-diluciôn de lodo por tubo, -tomando 5 tubos por diluciôn de la 10 a la 10 en los contro-

—1 —6les y de 10 a 10 en los tubos con tensoactivo, siendo las -dosis utilizadas de 100, 1000 y 10.000 ppm. Los cultivos se --han incubado a 2820 durante 15 dias y las lecturas se han he -cho los dias 7 y 15. Se ha determinado el n 2 de gérmenes fijadores por gr. de lodo de acuerdo con las tablas de Me. Crady.

VI.10.- Influencia sobre algunos aspectos del ciclo del CarbonO

VI.10.1.- Amilolisis.- Se investiga la desapariciôn del almidôn con el lugol en un medio llquido sembrado con sus- pensiones -diluciones de lodo. El medio (lO) se ha repartido - en tubos a razôn de lOcc. por tubo y se ha sembrado 1 cc. de suspensiôn-diluciôn por tubo tomando tres tubos por diluciôn de la 10 a la 10 Se han utilizado las dosis de 100, 1000 y 10.000 p.p.m. de tensoactivos. Se ha incubado a 2820. durante quince dias y las lecturas se han hecho 1-2-3-4-5-7-9-12 y 15 sacando estérilmente unas gotas de cultivo de cada tubo aun tubo de hemôlisis. Se han establecido las curvas de activi-

f fdad amilolltica y se ha determinado el n 2 de gérmenes amilollticos / gr. de lodo con arreglo a las tablas de Mc.Orady.

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VI.10.2. Celulolisis aerobia.-

Se détermina la presencia de gérmenes celulolîticos por apariciôn de estos sobre un papel de filtro dispuesto en- medio llquido.El medio (il) se ha repartido en tubos a razôn de 8cc. de largo por tubo poniendo en cada uno una tira de - papel de filtro de 7 ce. de largo por 1 cm. de ancho y se ha sembrado 1 cc de suspensiôn-diluciôn por tubo tomando tres tu bos por diluciôn de la 10 a la 10 Se ha incubado a 282C durante 15 dias al cabo de los cuales se ha observado la posible apariciôn de gérmenes celulollticos aerobios por gramo de lodo con arreglo a las tablas de Me. Crady.

VI11.- Cultivos en agitaciôn y obtenciôn de muestras para espectroscopla de infrarrojos.

El proceso de cultivo seguido para la obtenciôn de - muestras para anâlisis con el espectrôgrafo de infrarrojos, - esta basado en el método para la determinaciôn de la biodegradabilidad de los productos y preparaciones de tensoactivos del grupo de los alquilaril sulfonatos utilizado en el Laboratorio Central de Aduanas y publicado en el B.C. del E. el 3 de marzo -de-1969-:----------------:_____________ ___________________________________

Se han preparado una serie de matraces erlenmeyer de 2 1. conteniendo ll.de medio basai (12) a los que se ahade una cantidad de tensoactivo suficiente para obtener una concentra - ciôn de 30 mg/l y 10 ml de medio de cultivo (lodo). Se han co - locado estos matraces en una mâquina agitadora a 125 carreras - por minuto, manteniendo la temperatura a 25^0 durante 72 horas, transcurridas las cuales se preparô otra serie de matraces de - 2,1.con 11 de medio basai en los que se anadiô 10ml. de soluciôn tomada del anterior erlenmeyer de ensayo, correspondiente a - cada uno, y 30 mg/l del tensoactivo correspondiente. Esta se -

- 58 -

gunda serie.de matraces se mantuvo bajo las mismas condiciones de agitaciôn y temperatura durante otras 72 horas con lo que - finaliza’el periodo de adaptaciôn. Al término de este periodo se preparô un nûmero igual de matraces con la misma cantidad de medio basai (1 1 ) ahadiendo las mismas cantidades y en igual forma que para el segundo periodo de 72 horas. Estos erlenmeyer se mantuvieron en las mismas condiciones de cultivo - citadas durante ocho dias.

Para seguir el curso de la biodegradaciôn se tomaron muestras de todos los matraces en los siguientes momentos ;

^- 1 hora después de estarse agitando los cultivos correspondientes a las primeras 72 horas del perio do de adaptaciôn.

- 1 horas despueô de estarse agitando los cultivos - correspondientes a las segundas 72 horas del periodo de adaptaciôn.

- 1 hora después de estarse agitando los cultivos - correspondientes al ensayo de ocho dias.

- El dia 1 del ensayo de ocho dias, a las 24 horas de tomar la muestra anterior.

- El dia”7T^ 1 "- El dia 8.El volumen de muestra tornado ha sido de 100 cc. en -

todos los casos.Una vez extraidas las muestras se procediô a filtrar-

las por membranas Millipore tipo AA de 0'8/ . primero y 0*45/4- después. Luego de filtrar, se ha extraido el tensoactivo contenido en la muestra con cloroformo grado reactivo de la casa - Carlo Erba en embudos de decantaciôn, repitiendo varias veces - la extracciôn. El resultado de estas extracciones se destilô - en Un aparato rotavapor conectado a una bomba de vacio para latv„ r-,evaporaciôn del cloroformo hasta que el residuo de tensoactivo

- 59 -

quedaba totalmente seco. Estas muestras fueron analizadas en el espectroscopio de infrarrojos.

VI.12.- Espectroscopla infrarroja:

Para realizar los espectros se utiliza, en el caso de las muestras liquidas, una célula semipermanente de Cl Na de O'1 mm de espesor, de la casa Beckman. Para su limpieza se emplea tetracloruro de carbono, evaporandose después con una- bomba de vacio.

En el caso de muestras sôlidas, se realizan en com- primidos de Br K en proporciôn de 1 mg aproximadamente demuestra pbr 300 mg. de Br K, y en el haz de compensaciôn se -pone otra muestra de Br K solo. (Br K especial para espectros copia de infrarrojos Urasol de la casa Merck).

La zona espectral barrida ha sido para muestra ll -guidas de 4000 a 625 cm ** , limite impuesto por la propia célu la de Cl Na. Para las muestras sôlidas la zona de barrido ha sido de 4000 a 250 cm ^ .

VII. ESQUEMA DEL TRABAJO PROPUESTO

— 61 —

Con objeto de proporcionar una idea de conjunto del trabajo realizado, antes de pasar a la exposicion de resultados, se"da un esquema de las distintas etapas realizadas :

12.- Acciôn de los tensoactivos sobre las bacterias:

A.- Influencia de la concentraciôn de los distintos tensoactivos utilizados sobre la - microflora total de las muestras de lodo.

I.- Influencia sobre el crecimiento.II.- Influencia sobre las propiedades mor

' folôgicas y de tinciôn.

B.- Influencia de la concentraciôn de Fenopon T 77 y Sodio Dodecil Sulfato sobre bacterias- aisladas de las muestras de lodo.

I.- Influencia sobre el crecimiento.II.- Influencia sobre propiedades morfolô

gicas y de tinciôn.

C.- Influencia de la concentraciôn de los dis - tintos tensoactivos sobre algunos procesos deT”CTcT6“~dël NitrÔgenbl,

I .- AmonificaciônII.- NitrificaciônIII- DesnitrificaciônIV.- Fijaciôn libre aerobia del nitrôgeno

atmosférico.

D.- Influencia de la concentraciôn de los distin tos tensoactivos sobre algunos aspectos del Ciclo del Carbono.

I.- Amilolisisf-: U II- Celulolisis aerobia

- 62 -

22.- Acciôn de la microflora del lodo sobre los tensoactivos :

- Anâlisis por espectroscopia de infrarrojos - de muestras tomadas en diferentes periodos de cultivos en agitaciôn.

VIII.- EXPOSICION E INTERPRETACION DE RESULTADOS

— 64 —

VIII.1.- Influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre la microflora total de las - muestras de lodo.

Se ha determinado midiendo la densidad ôptica de - cultivos con distintas dosis de cada producto, segûs se descri^ be en el Capitule de Material y Métodos en el apartado 7. Losresultados se expresan en las tablas I, II, III, IV, V, y VI yen las figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7.

A las 24 y 48 horas de incubaciôn se hicieron preparaciones microscôpicas de cada uno de los cultivos para su observaciôn,en vivo, tinciôn de Gram y producciôn de esporas. - Los cultivos control presentaban gran densidad de bacterias con formas cocâceas (estreptococos y micrococos preferentemente) y formas bacilares en su mayoria môviles, con mâs abundancia de - bacilos gramnegativos y esporulaciôn notable.

En los cultivos con tensoactivos, en la dosis inferior no cambiô esencialmente el aspecto de las bacterias, salvo en - lo que se refiere a que no aparecian formas môviles, y que la - densidad de células era menor. En general, en dosis de 1000 -p.p.m. sôlo algunos cultivos conservaban formas esporuladas ,mi entras en la mayoria no aparecian esporas. Lâ'"bbïôrâc iôhTlië^' las bacterias era mucho mâs ténue, y las formas bacilares apa - recian mucho mâs finas que en el control y algunas con aspecto retorcido. En dosis superiores, todas las bacterias aparecen - gramnegativas, escasamente tehidas y con una considerable dis - minuciôn de tamaho respecto al control; en estos cultivos no - aparecen esporas.

— 6 5 —

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Fig.l,- Influoncia dal Fancpon T 77 an el crecimiento de la microflora do una muestra da lodo, .

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Fig.2,- Influencia del Sodio Dodecil Sulfato en el crecimiento do la microflo:de una muestra de lodo.

- 67 -

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Fig.3,- Influencia del Dobans PT an el crecin'iento de la microflora da uno muast de lodo.

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Fig. 4.- Influencia del Dobano ÜNQ en el crecimiento de la microflora ds unamuestra de lodo.

— 69 —

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Fig, 5.- Influancia dsl Lissapcl 5NXP en si crecinisnto de la microflora de u n a (nuestra de lodo. - - - —

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1 3 11 12 dias

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muestra de lodo*

~ 71

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Fig, ?,- Influancia ds los distintos tansoactivos en concentracidn de 10 ppm Eohre el crecimiantc de la micrdflora de una muestra de lodo.

ÎS

- 75 -

Interpretaciôn de resultados.

De los resultados obtenidos en la influencia de la con- centraciôn de tensoactivos sobre la densidad celular de cultives de la microflora total de las muestras de lodo, observâmes, queen ggneral, son toleradas incluse las dosis mas elevadas, aunque se aprecia una reducciôn en los valores de la densidad optica con respecte a los contrôles que es del orden de un 70% en dosis de - 10.000 ppm. de Fenopon T 77, 75% en la misma dosis de Lissapol SN XP, 80% con Lissapol DS 4429 y 85% con Sodio Dodecil Sulfate.En - los cultives Dobane JNQ, se produce una disminuciôn de la densidad optica entre 75 - 80% en .dosis de 10, 1000 y 10.000 ppm. mientras que la dosis de 100 ppm. parece ser mas favorable, ya que la tur - bidez de los cultives aumenta y nos da valores sôlo un 40% infe - riores al control. Algo similar ocurre para Dobane PT en el que - hay una reducciôn mas sensible,del 40 al 50% en las dosis entre - 10 y 1000 ppm., mientras que en dosis mas altas la densidad opti - ca es incluse superior a la del control en los primeros dias para disminuir luego hasta ser solo un 30% inferior a la del control en los cultives con 10.000 ppm.

Las curvas trazadas tomando la densidad optica frente adias de cultive presentan diferente aspecto segûn los distintos - tensoactivos, si bien es comûn a todas ellas la disminuciôn de los valores de turbidez en el trame final con respecte al control,y - casi siempre en relaciôn directa con la dosis de tensoactivo uti- lizada. En las correspondientes a los cultives con Fenopon T 77 - se observa que en general siguen un curso muy parecido a la del - control, lo mismo que para los cultives con 10 a 1000 ppm. de Sodio Dodecil Sulfate, mientras que las dosis de 50, 5000 y 10.000 ppm. de este ultime tensoactivo muestran un période de adaptaciôn muchos. mas largo. En los cultives con Dobane PT las curvas muestran un curso parecido a la curva control dentro de las primeras 48 ho-

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ras, si bien, como ya hemos advertido anteriormente, las dosis de 50, 5000 y 10.000 ppm. alcanzan valores muy altos dentro de este- perlodo, con un tiempo de adaptaciôn mas corto quizâs debido a la râpida proliferaciôn de algûn grupo de microorganismos mejor dota- dos para tolerar la presencia del tensoactivo. A partir de las 48 horas los valores de turbidez permanecen casi estacionarios en la mayoria de las dosis mientras que en el control estos valores siguen un curso ascendente hasta el 112 dia. Para Dobane JNQ ocurre algo parecido, y en la mayoria de las dosis las curvas entran muy pronto en una fase estacionaria. Solo los cultivos con 100 ppm. - tienen un eriodo de adaptaciôn mâs largo pero luego alcanzan valores superiores al resto de las dosis y, con ligeras fluctuacio- nes siguen un curso ascendente hasta casi el final de la curva.

Respecte a los dos Lissapol utilizados se observa que - tienen un efecto similar, produciendo en todas las dosis un retraso bastante marcado en la primera parte de las curvas, es decir - que, en comparaciôn con el control existe un periodo de adapta - ciôn o de latencia bastante mas amplio que es igual para todas — las concentraciones de estos dos tensoactivos. Después, el resto- de las curvas es ya de curso parecido a las del control.____

Por otra parte, tanto en los dos tipos de Dobane como - en los dos de Lissapol, se observa que tienen una acciôn muy mar-cada ya en la dosis minima de 10 ppm, haciendo disminuir la den -sidad celular de los cultivos en proporciôn muy superior al efecto causado por la misma dosis de Fenopon o de Sodio Dodecil Sulfate.

En cuanto a la observaciôn microscôpica de estos cultivos, como ya hemos citado en la exposiciôn de resultados, se hannotado alteraciones como son pérdida de grampositividad y en ge - f fneral,de la capacidad para fijar el colorante, inhibiciôn de la -

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esporulaciôn y pérdida de la movilidad. En la bibliografia con - sultada hemos encontrado algunos datos cuya exposiciôn creemos — interesante ya que pueden estar relacionados con las observacio - nés hechas por nosotros, asi , ya en 1942 Lominsky encontrô que - los jabones y tensoactivos conseguian inhibidor de la movilidad - de algunas especies de Proteus por desapariciôn de sus caracte risticos flagelos sin afectar a sus propiedades de crecimiento.— Kopp (1965) niostrô en estudios realizados con Proteus mirabilis - que los alquilsufâtos lineales primarios inhibian la movilidad - con mayor efectividad cuanto mayor era la longitud de la cadena - carbonada, pero no estableciô si este era el resultado de un ataque directe sobre los flagelos o de una inhibiciôn de la formaciônde flagelos. Este mismo investigador observô tambien que el SodioDodecil Sulfato a nivel de 100 - 1000 ppm. puede causar una consi -derable ruptura o parcial desintegraciôn de los flagelos de otrasespecies bacterianas y Bishop (1967) viô que a 1000 - 2500 ppm - Sodio Dodecil Sulfato puede solubilizar parte de la proteina de - las membranas citoplâsmicas aisladas de Bacillus subtilis.

La mayoria de los autores consultados coinciden en que la acciôn que ejercen los tensoactivos sobre los microorganismosradica en su reactividad hacia las proteinas, a menudo réversibles.

Segûn Swisher (1970) las reacciones proteinas-tensoactivo pueden ocurrir con proteinas vitales de las células bacterianas — intactas y tambien ciertamente ocurren con proteinas purificadas - en soluciôn acuosa. Algunos de los radicales R de las cadenas pro- teicas llevan grupos carboxilicos âcidos libres, y, otros, llevan grupos amino u otros grupos bâsico libre. Las atracciones y repul- siones entre estos juegan importante papel en la determinaciôn de la configuraciôn de la molécula proteica en soluciôn, pero ademâssuministran puntos focales para la interacciôn con las moléculas-

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de tensoactivo y asi los grupos amino cargados positivamente atraen los.iones cargados negativamente de los tensoactivos aniô nicos, lo mismo que los grupos carboxilato atraen a los iones con carga positiva de los catiônicos. Existen numerosos trabajos rela tivos a la acciôn de tensoactivos, sobre todo Sodio Dodecil Sulfato o ciertos Alquilbencenosulfonatos dentro de los aniônicos, sobre diverses tipos de proteinas, y entre ellos citaremos los de - Ray (1966) Decker (1967) y Reynolds (1967) sobre seroâlbûminas y los de Cheesman (1968) sobre caseina y Pitt-Rivers (1968) sobre- 14 proteinas diferentes.

Tambien pueden entrar en juego otras atracciones capa. - ces de actuar sobre los très tipos de tensoactivos, aniônicos,catiônicos y no iônicos. Ray y Decker afirman que las fuerzas iôni- cas tienen sôlo un significado minimo en la formaciôn de comple - jos proteinas-tensoactivos y que juegan un papel mucho mas importante las interacciones hidrofôbicas actuando de forma similar a las responsables de la formaciôn de micelas en simples soluciones acuosas de tensoactivos. Segûn esto, los no iônicos formarian - complejos con las proteinas casi tan facilmente como los hacen los -iônicÆ)S^— Exi sten—todaviagjocos -trabajos ,- pero-aûn-asi - se - van acu— mulando evidencias de tal interacciôn como se deduce de los experiment os de Dowben (1961) con OPE^o sobre albûminas plasmâticas— bovinas, Imanishi (1965) con Nonilfenol E20, Cowgill (1968) con - Tween 80 y Cheeseman (1968) con GPEIQ sobre caseina.

Las interacciones tensoactivo-proteina pueden tener distintos resultados : Una proteina disuélta puede ser precipitada y una insoluble puede resultar disuelta. Las proteinas complejas - pueden ser disociadas en subunidades igual que una proteina sim -pie puede ser desenrrollada o cambiada de configuraciôn si las valencias secundarias saturadas de la proteina son desplazadas poi el tensoactivo. Bajo circunstancias apropiadas por ejemplo por di-

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fusiôn a través de una membrana permeable al tensoactivo y no a la proteina, ambos pueden ser separados y en algunos casos la proteina original es recobrada Intacta mientras que en otros puede — haber sufrido un cambio irreversible.

A la vista de esta serie de datos expuestos, no debe - sorprendernos el hecho de que los flagelos bacterianos resulten - afectados por la presencia de tensoactivos y con ello resuite su - primida la movilidad, si tenemos en cuenta que estos orgânulos son estructuras de origen ditoplâsmico que se componen en general casiexclusivamente de una proteina fibrosa a la que se ha denominado -flagelina. Sin embargo, en-ningûn caso se trata de alteraciones -irréversibles ya que al trasladarlos a medio de cultivo sin ten -soactivos, los microorganismos recuperan su movimiento caracteris- tico.

Respecto a las variaciones observadas en la tinciôn por el método de Gram creemos que podrian obedecer a cambios en la per meabilidad de las paredes bacterianas sometidas a la acciôn de los tensoactivos ya que la mayor parte de los trabajos sugieren que es en este factor de permeabilidad donde radica el fundamento de la - coloraciôn. Segûn Bartholomew y Mittner, las células grampositivas

negativas. absorben el colorante primario aproximadamente enigual cantidad como consecuencia de una uniôn iônica entre los grupos bûsicos del colorante y los grupos âcidos de la célula, El iodo en soluciôn acuosa pénétra en los dos tipos de células y forma un precipitado con el colorante que se encuentra alli présente, bie desplazândolo de las proteinas, bien combinândose con él Vin situ". En las células grampositivas el alcohol pénétra dificilmente ya que probablemente détermina una disminuciôn del tamaho de los poros del glucopéptido de la pared, la disoluciôn del complejo colorante - io do es lenta y su eliminaciôn aûn mâs lenta, de forma que la mayor - parte .île el queda en la célula, que guarda asi su coloraciôn. Las -

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bacterias gramnegativas contienen mucho menor proporciôn de glucopéptido y éste esta menos entrecruzado dejando poros que quedan lo suficientemente amplios aûn después del tratamiento con etanol como para que este pénétré facilmente y disuelva el complejo coloran te-iodo eliminândolo y dejando la célula incolora.

Existen numerosos trabajos que han tratado de los factores susceptibles de retirar a las bacterias su carâcter grampositi^ vOf Segûn Lambin y Germain (1969), Webb demostrô que la lisozima - produce una variaciôn hacia la gramnegatividad al eliminar de las células los polisacâridos y âcidos ribonucleidos. El tratamiento - con eter caliente tiene igual resultado al arrastrar un lipoide. - Henry y Stacey exponiendo Welchia perfringens a la acciôn de la b^ lis al 2% a 602C obtuvieron ese mismo cambio de colorabilidad con pérdida por la célula de ribonucleato de magnesio, polisacâridos y algo de proteina. La eliminaciôn de estas sustancias como lipopro- teinas, mucopolosacâridos o ribonucleato de magnesio aumenta la - permeabilidad de la célula que pierde su coloraciôn de Gram bajo - la acciôn del alcohol igual que una célula gramnegativa.

No hemos encontrado en la bibliografia ninguna referenda respecto a la influencia de los tensoactivos en la formaciôn de - esporas por las bacterias. Durante los ûltimos ahos se ha venido- • acumulando informaciôn sobre la arquitectura molecular de la endo_s pora bacteriana cuyas cubiertas estân constituidas principalmente de proteinas con mayor proporciôn de Cisteina que en las células - vegetativas, y menor cantidad de lipidos y glucopéptido. El proto- plasto contiene ADN, ARN y proporciôn elevada de âcido dipicolini- co, ausente en las formas vegetativas, en forma de sal calcica.En cuanto a las reacciones metabôlicas que se suceden durante la - esporulaciôn, se sabe que ciertos componentes se sintetizan a partir de depôsitos intracelulares de compuestos de bajo peso mole - cular, entre ellos aminoâcidos y nucleôtidos pûricos y pirimidi - nicos. Ademâs parece que algunas proteinas se obtienen directa -

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mente a expensas de la célula vegetativa, y que el âcido dipico- linico se forma a partir del âcido diaminopimélico de la pared - bacteriana’.

El hecho de que hayamos encontrado una ausencia de - esporulaciôn en los cultivos en presencia de ciertas dosis de - tensoactivos podria obedecer a la interacciôn de estos compuestos con las proteinas estructurales de las esporas, aunque por otra - parte podria ser una de las consecuencias de la alteraciôn de la membrana plasmâtica ya que numerosos autores consideran a los de tergentes de s'intesis como sustancias que desintegran la membrana y alteran su estructurâ fisicoquimica causando una desorgani - zaciôn general en el funcionamiento celular (Stanier, Doudoroff,- Adelberg, 1965. Rose 1968).

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VIII.2.- Tolerancia de las estirpes bacterianas aisladas frente a distintas dosis de Fenopon T 77 y Sodio Dodecil Sulfato. -

Todas las estirpes se han cultivado segûn el método descri to en el apartado 8 del Capitule de Material y Métodos, midien- dose la. densidad optica a 500 mm. Los resultados se expresan en - las tablas VII a XL y en las figuras 8 a 41.

A las 24 y 48 horas de incubacion se hicieron prépara - clones para la observaciôn al microscopic. Como resultado de estas observaciones podemos decir que en general se produce una pérdida de la movilidad desde las dosis mâs pequehas de tensoactivo, reduc ciôn del tamaho de las células en comparaciôn con los contrôles, - siendo frecuente el encontrar formas redondeadas que parecen pro - toplastos o esferoplastos a partir de dosis mâs altas, 1000-5000 ppm. salvo Bacillus licljeniformis en que aparecen ya en dosis de - 10 ppm. de Sodio Dodecil Sulfato. No hemos encontrado esporas en - los cultivos de Bacillus con dosis de 500 a 1000 ppm. y superiores, Por otra parte, se notô una disminuciôn de la coloraciôn adquirida por las bacterias después de la tinciôn de Gram, mâs aparente en - las dosis mâs elevadas, que aparecian apenas tehidas. Las bacte - rias gram positivas, en dosis superiores a 500 ô 1000 ppm. apare - cen como gram negativas con una coloraciôn muy débil.

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- 89 -

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Fig. 12.- Influsncia dsl Fenopon T 77 en el crecimiento de B. pantothsnicus (f-Al

- 91 -

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Fig. 13.- Influencia del Sodio Dodecil Sulfato en el crecimiento do Bo pantoth: eus (ni 4l).

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Fig.22*- Influoncia del Fenopon T77 cn el crecimiento do B. laterocporus (A 2)

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Fig.23.- Influencia del Sodio Dodecil Sulfato on el crecimiento de B. latercepa:

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Fig, 36.- Influencia del Fenopon T 77 an el crecimiento do Ps. putida (M22)

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Fig* 41.- Influencia dal Sodio Dodecil Sulfato an ol crecimiento de F, freundii (W63)

- 136 -

Interpretaci6n de resv.ltados.•— ■ — ■

En iGS resultados obtenidos de la influencia de dos - tensoactivos aniônicos, Fenopon T 77 y Sodio Dodecil Sulfato, sobre una serie de estirpes bacterianas aisladas del lodo nos encontramos con algunos casos en que existe una reducciôn progresiva de la densidad celular de los cultives a medida que se aumenta la do sis del producto ensayado, otras estirpes para las que aûn las dosis mâs bajas muetran una acciôn bacteriôstâtica y por ultimo al - gunos casos en que a determinadas concentraciones parece fabore - cerse el crecimiento.

Fenopon T 77 ejerce una influencia negativa muy - patente al rebajar progresivamente la densidad ôptica de los cül - tivos de Bacillus pumilus (estirpe A3), B.pantothenicus (estirpe M4l), B.licheniformis (estirpe C2), B. laterosporus (estirpe A2), Alcaligenes fecalis (estirpe Cl), Pseudomonas putida (estirpe M22) Escherichia intermedia (estirpe M23) y Escherichia freundii ( e s tirpe M63).

El mismo efecto se observa para Sodio Docecil Sulfato en los cultivos de B.licheniformis (C.2), B.Brevis (A4), Alcali - genes fecalis (Cl), Escherichia intermedia (M23), y Escherichia - freundii (Mô3).

Fenopon T 77 se muestra como un agente bacteriostâtico a concentraciôn de 10 ppm en los cultivos de Bacillus s.p. (estirpe MlOl), B.pulvifaciens (M24), Brevibacterum erythrôgenes (M2l) - Bacillus pasteurii (M4), Bacillus èsphaericus (M7S) y Bacillus s.p. (M12S) como de igual forma lo es el Sodio Dodecil Sulfato en la - misma dosis para los cultivos de Brevibacterium erythrogenes (M21) Bacillus pasteurii (M4), Bacillus esphaericus (M7S) y Bacillus s.p. (M12S), en dosis de 50ppm. para Bacillus s.p. (MlOl), Bacillus panthotenicus (M4l) y Bacillus pulvifaciens (M24 y en 100 ppm. para Bacillus pumilus (A3). Ambos tensoactivos,en concentraciones - superiores a las citadas mostraron una acciôn bactericida para estas estirpes, de forma que no sôlo impedian su desarrollo sino, que

- 137 -

ademâs, al inocular muestras de estes cultivos en un medio nutritive comûn desprovisto de tensoactivo, no se obtuvo crecimiento - en ningûn case.

Por ultimo, hemos encontrado, en alguna ocasiôn y a - determinadas concentraciones, se obtienen valores de densidad celular muy superiores a los dados por el control, como ocurre con Microcôccus ureae (M62) cuyo crecimiento résulta favorecido con - la casi totalidad de las dosis de Fenopon T 77 y con 50ppm. de Sodio Dodecil Sulfato y Pseudomonas putida (M22) en que las dosis - bajas y altas determinan disminuciôn del valor de la densidad ôptica, mientras que en las dosis médias 500 y 1000 ppm. este valor es notablemente mas alto que en el control. Sin embargo, la veloci dad de multiplicaciôn durante las primeras 24-48 horas es inferior a la de los tubos control, lo que podria interpretarse sobre la base de que cuando se introduce en la nu tri ci ôn bacteriana una sustancia extraha como fuente de carbono, no se produce un ataque inmediato a la molécula y se detiene la proliferaciôn celular hasta que, después de un eierto période de tiempo, la molécula pue de comenzar a ser atacada reproduciéndose las bacterias.

Vemos pues, que en la mayor parte de los casos el efec tb de estes dos tensoactivos sobre les cultivo's" bacbériahôs es ünà disminuciôn de la densidad celular, es decir, que inhiben en mayor o mener grade el crecimiento. Stanier, Doudoroff y AdeIberg (196 5) consideran a las sustancias tensoactivas, como los jabones, detergentes sintétidos y compuestos fenôlicos, como ejemplo de agentes bactericidas y bacteridstatices cuyos efectos tôxicos se atribu - yen a su acciôn quimica sobre las estructuras celulares, especialmente sobre la membrana celular en cuyos componentes, principal - mente proteinas y lipides se disuelven o se combinan quimicamente con ellos y en consecuencia modifican la superficie de la celula y alteran sus funciones esenciales. La membrana celular no solo préserva la integridad de la célula previniendo la salida de los componentes citoplâsmicos al medio, sino que interviene en el trans

— 138 —

porte activo de los nutrientes hacia su interior. Por consiguiente cualquier agente qufmico que altéré la estructura fisicoqui - mica de la membrana semipermeable causarâ una desorganizaciôn gen£ ral en el f unci onami en to celular. Cuando se pierden las propieda - des selectivas de la membrana, hay salida de algunos de los componentes de la célula taies como amioâcidos, nucleôtidos, coenzimas e iones orgânicos y el organisme muere. Shafa y Salton (i960) h an e_s tudiado la acciôn del Sodio Dodecil Sulfato sobre la pared celular de Salmonella gallinarum y otras especies gramnegativas observando una disgregaciôn compléta de las paredes celulares y sugieren que - el mecanismo*por el que se produce ese fenômeno comprende una inte- racciôn entre el tensoactivo y la parte lipidica, lipoproteica y - lipopolisacârida de la pared. Carl A. Schnaitman (1971) ha observado que las proteinas de la membrana citoplâsmica de Escherichia coli resultan selectivamente solubilizadas por acciôn de un tensoactivo - no iônico. Triton X-100 y C.L. Voldringh y Voûtera Van Iterson (1972 tratando Escherichia coli con Sodio Dodecil Sulfato han obtenido una disoluciôn de la membrana que varia con la duraciôn del tratamiento llegândose a veces a producir una plasmolisis.

_______ Rose (1968) considéra a los alcoholes, fenoles, sales_biliares y detergentes de sintesis como compuestos que alteran las fun ciones fisiolôgicas de la membrana plasmâtica de lo que résulta la - incapacidad del microorganismo para reproducirse, afirmando ademâs que frecuentemente estos agentes obran destruyendo la barrera osmô- tica del organisme, hecho que podria servirnos de base para inter - pretar la formaciôn de protoplastos y esferoplastos en numerosos cu_l tivos con determinadas dosis de tensoactivo. Varies autores han ob - tenido este tipo de formaciones después de un tratamiento con enzi - mas, como la lisozima, que hidroliza la sustancia mucocompleja de la paredes^ bacterianas y hacen que las células se vueIvan osmôticamente sensibles produciéndose la liberaciôn de protoplastos y esferoplas -

- 139 -

tos que, aujique tienen distinta forma que las células de que deri- van, conseryan muchas de las funciones fisiolôgicas celulares. Por otra parte, hemos observado las mismas alteraciones respecte a la movilidad, tinciôn de Gram y esporulaciôn a que hacemos referenda en el apartado anterior al tratar de la influencia sobre cultivos- de microflora total, siendo al parecer la primera la propiedad que se muestra mas susceptible a la acciôn de los tensoactivos, ya que las bacteriæ tipicamente môviles dejan de serlo ya cuando se culti- van en presencia de dosis muy pequehas ( 10 ppm.) de estos productos. Y de la misma forma, podemos considerar que todas estas altera clones serian consecuencia por una parte de los complejos que parecen formarse entre tensoactivos y proteinas con la consiguiente mo- dificaciôn de estas ultimas, y por otra de cambios en la permeabi - lidad de la pared bacteriana que harian variar las propiedades de - tinciôn caracteristicas.

U

- 140 -

VIII. 3.- Influencia sobre algunos procesos ciel Ciclo del Nitrôaeno.-

VIII.3.1. Influencia sobre la Amonificacion y Nitrificaciôn.

Se siguiô el método descrito en Material y Métodos en - el apartado 9. Los resultados se expresan en las Tablas LXI a LXVI y Figuras 42 2 48 para la Amonificacion y en las Tablas XLVII y - XLVIII y Figuras 49 y 50 para la Nitrificaciôn.

DM 14 .

10

i IS U S . FEN.T77 D0B.3MQ

i io o b .pt

j j ^ jÛS.SNXP

OJ - M T-l Ti

LIS.DS

Fig. 42, Influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre los microorganismos amonificantes de 1 gr. de lodo.

- 141 -

Tabla n^.X'LI; Influencia del SODIO DGü lCIL SULFATO sobre la produccionde amonlaco por los microorganismos de un gramo do lodo

Dosis Diluciones

to(0

Q

itrol 10 lô" 10' 10^ IG® uf 10^ 10^ in^ lô^ [I.E.1 + + 4 - + + 5/32 + 44 44 + 44 + -4- 10/33 44 + + 44 + 44 ++- + 44 — — — 44 — + — — + 4- --- 44- 44 + -4- --- — — — 2S/34 444 444 444- 4 + 4 44 + 4 + 4 + 44 + 4- 4 + — --- 444 444 4 + - — — — — — — 33/35 4 + 4 + 4 + 4 4 4 44 + + + + 4 + 4 + 4 + 44- + 4- + -- 444 + 44 44- — — — — — — 34/37 + V4 + 44 444 4 + 4 + 44- 444 4 + 4 + + — 44- 4 + — + 44 4 + 4 + + - — — — — —— 35/39 + 4 + + 4 + 444 + 44 + 4 4 •4 + 4 + 4 + 4 + 4 + + - + + + 44 + 44 + 44- — -— — — — 37/312 44 + 444 444 + 44 4 + 4 + 44 44 + + 44 44 4 + + + 4 + 4 + 44 + + — 4 — — — — — 39/315 4 + 4 4 + 4 4 + 4 + + + 4 + 4 + 4 + + + + + 4 + 44 + 44 + 4 + 4 + 4 + 4 + 4 + 4+ — —— . 42/3

N9 1de Mo Crady=300 NS amonif ic./gr. de lodo= 2,5.10^^

100ppm 10 10^ 10^ 10^ 10^ 10^ 10® 10-5 lô^° D.E .

1 44 + — — — — — — — — — ——— — —— -—— — — — — —— — —— 3/32 44 + 44 + + 44 4 — + 44 — —— ——— — — — — — — — — 13/33 4+4 44 + + 4 + + 44 4 + 4 — —— — —— — — — — — — — — —• 15/34

S 5+44 + 44 444 4 + 4 444 — —— +--(r — —— --- — 17/34 + 4 + + + 444 -4 + 4 4 + 4 +-- + - + —— ■. --- — —— 10/3

S 7 ++ + 444 444 4 + 4 + 44 4 + 4 4-4 — 23/39 4-4 + + 4 + + + + 4 + 4 + 44 4 + 4 + 4 + — —— 24/3

12 44 + 4 + 4 444 4 + 4 444 44 + 444 — —- — — — 24/315 4 + 4 + 44 + 44 4 + 4 4 + 4 44 + 444 4-44 44 + 30/3

N9 de r,c 1Orady=:333 N9 amonific ./gr. de lodo = 140 .10^°

1000m 10^ 13^ lô^ lô" 10^ iE“ 10 1-' 1C® O.E.123 44 + 44 + 4 + 4 +— 4——

— —— --- —— — - —— — - -Gü

11/34 +++ + + + 444 4-4 ++ + - —— — —— -- - — — — — —— 14/3

to 5 + 44 4 + 4 + 44 444 4 + 4 --- 4 + 4 -— --- — —— lG/3v2 7 444 + + + 4 + 4 44 + 4+4 4 + 4 4 + 4 +-- —-- --- 22/3^ 9 4 + 4 + + + 4+4 + 44 44 + 4 + 4 4 + 4 +++ — — — — — - 24/3

12 4 + 4 4+ + 4 + 4 4 + 4 444 + + + 4 + 4 4 + 4 — —— — — - 24/315 4 + 4 4+4 444 4 + 4 4 + 4 + 44 4 + 4 + 44 44- + 4- 28/3

09 de Rio Crady=;322 rj9 amonific ./gr. de lodo= 20.

- 142 -

Tabla nS XLI ( continuacion)

ID.OCOppm ’iQ- ID^ lô^ 10" 10^ lô' 10® lÔ^ 10"® D.m.

12 •V+ + 44 + 444 4— 44-

——— ——— G12/3

3 +++ 444 444 44- + 44 —— — — — — — — — — — — — - 11/34 +++ 444 4 + 4 44 + 4 + 4 — — — — - — '— —— — — — — — — 15/3

S ^ 4 + + 4 + 4 444 444 4 + 4 — — — — — — — — — — — — — 15/37 + -V + 444 44 + 44 4 4 + 4 4 — — — — — — — — — — — — — lü/3

° 9 444 444 444 444 444 + + + 4 + 4 ——— —— — 24/312 + 44 444 444 4 + 4 4 + 4 4 + 4 + + + + 4 + ——— — — — 24/315 44 + 44 + 4 + 4 444 4 + 4 4 + 4 4 + + 4 + 4 4^.. — 2G/3

N8 do Me Cradyr3 20 N 2 amonif ic./gr. de lodo=9,5.10®

DMcontrol

13

1 0 0 ppm

1 0 0 0 0 ppm

7 91 3 5 151311 dias

Fig. 43.- Actividad anonificantc de la microflora de 1 gr. de lodo en praesnciade Sodio Dodecil Sulfato

- 143 -

Tabla nS'XLII; Influancia del FENOPON T 77 sobre la produccion de amoniacpor los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis Dilucicne:

to03»r4Q

1

2

345 7 91215

Control lô^ lé" lô" 10^ lô' 10® lô" i5° 10^ l é " l é " l é " l é " l ô " 10 15 Ü.m .1 44 + — 4 + 3/2 + + + + + + 4+4 10/'3 + + + 4 + 4 44 + + 4- + + + --- ++—* 4 —— 44- ——— + 4 — 4+4 - + - ——- 25/"’4 + 44 + + + + + + + 44 4 + 4 + 44 + 4 + + 4- + + - ——— 4+4 + 44 ++— --- ——- 33/_

S 5 4 + 4 + + + + 44 4 + 4 + + + 444 + 44 + + — + + — 4-- 444 + 44 4 4 — — - — — - 22/.++4 + 44 4+4 444 + + + 44 + 4 + 4 + + - + + - + 4- 4 + 4 444 44- ——— — —- 35/uQ 9 444 444 4 + 4 4 + 4 44+ 444 + 44 + 4 + 444 44- 444 4 +V 44- ——— — —- 37/

12 + 4 + + 4 + 444 444 + 44 + 44 444 + + + 4 + 4 + ++ 44 + 44- --4 — —- 39/"15 + 44 4 + 4 4 + 4 4 + 4 44 + 4 + 4 4+4 444 4 + 4 444 + 44 444 4 + 4 + 44 — —- 4 2/'

N2 de lYic Crady= 3C0 NG amonific ./gr. de lodo = 2,5 .lO^'*

100m 10^ 10^ 10® -410 i5^ lÔ® lô^ 10® 10® l é " l é " l é " l é " lé"' 18

15 0.1:: .1 — 4 1/"=2 4 + 4 +++ -44 3/:3 4 + 4 44-4 4 + 4 -4 + — 4 15/4 4+4 444 + 44 4 + 4 — 4 + 4-4 - + 4 -4- -4- -4- ——— — — — — — — — - 21/-

S 5 44 + 4 + 4 44 + 4 + 4 -4 + + + + -+ + 4 4 — 44- 24/S 7 444 4 + 4 4 + 4 4 + 4 + 44 4 + 4 4 + 4 + 4- + 4- + + - 4 —- 4-4 — — —— — - -- 32/

9 44 + 44 + 444 444 + + + + + + + 44 4 4 — + 4- + + — + -- 4-4 — — — — - 32/.12 + + + 4 + 4 + + + + 44 44 + + + + 4 + 4 4 + - + 4- 44 — + — — 4-4 — — — — - 32/;.15 + 44 + 4 + + 4" 4" 44 + 444 + 44 44 + 444 4 + 4 + 44 4-- + - + — — + —— — - 34/-'

î\!9 1de f"iC Crady= 313 NG amonif ic./g r. da lodo= 15,Io:®

1000•m i5 10 2 i5^ 104 10® lô6 -7

10 1C3 -9lu ]Glu D .r:.

+ —

+44 444 444 44 + 4+4 444 444 444

-4- 4 + 4 44444444 + 4 4 4 44 + 44 + 44 +

4--4 + 4 + 44 444 + 44 4 + 4 + 44 + 44

4-- 4* —

444 44 + 4 + 4 4 + 4

-+4 44 + 44 +

- - +

4 — +

+ 4 +

4-- + -- 4 ------

N8 de file Crady=310 NB amonific./gr. de lodc=4,5.10

2 /

7/9/lD/\IC/1 2 /

16/18/19/

- 144 -

Tabla n2 XLII (ccntinuacion)

B / 3

8/39/310/3l D / 5

10/312

+ + +

fJS amonific*/gr. de lodo=2Ü,10rady=322

DM

control

100 ppm

1000 ppm

1 0 0 0 0 ppm

13 15dias

Fig# 4 4 Actividad amonificante de la microflora de 1 gr. do lodo en preoonc.de Fenopon T 77

- 145 -

Tabla np-XLIII; Influencia dal uüBANC PT sobre la produccion de arnoniacopor los microorganiomos do un gramo de lodo

Dosii DilucionosControl -1

1 0

C3

Q

i n " 13^ 10^ l ô ? 1 0 % I D ^ ^ 1 4 , - 1 5

1 444 -44 5/ '2 444 444 444 -4- 15/'3 ^44 444 444 44- 444 — —— 44- 4-- 44- — — — 44- 444 — 4 — --- — — 25/.4 444 444 444 444 444 444 444 44- 4» -V — --- 444 444 44 — — — — 35/'5 444 444 444 444 444 444 44 4 4 4 — 44- 4 —— 444 444 4 4 — --- — — — 55/7 444 444 4 4 4 444 444 444 444 44- 44 — 44- 444 444 44- --- — — — 35/9 444 444 444 444 444 444 444 4 4 4 44- 444 4 4 4 444 4 4 — — — — — “ ~ T 1 / * /12 444 444 4 44 444 444 4-V4 444 444 444 44 + 444 444 44- — — 4 — — — 39/'15 444 444 444 444 444 444 444 444 44 4 444 444 444 444 444 — — — ^2/

fj9 do flic Crady=30C NG anonific./gr. do lcdo=2,5.1014

100m

wco

' Ho

1

2

345

7 9

1 2

15

w(0

' HQ

1000m

1

2

345 7 9

1 2

15

* »

-1 -2 -310 10 10444 444 4-4444 444 4-4444 444 444444 444 444444 444 444444 444 444444 444 + + +444 444 V + 4

NG de Me Crady=30Q

— 1 — 2 -310 10 10

44 4— 4444

— — —

444 444 —444 444 —— —444 444444 444 —— —444 444 —— “N2 de Me Crady=3G0

lô'

+ - 4

4 4 4 -

4 4 4

444 444 444

-41 0

1 0 -^

— — 4— — 4- 444 444 444 4 4 4

~6 lô" i5

N 2-"araôHi TT5'./gf ;“ 'dè'“lo'cro= 2',’5;TCr'

—5 “6 — 7 —o —9 —101 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0

NSamoniric,/gr. de lodo=2,5.10‘

u , 1

e/B / '

1 2 / "

13/15/15/15/15/

D J:;

ü

C1/0/5 /0/6/6/

- 146 —

Tabla XLIII (continuacion)

10,0001 0

6/37/37/3

7/38/3

1 2

15

fis arr.onific,/gr, de lodo=9,5,10f'jS de Me Crady=32

D M14 control

13

1 1

10 0 ppm

1 3 975 13 151 1

fiQ» v5,“ Actividod suionificantG o G la i.îicroriora oe 1 gr» de iodo en pi'GSGnci.''de Dedans PT

- 147 -

Tabla n- • XLIU ; Influencia del DCBANE 3NQ sobre la produccion de amo-niaco por los micrcorganicmos do un gramo do lodo

Do sis Dilucionos

Con trol -11C" IG^ 10" IG® IG^ 10* 10® 1C® ic“ 10^® i c ^ d c "

1 v+v - 4 + --- 5/32 44 + 4+4 444 —+ — — — — — — — --- — — — — — — --- -------- lD/33 4-4-V 4+4 444 44- + 44 — — — + + •- «0 aw «VMM* + 4 — 4 4 4 -4- ---— —— 25/ à4 + + + 4-r4 4 + 4 4 + 4 444 44+ + 44 + + — 4 4 — — — — +++ 4+4 44 — — — — — —— 3 3/ 3

ifia 5

7+ 4 4- 4 + 4

+4+ 4+4 444 444

+ 44 + 44

4+4 44+ 444 4+4

44 + 44 +

4 4— +4— 4 — — 4 4 — +4— 4 4 —

+44 4+44+4 4+4

44-44-

34/335/3o 9 + + + 444 444 444 444 • 4 4-4 4 + 4 444 44— 444 4+4 4+4 44- —--— — — 37/3

12 4 44 44 4 + 44 444 +44 44 + 444 +44 44+ 4+4 4+4 44- - — 4 — — — 39/315 +++ 4+4 44+ 444 44+ 4+4 + 44 44+ 4+4 44+ 444 444 + 44 444 — — — 42/3

rj9 de nic Cr ady=3 00 Ns amonific,/gr. de lodo = 2,5 .10^^'

ICOppm i5^ 10“ i5^ 10^ 10^ 10® lô' 10^ 10^ irA® D.r;.

1 A' ■ V" — —— — —— —-- — — — — — — — — — — — —— 2/ o2 + + + - —— -4- --- — --- --- — - - — — — 4/33 + + + 4 + 4 + 4 + --- — --— --— — —— — — — --- 9/34 + + + 444 444 — —— — — — — — — — — * — —— 9/3torj 5 + + + 444 4 + 4 44 + — --- — —— —-- — -— —- — 12/3

'■HÛ 79

4 + + 44 +

444444

4 + 4 4 + 4

4444+4

+ + + V4

15/315/3

12 444 444 + 44 4 + 4 + + f — — — — —— - — — —— — — 15/315 4 + 4 4 + 4 4 4-4 4 + 4 4* 4- — — — — - —- 15/3

t.'S do Me Crady=3 ID fjs smonific./gr, de lodo = 4,5 .10“

IDGOppm lE- l5^ iS" 1Ô' l5^ 10^ IG* 1C® 10^ lü^° 0 ,r ,

12 44 4 4 + 4 :::

--- — — — ——— ——— iT6/3

3 44 + 44 + -44 — —— — — — — — — — — — -- --- S/34 4 + 4 + 4 + + 4 + +- — — — ——— —— — — — — —— — — lG/3Q(0

Q579

444 + 44 444

44 + 444 + 44

44 + 44 4 44 +

+-4 + 4 4+4

“- ——— ——— —— --lC/312/312/o

12 + 44 444 + 44 4 + 4 — — — -- — — - —- - —- 12/315 44 4 + 4-4 44 + + 44 —— — —— — — — — — ——- — —— 12/3

NQ de flic Grady = 300 N2 amonific./gr. do lode= 2,5 .10?

Tabla nS XLIV (continuacion)

IQ.DCG15^ 10^ IG 10^ 10^ 10^ 10^ 10^^ ID.iïi.

0)aQ

1 — --— — —2 4 + 4 -- — —3 4+4 +4 4 -4 444 4 + 4 4-5 . 444 + 44 4-7 444 4 4 4 4-9 444 444 4-12 4-4 + 444 4-15 444 444 4-

0

3/36/37/37/37/37/37/37/3

NG de Me Crady=31C K'2 amonific./cjr. de lodo=4,5.1D

control

ppm

1 0 0 0 ppm

1 0 0 0 0 ppm

ri I as

FIG.46.- Actividad ancnificants de la microFloro do 1 gr. do loco en pro-on' Dobano 3NQ G<

— 149 —

■ Tabla nQ XLV; Influencia del LI5SAP0L SNXP sobre la producffiron de amoniaco por los microorganismos de un gramo de lodo

Dosi; DilücicnssCentrol 10* -210 -310 -410 -510 -610 -710 -610 -910 -1010 -1110 -1210 -1310 -1410 -1510

1 4+4 —+ 2 + 4 + + 4 + + 44 - 4 - 10/33 + + 4 + f 4 4" + + + + ** 44 4 ——— 4 4 - +—— 4 + — — — — 4 4 “ 44 4 -+- ——— — 25/3A t + 4 + + + 4 + 4 + + + + 4 + + 4 + + 44 + + - 4 4 - —— — 4 + + 4 + 4 + 4 - ——— -----— 33/3

(/) 5 4 + + 4 + 4 + 4 + + 4 + 4 + 4 + + + 44 + 4 4 - + + - + - - + 44 44 + + 4 - ——— — —— 34/37 44 + 4 + 4 + + + 4 + 4 + 4 + + 4 + + 4 + 44 — 44 — + + - 444 4 + 4 + 4 - ——— 35/3

Q 9 ++ + 4 + 4 + + + + + + 4 + + 4 + + + + + + + + 4 4 - 4 + + + + + + 4 + + + - ——— — —— 37/312 +4 4 4 + 4 44 + + 44 + + + + + + + + + + 44 + 4 + + 4 + 44 + 4 + 4 + + — —— — —— 39/315 ^ 4 + 4+ 4 + + + +4 + + 4 + + 4 + + + + 44 + 4 4 4 4 4 4 + 44 44 + + 4 + 4' + —- — 42/3

NB de lilc Crady=3C0 NB amonific ./gr. de lodo= 2,5 . 1 0 l 4

100 _ ppm

— i10 10 ~310 -410 -510 -G10 -710 -010 - 910 -1010 -1110 i d '-1310 -1410 -1510 •0 J : ;.

1 . G2 4+4 4 + 4 4 + 4 10/33 + 44 44 + + 44 - + - 11/3

ma4 + + + + 4 + + 44 + 4 + ++- 4 — 17/35 + 4 + + 44 + + + + 4 + + 4 - + + 4 - +— —-— — —— + ---- + + - ——— — 4 — — — — 22/3

Q 7 + + + + 44 + + + + 4 + 4 4 - 4 + 4 4 4 - +-- ——— 4 - 4 + + + 4 4 4 —+ — 4 + 4 — — — 32/39 44 + 4 + 4 + + + + 4 + + 4 - + 4 + 4 4 - 4 — + 4 + 4 + 4 44 + + 44 + 4 - + + + — — 37/3

1 2 + 44 + + + + 44 + 44 44 + + 4 + + 44 + -- 44 + + + + + 44 44 + 44 + + 4 + 40/515 44 + 44 + 4 4 4 44 + 4 + 4 4 + + + 44 + 44 4-r + 4+4- + 44 44 + 4 + 4 + 44 42/3

NB de Me Crady=30ü K9 amonif ic./qr• de lodo= 2,5 .10^^

lOCO

.ppm .. lô- l52 l5' l54 i5® 10-U lô^ 108 i5® 1010 u ..,.12 44 — - 4

-

4 4 -

- - - — —— — - - - - - - - ——- 05/3

3 +4+ +++ 44 + 4 - 10/34 44 + 44 + + 44 + - 4 - 4 - ——- — —— - - - ——- 12/3oco 5 4 4 4 44 4 4 44 4 - + - 4 - — - — — — ——- — — — —- - 12/3

'H 7 + 4 + + 4 + 44 4 + 4 + - + - ——- — —— - - - — — ——- 13/"9 4 + 4 •^44 4 + 4 + 4 + — 4 — 4 - - — —— — —- w ——- 14/312 44 + 4+ 4 4 + 4 + 44 4 + 4 44 - 4 - 4 —-- — —— —-- 19/"15 44 + 4 4 4 44 4 4 4 4 + 4 + + 4- 4 - 4 —-- — — --- 19/"

NB de Me Crady=322 NB amonifie ./gr. de lodo= 20 #10^

NOT A: En ninçun cultiuo ccn dosis do IG.GCG ppm so dctecto produccion co aocniaco, por lo que el ES ng acionificantos/gr, de lodo=C, 5in orj-

bargo habia crccimionto en todos los tubos hasta la dilucion 10"“' inclusive.

— 150 —

D M

14 control 100 ppm

13

1 0 0 0 ppm

10000 ppm1 3 5 7 9 1 1 13 15dias

Fig, 47.- Actividad amonificante da la microflora da 1gr. de lodo an presencia da Lissapol SNXP.

- 151 -

Tabla nS XLl/I : Influencia del LISSAPCL D5 acbrs la produccion de amoncacopor los DicroorganisiTios do un nrano de lodo

Dosis DilucionesControl IC -210 10^ -410 -510 -610 -710 -810 -910 -1010 -1110 -1210 -13 -14 -1510 10 10 D.%,

1 +++ - 4 4 5/32 + 44 + 44 — 4 — — —— — — — — — — —— — — — — — — - — - 10/23 4++ 4 + 4 + 44 44 — 44 + — — — 44- 4- — 4 + ~ — — 44- 44 + 25/34 t++ 4 + 4 444 + 44 + + + 4 + 4 + 44 + 4 — + + " — — 4 + 4 4+4 33/3(0RJ 5 +++ 4 + 4 444 4 + 4 4 + 4 4+4 + 44 + 4- 4- + - + 4 + 4 4 4 — 34/3

'HO 7 44 + 4 + 4 4 + 4 + + + + + + 4 + 4 44 + + 4- + + — 44 + 4+4 35/39 444 4+4 + + + + + + 4 + 4 44 + 44 + + 4 + + -¥•" + + + 4 + 4 4 + 4 37/312 + 44 + 4 4 444 444 4 + 4 44 + 444 444 4 + 4 4 + 4 444 44 + "" — + m" — 39/315 4 + + 4 + 4 + + + 4 + 4 444 4 + 4 444 444 + 44 4 + 4 4 + 4 + 4 + + + + + + + •- «* — 42/3

NS de Me Crady=300 NQ amonif ic,/gr. de lodo=2,5.10^4

100.. ppm . _ IC 1C- lô' -410 10^ i5“ lÔ* 10-® 10® lô'®i":'lô:® D.iii.

1 û2 444 44 + 444 9/33 444 444 4 + 4 9/34 444 444 4 + 4 444 12/3co 5 444 4 + 4 444 4 + 4 15/37 444 + 44 + 44 + 4 + + 4 + 4-4 4-4 + 44 — 4 44- — — — — 25/39 444 444 + 4 + 4 + 4 44 + 4-4 444 4 + 4 — 4 44- 26/312 + 44 4 + 4 + 44 4 + + 444 4 + 4 4 + 4 44 + 44 — 29/315 444 4 + 4 44 + V4.+ 44 + 44 + 444 4 + 4 44 + 444 31/3

N2 de Me Crady=310 NS amonific./gr. de lodo=4,5.10lC

1000 o --- ---- —10 -R S 8-- r.',ppm 1C 10 10 10 10 10 101 mmmm^ - • • - «M «a» M — — - — " •— — —— ## — «# û2 44- - +- - M M» M — — - mmwmmrn — — - «m *# #» n / ' y, w/ u3 444 -44 444 -- - -4- — —- — — —- — — — — —— 9/34 4 + 4 4 + 4 44 + -44 — 4 — -4 - — — — — — - — — — — —— 13/3(0(0 5 44+ 4 + 4 + 4 + -4 + 4 + 4 -4 - 4 — -- - — — — — — — 15/3

'HQ 7 4+4 + 4 + 4 + 4 4 + 4 + 4 4 + 4- 44 — -- - — — — — — — 19/3

9 4+4 444 4+4 44 + 4 + 4 +44 + 4- -4 - — — — — — — 21/312 4+4 4 4 4 44 4 4+4 + 44 4 4 4 + 4 — - 4 - — — — — —— 21/315 444 4 4 4 444 444 4 4 4 + 4 + 4 4 - - 4 - — — — — — — 21/3

N9 de fflc Crady=321 NS amonific ./gr. de lodo=15.10^

NOTA: Les cultives con dosis de 10.000 ppm no prosentaban amcnificacion, aunque si habia crocinisnto en todos los tubos hasta la dilucion 10"5 inclusive, y en un tubo hasta 10”®

- 152 -

D M

control14

13

1 1

1 0 0 0 ppm

1 0 0 0 0 ppm

1 3 13 155 7 9 11dias

Fig* 48.- Actividad amonificante de la microflora de 1 gr. de lodo en presencia de Lissapol DS

- 153 -

Tabla nS XLVII: Influancia de la concentracidn de tensooctivos sobre los rni-crocrganismos oxidantcs dol amoniaco présentas en 1 or da lodo

Dosis de tensoactivo pprn

Diluciones IG IC^ 10“ 10 10^ IG^ D.M.

tv2 nitrificante: /gr.da lodo

Control

m 100 ppm * â 1000 ppm

10,000 ppm

g 100 ppm g- 1000 ppm c 10.000 ppr

u

a 100 ppm, 1000 ppmo 10.000 ppm ocrz ICO ppm

ICCC pcm■^10 .0CD‘'ppm'ag 100 ppm "% 1000 ppm « 10.000 ppm

mQ

nt H- I

100 ppm ICCn ppm 10,000 ppm

+ + + 4 4 4 + + +

2,5.10'0,5.10

C0

131,3.100

2,5.100

0 —

13.101,7.100,2.10

3.5.102.5.10 0

— 154 —

Tabla XLVIII: Influancia de la concentracidn rie tcncoactivcs sobre los microorganismos oxidantss de los nitritos en un gramo de Iode

Dosis de tan- sooctivo ppm

Control

Diluciones—1 —2 “3 —4 —5 “610 10 10 10 10 10

4 + 4 4 4 +44-

N9 nitrificant: D.Ç, /gr. de ledo

e/5 8.10

tn 100 ppm Q 1000 ppm

10.000 ppm1/5CQ

0 ,2.100

Q

coo.□ca

Lu

100 ppm 1000 ppm10.000 pÜ.Ti

444 ' 4/50

0

1,1.10C0

I— CL

JOO

O

ICO ppm 1000 ppm 10.000 ppm

M 100 ppm^ 1000 ppmo 10.CGC ppm o

^ —

--------------4

4/51/5G

1,3.100,2.10

0

aX

IT)W•H

100 ppm IGGC ppm 10.000 ppm

44 + 44 — 4 ■4 + 4 + 4 -----

4---- --

6/55/51/5

5.5.102.5.10 0 ,2.10

Q 1 0 0 p p m

m 1000 ppm 10.000 ppm

-44- ■/^ 0,5.100

0

- 155 -

DM

3

2 1 1 h "f 1 ^ £ ! 1 1 e 1 1 1(! s * 8 ? « g t o I i d 0 8 §

a o 'a 45.D.5. FEM.T77 DO&JN& DOB.PT

J iLIS. DS

JZLI ^ +4 rA LiS.GNXP

Fig, 49.- Actividad bioldgica de los microorganismos oxidantes del amoniacc pre sentes en 1 gr. da lodo an presencia de distintos tensoactivos.

DM

2 ,

1 .

<3 ^S.D.5.

1111 FEN.T77 DOB. PT

l i i iD08.TNQ

J i l lLÎS.SNXP

5 ^ ^ ^ LÎS.05

Fig* 50,'- Actividad bioldgica do los microorganismos oxidantes de los nitri présentés en 1 gr. de lodo en presencia de distintos tensoactivos

156 -

VIII.3.2. Influencia sobre la Desnitrificaciôn.

Siguiendo el método descrito en el apartado 9 del Cap de Material y Métodos se obtuvieron los resultados que se expre* San en las Tablas XLIX y LX y Figuras 51 a 63.

N'iTHMOî] I

I4

5. D. S.

NiTdhost

PEN.T77 DOB.PT LIS.05 U S S N X P

Fig. 51. influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre los mi croorganismos de l.gr. de lodo que realizan la Desnitrifica ciôn.

\

- 157 -

Tabla n^-KLIX; Influencia del SCDIG GODECIL SULFATO en la reduccionde nitrates por los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis DilucionosControl

I C ^ 1 G “ l Ô ^ I C ^ I C ^ 1 3 ^ ID*^ l 5 ° l Ô ^ 1 5 ^ ° 1 C ^ ^ 1 G ^ “ 1 Ô ^ “ 1 G ^ ^ 1 Ü ^ ^ 'Ü . f : ! .

(0co'«HQ

1

2

345 7 91215

4 + 4 4 - 4 --- ----- ---- ----------------------------------- ---------------4 + 4 444 444 4 4 - ------------------------------------------------------4 + 4 44+ 44 4 444 4 4 — — — 4 — 4— — — — — — — —— — — — — — — — — — — — — — — — —444 44+ +4+ 44 4 444 ---4 +4- -44 - - + --- -------------------- -----4 + 4 44+ 4 + 4 4 + 4 444 —— 4 +4+ 4 + 4 444 —— — — — — — — — — — — — — — — — —4 + 4 44+ 4 + 4 4 4+ 444 444 4 + 4 444 444 44— — — — — — — — — — — — — — ——444 444 4 + 4 4 + 4 4++. 44 4 4 4 4 +44 +44 4 + 4 — 4— — 4 — — + — 4 — 4 — — —444 4+4 +44 44 4 444 4 44 444 444 44+ 4+4 4 4— 444 444 444 — — —44+ 4+4 444 444 444 444 +44 444 +44 +44 4+4 444 44+ 44+ +4-

ÎJS de fitc Crady=532 NS desnitrif./gr. de lodo=llD.10 14

11/3lG/321/324/329/335/341/344/3

100J E H L 1 0 ' lÔ 10 lÔ lÔ lô lô® lÔ D .f;i.

tn(0

Q

1

2

345 7 9

1 2

15

4-4 + 44

444 44 +

4 ^ 4

444

444

444

444

444

444

44 +

4 4 4

444

44 +

4 + 4 444

- + -

44 4

+ 44

4 + 4-

4 + 4

44 4

44 4

4 4 4

44 4

444-

4 4 4

44 4

4 + 4 4 4 4

44 4

4444 4 4

4 4 -

444

4 4 4

444

44 +

4 4 4

4 4 4

4 —

4 4 -

4 + 4

44 +

- 4 - 4 + 4

44 4 44 4

4 4 4

4 + 4

+ 44

K’S de fiic Crady=332 NS desnitrif./gr. de louo=110.10

3/ 3 12/3 12/3 12/3 12/3 16/3 26/3 27/3 29/3

1000p p m lô IQ IC -5 - F

1 C ic" -81C 1 0 °

tnco' Ho

1 4 4 - ——— ——— — — — — — — ——— — — —

2 4 + 4 4 4 - 4 - 4 — 4 ------- + - - — ——

3 444 444 4-*4 - 4 4 — — — 4 — —----

4 444 444 4 + 4 - 4 + — — — 4 ---- — — —

5 444 + 44 4 4 4 4 4 4 -- 4 4 - 4-7 + 44 4 4 4 4 4 4 44 4 ------- 4 4 - 4 —

9 444 444 4 4 4 44+ 44 4 + 44 4 4 -

12 44 + 444/ 4 4 4 4 4 4 + 44 4 4 4 + 4 -

15 4 + 4- 44 4 44 + 44 4 4 4 4 4 4 4 444-

N6 de r.ic crady=310 NS desnitrif./gr

Li ù9/312/312/315/315/320/320/322/3

- 158 ■-

Tabla XLIX (continuacion)

lO.OOC ID 10^ IL-' lo" IC IQ 10-’ 10° 10-® ic-'° D .r;..1 4 + t ^ mm mm mm mm ^ mm mm mm mm mm mm mm mm mm VMM MMM 3/32 4-4 + 444 - 4 - 4 4 4 — — — ^ mmmm mm mm mm mm mm mm mmmmmm MMM 10/33 ++4 444 4 4 - 4 + 4 —— — 4 — — — — mmmmmm mmmmmm MMM 12/3

(0(0

4 44 + 44 4 4 4 - 4 4 4 ——— 4 — — — mmm.mrn mmmmmm MMM 12/35 444 44 4 4 * 4 4 4 4 44 + — — — rnmmmmrn — — — MMM 15/3

O 7 . 444 4 4 4 4 + 4 ——— 44 4 — — — — — — MMM 15/39 444 444 44 4 44 4 4 * 4 4 + 4 4* — — MM M MMM 19/312 444 444 444 444 4 + 4 4 4 4 — —— MMM MMM 20/315 444 444 444 4 4 4 444 4 + 4 + + 4- — + - — MMM 22/3

NB de rue Crady= 301 NB desnitrif./g r . de lodo=4.if

controlD M

1 0 .1 0 0 ppm

8

1 0 0 0 ppm 10000 ppm

1511 13973 51 diasFig, 52.- Actividad roductcra ce los nitratos de la nicroflora de 1 gr, de lodo

en presencia de Sodio Dodecil Sulfato

- 159 -

Tabla n2 b: Influencia del 50CI0 DGDECIL SULFATO sobre la reduccion denitritos por los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis DilucionesControl

f2

34

S 5Q

V)a' Ho

1 n—1 —2 —3 —4 —5 —{' 1C 1C 10 10 ÎG -7 -8 -910 10 10 D . m

+ + - ---------

+ + 4 4 + + — — — — ——

+ 4+ 444 444 444 - —444 444 f 44 444 44—

7 444 444 44-4 444 444 ——4 4 + 4 444 444 4-----9 444 444 444 t + + 444 _444 444 444 444 4 4— ——— —— -- — — — —'12 444 444 4 + 4- 444 +44 444 44+ 444 4+4 -+- 4-4 — 4 4 -f — — •15 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 44+ 444 4

MMB de Me Crady= 331 MB desnitrif ./gr. de lodo=A5 .10

!0 — 1 — 2 ""3 -4 -5 -6 —7 —8 -9 -11m 10 10 10 10 10 10 10 IG 10 101 — — — — — — «•••«• •VMM — — — — — — —2 4 —3 4-4 44- 4 —4 4-4 44- 4-5 444 444 44 — -4- “ — — — —— ——— — — — — — —7 444 4 + 4 444 -4- — — — ——— ——— —-9 : 4 44 444 444 -4- •+ —— *■ ——* ——— ——— — — —12 444 444 444 -44 + + + + 4 + ——— 44+ 4 — —15 444 444 4 4 4 44 4 + + + 444 4+4 4 — + —

MB de Me Crady=311 MB desnitrif ./gr. de lodo=7; 5.10®

0

V 37/312/317/326/329/336/343/3

0 JT .

D1/35/35/39/310/311/321/326/3

1000ppm 1 n 10 10

1215

MB desnitrif./gr. de lodo=7,5.1DMB de Me Crady=311

ü.n.0

0

0

5/36/310/315/317/3

— X6 0 —

Tabla nS L (continuacion)

10.000 p p m . ic^ 1 0 1 0 ^

—410 - 610 10 - 7 -0 -9 - 110 10 10 10 D . L : .

(003

' Hû

12 ::: :34 4 — 4 4 -

5 +• + + 4 4 + 4 —

7 . 4 + 4 + t 4 + —9 + 44 4 4 + 4 4 + + 4 +12 444 + 44 + 4 + 4 4 4

15 + 44 + 44 4 4 4 + 44

NG de Oc Crady=300

4 + + 44 +

NG desnitrif./nr. de lodo=2,5.10'

Ü

CD3/36/58/312/315/315/3

control

13

100 p p m

1000 p pm

1 0 0 0 0 ppm

13 15dias

Fig. 53.- Actividad reductora do los nitritos do la nicroflora de un gr. de lodoen prescncis de Sodio Dodecil Sulfato

- 161 -

Tabla n6' ill: Influencia del FENOPON T 77 sobre la reduccion de nitratospor los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis DilucionesControl —1 —2 —3 —4 —5 —6 —7 —8 —9 —10 —11 —12 —13 —14 —1'". ■ 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

1 4+4 4-+ — — — — — — — - — — — — — — — — — —— — — — — —— — — 5/32 +++ +++ +++ + + - ---- — ---- --------- — ------ ll/o3 4 + 4 + + + + + + +4+ + + — — — 4 — +— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 1 6 / 3

4 4 + + + + + +4+ +4 4 4+ 4 — —4 + + — — + + — — + — — — — — — — — — — — — — — — —— — 21/ vj5 4 + 4 44+ +44 +4+ 4*4+ — — 4 + + + 44+ — 4+ — — — — — — — — — — — — — — — — — — 2A/J(!)(0

Q 7 44+ + + + + + + 4+4 +4+ +44 + + + + + + 44+ + + - ----- 29/39 4+4 +++ +4+ +4+ +44* +4+ 4+4 4+4 4+4 +44 — 4— —4 — — 4 — 4 — 4 — — — 35/3

12 ^4+ + + 4 +4+ 4 + 4 4 + 4 44+ 4 + 4 44+ + + + + + + 44- +4+ 44+ 44+ — — — 4 1/O15 +4+ +++ 44+ 44+ 44+ 4+4 4++ +4+ +44 +44 +4+ 44+ 4+4 +4+ ++- . 44/3

NG de nie Crady=332 NG desnitrif ./gr. de lodo=110.10^

100 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 -1^10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 101 -------------------------------------------------------------------- ----------------------------------- û2 - 03 ♦++----------------------------------------------------- 3/3

o ■ 4 * * * ........... - ........................... 3/32 5 +++ — + -+--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 5/o 7 + + + 4+ 4 4 4 4 --+ 4 + 4-----4--------- --- -- ---- ----- --- 14/"'

9 +44 4 + 4 444 — 4 4 444 4 + 4 4 — + — — 4 — 4+ —— — + — — — — — — — — — — — — — — Z.^/ "12 4+ + 4+ 4 4 + 4 4 + 4 4 4 4 44 4 4 — 4 +4 4 4 + 4 4 —— 4 - — + 4 — —4 — — + — --------- 32/15 +4+ 4+4 4 +4 44 4 4 4 4 44+ 4+ 4 4+4 44+ 4 4 4 +4 4 4 +4 4 4 4 ++4 - 4 - 43/^

NG de lilc Crady=331 NG desnitrif ./gr. de lodo=45.10

-7 -3 -9 -10 D.M.10 10 10 lu

0 4 + 4 4 4 + — — + w + » 4 — mm mm 9/Q 7 4 4 + + 4 + + — + — + — 4 - 4 + + + — — — — — — mmmmmm mmmmmm 1 4 /

1000 -1 -2 -3 -4 -5 -5m 10 10 10 10 1C 101 -- — — — — - — ——— --- — — —2 — + ——— — — — — — mmmmmm mmmmmm

3 + 4 + ——— mmmmmm — — — mmmmmm mmmmmm

, 4 + 4 + +++ — — + — — — — —— — — —1 5 +44 44 + -- + — — — — — 4 -4-

7 44 + + 4 + + - + — + — + - + 44 +9 + 44 44 + + 4 + - 4 - + + + +++12 + 44 44 + + 44 - + - 4 + 4 + 4415

»

f.

+ + +NG de

+ + + -4+4

Me Crady=300+ 4+ 44 +

NG 1+ + +

desnitrif+ 4 4 4 4 + — — — — — — Z4/.

- 162 -

Tabla nS LI (continuacion)

10.000ppm lÔ^ -210 "310 -A10 -510 -610 -710 -810 -9 -10 10 10 D.m.

1O —- — —- — --- —— — — — ——— —- —- G05/3

Z3 4 4 - -4- ———» — —«»»» — — —

co 4 444- 444 «• — a» — —— ——— ——— —— —- -- 9/35 . * + 4- 444 444 — — — — — -—— —-— -- —- — —— 9/3

Q 7 + + + 444 444 -44 44- 44- ——— -- — — — — —— 15/39 444 44 4 44 4 444 4 4 - 44 4 -- ——— — — — ——— 17/312 444 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 — — ——— — — — — —— 17/515 44-V 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 44-4 --- -- —- — —— 10/3

_ - -, «

NB de nie Crady=300 NB desnitrif./gr, de lodo=2;5.10^

D M control \00 ppm

1 0 0 0 ppm

1 0 0 0 0 pprn

Fig. 54,~ Actividad reductora de los nitratos de la microflora de 1 gr, de lodo enpresencia de Fenopcn T 77

- 163 -

Tabla nS LU: Influencia del FENOPCN T 77 sobre lo reduccion de los nitritos por los microorganismos ce un gramo de lodo

Dosis Dilucione:Control “1 —i- —3 — 4 —5 —6 —7 —G —9 —10 —11 —12 —la —14 —1510 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

1 -----------------2 + 4 - * - 4 ................. - ................... - - .......................- ..................-3 4 + t- 4» 4-4 4 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —4 44-4 4 4 4 4 4-4 4 4 - ----- --- ----------- --- ---------- ------ ---------- --- -------------

n 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 - 4 4 - - - 4 4 --- 4 - 4 ------ ------------------------------------------Q 7 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 — — 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 + — — — — — — — — — — — — — — — — —

9 4* + 4" 4*+ + + "4 + — — — — * —•- — — —12 + + + "4 + 4* 4" 4" 4" H + + * 4" 4" ^ + 4* "f + "t + "4 "" ^1 5 ++4- + + 4 4 + + 4 + 4 4 + + + + + + •►-t4 +44- *4-4- ^ + + + - -

NG de Me Crady=331 NG desnitrif./gr. de lodo=A5.10^^

ICO

totaQ

m12345 7 91215

-1 -2 -3 -4 ■ -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 -1;10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

444 ----------- --------- --------------------------------------------444 ----- --- --- --- --- --- --- --- ------ --- --- ---4 4 4 4 4 4 4 4 4 - - 4 -------- - - -

4" + + 4 "+ • -—+ — — — — — + ^ — — — — — — — — — —

+ + — 4" 4 4" + — 4" "" + — —" — —+ H-+ + 4'4*+ + 4r "*"4 4" + «V44 + 4 4 4 + 4 4 4 + 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 —

NG de Me Crady=330 NG desnitrif./gr. de ïodo=25,10~

D .M .0V 37/3 11/3 17/3 2c/ 3 29/3 36/3 43/3

ü.n.CiCG3/33/310/311/321/342/5

1000m

to(0O

lô’ lô —5 —6 —7 —8 —9 —1010 10 10 10 10 1012

--- — —— — — — -- — —— -- — —— — — — -- — —— C0

34

- —— -- -- — —— -- —- -- -- —- — c3/3

5 •t*t4 — —— — 4 — — — ---— ---- — — — ---- — — — ---- 4/37 4-V4 4 4 4 •— 4 — - — ---- — — — — — — ---- — — — ---- 7/39 4 4 + 4 4 4 4 4 4 — — — — --- — — — — — — — - — — — — ---- 9/312 4 4 4 4 4 4 4 4 4 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 9/315 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 - 4 4 4 — — — --- --- --- 15/3

NG de Me Crady=321 NG desnitrif./gr. de lodo=15.1G

A ?

— 164 —

Tabla L U (continuacion)

10.000lü lô" lÔ^ IG^ 10* 10 10 i v } ^

o.m.

2/36/3S/39/3

12/312/314/3

1215 44

NS desnitrif./gr. de lodo=9,5NS de lïlc Crady = 32C

DM 15

co n tro l100 p p m

13

11 .

1 3 5 7 9 13 1511dias

fig* 55.- Actividad reductora do los nitritos de la microflora do Igr. de lodo enpresencia do fenopon I 77

165 -

Tabla nS LIII: Influencia del DC3ANG PT sobre la reduccion de nitrate;i . por los microorganismos da un gramo de lodo

Dosis Diluciones

Control -210 ic" -410 10*' -61C -710 - B10 -910 -11 -12 -1310 1C 10 -lA -1510 lü D . n .

1 4+4 4-4 0/32 ■ ++f 4 4 4 + 44 + 4 —3 4+4 4 + 4 444 44 + 44- — 4 lG/3A +++ 4 4 4 444 4 4 4 4 + 4 — — 4 + 4- 21/3

C3 5 4+4 444 4 + 4 + + + 4+4 - - 4 + + 4 + 4 -4 + 2A/3Q 7 + 44 44 + + + + 4 4 + 4 + + 4 + 4 4 + 4 4 + 4 444 + 4- — — — — ——— ——— ——— 29/3

9 44 + 444 4 + 4 + 4 + 4 + 4 44 + 444 + 44 4 + 4 444 4 — 4 — — — 35/312 444 444 444 44 + + 44 444 444 4 + 4 + 44 444 44- 4+4 44+ 444 — — — Al/315 44 + + 44 + 44 + 44 444 + 44 44 + + 44 444 4 + 4 444 4+4 44+ 44+ +4- AA/3

NS ,de Me Crady=332 NB desnitrif ./gr lA. de lodo=110.1G

100m i5 -210 iô“ -A10 -510 -510 -710 -010 -910 1-0 ° D.M.1 --- — — ——— --- —-- —- — — — — — - -- — 02 ——— ——— — —— -- ——— —— — — - — — — ——— — — — 03 + 44 ——— — —— -- ——— --- — — ——— ——— 3/3

(0 A 444 44 + —- — ——— ——— ——— ——— — —— ——— -- 6/3d- 5 444 444 — 4— ——— ——— ——— ——— — — — 7/3o 7 44+ +44 44 + ——— -- ——— ——— -- -- —- 9/3

9 444 44 + 444 --+ -4 ——— -- ——- —- 11/312 + 44 4 + 4 444 44 + 444 --4 —— — -- -- — —- 16/315 44 + 44 + + 44 44 + + + + 44 + --4 — — — —— — — —— 19/3

NS de Mo Crady=310 NG desnitrif./gr. de lodo=4,5.1D

1000m12

— 110 -210 -310 -A10 -510 i5® -710 -810 -916 -1010 D.m.G~'C

0)(d

345

-- ——— — — — — — — - * — — — --- -—- ——— ———CG0

O 79 — 4 -4 + III • 0

3/312 —- + -44 mmmmmm — — — — — — — — — 3/315 4-4 -44 — — «• — V --- — — A/3

NS de Me Crady=22D NS desnitrif./gr. de lodo=2.10

NOTA: En la dosis de 1C.CCD ppm no se registre creciniento ni desnitrificc cion en ningun tubo de cultivo, por lo que el NS desnitrif./gr. de 1

' do=0

166 —

controlDM

12

10 J

1 0 0 ppm

1 0 0 0 ppm

1 0 0 0 0 ppm

31 5 9 151 37 11dias

Fig. 56.- Actividad reductora da los nitratos de la microflora do 1 gr. de lodo en prasancia de Dobane PT.

- 167 -

Tabla nS LIU; Influencia del Ü03ANE PT sobre la reduccion de nitritospor los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis Dilucione!Control ^1lu lô" i f ic" IQ^ lô" lô® 10°

2 ++-3 +++ 4" 4 4—

0) 4 t+4 44 + 4 + 4 44-(0'H 5 4 + 4 4 + 4 44- 44-Q 7 t + + 444 44 4 + 44 444 — 4 4+4 + 44 444

9 4 + + 444 4 + 4 444 444.+44 44+ 44 + 444 — — — — ——12 4 + + 444 4 + 4 444 44+ 44 + 444 44 4 444 444 —4— —4— 44— 4—4 ———15 44 + + 44 4 + + 44+ 444 444 444 4 44 4 + 4' 444 44+ 4+4 44+ 4 44 4——

N9 de nie Crady= 331 NS desnitrif ./gr. de lodo=45 .10^4

100m1

lô^ 102 icP 104 10^-1106 —7 —8 —910 10 10

2345

+--44-444m03 4-4 ## mm mm #» mm_ mm mm mm mm mm'H

0 7 444 444 -44 - —- — — — — mmmmmm

9 44 + 44 + + 44 -- - — -— - ---12 + 44 444 444 -- 4 — — -— — - — ——15 + 44 444 444 44 + + 44 — — —

NQ de nie Cr ady= 300 NS desnitrif./gr. de lodo=2, 5 .10^ '

NOTA; En las dosis de 1000 y 10.000 ppm, no se registre crecimientoduccion de ficantes/g

nitritos en r. de lodo=0

ningun cultivo. por lo que el NG de de;

Lv • 1 i i $

' G 4/3 7/3 11/3 17/3 26/3 29/3 36/3 43/3

D.u.G01/32/35/38/39/310/318/3

f fr- fv

- 168 -

DM 15control

13

11

1 0 0 ppm

1 0 0 0 ppm1 3 5 7 119 13 15 dias

Fig, 57.- Actividad roductora de los nitritos do la microflora de 1 gr. do lodo en presencia da Dobane PT,

AL

— 169 *“

Tabla nQ LV: Influencia dsl DOBANE 3NQ sobre la reduccion de nitratospor los microorganismos de un gramo de lodo

Dosii Dilucione:Control IC^ 10" lô'' lÔ" 10^ ic' lô" 10^ lô^^io^^lô" lÔ^^lD^^lÔ^'

+ 4 4 4 — 4 — — —' — — — — — — — —----------------— — — — — —' — — — — — — — — — -— — — — — ——

+++ 4+4 444 44 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —444 444 444 444 4 4 - --4 - 4 - --- -------------- --------- ----------444 444 444 444 444 — — 4 4 4 “ *“44 — — 4 — — — — — — — — — — — — — — — — ——444 444 444 44 4 444 — —4 444 4 4 4 — 44 — — — — — — — — — —— — — — — — — —444 444 444 444 444 444 444 444 444 4 4 — — — — — — — — — — — — — — — —4 44 444 +44 +44 444 444 444 444 444 444 — 4 — — 4 — — 4— 4 — 4 — ——444 44 4 444 444 444 444 444 4 4 4 44 4 444 4 4 — 444 4 4 4 444 — — —444 +44 444 444 +44 +44 44+ +4+ 444 44 4 + + 4 +44* +44 444 4 4 —

• , 14NS'de nie Crady=332 N2 desnitrif ./gr • de lodo=110.1C

O.K.

OîCJ'HQ

123A5791215

5/311/316/321/324/329/335/341/344/3

100ppm IG* 10 lô^ — 5 —5 —7 —9 —9 rr 1010 10 10 10 10 IB

1 ——— — — --2 -- -- — —3 ——— — — — ——4 4— -4-

S 5 4-4 — 4 — — —

° U4 + 4 444 -4

9 444 444 -412 444 444 -415 4 + 4 44 + 44

“t

-4-

NG de lue Crady=321 NG desnitrif./gr, de lodo=15,lG

D.%.0002/33/37/37/37/39/3

1000 ■PPm . 1C‘ 10 10 10^ lÔ" 10 10^ 10-® lü"

coao

12345 7 91215

--4-444444444+4

— — 4 -- +— — 4— — *t444

4 — 4-4 444

NS de nie Crady=323 NG desnitrif./gr. de lodo=30.10

0CüG2/33/34/35/311/3

NOTA: En ninguno de los cultivas de la dosis rie 10.CGC pprn sa registre r U duccion de los nitratos, por lo que el N2 do desnitrificantss/gr.< loda=0

- 170 -

controlDM

12

10 .

100 ppm

1 0 0 0 ppm

10000 ppm

71 3 95 151311dias

Fig. 58,- Actividad raductora de los nitratos de la microflora da 1 gr. de lodo an presencia de Dobane 3NQ,

- 171 -

Tabla nS LVI: Influoncia del DCHAIiC 3MQ sobre la reduccion de nitritos— por los nicroorganismos de un gromo de lodo

DosisControl

wtoQ

2345 7 9

1215

Diluciones

lô^ i5 lü^ ig" ig" iq lô^ iG^ 10^ ib^îo^îc^îo^î5^î5^^++- +-+ — — — — — — — — — — — — —+ 4+ + + + +---- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---+ + + 4-44 4 + 4 4 4 - --- ----------------------- --------------------------+ 4>V +'V4 4 + 4 4 4 — — 44 4 — — 4 — 4 — 4 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —444 4 4 4 444 444 444 4 —— 444 444 444 4**“ — — — — — — — — — — — — — — —444 444 444 4 4 4 444 444 444 444 444 4 4 — — — — — — — — — — — — — — — —444 444 444 44*^ 444 444 444 444 444 4+4 — 4— —4 — 4 4 — 4 — 4 — — —444 44 4 4 44 444 444 444 444 444 444 44 4 +4+ +44 444 4 44 4 — —♦ • 1 /NQ de f;ic Crady=331 NS dosnitrif,/gr.de lodo=45,10

O . K .

A/37/3

11/3 17/3 26/3 29/3 36/3 4o/ o

10010 10

123A5791215

G/37/37/3

f']9 desnitrif./gr, de lodo = 4,5,10N8 de Ko Crady=310

10 CD Ü42 5 6 7 8 101 3 9 Ta4 1010 1010

S4o 2/34/312

NG desnitrif./gr. de lodo= 4,5.10dy=310

NOTA: En los cultivos con la dosis do 10.000 ppm no se encontre dosnitri- t-, ficacion por lo que el NB de desnitrificantes/gr, de lodo=C

- 172 -

DM 15

control

11

3 9 135 7 151 11

Fig. 59.- Actividad redactors do los nitritos de la microflora de 1 gr. de lodo en presencia ce Dobane JNQ.

— 17 3 —

Tabla nS. LVII: Influencia del LISSAPOL SNXP sobre la reduccion denitrates por los microorganismos de un gramo de lodo

Dosis DilucionesControl 10^ -210 -410 -510 -610 -710 -810 -910 -1010 —11 —12 —13 —1A —15 10 10 10 10 10 O.K.

1 + 44 4 — 4 5/32 + 44 + 44 44 + 4 + - 11/33 + 44 444 44 + 44 + 44- 16/34 44 + 444 44 + + 4 + 444 — — 4* 44- 21/3

S 5 44 + + 4 + + 4 + + 4 + 4 + 4 -+ + 4 + 44 + -++ 2A/3s 7 + + + + 4 + 44 + 4+4 + + + + 4 + + 4 + 444 + 4 + + 4 — 29/3° 9 + + + 44 + + + + + 44 + 4 + + 4 + 4 + 4 + 4 + 444 44 + — 4 — — 4 — ' — + — 4 — ^ 35/3

12 + + + 4'+4 + 4 + 4 + 4 + 4 + 44 + 444 444 + 4 + + 44- +4+ +++ +44 — Al/315 + + + + + + 44 + + 4 + 4 + 4 + 4 + 44 + 444 4*f + 444 444 444 44 4 4‘4 — AA/3

N2 de Me Crady=332 N2 desnitrif./gr • de lodo=110,10^^

100 -1 2 -3 A -5 6 -7 -0 -9 -10 D ,iïi •ppm 10 lô 10 lô 10 10 10 10 10 10

(06}VHO

12345 7 9

1215

——4» + + — + —— — ——4 — 4" 4*f*V — — —4 4 + + 4 + 4 + 4 -----4 + 4" 4 + 4 + + + — — —444 +44 +44 4--4±4L ±4+____+44 +4 +

NS de file Crady=32G

4— ». + 4 +

— — + — 4 +-44 44 + + 44

44 + + 44 44-

NS desnitrif./gr, de lodo=9,5.1Q

0c04/39/311/311/518/323/3

1000 -11C -210 -310 -A10 -b10 -510 -710 -810 -910 -1010

(0<0O

12'i

— — — --- --- —— —ù

A5

+ —+-+

4 — — 4-4 + - +

+ — ++-

---4 — — — 4- — 4

7 +-+ 444 + 4 + — + - 44- 4-4 -4 +9 +-+ 44 + + + + 44- 44- 4-4 — *■412 + 44 444 + 4 + + 44 + 4- 4-4 44 +15 444 t44 ++ + 444 + 44 4 + 4 4+4

? . NG de fiic Crady=310 NG desnitrif,/gr. de lodo=A , 5.10*

001/34/39/315/316/319/322/3

- 174 -

Tabla nG LVII (continuacion)

lO.OOC10

+•+12/312/316/3

4 + -+ 4 ++ +

15MB desnitrif./gr. de lodo=

controlDM14

12 .

10

1 0 0 ppm1000 pPm

10000 ppm

151 39 115 71 3dias

Fig. 60.- Actividad reductcra do los nitratos de la microflora de 1 gr. de lodo enprasencia oo Lissapol 5MXP

- 175 -

Tabla riG Ll/III: Influencia del LISSAPOL SNXP sobre la reduccion denitritos por los microcrganismos de un gramo de lodo

DosiiControl

09to'HQ

123A579

1215

100ppm

09to'Hca

12345 7 .91215

1000p p m

C9(0Q

12345 7 91215

r\

Diluciones

IG^ 10- lô" l ù ^ IG^ lô’ JD^ 10° XG^°lê“ lÔ^\D^dc^^G^‘+ +- +-+ --44+ 444 H — — — — — ——— — — — — — — — — — ---— — — — — — ——4 4 4 4 + 4- ++-4 + 4 — — — — — — — — — — — — — — — — —— —' — — — — — — — — — — — ~ — — —4 + + +4+ 4 4 4 44— 44— — — 4 + —— 4“+ — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —44 4 4 4 4 +44 4 4 4 4 4 4 — — 4 444 4*44 444 4 — — — — — — — — — — — — — — — — —444 4 4 4 4 4 4 444 444 4 + 4 444 444 44 4 44— — — — — — — — — — — — — — — —444 444 4 + 4 444 44 4 +44 444 44 4 444 444 — 4 — — 4 — 4 4 — 4 —4 — — — 4^4* 444 444 444 444 444 4 4 4 +44 +44 +44 444 4 4 4 44 4 +44 4 — —

NG de f:lc Crady=331 NG desnitrif./gr. de lodo=45.1G^^

lÔ 1C lô'* lô^ lô' lô^ lô' 10^ lô''

— 4 4 4 - 4 —4-4 + 44 4 4 44 + 4 4 4 4 4 4 44 + 4 + 4 + 4 + 44 + 4 4 + 4 + 4 4

+ —-* + + +

4—— 44+4+4 444 444

r.-S - de~fitcr~Cradys:3utI' nrtrlf'T/gr V“ de -Icrrc^2,5. Itr

l ô ' lÔ^ -3 -Cl10 lô' lô' lô^ lô' lô' l ô "

4— 4 —

4 - 4 4 4 4 4 4 - - 4 -4 - 4 4 + 4 4 4 — 4 4 — — 4 — —— 4 — 4

4 4 + 4 + 4 4 + 4 + 4 4 4 4 — — — 4 4 - 44 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ——4 4 4 4

NG d e nie Crady=313 NG desnitrif ./gr

4/37/311/317/3:G/329/336/343/3

G0004/3B/310/314/321/3

01/32/311/312/317/319/3

- 176

Tabla nG LUIII (continuacion)

lü.OGC__

-910

1/312/312/315/312

15NG desnitrif./gr. de lodo=4,5.1Gde file Crady=310

control

13

100 ppm

1 3 5 7 9 11 13 15- ' dias

Fig, 61,- Actividad reductcra de los nitritos do la microflora de 1 cr. de locoen prasencia de Lissapol SNXP

- 177

Tabla nS'LIX: Influencia del LISSAPOL DS4429 sobre la reduccion denitratos por los microorganismos de un gramo de lodo

DosisControl

CD(0Q

12345 7 9

1215

100ppm

coa'H

Q

123A579

1215

Diluciones

l5~ 10 10 10" 10 10 lÔ 10 10 1Q°1C 1Q"1Ô 1G~1Ô^+ 4+ 4 — 4' — — — — — — — — — —— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —

+++ 4 + + 444 4 4 - ---- --------------------------------------------------444 444 44+ 444 4 4 - --4 - 4 - ---- -----------------------------------4 44 444 444 444 444 — — 4 4 4 — —44 — — 4" — — — — — — — — — — — — ——— — ——444 444 444 44 4 444 — —4 444 44 4 — 44 — — — — — — — — — — — — — — — —— —444 444 444 444 444 444 444 444 444 4 4 - --- --------------------44 4 444 444 444 444 444 44 4 444 444 444 — 4 — — 4 — — 4 — - 4 — 4 — — —444 444 444 444 444 444 444 «44 4 444 444 4 4 — 4 44 444 444 — — —444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 44-

N2 de nie Crady=332 NB desnitrif./gr. de lodo=llD.10^^

lô 10^ lô^ lô' lô' lô" lô' lÔ lô:'

— 44"— 44" 444 444444444444

-4--44444444444444

-4--4-44-44-444444

-4-444444444444

--4-44 4 4 4 444 444

— 4 — -44 444

-4-— 4 — 44 —

-4-444

NG de nie Crady=323 NG desnitrif./gr, de lodo=30,10

D . n i .5 / j 11/3 16/3 21/3 24/3 29/3 35/3 41/3 44/3

G02/34/3B/314/316/319/323/3

1000p pm

co(0'HO

12345 7 9

1215

lô: lô" lô' iô ‘ 1C® 1C® lô' 1C® i5® 1Ô^°

4-44-4444444444444

— 4— 4 444 444 444 444 444

-4--4--4--44- — 44

NG de nie Crady=322 NG desnitrif./gr. de lodo=20.10

ü .ni.0G1/33/35/37/37/37/310/3

- 178 -

Tabla n^LIX (continuacion)

10.000ppm 10^ 10 ' 10-= lô" 10^ lô^ lô* ID® lô® iô'° ■ D.f;V,

1 — —— — —— — — — MM MM MM - —— — — — — — — — —— Q2 — —• —— — — — — — — — — — M-mmm. — —— — —— ——— — —— 03 ^ tm OTMMMM MM «M MM MM MM MM — — — — — — — — — — 0

44-- MM M M MM MM MM MM MM MM MM MM MM — — — — — •mmmw *• " — 2/3««5 5 + + - 3/3S 7 + + 4 + Mm MM «M «M MM MM MM'* MM MM MM. MM — — — — — — — 5/3

9 ++4. 44t — — — — - - M M - M M — — — — — — — — — — — — 6/312 +++ + 44 44 + — — M M * — MM MM — — — — --- — — — — — — 10/315 +-t*+

NB de

..- » •

444 ' 44 +

(île Crady=301 NQ desnitrif./gr. de 4lodo=4 • 1013/3

D Mcontrol

14

12

10

lOQOO ppm

lOOOppm

1 73 5 159 1311dias

Fig, 62.- Actividad roductora de los nitratos de la microflora de 1 gr, de lodo o;

- 179

Tabla n - LX: Influencia del LISSAPOL D54429 sobre la reduccion denitritos por los nicroorganismos de un gramo de lodo

Dosis DilucionesControl lÔ lÔ^ 10^ lô" lÔ^ 10^ 10* 10 i5' ic' 'l c./;

12 d/3 +4+ 44+ +-- 7/

on4 44+ 4+4 44+ 4 4 — 11/5 4 4 4 4 4 4 4 + 4 + + - 4 4— — — 4 4- 4—4 --- — — — — — 1/''

n 7 44+ 444 444 + 4 + + 4 4 — — + + 44 44+ 44+ +— - ::/9 4+4 44+ 4+4 4 + 4 44+ 4+4 44 + +4+ 44+ 44- -“ — — — — 29/12 4 4+ +44 444 4+4 4+4 444 + 44 44+ 4+4 + 44 - — 35/15 44+ +4+ +4+ + 4 + 4+4 4+4 44 + 44+ +44 44+ 44+ +4+ +44 4+4 +-- 4 3/

IjB de Ciic Cracy=331 MS desnitrif./gr. de lodo=45.1C^^

100ppm 10 1C- lô" -4IL lu-s lô' lô' -810 lô® lô'® D/:.

1 * — — ——— ——— ——— — — — — •* — — — — — — — - — — L,23

— —— -- --- — — -— ——— — —— — — — — —— Gco(0'H

45

— —-4 +

-— ——— ——- — — — --- -- — — — -- 1/2/Q 7 + 4 + -44 4-- G/

9 + 4 + -44 +-- 44 + -44 - + - -4- — — “ -- — —— 14/12 444 + 4 + + 4 + 4 + 4 44 + —+- + + - — — — -- — —— 10/15 444 444 444 + 44 + + + -4- + + +

C19/

MB de nie Crady=313 MB desni trif ./or. de lodo=Ï6.10

lOCOppm i5 lô^ -410 10^ lô' lô' -S10 lô ig "' 0 Jfi

12345 7

——— —— — — — — — — — — — — --Cüp

naQ

+— + -4

— + 444

-- -- ——— -- -- •* — — — - -— 1/5/'

9 + 4 + 44 + -- -- — — -- —- — — ——— — C/12 + 4 + 44 + — — — — —— ——— — — — —— — —— — — — -- 6/15 + + + + 44 - —— --- ——— -- — — — —- — -- - — 5/

MB de Aie Crady=30Q MB desnitrif./gr. de lodo=2,5.10^

- 180 -

Tabla nS LX (continuacion)

10

1/34/310/313/3

1215

NS desnitrif./gro de lodo=4.1Cde nie Crady=3Cl

DM 15

control

13

11

1 0 0 p p m

1 0 0 0 p p m

31 5 7 9 11 13 15d ia s

Fig. 63,- Actividad reductora de los nitritos de la microflora do 1 çr, de lodoprooencia de Lissapol US

— l81 —

VIII.3.3. Influencia sobre la fijaciôn libre aerobia del Nitrogeno atmosférico.

Se siguiô el método descrito en el apartado 9 del Capitule del Material y Métodos. Los resultados se expresan en la Tabla LXI y Figura 64.

DM6

5

4

3

2

1

i i

j js. 0 .5 .

IIIJFEN.T77

i ^ ^ ^DOB. ?T

Il IIDOB.JNa U5.SNXP

! ^ JU S . D5

Fig. 64. Influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre la fijaciôn libre aerobia del Nitrôgeno atmosférico por los microorganismos de 1 gr. de lodo.

- 182 -

Tabla NS LXI: Influencia da la concentracion de tensoactivos sobre la fijaciôn libre aerobia del N2 atmosférico por los microorganismos de un gramo de lodo

Dilucionesüosis de tensoactivo ppm lô 10“ 1-0^ lÔ^ lô' lô' D.M.

NG de fijadores /gr. de lodo

Control + 4-V 4 + 4 444 44 + V44 -4- 16/3 4,5.10^

in lOC ppm 4 4 + + 4- -4 + 4-- . . . 11/3230.10^

Q IQGC ppm - - - — — — — —— — — — — — — — —— 0 0m 10.DUO ppm — — - — — - — — — — — — — — - 0 0

c0 100 ppm 4 + + + 44 + 44 44- 11/3 9,5.10^0 1000 ppm 4 + 4 444 + 44 — — — •• M -p pppp*p 9/3 2,5.10^0 10,000 ppm + + + 444 44- •• •» M W PP pp PP PP B/3 9,5.10"L.1— Q. 100 ppm + 4 V 444 + 44 4- 12/3 2,5.10*n 1000 ppm 4 + - 4 4 — — — — — P. P. pp P. «p /t/3 2.100- O 10,000 ppm — “ — 0 0

cr2' 100 ppm 4 + + 444 444 •V- - 10/3 4,5.10^t ■) 1000 ppm — — » — — — — — — — — WPP PP PP PP OT 0 0JC0 lü.DDû ppm — — — — — — — — — •> M M - PP PP «• PP PP PP 0 00CLX 32: 100 ppm + + + 444 444 + - - — — P* 12/3 15.10^

1000 ppm + 4 4 444 4 + 4 4 — — — — — — — — 10/3 4,5.10,•H 10,000 ppm + 4 + 44 + 44- p,—— ■ »PPPP 8/3 9,5.10“

eno 100 ppm 4 4 4 444 444 11/3 9 ,5.103n lOCC ppm 4 + 4 4 + 4 4 + 4 «P P. P. P.PPPP 10/3 4,5.10•rH 10.000 ppm + 4 4 44 + 444 — — — — — — — 9/3 2,5,10^

- 183 -

VIII.3.4. Interpretacion de resultados.

•En la bibliografla consultada no hemos encontrado ninguna cita referente a la influencia que puedan tener los productos tensoactivos sobre los microorganismos implicados en los procesos del ciclo biolôgico del Nitrôgeno.

De las pruebas realizadas por nosotros y anteriormente expuestas se puede deducir :

A.- Procesos de Amonificaciôn y Nitrificaciôn :

- El Sodio Dôdecil SulPato produce una disminuciôn del numéro de microorganismos viables amonificantes de forma graduai de 100 a 10.000 ppm., siendo en la dosis de 1000 ppm. unas 10^ veces inferior con rela ciôn al valor obtenido para el control. La actividad amonificante de los microorganismos résulta retrasada casi en la misma medida para todas las dosis, si bien se observa que en las dosis mayores tarda mas - en comenzar la amonificacion.

Para los g ’ermenes nitrificantes este producto se---------------muestra como bacteriostâtieo,-'ya-que—so-lo— se-desarro— -

llaron en la dosis .inferior y en algûn tubo de la pri^ mera diluciôn.- Con Fenopon T 77 se produce una inhibiciôn mayor en el desarrollo de los microorganismos amonificantes - que en el caso anterior, reduciéndose considerable - mente su numéro de una manera graduai a medida que - aumenta la dosis. De igual forma résulta progresivamente disminulda la actividad amonificante reflejada en las curvas.

^^ En cuanto a su acciôn sobre los nitrificantes, este,' producto produjo una inhibiciôn total del desarrollo

de los microorganismos oxidantes del amonio, mientras

- 184 -

que para los oxidantes de los nitritos solo se desarrollaron en la dosis de 100 ppm. y con un numéro de viables en 10 veces inferior al control.- Dobane PT muestra una acciôn inhibidora muy fuerte del numéro de viables tanto amonificantes como nitrificantes, de forma que en la dosis de 100 ppm. el numéro de qérmenes amonificantes que se désarroilaron

gera inferior en 10 veces con relaciôn al control. - La .actividad amonificante se muestra muy disminulda, pero se ha observado que en la dosis mas elevada, -10.000 ppm.-, • comienza mas pronto la producciôn de - amoniaco que en las dosis inferiores.Los microorganismos nitrificantes resultaron completamente inhibidos por la presencia de este tensoactivo en el medio en todas las concentraciones utilizadas.- Dobane JNQ produce tambien una reducciôn muy notable del numéro de gérmenes amonificantes que en con-

”1 ocentraciôn de 1000 ppm. es 10 veces inferior al - numéro obtenido en el control. Ademâs la actividad -amonificante résulta-retrasada en los cultivos-con. ^dosis de 1000 y 10.000 ppm. en los que la producciôn de amoniaco no comienza hasta después de las primeras 24 horas de incubaciôn.

En cuanto a la nitrificaciôn, los microorganismos - oxidantes del amonio no se desarrollaron en dosis superiores a 100 ppm. y aûn en esta dosis lo hicieron - en numéro 100 veces inferior al control, mientras que los gérmenes nitricos manifestaron su actividad aun - que de forma muy reducida en 100 y 1000 ppm. quedan-

f do inhibidos a concentraciôn de 10.000 ppm.- El tensoactivo no iônico Lissapol SNXP es, de todos los productos utilizados el que en conjunto afecta en

- 185 -

menor grado a estos dos procesos del ciclo del nitrôgeno. El numéro de viables amonificantes résulta igual al del control en los cultivos con 100 -ppm. si bien su actividad es mas lenta ya que no se detecto amoniaco en el medio hasta después de 24 - horas de incubaciôn.En los cultivos con 10.000 ppm ocurriô que, aunque los microorganismos se desarrollaron dando un numéro aproximado de 2 ’5. lO^segûn las tablas de Me. Crady,no encontramos amonifica - ciôn en ninguno de los tubos lo que creemos que - podria ser debido o bien a una baja producciôn y répida utilizaciôn del amoniaco formado, o bien a que en dicha concentraciôn sea posible el crecimien to de los gérmenes, pero estos resulten imposibili- tados para desarrollar su capacidad amonificante.

Respecte a la nitrificaciôn no se ha producido - inhibiciôn ni de los gérmenes nitrosos ni de los nitricos, aunque si resultan bastante rebajados en nu mero respecte a los contrôles.

_.Lissapol. DS rebaja_ el_nm.ero_de_gérmenes_^^cantes asi como su actividad biolôgica en concentraciones de 100 y 1000 ppm., mientras que a 10.000 -ppm. ocurre que, como en el caso anterior, se pro - duce un desarrollo de los microorganismos en numéro aproximado de 16. 10^ pero en ninguno de los culti - vos hay indicios de amonificaciôn.

En los gérmenes nitrificantes résulta inhibida la oxidaciôn del iôn amonio por encima de 1000 ppm y la oxidaciôn de los nitritos por encima de 100 ppm.

B.- Procesos de Desnitrificaciôn.- En los cultivos con Sodio Dodecil Sulfato se ob - serva una disminuciôn del numéro de gérmenes viables reductores de los nitratos y de los nitritos en ra -

?\

“ 186

z6n directa con la concentraciôn de tensoactivos en el medio ademâs de que la actividad reductora résulta retrasada para los microorganismos responsables - de la reducciôn de los nitritos en concentraciôn de 1000 y 10.000 ppm. en que como se puede observar en las curvas correspondientes, solo empieza a verse - una desnitrificaciôn total a partir del 3 2 o 49 dias de cultivo.- Fenopon T 77 produce tambien un retraso en la actividad biolôgica tanto de los microorganismos reductores de los nitratos como en la de los que utilizan - los nitritos formados hasta su desapariciôn del medio de cultivo. Sin embargo, en ambos casos, en concentraciôn de 100 ppm se alcanza al final de proceso un nû mero de viables reductores caso igual al del control.4- Dobane PT inhibe la reducciôn de los nitratos en - concentraciôn de 10.000 ppm. y a 100 y 1000 ppm. rebaja muy notablemente la actividad biolôgica y el numéro de viables responsables de esta transformaciôn de nitratos en nitritos. En cuanto al desarrollo y acti-

— -— -vidad de los gérmenes que utilizan y -reducen—los-nitr^tos formados, queda i.nhibido ya a 1000 ppm. Hemos ob - servado que en esta dosis de 1000 ppm. en algunos de - los cultivos comienza la reducciôn de nitratos, pues - to que se détecta en los tubos la presencia de nitri - tos, y en los ’ultimos dias estos nitritos comienzan a desaparecer, pero no se llega a una desnitrificaciôn - total.- Dobane JNQ tiene un efecto parecido al anterior, in-hibiendo tanto la reducciôn de los nitratos como la -de los nitritos cuando se utiliza en concentraciôn de10.000 ppm. En 100 y 1000 ppm. rebaja considerablemen-

- 187 -

te el numéro de viables desnitrificantes ademâs de - producir un marcado retraso en là actividad reducto-

' ra de esos gérmenes ya que la reducciôn de nitratos no comienza hasta los dias 3 ô 4 de cultivo y la desapariciôn de los nitritos no se hace patente hasta el 42 o'62 dia. Por otra parte, en los cultivos con dosis de 1000 y 10.000 ppm. hemos observado que igual que en el caso anterior comienza la desnitrificaciôn en algunos tubos, pero parece quedar bloqueada y no - llega a ser total.- Lissapol DS rebaja tanto la actividad reductora co-

,' mo el numéro de viables, pero no llega a producir inhibiciôn total en ninguna dosis.- Lissapol SNXP es en conjunto el tensoactivo que demuestra una influencia menos acusada sobre este proce so, como tambien ocurria con la amonificaciôn y nitrificaciôn. Las curvas de actividad desnitrificante co ■ rrespondientes a los cultivos con las très dosis de - este producto resultan bastante prôximas entre si con lo que parece ser que no existe una diferencia marcada entre las dosis mlnima_^^ maxima en .lo_jreferente___a._la velocidad de reducciôn de los nitratos o de los nitritos.

C.- Fijaciôn libre aerobia del Nitrôgeno atmosférico.El nûmero de gérmenes viables que fijan libremente el Nitrôgeno atmosférico résulta bastante disminuido con la presencia de tensoactivos en el medio, Parecen — ejercer un efecto mas acusado los aniônicos que los - no iônicos ya que el proceso résulta inhibido en concentraciôn de 1000 ppm. de Sodio Dodecil Sulfato y -

Dobane JNQ y con 10.000 ppm. de Dobane PT, mientras - b, que ninguna de las dosis de los Lissapol SNXP y DS —i

llega a producir una reducciôn tan fuerte.

- 188

En conjunto, podemos decir que los procesos del ciclo del Nitrôgeno estudiados experimentan una reducciôn muy considerable cuando los microorganismos responsables de su consecuciôn- se desarrollan en presencia de tensoactivos.

Hemos visto que los tensoactivos tienen una interacciôn con las proteînas en general, y de acuerdo con esto, tambien ten - drân interacciôn con aquellas proteînas especiales que poseen una actividad espectacular de uno u otro tipo cuyos resultados a me - nudo se pierden reversible o irreversiblemente. Glassman (1951) - estudiô una enzima, la lisozima, consiguiendo su inactivaciôn compléta aunque se requerian concentraciones bastante elevadas de ten soactivo y.algo menores para los aniônicos y catiônicos que para - los no iônicos. Parece que la inactivaciôn es consecuencia del bip queo de ciertos puntos por las moléculas de tensoactivo y el résultante deJ-^plegamiento o disociaciôn y quizâs la mejor evidencia de ello ha sido presentada por Gorin (1967) indicando que el Sodio Dodecil Sulfato disociaba la ureasa purificada ( p.m.480.000 ) en subuni dades de peso molecular alrededor de 60.000 que se asociaban con aproximadamente igual peso de Sodio Dodecil Sulfato. Las observa - clones se hicieron a una concentraciôn de ureasa de unas 5.000 ppm. con Sodio Dodecil Sulfato entre 2.000 y 20.000 ppm. La ureasa per - dia su actividad enzimâtica irreversiblemente.

Numerosas enzimas son obstruidas en su actividad catâliti- ca por la presencia de tensoactivos aniônicos a concentraciôn entre 100 y 1000 ppm. y varies investigadores han observado un incrementc de inhibiciôn con los radicales hidrôfobos de mayor longitud (Mathen 1954 sobre hialuronidasa, Czok, 1968 sobre fosfatasas e invertasa ) Segûn esto, nosotros pensâmes que, a^parte de las alteraciones que puedan tener lugar en algunas de las estructuras bacterianas como - consecuencia de la presencia de tensoactivos en el medio, es posi -ble que la reducciôn o inhibiciôn observada en los procesos de amo •■> -/nificaciôn, nitrificaciôn, desnitrificaciôn y fijaciôn libre aero - bia fuera tambien debida a interacciones de dichos tensoactivos con

— 189 —

algûn tipo de enzimas de las que intervienen en estos aspectos del ciclo del Nitrôgeno.

Por otra parte, encontramos que la acciôn inhibidora de los tensoactivos sobre los microorganismos que intervienen en el - Ciclo del Nitrôgeno es mucho mâs fuerte en conjunto que la de otros productos considerados como posible causa de poluciôn en los sue - los. Asf, Mendoza, C. (1971) ha hecho un estudio semejante al realizado por nosotros utilizando varios Pesticidas frecuentes en la prâctica agrlcola y de ellos solo uno, Rogor producfa una inhibi - ciôn en la desnitrificaciôn cuando era utilizado en concentracio - nés superiores a 1000 ppm, y otro, el carbamato sevin, rebajaba êl nûmero de gérmenes viables por encima de 10 ppm, pero sin lie - gar a inhibir ninguno de los procesos estudiados. El resto, sôlo - en dosis muy altas afectaban ligeramente dichos procesos.

- 190 ~

VIII.4. Influencia sobre algunos aspectos del Ciclo delCarbono.-

VIII.4.1. Influencia sobre la Amilolisis.• • Se siguiô el método descrito en el apartado 10 del Capi

tulo de Material y Métodos. Los resultados se expresan en las Ta bias LXII a LXVII.y figuras 65 a 71.

IllS. O.S.

i i

j jFEN.T77

j j âDOB. PT DOB.INCl US.5NXP

e 1 I Ij jLis. DS

Fig. 65. Influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre la Amiloli sis realizada por los microorganismos de 1 gr. de lodo.

- 191

tabla nS LXII: Influencia del SODIO DODECIL SuLEATO sobre la amilolisis realizada por los microorganismos de un gramo de lod

Dosis Diluciones

ontrcl 10^ 10“ 10“ lô' IG^ 10“ 10* IG^ ir-" 10- 'n ^

123

+ 44+ 4 +

4 — 4 4 4 — 4 —

— — — —— ——— ———0

7/34 + 4 + 4 4 4 . - + 4 — — — ——— — — — — — — — — — mmmmmm — — 8/3

s 5 44 + 4 4 4 - 4 4 — — — — — — mmmmmm — — — — — — mm mm mm «•«•MF 8/3'H 7 Q 4 + 4 4 4 4 4 + 4 — —— ——— ^ — ——— — — — rnmmmmm •• •• — 9/3

9 4 + 4 4 4 + 4 4 4 — —— — 4 ——— — — — mm mrnmm 11/312 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ' +++ 4 + 4 ——— — — — mmmrnm- M M. M 16/315 4+’+ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 + + 4 - 4 --- mmmmmm 20/3

fiQ de Me Craay=320 NG amiloliticos/gr. de lcdo=9 ,5.1ë '

100m lô^ lô" lô^ lô^ 10^ lô' -7 -810 10 10^ lô'' D.M.1234 - 4 -

- —— ---——- ———

--——— ——— — — —

GC0

1/3S 5 S 7

- 4 -4 4 - — 4 4 - 4 -

2/35/3

9 4 4 4 4 4 4 4 4 - 4 — 9/312 + 4 4 4 4 4 4 4 - 4 — 9/315 4 4 4 4 4 + 4 4 - 4 - - 9/3

NG de Me Crady=3 21 NG amilcliticbs/gr. de-lodo:15.10^

1000pm IG^ lô- 10^ -410 IL-' lô' -7 -810 10 lô' 10^' !

n ^

12 M M M M n* w » MB mm mm mm mm mm mm mm mm mm mm mm mm

üc

34

o 5 S 7

9

— — — — — —

— — -— — — — — — — — —

— — —

— — —C00cQ

1215 -44-

02/3

NG de flic Crady=20G NG amiloliticos/gr, de lodo=0,9.10

- 192 -

Tabla nS LXII (continuacion)

lO.OCü

-PP-r- --—1 — 2 —3 —A “5 —6 —7 —8 —9 —101C 10 10 10 10 10 10 10 10 10

D.fn.

01C3O

12345 7 91215 4-++ ——+ —— —

NG dé Me Crady=310 NG amiloliticos/gr. de lcdo=4,5,lG

1/31/31/34/3

Vf

c o n t r o l

100 pprn

10000 p p m

1000 p p m

3 91 75 1511 13 dias

Fig, 66,- Actividad amilolitica de la microflora de 1 gr, de lodo en presencia do Sodio Dodecil Sulfato

u

- j -

Tabla r»2, LXII I : Influencia del FENQPON T 77 sobre la amilolisis rea-lizada por los microorganismos do un gromo da lodo

DilucionesDosis

IDControl 10

-44- 4 44 4 4

Ü/ J9/311/3

16/32C/3

Q1215

lollticos/gr. do lodo=9,5.10NQ da Me Crady=32C ami

1010 ID 10

'c-tQ1215

NG amiloliticos/cr. de lodo=30.10NG de (Tic Crady=323

1000 PJIM. . 10 10

1215

NG amiloliticos/gr. de lodo=D,9.10rady=200

NOTA; En los cultivos con dosis de 10,000 ppm no se detecto amilolisi:

194 -

control

100 ppm

1000 ppm 10000 ppm

8 51 7 9 1311 15dias

Fig, 67,- Actividad amilolitica de la microflora del or, de lodo en presencia de Fenopon T 77.

- 195 -

Tabla LXIV : Influencia del DCBANE PT sobra la aii'.ilollais rea-liz ada por les microo rganismo s de un gramo de lodo

Dosis Diluciones

Control -1 -2 -3 -4 -5 -G -7 -8 -9 ,-10 O.K.10 10 10 iU 10 10 10 10 10 1012 + -V + 4—

-- — —- — --- --- — —— C

3 -*44 44 + -4- —— ——— — — — — --- --- - —- 7/3M(0

4 + 44 4 44 - 4 4 — — — —— — — — 0/35 4 + 4 4 + 4 - 4 4 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 8/3

Q 7 + + + + 44 4 + 4 — — — — — — - — ' — —— —-- — —— — —— 9/39 4 + 4 4 44 4 + 4 — — — --4 - + - — —— ——— --- ^ 11/3

12 444* 4 + 4 4 4 4 +- + 4- 4 + 4 —-V — — —- ——— — —- lG/315 4 + 4 + 44 444 + + + 444 44 + + - + ——— ——- — — — 20/3

NS de 1T:C C rady=32C Nfi amiloliti cos/g r. de lodo= 9, 5 . 1 0 ^

100 -1 -2 -3 -4 - 5 -5 -7 -8 -g -10 o . m .ppm 10 1C 10 lU 10 10 1C 10 10 10123

- — — — — ---- — — — — — — — -- — —nC

4 4 + t m» M W M «# mm «• #* mm mm mm «■ #*» mm mm mm mm mm mm

1/3/3

o 5 4 + 4 w ^ M mm ^ mm mm mm mm w «. «• mm mm mm mm mm mm A/3(0'H 7 4 + 4 -4 4 “ k- — mm mm mm mm mm mm «» w rnmmmwmm mm 5/3O 9 + 44 + 4 + — — • — — mmmm^ wmmmmm mmmmmm mmmmmm 6/3

12 44 + 4 4 4 — — — — — — — — mmrnmm» — — — mmmmmm 6/315 4 + 4 + 44 — — — — — — - — mmmmmm — - — mmmmmm — — - 6/3

N2 de Ilc Crady=3DC N2 amiloliti cos/g r . de lodo= 2 , 5 .10^

NOTA: En las docis de 1000 y 10.000 ppm no se detscto amilolisis en nin gun cultivo.

r-,A

Tabla nS Li<V : Influencia del DOBANL 3îiQ sobre la omilolisis realizariapor los microorganisrp.OG de un gramo de lodo

Do sis Oil uciones

Con trol IG^ lO^ 10-3 lô^ 10^ 10* 108 1Ü° lôio D.m.12 +++ 4. _ M

--- — — --— ——— --- -- « — 0

V z3 4 + 4 4+4 -4- ——— ——— ——— —— — —-- — — — 7/3A 44 + 444 - 4 4 ——— ——- —— — ——— --- -- — 8/3

tf) 5 44 + 4 4 4 - 4 4 ——— ——— —— — — —- -- ——— — 8/3'H 7 4 + 4 4 4+ 4 + 4 -- ——— ——— — — — — —- 9/3O 9 44+ 4+4 444 — - --+ -4- ——- ——— 1 1 / 3

12 44 + 44 + 44 + +4 + 44 + — 4 — ——— — —- —— — rnmmmmm 16/315 44,4* 444 44 + + 44 4 4 4 444 4 - 4 -- --- 20/3

N2 de Mo Crady=320 NG amiiolit icos/gr de lodo=■9,5.10^

ICO -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 8 -9 -10 D .P .PPrn 1C 10 10 10 lU 10 10 lu 10 10^

(0co

12345

——— —- —-— -- ——- ---. — - ———

00000'HO 7

94— 4-4 4 --

2 / 3

3/312 4 + 4 4 + 4 — 4 ——— --- ——— --- - -- —— — 7 / 315 444 + +4 -44 — — + -—— — — - — — -- 9/3

NG de flic Crady=3 21 "NG amiloliticos/gr de lodo= 2=15.10

NOTA: EIn los cul tiVOS con dosiS de 1000 y 10.000 ppm no se detectoamilolisis

•??

- 197 -

control

1 0 0 ppm

1 3 5 7 9 11 13 15dias

Fig. 68.- Actividad amilolitica de la microflora de 1 gr. de lodo on presencia do Dobane PT.

con t ra !

100 ppm

97 15133 5 111 dias

> AFig. 69.- Actividad amilolitica de la microflora de 1 gr, de lodo on presencia

de Dobane 3NQ.

— —

Tabla ri9 LXUI: InPluoncia del LI55AP0L SNXP sobre la amilolisis rec-• ' lizada por los microcrganismos de un gramo de lodo

D o s is D i l u c i o n e s

C o n t r o li g " l c r l ô ' " lô '* 1G = l6 ^

- 7 -3 -910 10 10 l ô ^ ^

ü .1'! .

1 . 2 3

v-v-v 4 4 +

4 --4 4 4 - 4 -

- - - — — — ——— -----C

4 / 37 /3

4 4 4 4 4 4 4 »• + 4* — — — — — — —— — mm mm ^ B /3V )a 5 4 4 4 44 + - 4 4 — — — — — — ——— — •* — 0 /3Q 7 4 4 4 4 4 4 4 + 4 — —— — —— —— — — 9 /3

9 4 4 4 4 4 4 4 4 4 — —— -•* + - + - •mmmmr. i l / 312 4 4 4 4 4 4 4 4 4 44.4 4 4 4 - 4 - ^ —— 1 6 /315 4 4 4 4 4 4 + 44 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 0 /3

N2 de Me Cra d y = 3 2 0 NQ em i l o l i t i c o s / g r . de lo d o = 9 , 5 . 1 0 ^

100 _PPn____ lÔ^ 10^ lô ^ lô"^ 3 0= IQ^

- 7 -8 -910 10 10 1Q^^‘

D ,r;,.

o

12345

4 - 44 - 4

— +— 4— — 4

- —— — — —

w ## «*

00

1 / 33 /33 /3

'HO 7 4 - 4 44 + ——— — — — mmmmmm •Vmmmm 5 /3

9 4 4 4 444 4 - 4 — —— — — — mmmmmm 8 /312 4 4 + 4 - 4 — — — •* — — ^mmmm — — — 0 /315 4 4 4 + -4 ----- — — — mmmmmm — - — 8 /3

fJS de Tilc C rady=32C JJ2 a r n i l o l i t i c c s / g r , de lo d o = 9 , 5 . 1 0 "

lOüC _ ppm lÔ^ 10 “ IC ^ l ô ' 10^ 10-=

- 7 -8 -910 10 3 0

U .u .

12

---— — — — — — - 00

enco

34 ♦♦+ ::: 0

3 /35 4 4 4 •V ## M mm •4 «V «4 mm. mm mm ## mm mm mm mm 5 /3'■H

Q 7 + 44 44-4 — — — — mmmmmm. mmmmmm — —— ——— — — — «> mmm. 6 /39 4 + 4 4 4 4 — — — — — — — — — — “ — — — — 6 /3

12 + + + 4 4 4 — — — — — — — — —— 6 / 315 4 4 4 + 44 + - + 4 — — 4- — —- — — — — 1 0 /3

f'JS de fiic C ra d y= 3 2 2 M2 amiloliticos/gr. de lodc=2 20 .1 0

Tabla nS LXUI (continuacion)

10104-4

U / O

B/38/3

11/312

NG aniloliticQs/gr. de lodo=7,5.1Qde (TiC Crady=311

M

rc o n t r o l

»

.1 OOOOppm1000 PP m1 00 ppm

1 3 5 7 9 11 13 15dias

Fig. 70»- Actividad amilolitica de la microflora de 1 gr. de lodo en presencia d Lissapol SNXP

Hr- K

- 200 -

Tabla nS LXUII: Influencia del LI55APDL OS sobre la amilolisis reali-zada por los microornanisnos do un gramo do lodo

Dosis Diluciones

Control 12^ 10^ lô^ i5= 10^ -7 -810 10 lô' -1010 D.M.

123

+ 44 4+4

4--444 - 4 -

— — — — — — — — - — —— ——— — —- ——D

A/37/3

0)C34 ♦ 44 4 + 4 — 44 ——— ——— — —— —— — — — — — ** — 8/35 44 4 444 -44 — — — — — — — — - — — — — — — — — — •--- 8/3V4

Q 7 444 + 44 4 + 4 — —— — — —— ——— ——— — “ — —-- 9/39 44t 4 4 4 + 4 4 ——— -4 — 4- ——— ——— — —— — — — 11/312 4 +4 + 44 + 4 4 444 4+4 -4- ——— —— — mmm,mrn — — — 16/315 444 44 + 444 444 444 444 4—4 ——— — — 20/3

NS de nie Crady=320 NG amilolfticos/gr. de lodo=9 ,5.10®

100.P_P.ni IC^ l5^ 10^ lô' 10-^ -510 — 7 — 810 10 -910 D .M .

w

1234

— —- - - — - — -- - - -

— — — — —— — —

GC0D

o 5 0'riO 7 — — — » « mm mm —• mm mm mm «M ^ mm m* mm mmmmmm mmmmmm mm mm mm 09 4 4 4 - 4 - M W •• mm mm mm mmwmmm mmmmmm mm mm mm ^ mm ^ — — rnmm^mm 4/312 ♦ 44 - 4 - 4 / 315 + 44 4 4 4 - - - - — — mmm,mm — — — — — — — — mmmmmm 7 /3

Ivfi de flic Crady=310 NO atniloliticos/gr. de lodc=4 ,5.10^

1000p p m

-110 — 210 —310 -410 -510 -610 - 7 -S10 10 -910 D.m.

ffj(0'H

12345 7

————

— — “- - - — —

— - — - - -0c00c0O 9 -44 M W — mmmmmm mm mm mm mm mm mm mm mm mm mmmm mm V M «« mmmmmm 2/3

12 - 4 4 M M M V mmmm mm mm mm mm mm mm mmmmmm tm mm mm mmmm mm mm mm mm 2/315 4 4 4 — — — — — rnmmmrnm mmmmmm — — — """""" m m ^m rn — — — 3/3

f m de nie Crady=30Q m amiloliticos/gr. de lodo=2 ,5.10

— 201 ~

Tabla p.5 LXV/Iî (continuacion)

2 /35 / 3qQ

-f +10/315

NQ amiioliticos/gr. da lodo=20.l0N2 de fflc Crady=322

co n t r o l

10000 p p m

100 p p m

1 3 5 7 9 11 13 15dias

Fig, 71.- Actividad anilolitica de la microflora da 1 gr. de lodo en presencia Lissapol D5 f 6

— 202 —

VIII.4.2. Influencia sobre la Celulolisis Aerobia.

Se siguiô el método descri to en el Apartado 10 del Capitule de Material y Métodos. Los resultados se expresan en la Tabla LXVIII y Figura 72.

SD.5.t_i 'v'

F E N . T 7 7

i I I i J i

DOB. PT D O 0 .T N Q

-e i

L I S . S N X P

IIL1S.D5

Figura 72. Influencia de la concentraciôn de tensoactivos sobre la Celulolisis Aerobia por los microorganismos de 1 gr. de lodo.

- 203 -

Tabla LXVIII: Influencia da la concentracion de tensoactivos sobre losmicroorganismos celuloliticos aerobios de un gramo rie lodo

Dosis de tensoactivo ppm

Diluciones 10^ 10" lo"* lÔ® lô^ D.m.

NG celuloliticos /gr. de lodo

Control •• •• • m# 6/3 9,5.10

t/î lOOppm Q lOûOppm

10. OC 0 ppm

4/300

4.5.1000

o lOOppm o lÜCOppm o lO.OCCppm

4/300

4,5.1C 0 0

^ lOCppm . lOCOppm •g lÔ.OGCppm o

000

00 #0

2 lODppm 1 ICCGppm o W._OCGppm_

0QD

0DC

a1 ICCppm p] lOüGppmM lO.CCüppm

C00

000

Q ICCppm . lüCOppm

lO.OGüppm_j

^ ^ m# m» 5/31/31/3

15.100,4.100,4.10

- 204 -

VIII.4.3. Interpretaciôn de resultados.

A.- En lo referente al proceso de la Amilolisis, hemos observado que todos los tensoactivos utilizados rebajan conside - rablemente el numéro de gérmenes viables amilollticos que alcanza valores muy inferiores a los del control ya en la dosis de 100 - ppm. Por encima de esta dosis se produce una inhibiciôn tanto del crecimiento como del ataque del almidôn con Dobane PT, mientras - que con Dobane JNQ a 1000 ppm. se ha detectado crecimiento en algunos tubos, pero solo se realiza una amilolisis parcial ya que - hemos encontrado que se destruye la amilosa, pero no la amilopep- tina. Este mismo producto, as! como el Fenopon T 77 a 10.000 ppm. inhiben el proceso.

Ademâs, la actividad amilolitica de los microorganismos résulta bastante retrasada y asi como en el control comienza a - desaparecer el almidôn a partir de las 24 horas de cultivo, en pre sencia del tensoactivo lo hace entre las 48 horas y el 7^ dla, se- gûn la concentraciôn y el tipo de producto, de forma que aûn en - los casos en que el proceso no es inhibido, existe un periodo de - latencia o de adaptaciôn mucho mas amplio de lo normal. Es posible que esto pueda deberse al hecho de que la presencia de tensoacti - vos en el medio dificulte, y a veces impida la slntesis de alguna o algunas de las enzimas necesariâs para comenzar el ataque a la - molécula de almidôn, aunque también podria suceder que las enzimas ya sintetizadas resulten inactivadas por el tensoactivo como hemos dicho en los trabajos de algunos investigadores citados en la in - terpretaciôn de los resultados obtenidos del ciclo del Nitrôgeno - en el apartado anterior.

B.- En cuanto a la Celulolisis aerobia résulta inhibida para todas las dosis de Dobane PT, Dobane JNQ y Lissapol SNXP, y para dosis superiores a 100 ppm. de Sodio Dodecil Sulfato, Fenopon T 77 y Lissapol DS. La concentraciôn minima de estos très ultimes tensoactivos reduce el numéro de viables celuloliticos en unas 20 veces con relaciôn al valor obtenido para el control.

- 205 -

ALGUNAS CONSIDERACIONES ECOLOGICAS.-

A lo largo de los estudios que, con relaciôn a algunos procesos de loc Ciclos del Nitrôgeno y del Carbono, hemos realizado durante el desarrollo de este trabajo, hemos puesto de mani- fiesto que los productos tensoactivos tienen una marcada influen - cia en los microorganismos que llevan a cabo dichos procesos, pues to que su actividad queda muy disminuida y en muchas ocasiones inhibida.

Creemos que es de destacar este hecho, ya que es fâcil - que en la Naturaleza se alcancen concentraciones de estos produc - tos al nivel de las utilizadas por nosotros, y estas, como hemos - visto, entrahan un cierto peligro para el equilibrio biolôgico del suelo. Asi, es un hecho suficientemente difundido, que el uso ma - sivo de los detergentes de slntesis, esta produciendo acumulaciôn de espumas y residues en los rios y por consiguiente en las aguas de riego dé donde pasarlan a los suelos. Aunque estos productos - sean biodégradables, su destrucciôn es lenta y por ello es fâcil que lleguena acumularse con lo que dificultan o incluso impiden - procesos microbianos tan importantes desde el punto de vista eco- lôgico como son amonificaciôn, nitrificaciôn, desnitrificaciôn y fijaciôn libre aerobia. Puesto que forman parte de un ciclo que,- como tal, debe realizarse de forma continua y su interrupciôn cau- sarla, en un plazo mas o menos largo, la destrucciôn del suelo — como entidad biolôgica.

Queremos por tanto resaltar la importancia que puede tener cara al future el conocimiento profundo de la influencia de - los detergentes de slntesis sobre los microorganismos y mas con - cretamente las bacterias que intervienen en el Ciclo del Nitrôgeno, y a ello dedicaremos nuestra llnea de investigaciôn ya que ademâs nos hemos encontrado con que no ha sido objeto de estudio por otros investigadores y nos parece un problema de gran interés.

- 206 -

VIII.5. Acciôn de los microorganismos sobre los tensoac

tivos utilizados.

Se hicieron cultives en agitaciôn segûn el método descri-

to en el apartado 11 del Capitule de Material y Métodos. Los resu],

tados de los espectros de infrarrojos se expresan en las figuras

73 a 87.

rBmr:

(7o) 33fs'ViIIWSNV«l

' Ci» ‘ 'f

r—IcA+)cooo-p(QCt-.r43tnr-1•HuC)X3oQÜ"'4T3otnrHm‘O

op4JoaQ.wwr)r-04cbpnoi•HU.

! i

I i

- .i;:/ yZl fj' :::t:G

[J ; -:■ t%;jr:ïïi*t

O4JKJ(*-r—13enIH•HUa%]oQO•HTDOena•a(0•HüCC)mpD.CCJO■DO1-4Q) •U to

PCO -PO aG m0) 3•r4 GCO cwenMa CJc r-4MÜ tu•H

trO 4-4T?

OO p> 4J•H ü-P Û)r--! O.3 nu w

<3-f--CJl•H

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- 222 -

Interpretaciôn de resultados.-

1.- En los espectros correspondientes al control y cultivo de microorganismos en presencia de Sodio Dodecil - Sulfato podemos observar :A. Control : Las bandas que se pueden asignar con se-

guridad son :- Banda a 2.960 cm. ^.- Vibraciones de tensiôn asi- métrica de enlaces C-H en grupos CHg.

•- Banda a 2.870 cm .- Vibraciones de tensiôn si-métrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 2.925 cm ^.- Vibraciones de tensiôn asi- métrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 2.855 cm ^.- Vibraciones de tensiôn si - métrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 1.465 cm ^.- Vibraciones de flexiôn delCH en grupos CH^.

- Bandas a 1.245 y 1.215 cm .- Vibraciones de tensiôn de enlaces en grupos 8=0.

-1-Bandas a 1.075, 1.010 y 830 cm .- Vibraciones - de grupos sulfatos.

-1- Banda a 710 cm .- Vibraciones Rocking de defor- maciôn de cadenas lineales con cuatro o mâs grupos CH^.

Este control no présenta ningûn anillo aromâtico , siendo su espectro y composiciôn quimica idénticos al espectro nQ 23 de Dieter Hummel ( "Identification, and Analysis of Surface-Active Agents by Infrared - and Chemical Methods ", 1962).

B.- Degradaciôn en cultivo de microorganismos del lodo:

- 223 -

En los espectros de las muestras numéros 1 y 4 se aprecia un producto residual de naturaleza - desconocida que no hemos identificado y no que- queda ningûn resto de tensoactivo, lo que puede indicar la rapidez con que se dégrada.

En todos los espectros se nota la falta del gru po sulfato que es râpidamente eliminado de la - molécula ( bandas muy fuertes, especialmente à 1.215 cm y 1075 cm ^).

En cuanto al resto alifâtico que queda como residuo ( bandas entre 2 .8 0 0 y 3 .0 0 0 cm ) sera decadena mâs corta que el original ( no hay banda

-1 -1a 710 cm y la de 1 465 cm solo se puede apre-ciar en el espectro de la muestra ns 2 donde son mayores.

En el espectro correspondiente a la muestra nô 3-1la banda a 1.740 cm indica la presencia de vi -

braciones de tensiôn 0=0 en ésteres o cetonas.En este mismo espectro las bandas a 1.260 y 1010

-1cm parecen indicar la presencia de OH en alcoholes primaries lo que vendria apoyado por la - presencia de una banda ancha hacia 3.400 cm

2.- Los espectros correspondientes al control y cultivo de microorganirmos en presencia de Fenopon T 77 se - pueden interpretar como sigue :

A. Control: Bandas que se pueden asignar con seguri- dad :- Banda a 3.400 cm Corresponde a vibraciones

de tensiôn de enlace N-H (en ralidad estes enlaces no corresponde a este tipo de moléculas pe - ro aparecen aqui tal vez como contaminaciôn.)

— 224 —

- Banda a 2.960 cm Vibraciones de tensiôn - asimétrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 2.925 cm ^.- Vibraciones de tensiôn - asimétrica de enlaces C-H en grupos CH^.

-Banda a 2.870 cm .- Vibraciones de tensiôn - simétrica de enlace C-H en grupos CH^.

- Banda a 2855 cm Vibraciones de tensiôn simétrica de enlace C-H en grupos CH^.

- Banda a 1.630 cm .- Vibraciones de tensiôn de enlaces C=0 en amidas terciarias que debe con - siderarse como banda tipica en estos compuestos.

•“ 1- Banda a 1.190 cm .- Vibraciones de tensiôn de enlaces en grupos 8=0 .

- Banda a 1.040 cm \ - Vibraciones en grupos - suifonatos.

B.- En la degradaciôn de este producto en el cultivo con microorganismos de lodo, se observa :Las cadenas alifâticas persisten en todos los espectros de la serie lo que indica que la degradaciôn no se llega a realizar totalmente.- Desaparecen, en cambio, las bandas de suifonatos en todos los espectros y tambien, progrsivamen- te ( espectros de las muestras nûmerosl, 2 y 3)desaparece la banda 0=0 en amidas terciarias a

- 11.630 cm , siendo sustituidas por una banda --1 -1 a 1.735 cm que junto con la banda a 1.260 cm

debe indicar C=0 en âcidos carboxilicos'(la ban- -1da a 1.260 cm corresponde a vibraciones de

tensiôn de enlaces en grupos 0=0 y flexiôn OH.

- 225 -

Bstudio de los espectros correspondientes al control y cultivo de microorganismos en presencia de Dobanne JNQ.

A. Control : Asignaciôn de bandas caracteristicas :- Banda a 3.030 cm .- Vibraciones de tensiôn de

enlaces C-H en anillos aromâticos.

- Banda a 2.960 cm \ - Vibraciones de tensiôn - asimétrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 2.925 cm .- Vibraciones de tensiôn - asimétrica de enlaces C4H en grupos CH^.

- Banda a 2.870 cm Vibraciones de tensiôn - sim'etrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 2.855 cm \ - Vibraciones de tensiôn - simétrica de enlaces C-H en grupos CH^.

- Banda a 1.600 cm .- Vibraciones de tensiôn - C=C del anillo.

-1- Bandas a 1.190 y 1.040 cm . - Vibraciones de - tensiôn de enlaces en grupos S=0.

- Banda a 1.010 cm . - Vibraciones Rocking ï=CH en el piano en anillos aromâticos.

- Banda a 833 cm .- Vibraciones de flexiôn = CHfuera del piano en anillos sustituidos en para.

- Banda a 685 cm .- Vibraciones de flexiôn en -grupos 8=0

Queremos hacer nbtar la mayor intensidad de las -bandas correspondientes a las vibraciones en gruposCH^ puesto que quedan dos grupos metilo terminales.

— 226 —

• B.- Espectros de las muestras del cultivo de microorganismos :En este caso la degradaciôn es mâs lenta apre - ciândose mejor los productos intermedios, sobre todo en los espectros correspondientes a las - muestras numéros 2 y 3, en donde se nota la per-sistencia del anillo aromâtico, que se observa -

-1 -1 -1en las bandas a 1.500 cm , 1010 cm y 830 cmEsta ultima banda indica que continua la susti - tuciôn para .

En cuanto a la cadena alifâtica se ve que persiste claramente en el espectro de la muestra nQ 3 , pero evidentemente es mâs corta que en el control segûn la relaciôn de intensidades de bandas CH / CH^. En este mismo espectro parece permanecer el grupo sulfonato.

En cuanto al compuesto oxidado, tiene un grupo - C=0 (carbonilo) segûn se aprecia en las bandas - entre 1.700 y 1800 de los espectros correspondientes a las muestras nûmeros 2 y 3 que en parte puede ser carboxilico (espectro de la muestra ii2

3 bandas a 940 cm de vibraciôn de flexiôn del - OH fuera del piano y a 1.240 cm combinaciôn de tensiôn C-0 y flexiôn 0-H) y en parte de éste y tal vez fenôlico por su elevada posiciôn.

En el espectro de la muestra ne 2 la absorciôn - hacia 1.625 cm parece debida a una insaturaciôn que podrlà ser Ar-C=C.

4.- Estudio de los espectros correspondientes al control y cultivo de microorganismos en presencia de Dobane - PT.

- 227 -

Aunque el espectro correspondiente al contre : estâ pococoncentrado, debe ser muy parecido al Dobane JNQ. Se -diferenciara especificamente en la intensidad de lasbandas correspondientes a los grupos CH y la presen -cia delidoblete de grupos isopropilo a 1.385 y 1365 -cm . Estos detalles persisten y probablemente se acentuan en los productos de degradaciôn, sobre todo en elespectro correspondiente a la muestra nG 3 en que en la

— Trelaciôn entre las bandas a 2 .9 6 0 y 2 .9 2 5 cm se observa que son casi iguales de intensidad.

En los espectros de las muestras nûmeros 1 y 3 pueden -/ -1verse las bandas debidas al grupo sulfonato (1 .180cm ;

1.035 y 670 cm ^) y al anillo aromâtico parasustituido (1 .0 0 5 y 830 cm“”' ).

Los productos de oxidaciôn acumulados presentan una insaturaciôn no conjugada, a juzgar por la banda a 1.650 -1cm del espectro de la muestra ns 3 y grupos 0-H alco -

hôlicos ( 3.400 cm y hacia 1.200 cm ).

5.- Estudio de los espectros correspondientes al control y cultivo de microorganismos en presencia de Lissapol - SNXP y Lissapol DS.

\

A. Control : Aparté de las bandas ya citadas para los -/ —1 —1 otros productos ( 3.000 - 2.800 cm , 1.500 cm ,

-i -1. .1460 cm y 830 cm ) las mas significativas de es^tas fôrmulas serian :

- Banda a 3.380 cm .- Vibraciones de tensiôn 0-H en alcoholes que dénota la presencia de un grupo alcohôlico terminal.

-1 .- Bandas a 1.03 5 cm (un poco enmascarada por la -—1 \ —1 banda intensa a 1.100 cm ) y a 1.285 cm de vi

braciones de tensiôn del 0-0 y de flexiôn del 0-H

en alcoholes primaries. Estas dos bandas apoyan- 1a la citada anteriormente a 3.380 cm

"1- Banda a 1.350 cm de vibraciones waggin de - grupos CH^.

“ 1- Banda a 1.110 cm de tensiôn C-0 en éteres - aciclicos. Esta banda podemos consicerarla como la mâs representativa de este grupo de compuestos.

B.- Estudio de la degradaciôn en cultivo de microorganismos :Al contrario que en los productos anteriores, ladegradaciôn es menos ac sada.Es digna de notar la acumulaciôn de un producto de degradaciôn que debe ser un ester o una lacto- na, a juzgar por la posiciôn de la banda 0=0 de

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tensiôn a 1.770 cm . Este producto se forma en los espectros de las muestras numéros 2 y 3 corres pondlentes al Lissapol SNXP y tambien en el de la muestra n2 2 de Lissapol DS. Teniendo en cuenta - que ambos productos tienen en comûn los grupos oxi Gtilénicos. debernos pensar que la sustancia -acumulada procédé de esa parte de la molécula.

En otros espectros ( muestra ns 1) aparecen en ladegradaciôn otros carbonilos (banda a 1725 cm )que parecen carboxilicos. asociados a bandas tipi-

—1 —1 cas (9 4 0 cm y 1.290 cm ).

IX.- CONCLUSIONES

- 230 -

1.- Cuando cada uno de los seis tensoactivos utilizados en el presente trabajo ha sido ahadido en distintas dosis a cultivos de la microflora total de muestras de lodo hemos obtenido una reducciôn sensible en el crecimiento de los microorganismos aun en la coneen tracion mâs baja.(lO ppm.)

2 . - Las bacterias aisladas han tenido un comportamiento diferente como respuesta a la presencia de tensoactivo en el medio de cultivo : *- En algunos casos el crecimiento bacteriano résulta disminuldo prog^sivamente al aumentar la concentra - ciôn de producto en el medio.- En otros los tensoactivos muestran una acciôn bac - teriostâtica y, por encima de ciertas dosis,bacteri - cida.- Alguna vez, por ultimo, parece que el crecimiento résulta favorecido con determinadas concentraciones de tensoactivo.

2 __En todos los casos, y aûn en la dosis mâs baja se - produce una pérdida de la movilidad que caracteriza a algunas bacterias, pero estaipropiedad es recupe- rada cuando los microorganismos afectados vuelven a cultivarse en medios nutritives sin tensoactivos.

4.- Se ha observado la ausencia de formaciôn de endosporas en los cultivos de las estirpes del género Bacillus estudiadas cuando la concentraciôn de tensoactivo es del orden de 500 ppm. o superior.

5.- Las bacterias tipicamente grampositivas pierden esta coloraciôn en dosis superiores a 500 6 1000 ppm. apa- reciendo como gramnegativas. Ademâs tanto en las Gram-

- 231 -

positivas como en las gramnegativas, el colorante se fija en menor cantidad y aparecen en las preparaciones muy debilmente tehidas.

6.- En los procesos del ciclo del Nitrôgeno estudiados los tensoactivos afectan en distinto grado segûn - la concentraciôn y naturaleza del producto y el gru po de microorganismos sometido a prueba :- Sodio Dodecil Sulfato reduce considerablemente el nûmero de gérmenes viables responsables de cada uno de estos procesos a concentraciôn de 100 ppm, e inhi_ be la nitrificaciôn y la fijaciôn libre aerobia del Nitrôgeno atmosférico por encima de esta concentra :— ciôn.- Fenopon T 77 no afecta al nûmero de viables desnitrificantes hasta la concentraciôn de 1000 ppm, pero en 100 ppm. inhibe parcialmente la nitrificaciôn y - rebaja el nûmero de amonificantes y fijadores libres aerobios.- Dobane PT en 100 ppm. disminuye el nûmero de amonificantes, desnitrificantes y fijadores libres aerobios e inhibe por completo la nitrificaciôn. En concentra - ciôn de 1000 ppm. inhibe también la desnitrificaciôn.- Dobane JNQ actûa disminuyendo de forma muy notable el nûmero de viables en todos los casos desde la do - sis de 100 ppm, e impide el desarrollo de los gérme - nés oxidantes del amonio y de los fijadores libres - aerobios cuando se ahade en 1000 ppm.- Lissapol SNXP es en conjunto el de menor efecto in- hibidpr de los tensoactivos utilizados. No afecta al de amonificantes hasta la dosis de 1000 ppm. y, aun - que en los demâs procesos ya en 100 ppm. disminuye el nûmero de gérmenes, las dosis mâs altas son casi siempre mejor toleradas que las de los otros productos.

- 232 -

- Lissapol DS disminuye tambien el nûmero de viables en todos los procesos en concentraciôn de 100 ppm. - Inhibe el desarrollo de los oxidantes de los nitritos a 1000 ppm y a 10.000 ppm. el de los oxidantes del - amoniaco y de los amonificantes.

7.- En el proceso de la Amilolisis el nûmero de viables résulta mucho mâs bajo que en el control en concen - traciôn de 100 ppm. de todos los tensoactivos y son bacteriostâticas las dosis de 10.000 ppm. de FenoponT 77 y 1000 ppm. de Dobane PT y Dobane JNQ.La celulolisis aerobia queda inhibida en dosis superiores a 100 ppm. de Sodio Dodecil Sulfato y Fenopon T 77 y en todas las concentraciones de Dobane PT, Dobane JNQ y Lissapol SNXP. Lissapol DS es el producto mejor tolerado por los microorganismos celuloliticos aerobios que se desarrollaron en todas las dosis —aunque en nûmero muy inferior al del control.

8.- En el estudio por espectroscopia de infrarrojos de la degradaciôn de los productos tensoactivos utilizados;- por los microorganismos del lodo hemos observado :

- Tanto los grupos sulfato como sulfonato son separados râpidamente del resto de la molécula del producto dejando de aparecer en los espectros sus bandas - caracteristicas.

- Son mucho mâs râpidamente metabolizados el Sodio - Dodecil Sulfato qælos Dobane JNQ y PT, mientras que Fenopon T 77 conserva la mayor parte de su cadena - alifâtica y en los Lissapol SNXP y DS la dégrada - ciôn es mâs lenta.

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