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EL SISTEMA INMUNE

El sistema inmune es el responsable de que no nos enfermemos. Muchas veces, sin embargo, no gana el combate contra el agente agresor y necesita colaboración extra. Por ejemplo, en el caso de las infecciones por HIV se necesita administrar un agente antiviral para que el individuo no muera por la infección. A veces no se elimina el patógeno, como en la enfermedad de chagas, pero se puede controlar y evitar que se disemine. El sistema inmune es el responsable de que, a pesar de vivir en un ambiente plagado de agentes potencialmente patógenos, sólo en ocasiones desarrollemos procesos infecciosos evidentes desde el punto de vista médico. El sistema inmune reconoce como propio los componentes de nuestro organismo, porque se desencadenarían reacciones inmunológicas todo el tiempo. La vacunación permite que el sistema inmune adquiera experiencia en combatir un patógeno sin ocasionarle daños al individuo. Se logra entonces, en ese momento, un estado que se denomina inmunidad, sinónimo de la resistencia resultante entre las fuerzas que pone el agente agresor para enfermarnos y las fuerzas que ponemos nosotros para combatirlo. También es importante que no ataque al propio organismo. Inmunógeno: cualquier sustancia que es capaz de generar una respuesta inmune y reaccionar con los productos de esa respuesta. TIPOS DE INMUNIDAD NATURAL: Es la que se posee desde el nacimiento, influida por factores genéticos y raciales, la edad, factores hormonales y presencia de Ac naturales. (Por ejemplo: isoaglutininas→ Ac naturales contra ciertas moléculas de los GR). ADQUIRIDA: Puede ser:

• Activa: el hombre genera sus propios anticuerpos. (Primero se enferma y luego se cura � memoria). Puede ser espontánea como las infecciones, o artificial como las vacunas en las que se introducen Ag a propósito para generar Ac.

• Pasiva: espontánea (Ig materna que atraviesan placenta, IgA por amamantamiento) o artificial (introducción de γ-globulinas que son Ac ya formados en otra especie, antitetánica).

• Adoptiva: artificial, se transfieren células y no Ac (transferencia de células inmunocompetentes). INMUNIDAD LOCAL: mediada por IgA secretora, muy abundante en mucosas.

REACCIÓN DEL

HOSPEDADOR

AGENTE AGRESOR

RESPUESTA INMUNE

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AGENTES POTENCIALMENTE PATÓGENOS Las bacterias y los parásitos pueden ser intra o extracelulares, los virus tienen distinta forma de acción. Para cada uno de los patógenos el sistema inmune ha desarrollado mecanismos de defensa, cada mecanismo es distinto según de que patógeno se trate. BARRERAS DE DEFENSA Hay distintos tipos de mecanismos contra agentes agresores: • Barreras físicas (piel y mucosas). Contiene células que elaboran sustancias microbicidas o bacteriostáticas y mediadores de la inflamación. • Mecanismos innatos o inespecíficos (fagocitos, complemento, células NK). Son los primeros que actúan y de manera rápida, si no logran eliminar el agente actúan los mecanismos adaptativos. • Mecanismos adaptativos o específicos. Son más lentos porque los linfocitos necesitan proliferar. COMPONENTES DE LA RESPUESTA INNATA O INESPECÍFICA • Células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos) • Natural Killer (NK) • Mastocitos • Células dendríticas (Cd) • Células endoteliales • Sistemas moleculares: sistema complemento, fibrinolítico, de las quininas y de la coagulación. El complemento, en mecanismos innatos, se activa por la vía alterna y por la vía de las lectinas (vías independientes de Ac). El reconocimiento del agente extraño se hace a través de receptores que contienen los macrófagos, neutrófilos y NK en sus membranas que reconocen ciertos motivos particulares presentes en los patógenos llamados PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos). Los PAMPs no se encuentran en nuestras células. Cada tipo celular tiene distintos receptores. Hay receptores que reconocen residuos de manosa, lípidos, etc. Receptores Toll (TRL: Toll Like Receptors) reconocen distintas moléculas en los distintos patógenos, pueden reconocer DNA, lipopolisacáridos de las membranas bacterianas, etc. Una vez que los macrófagos reconocen al patógeno lo eliminan por fagocitosis, los neutrófilos también fagocitan o pueden liberar el contenido de sus granulaciones. Los mecanismos innatos si no logran eliminar el agente agresor retardan la diseminación de la infección convocando a las células de la respuesta adaptativa (LB y LT): • LB: diferenciación a plasmocito, producción de anticuerpos.

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• LT: distintos perfiles fenotípicos permiten distintas funciones de acuerdo al marcador molecular que tengan en su membrana.

• CD4+: Th1: activan macrófagos, activan y expanden CD8+. Th2: colaboran con los LB. Tr: regulación de la respuesta inmune para que no sea excesiva.

• CD8+: lisan células infectadas por virus (LT citotóxicos). TH1 y TH2 se diferencian por las citoquinas que producen. TH1 actúan principalmente cuando el patógeno que ingresa es intracelular. TH2 actúan frente a patógenos extracelulares. ¿Qué ocurre cuando se produce un foco infeccioso? Las bacterias son reconocidas por los receptores de los macrófagos. Se activa el complemento (C). El complemento es un sistema proteico de activación en cascada que tiene tres vías de activación: • Vía clásica: depende de que haya anticuerpos y se activa con complejos Ag-Ac. • Vía alterna • Vía de las lectinas Cuando el complemento se activa produce una serie de sustancias o de proteínas. Algunas van a tener la capacidad de opsonizar, son opsoninas que recubren al patógeno (que tiene receptores para ellas) y facilitan la fagocitosis por parte del macrófago. Otras moléculas del complemento como C3a y C5a anafilotoxinas y tienen la capacidad de atraer otras moléculas. Cuando se genera el proceso de inflamación, las moléculas liberadas permiten que los neutrófilos que están circulando atraviesen los vasos, vayan al sitio de infección y comiencen su acción. MECANISMOS ADAPTATIVOS O ESPECÍFICA Las células que participan en los mecanismos adaptativos son los linfocitos B (LB) y linfocitos T (LT), también tienen receptores para reconocer patógenos. El receptor con el cual los LB reconocen patógenos es una inmunoglobulina (Ig) de membrana. Todas las Ig están formadas por dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas unidas por puentes disulfuro. La Ig está anclada en membrana, pero la porción transmembrana es muy cortita, entonces necesita de otras moléculas que le ayuden a transmitir las señales al interior de las células. El receptor T está constituido por dos cadenas. Se asocia en los LTCD4+ a la molécula CD4 y en los LTCD8+ a la molécula CD8. El LT necesita que el Ag le sea presentado por otra célula, esto quiere decir que el LT reconoce pequeños péptidos de un Ag que haya sido procesado previamente por otra célula.

Actúa en los mecanismos innatos porque no necesitan Ac.

La presencia de IL-12 y citoquinas relacionadas promueve la diferenciación de los LTCD4+ en un perfil Th1,mientras que la presencia de IL-4 conduce a la diferenciación de los LTCD4+ en un perfilTh2.

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Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) son las encargadas de presentarle los péptidos a los LT. El CMH son moléculas de membrana que se expresan en todas las células, fueron descubiertas por primera vez en los leucocitos, por eso también se las llama HLA (antígeno leucocitario). Los MHC clase I están en todas las células del organismo, menos en los eritrocitos. Presentan péptidos a los LTCD8+ citotóxicos. Las células que las contienen participan en la presentación de todos los Ag que provengan del interior celular. Los MHC clase II están en algunas células, en particular en los LB, macrófagos y células dendríticas. Estas células se las llaman células presentadoras de antígenos (CPA) profesionales, porque son las únicas que pueden presentarle Ag a los LTh CD4+. Presentan Ag que provengan del exterior celular, esto implica que los LB, macrófagos y células dendríticas tienen que haber captado esos Ag, degradado y presentado en membrana. Una vez que el linfocito reconoce el Ag se activa y comienza a proliferar, esa proliferación se denomina expansión clonal, va a haber un montón de linfocitos que se originan a partir de uno que van a tener capacidad para reconocer al mismo Ag. En toda respuesta adaptativa hay una fase de reconocimiento, una fase de activación, luego una fase de proliferación y por último una diferenciación a célula efectora. Las células de la respuesta innata reconocen, se activan y ejercen su función, no necesitan proliferar como los linfocitos. LT y LB se originan en la médula ósea. Una vez que salen de la médula ósea ya van a estar comprometidos a ser o T o B. El proceso de maduración de los LT se realiza en el timo y el de los LB ocurre enteramente en la médula ósea (en algunas otras especies animales los LB terminan de madurar en la bolsa de Fabricius). En base al marcador molecular que expresen en su membrana los LT pueden ser de dos tipos: • CD4 LT helpers LTh1 (median la activación de los macrófagos y contrubuyen además a la activación y expansión de los LTCD8+ citotóxicos) LTh2 (colaboran con los LB y permiten su correcta LT reguladores activación, expansión y diferenciación a plasmocitos productores de Ac. También participan en la inmunidad antiparasitaria en los tejidos periféricos al inducir la activación de los eosinófilos, basófilos y mastocitos. • CD8 LT citotóxicos Las poblaciones de los LB son responsables de producir los Ac naturales: • LB1: se encuentran en la cavidad peritoneal, producen IgM, se autorrenuevan. • LB2: producen cinco tipos de Ac: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD . • BZM: se encuentran en la zona marginal del bazo, se autorrenuevan, solamente producen IgM, actúan cuando hay un patógeno que ingresa por sangre.

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COMUNICACIÓN ENTRE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE La comunicación intracelular puede ser a través de: • CITOQUINAS: proteínas pequeñas, pueden tener efecto local (autócrino) o actuar sobre células más alejadas (parácrino). Se producen de novo cuando la célula se activa, tienen una vida media limitada y estimulan células que tienen receptores para ellas. Redundancia: varias citoquinas pueden tener el mismo efecto, por lo tanto si una falla otra la puede reemplazar. Las citoquinas van a recibir distinto nombre según la célula que las produzca. Los leucocitos producen citoquinas llamadas interleuquinas que regulan la proliferación y diferenciación celular. • QUEMOQUINAS: son proteínas pequeñas que participan en la conducción de los leucocitos (neutrófilos) a los sitios en los que se necesitan (de infección). Son agentes quimiotácticos. • MOLÉCULAS DE ADHESIÓN: se expresan en la membrana, de forma constitutiva o por activación. Determinan la migración y salida del vaso sanguíneo de los neutrófilos.

- Selectinas: L-selectinas (leucocitos), P-selectinas (plaquetas), E-selectinas (células endoteliales).

- Integrinas. - Moléculas de la superfamilia de las Igs. - Sialomucinas. - Cadherinas.

Una vez que los linfocitos reconocen al antígeno empiezan a proliferar, hay una “expansión clonal”: muchos linfocitos se originan a partir de uno y responden al mismo antígeno.

Esto no ocurre en la respuesta innata, no necesitan proliferar. De los linfocitos que proliferan, algunos se mantienen como células de memoria: viven más tiempo y actúan cuando un antígeno ingresa por segunda vez, entonces se genera una respuesta más rápida y más eficaz. � Entrada de Ag por primera vez → respuesta primaria. � Entrada de Ag por segunda vez → respuestas secundarias mediada por linfocitos de memoria. Respuesta más rápida y eficaz. (Esto es lo que se busca con la vacunación). ORIGEN DE LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE Si bien las células del sistema inmune son muy diferentes y cumplen distintas funciones, todas tienen un origen común que va variando a lo largo del desarrollo del individuo.

RECONOCI- MIENTO

ACTIVA-CIÓN

PROLIFE-RACIÓN

DIFERENCIACIÓN A CÉLULA EFECTORA

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Cuando se forma el embrión, en los primeros días, las células son producidas por el saco vitelino. Después, el hígado y el bazo fetal, adquieren la función de producir células, hasta que se desarrolla la médula ósea y toma la posta en la producción de células hematopoyéticas. En el adulto la producción de células ocurre en la médula ósea del esternón, costillas, huesos largos, etc. La célula troncal hematopoyética es el progenitor común que va a dar origen a los distintos linajes celulares. CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS MACRÓFAGOS: se originan a partir de los monocitos circulantes y se diferencian a macrófagos cuando se establecen en los tejidos. Reciben distintos nombres de acuerdo al tejido en el que se encuentren: -Hígado→ células de Kupffer. -SNC→ células de la microglía. -Hueso→ osteoclastos. Son células presentadoras de antígenos profesionales (APC). Tienen la capacidad de fagocitar agentes extraños que reconocen por sus receptores, procesarlos, degradarlos y presentarlos en MHC de clase II en la membrana. Producen citoquinas importantes en la respuesta inflamatoria. También producen IL-1, IL-6, TNF-α que son citoquinas proinflamatorias. Producen también citoquinas antinflamatorias para regular la respuesta. NEUTRÓFILOS: se originan en la médula ósea, necesitan entre 5 y 7 días para transformarse en maduros, no pueden volver a la circulación (recircular). Representan el 90% de los granulocitos. Ejercen su acción a través del reconocimiento de patógenos, fagocitosis y mecanismos citotóxicos (dependientes e independientes del oxígeno). Producen mediadores de la inflamación (prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos) y citoquinas (IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α). Sus granulaciones se tiñen con colorantes neutros. Neutrofilia es el aumento de neutrófilos en sangre, lo que es un indicio de inflamación. CÉLULAS DENDRÍTICAS: nexo entre inmunidad adaptativa e inespecífica. Activan linfocitos T vírgenes. Son células presentadoras profesionales, contienen MHC de clase II. Tienen un aspecto estrellado. Reciben diferentes nombres de acuerdo al lugar donde se encuentran (piel → Langerhans). Se encuentran en dos estadios: -Inmaduros → presentan una fagocitosis activa -Maduro → luego de su maduración disminuye su actividad de fagocitosis pero aumenta la capacidad de presentación de Ag. CÉLULAS NK: de origen linfoide, poseen receptores para IL-12, IL-2 y TNF-α. Las células NK participan en la inmunidad antiviral. Presentan en la superficie celular moléculas de histocompatibilidad de clase I. Funciones: - Cistólisis: a través de sus gránulos que contienen perforina y granzimas. - Producción de IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-3. Mecanismo de acción: →Anticuerpo dependiente (adaptativa): receptor para Fc

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→Anticuerpo independiente (innata): MHC clase I: disminuye la expresión de MHC clase I en células infectadas por virus, así, las NK las detecta y las destruye. CÉLULAS NKT: son LT. Reconocen Ag lipídicos presentados por las moléculas CD1D. LB1: cavidad peritoneal→IgM→ se autorrenuevan→ Ac naturales. LB2: producen Ac: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD. LBZM: zona marginal del bazo. Se autorrenuevan. Producen IgM. Actúan cuando el patógeno ingresa por sangre.

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ORGANOS LINFOIDES

La inmunidad innata es el primer mecanismo que se desencadena cuando ingresa un antígeno, y generalmente actúa de la misma manera ante una segunda entrada de ese mismo antígeno. Los mecanismos de inmunidad adaptativa están mediados por los LT y los LB. Los LB producen Ac y los LT producen citoquinas. Entonces, un animal frente a un antígeno genera tanto células específicas como moléculas. Las células serían los LT y las moléculas los Ac. Para un estudio más simple se dice que la inmunidad humoral es la que está mediada por Ac y la inmunidad celular es la que está mediada por LT, aunque están muy relacionadas una con otra. Las diferentes células del sistema inmune están comunicadas entre si por la liberación de citoquinas y moléculas de adhesión. Estas células se van a organizar en los órganos linfoides. ORGANOS LINFOIDES De acuerdo a su función se pueden clasificar en: • Órganos linfoides primarios o centrales que son los lugares donde se van a generar las células del sistema inmune. Estos órganos son: médula ósea, timo y bazo (en período fetal). • Órganos linfoides secundarios o periféricos son el bazo, los ganglios linfáticos y todo tejido linfoide asociado a mucosas. En éstos se produce el encuentro entre los linfocitos y el antígeno. En el humano, los LB se agrupan y maduran en la MÉDULA ÓSEA . Todo el proceso de maduración de los LB se denomina ONTOGENIA B . Durante este proceso los LB van a ir expresando en su membrana diferentes moléculas, y van a ir ordenando los genes que codifican para el receptor B. En la médula ósea también sufren el proceso de TOLERANCIA CENTRAL : los LB que sean capaces de reconocer Ag propios van a ser eliminados (sus receptores reconocen Ag del propio organismo). Si algún linfocito B se escapa de este proceso, en el bazo se va a producir otro proceso que se denomina TOLERANCIA PERIFÉRICA que va a eliminar a los LB autorreactivos que se pueden haber escapado del primer punto de control. Para los LT , en cambio, el sitio de maduración donde terminan de transformarse en linfocitos competentes es el TIMO . El timo es un órgano que está ubicado por detrás del esternón, es bilobulado y aumenta mucho de tamaño desde el nacimiento hasta la pubertad. Luego de la pubertad el timo comienza a involucionar. Se cree que esta involución se produce porque las células del timo carecen de ciertas enzimas del metabolismo de las hormonas esteroidales. Estas hormonas esteroidales que se generan en gran cantidad durante la adolescencia, son tóxicas para las células del timo. Sin

Órganos primarios Se generan y maduran las células del sistema

inmune LT y LB

Órganos secundarios Se encuentran los LT y los LB con los Ag, y

donde tienen un microambiente adecuado para montar una respuesta inmune.

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embargo, los linfocitos que llegaron al timo alcanzan a ser suficientes para montar cualquier respuesta inmune a lo largo de toda la vida del individuo. El timo tiene un sitio entre la corteza y la médula en donde se va a producir un mecanismo de selección positiva y otro, luego de la médula, donde se va a producir la selección negativa. Esto va a permitir que salgan LT y que no reconozcan Ag propios. La maduración de los LT se denomina ONTOGENIA T , durante la cual los LT van a ir expresando distintas moléculas en su membrana. Estos serían los órganos primarios o centrales. Luego tenemos órganos secundarios o periféricos. El BAZO está ubicado en la región abdominal, tiene una región que se denomina pulpa roja y es el lugar donde se eliminan los eritrocitos deteriorados. Tiene una zona de pulpa blanca donde predominan los linfocitos tanto T como B. El bazo es un órgano muy importante y es el primero que actúa cuando el Ag ingresa por vía sanguínea. En el bazo no hay circulación linfática, solamente sanguínea, y los linfocitos entran y salen por la misma vía. Los GANGLIOS LINFÁTICOS están ubicados a lo largo de todo el organismo, cerca de los vasos sanguíneos más importantes del cuerpo, donde se forman las cadenas de ganglios linfáticos. Los ganglios tienen estructura ovoide y poseen también una zona cortical y una medular. Algunas zonas son específicas del los LT y otras son propias de los LB. En los ganglios es donde se produce el encuentro entre los LT y los LB, para que el LB se transforme luego en productor de anticuerpos. El ganglio es un órgano que tiene circulación linfática y sanguínea. Los linfocitos van a entrar al ganglio por vía sanguínea, los Ag van a provenir de distintas partes del cuerpo, por vía linfática entran al ganglio y se encuentran con los LT. Se le presentan los Ag a los LT, estos reconocen al Ag y comienzan a proliferar y van a poder contactarse con los LB. Los LB se van a diferenciar a plasmocitos y van a producir Ac. Las mucosas son sitios muy importantes para el ingreso de Ag. Para controlar todos aquellos Ag que puedan ingresar hay TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A LAS MUCOSAS. Hay algunos tejidos asociados a la mucosa nasofaringea, a los ganglios mesentéricos, a todo el tracto gastrointestinal. Este tejido linfoide puede ser diferenciado en dos componentes: sitios inductores, donde se van a generar las células específicas, y los sitios efectores, que son donde van a ir a actuar esas células específicas. Para que un linfocito pueda ir a un determinado lugar necesita expresar un determinado receptor para quemoquinas. DIFERENCIAS ENTRE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA La inmunidad innata actúa desde el inicio del proceso infeccioso, mientras que la inmunidad adaptativa requiere varios días para generar sus mecanismo efectores. Difieren en las estrategias empleadas en el reconocimiento de microorganismos y sus productos. La inmunidad innata reconoce patrones moleculares asociados con patógenos (PAMPs) mediante receptores de reconocimiento de patrones (RRP), mientras que la inmunidad adaptativa reconoce epitopes antigénicos mediante receptores específicos distribuidos clonalmente en células B y T. La actividad de la inmunidad adaptativa conduce a la expansión de los clones reactivos y al desarrollo de la memoria inmuntaria, procesos que no se observan en la inmunidad innata.

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PIEL Y MUCOSAS: PRIMERA LÍNEA DE DEFENSA CONTRA LA AGRESIÓN

COMPONENTES DE LA INMUNIDAD INNATA LA PIEL El ser humano posee entre 1,5 y 2 m2 de piel. Está constituida por distintas capas, la más externa es la epidermis, la media es la dermis y la más profunda la hipodermis (tejido graso subcutáneo). En la epidermis se distinguen distintos tipos celulares importantes para la inmunidad innata, entre ellos los queratinocitos. Los queratinocitos producen queratina la cual le da cierta dureza a la piel, la hace impermeable, la protege de los agentes físicos y químicos. Los queratinocitos se recambian constantemente cada 30 días y así se eliminan a los microorganismos que puedan haber quedado ahí, encima de ellos. Además de la función de barrera, los quertinocitos producen citoquinas y algunas quemoquinas. En algunos casos de dermatitis hay una excesiva actividad de los queratinocitos y los fenómenos que se observan se deben a esa gran cantidad de quemoquinas que producen. Otras células importantes presentes en la epidermis son las células de Langerhans, estas son células dendríticas que son muy importantes como células presentadoras de Ag, y son el nexo entre la inmunidad innata y la adaptativa. Tienen una gran capacidad endocítica, tienen muchos receptores para los distintos componentes de los agentes patógenos: para el lipopolisacarido bacteriano, flagelina, DNA y RNA viral, y también tiene receptores para citoquinas: IL-1 y TNF-α. Si bien no son muy abundantes, las células de Langerhans tienen unas prolongaciones muy largas que aumentan la extensión de la superficie que abarcan. LAS MUCOSAS Tenemos 400 m2 de mucosas. Tienen la característica de la continuidad epitelial, no solo se debe a las uniones que hay entre las células, sino a la unión que existe entre esas células y la matriz extracelular. Esa unión es fundamental para evitar el ingreso de microorganismos. Además de la continuidad epitelial, está la secreción de moco. Existen alrededor de 8 familias de mucinas diferentes. El moco se secreta de forma continua, se recambia muy rápidamente cada minuto. Tiene una permeabilidad selectiva, permite el pasaje de gases y de nutrientes y evita el pasaje de los microorganismos con sus toxinas. Tiene capacidad de adherirse a las células del epitelio de las mucosas, impidiendo la adherencia de microorganismos. Además producen muchas sustancias con actividad microbicida, por ejemplo la lactoferrina tiene la capacidad de secuestrar el hierro, el cual es importante para el crecimiento de los microorganismos; la lisozima, que produce la alteración de la permeabilidad de las paredes de los microorganismos, lo mismo que las defensinas; las aglutininas que bloquean ciertos receptores de los microorganismos impidiendo que se unan a las células y de esa manera logren penetrarlas. Además de estas sustancias, muchos epitelios mucosales producen IgA secretora, que es un tipo particular de anticuerpo. También producen muchas citoquinas y quemoquinas. El espesor del moco es diferente en los distintos tipos de epitelios. Es mucho menor en el epitelio respiratorio (aprox. 2 µm), en el epitelio digestivo es mucho mayor (aprox.

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100 µm). El moco, junto con los microorganismos que pueden haber quedado adheridos se elimina en el tracto respiratorio a través de las cilias que poseen las células. En el tracto digestivo contribuyen los movimientos peristálticos. Otro mecanismo de defensa a nivel del tracto digestivo es la acidéz del jugo gástrico, que elimina cualquier microorganismo que pueda haber sido deglutido. INFLAMACIÓN Cuando todas estas primeras barreras de defensa son vencidas e ingresa un microorganismo, se produce entonces el fenómeno de INFLAMACIÓN . El objetivo de este fenómeno es facilitar el acceso de las células del sistema inmune al lugar de ingreso de un agente agresor. En la inflamación se van a producir cuatro signos característicos que son DOLOR, CALOR, RUBOR y TUMOR. Cuando se produce este fenómeno hay vasodilatación de los capilares y aumento del flujo sanguíneo, esto conduce al calor y al rubor. Cuando se produce esa vasodilatación sale líquido de los capilares y se produce el edema o tumor. Este edema puede generar compresión de los nervios y producir dolor. En la inflamación participan numerosos sistemas y también numerosas células. Dentro de los sistemas moleculares que van a participar es sumamente importante el sistema del complemento. El SISTEMA DEL COMPLEMENTO es un sistema de activación en cascada que va a generar distintos componentes, algunos de sus componentes participan en el proceso inflamatorio. Por ejemplo, C3a y C5a son anafilotoxinas, pueden inducir la liberación de gránulos de basófilos y mastocitos. C5a tiene actividad quimioatractante de neutrófilos. C3b tiene capacidad de opsonización (recubrimiento del patógeno con distintas moléculas para facilitar la fagocitosis). Luego está el SISTEMA DE LAS QUININAS , que va a producir bradiquinas en un sistema de activación en cascada, la cual participa en la alteración de la permeabilidad capilar. El SISTEMA FIBRINOLÍTICO y otros mediadores químicos, como las prostaglandinas, leucotrienos, óxido nítrico e histamina también participan en la respuesta inflamatoria. En la eliminación de NO participan dos enzimas, una constitutiva y una inducible, y el NO produce aumento de la permeabilidad capilar. La histamina también tiene el mismo efecto. Dentro de las CITOQUINAS son muy importantes TNF-α, IL-1 e IL-6, las cuales estimulan el aumento de la temperatura corporal porque actúan a nivel del hipotálamo. Este aumento de la temperatura corporal reduce el crecimiento de los microorganismos y favorece las reacciones inmunológicas. Dentro de las QUEMOQUINAS la IL-8 es muy importante porque favorece el pasaje de los neutrófilos desde los vasos sanguíneos hasta los tejidos infectados (CXCL8 = IL-8). Dentro de los COMPONENTES CELULARES están: - Las células de primera línea: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y células NK. Algunas de estas células van a producir liberación de sus gránulos, otras son fagocíticas (neutrófilos), otras van a destruir directamente a las células infectadas (células NK). - Las células de segunda línea son células que además de fagocitar pueden presentar antígenos (macrófagos y células dendríticas).

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NEUTRÓFILOS Los neutrófilos destruyen los agentes patógenos por mecanismos dependientes del O2 o independientes del O2. Además de fagocitar producen muchas citoquinas, de las cuales las más importantes son IL-12 y el TNF-α. Luego de la fagocitosis pueden liberar el contenido de sus gránulos y causar daño tisular. MACRÓFAGOS Otras células que son claves en el proceso de inflamación son los macrófagos. Estos además de tener receptores para reconocer a los patógenos, producen muchísimas citoquinas: citoquinas inflamatorias (IL-1, IL-6 y TNF-α) y citoquinas antinflamatorias (IL-10 y TGF-β) para controlar y regular y así evitar excesos. REACCIÓN DE FASE AGUDA A pocas horas de haberse iniciado el proceso infeccioso, sobre todo en los de naturaleza bacteriana, los macrófagos incrementan de menera notable la producción de IL-1, IL-6 y TNF-α en respuesta a su estimulación por PAMPs, citoquinas o componentes del complemento. Estas tres citoquinas median un conjunto de actividades tendientes al desarrollo de un cuadro inflamatorio agudo local y sistémico, denominado reacción de fase aguda, que intenta resolver el proceso infeccioso con la eliminación de su agente causal. Las acciones inflamatorias locales mediadas por IL-1, IL-6 y TNF-α se ejercen sobre las diferentes poblaciones celulares en el entorno inmediato del foco infeccioso. Las acciones inflamatorias sistémicas mediadas por IL-1, IL-6 y TNF-α se ejercen a tres niveles diferentes: A) A nivel hepático van a producir la síntesis de las proteínas de FASE AGUDA. Estas proteínas tienen como función proteger al organismo de las acciones nocivas. Otras tienen función estimuladora de algunas vías de eliminación de patógenos, por ejemplo, la proteína C reactiva, que estimula la activación del complemento. Las proteínas de fase aguda median mecanismos antimicrobianos poderosos, y por otra parte, protegen al huésped de las posibles acciones perjudiciales asociadas con el desarrollo de las reacciones inflamatorias. B) A nivel del hipotálamo estas citoquinas producen el aumento de la temperatura corporal (se conocen como pirógenos endógenos). El aumento de la temperatura corporal también puede producirse por componentes bacterianos (pirógenos externos). C) A nivel de la médula ósea aumentando la producción de pirógenos endógenos (neutrofilia). Todos estos mecanismos se generan para que vallan mayor cantidad de células al sitio de infección. �La reacción de fase aguda aumenta la resistencia del huésped, disminuye la lesión tisular y favorece la reparación y resolución de la lesión.

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ADHESIÓN Y PASAJE DE LOS NEUTRÓFILOS AL SITIO DE IN FECCIÓN Los neutrófilos para pasar de los vasos sanguíneos hacia los tejidos siguen un proceso de cuatro etapas. Va a estar mediado por moléculas de adhesión que tienen tanto los neutrófilos como las células endoteliales. 1o PASO: RODAMIENTO . Los neutrófilos van como rodando por las células endoteliales. Las principales moléculas que intervienen son las selectinas. En este caso la unión que se produce entre el neutrófilo y la célula endotelial es débil. Se unen y se separan. 2o PASO: ADHERENCIA ESTABLE. En este caso intervienen las moléculas de adhesión integrinas.

La respuesta inflamatoria se acompaña por cambios en el flujo sanguíneo local y en la permeabilidad vascular, que producen los signos clásicos de la inflamación: tumor, rubor, clor y dolor. Los cambios vasculares permiten, además, que leucocitos circulantes se extravasen a los sitios de infección, destruyan a los patógenos, limpien los restos celulares y comience el proceso de reparación tisular. El incremento de la permeabilidad vascular, producto de la contracción que sufren las células endoteliales de las vénulas poscapilares en respuesta a mediadores como la histamina, produce un escape del líquido del vaso al tejido subyacente. Esto provoca hemoconcentración, lo que enlentece el flujo sanguíneo y en consecuencia, los leucocitos, que normalmente circulan en la corriente central del flujo sanguíneo laminar, se marginan y pueden contactarse con el endotelio, facilitando su posterior extravasación. El proceso de extravasación leucocitaria involucra la acción coordinada de moléculas de adhesión y quimioatractantes. Las moléculas de adhesión constituyen un conjunto de moléculas presentes en la superficie celular que median las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Existen cinco familias de moléculas de adhesión: -selectinas (L-selectinas, P-selectinas y E-selectinas de los leucocitos, plaquetas y endotelio respectivamente): reconocen carbohidratos sobre glucoproteínas de la superficie celular. -integrinas:cumplen un papel crítico en la extravasación leucocitaria. -moléculas de adhesión que por su estructura se incluyen dentro de la superfamilia de las Ig: su expresión puede ser constitutiva o inducible. Por ejemplo ICAM-1 y VCAM-1 se expresan enniveles muy bajos en la mayoria de los lechos vasculares. Su expresión es mucho mayor en el endotelio de vasos que irrigan tejidos infectados o inflamados por la acción de citoquinas inflamatorias producidas localmente. -cadherinas: son moléculas responsables de mantener la integridad estructural de los tejidos. Estas moléculas se expresan como dímeros y establecen interacciones con otros dímeros de cadherinas expresados en células vecinas (ejemplo cadherinas expresadas en las células de Langerhans que se unen a cadherinas de los queratinocitos, y cuando la célula dendrítica reconoce algún Ag deja de expresar estas cadherinas para poder dirigirse a los ganglos linfáticos y presentarle el Ag a un LT). -sialomucinas.

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3o PASO: DIAPÉDESIS. Consiste en el pasaje del neutrófilo entre dos células endoteliales. En este caso también intervienen las integrinas y otra molécula que es la CD31. Una vez que pasó el neutrófilo libera proteasas que van a degradar la membrana basal. 4o PASO: MIGRACIÓN . Se produce gracias a un gradiente de quemoquinas. Una quemoquina importante en este caso es la IL-8. En la inflamación había una vasodilatación capilar, una disminución del flujo sanguíneo, y al enlentecerse todo el flujo, los neutrófilos que estaban circulando por el torrente empiezan a bajar y a acercarse cada vez más a las células endoteliales y así iniciar el paso 1. CÉLULAS NK Las CÉLULAS NK actúan en la inmunidad mediata, destruyendo células infectadas por virus. Las células infectadas por virus expresan menor cantidad de moléculas de histocompatibilidad de clase I, y estas células NK detectan estas diferencias de producción. Las células NK tienen un receptor, el NKG2D, que reconocen los Mic a y Mic b , que pertenecen al CMH, y estas moléculas se expresan de forma constitutiva en intestino y aumentan mucho en condiciones de estrés. Cuando estas células NK se unen a estas moléculas se activan. En la infección por virus se producen unos mecanismos innatos con la producción del interferón de tipo I por parte de las células infectadas. Estos dos interferones INT-α e INT-β, inhiben la replicación viral, y además estimulan la actividad de las células NK. Todas las células tienen capacidad de producir interferones. INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS T Un linfocito T que no haya impactado con un Ag se denomina virgen o naive. Los LT se originan en la médula ósea, terminan de madurar en el timo y cuando salen del timo son linfocitos vírgenes. Estos tienen en su membrana un receptor T y pueden tener una molécula CD4 o una molécula CD8. Los que tienen la molécula CD4 se llaman helpers y los que tienen la molécula CD8 se llaman citotóxicos. Los linfocitos que salen del timo van a parar a un ganglio y ahí se encuentran con una célula dendrítica que llegó desde un tejido periférico cargada con algún Ag. Esta célula dendrítica le va a mostrar al LT ese Ag. Si se trata de un LT CD4+, se lo va a presentar en el contexto de la molécula de histocompatibilidad de clase II. Esto no es suficiente para que el linfocito se active, necesita una señal más que va a estar dada por una molécula co-estimulatoria, la CD28 y la CD80 y CD86 de la célula dendrítica. Con esas dos señales el linfocito se activa y empieza a proliferar. Se transforma así en efector. Los LT helpers pueden ser de dos tipos: LTh1 y LTh2. Esta diferenciación se produce por acción de distintas citoquinas. Las que favorecen la diferenciación a LTh1 son INF-γ y la IL-12; las que favorecen los LTh2 es la IL-4. Los dos LTh se diferencian en las funciones y en el patrón de citoquinas que producen. Los LTh 1 median respuestas contra microorganismos intracelulares, van a favorecer la fagocitosis, van a estimular a los macrófagos. Los LTh 2 colaboran con los LB y ayudan a producir anticuerpos.

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Las citoquinas que producen uno u otro se inhiben mutuamente. El LTh1 secreta principalmente INF-γ, que activa neutrófilos, macrófagos, células NK y a su vez inhibe la proliferación de LTh2. Los LTh2 producen IL-10, TGF-β que inhiben a los LTh1. De todos modos siempre se generan los dos tipos de respuesta, pero va a predominar una u otra, de acuerdo a que los patógenos sean intracelulares o extracelulares. Si bien los LT se diferencian en el ganglio, los LTh1 van a dirigirse a tejidos periféricos que es donde tienen que efectuar su función. Los LTh2 se quedan en el ganglio, porque en el ganglio están los LB con los que van a colaborar. También se producen unos LT de memoria. Algunos van a ser LTm centrales (LTmc) y otros LTm periféricos (LTmp) . Estos linfocitos se diferencian en receptores que tengan para quemoquinas. Esto le permite a los LTmc volver a un ganglio linfático para ver si encuentra algún Ag, mientras que los LTmp no pueden volver. Estos son fenómenos de recirculación de los linfocitos que permiten a un linfocito que no encontró a su Ag en el ganglio, volver a salir y hacer todo el circuito sanguíneo. Por otro lado están los LT citotóxicos CD8+. Reconocen Ag presentados por moléculas del CMH de clase I y actúan cuando hay células infectadas por virus. El mecanismo de acción puede ser por liberación del contenido de sus gránulos que contienen la enzima perforina , o pueden actuar a través del sistema FADD + ligando induciendo la apoptosis de la célula infectada. Para activarse necesitan mayores señales que los LTh. Los LT CD8+ se van a activar en el ganglio y después van a ir a los tejidos donde van a ejercer su acción. Para que un LT se active necesita que el Ag se lo presente una célula dendrítica, porque necesitan señales co-estimulatorias de mayor intensidad. Los linfocitos efectores no necesitan señales tan fuertes y se pueden activar por macrófagos. Hay una población de LT que se denominan LT reguladores (LTr) . Los LTr se conocían antes como LT supresores. Hay dos tipos de LTr, unos que se originan como tales en la médula ósea y en el timo (LTr naturales), y otros que se inducen ante la presencia de determinados Ag (LTr inducibles). Estos linfocitos varían en las moléculas que expresan en sus membranas. � Los LT reconocen péptidos pequeños y los reconocen en el contexto de las moléculas del CMH de clase I o II, los citotóxicos de clase I y los helpers de clase II. Th1 LT CD4+ Th2 CD8+ Tr INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS B Hay tres clases de linfocitos B. Los LB1 son muy poco abundantes en sangre, pero son los mayoritarios en las cavidades peritoneal y pleural. Pueden proliferar sin necesidad de estar en contacto con el Ag. Producen Ac contra distintos componentes bacterianos,

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y el principal Ac que producen es de tipo IgM. Estos son los Ac naturales del organismo. Estos LB reconocen un Ag bacteriano a través del receptor B que es una inmunoglobulina con otras moléculas asociadas. Este linfocito se transforma directamente en plasmocito y produce Ac IgM. Esos Ac se van a ir a fijar a la bacteria que tenía los Ag que le dieron origen. Los LB de la zona marginal del bazo (LBZM), son los primeros que actúan contra antígenos que llegan por vía sanguínea. Estos linfocitos pueden proliferar sin la necesidad de la presencia de Ag y también producen Ac de tipo IgM. Es la principal defensa contra bacterias que ingresan por sangre. La población mayoritaria de LB son los LB2. Constituyen el 90% de los linfocitos que están en sangre periférica y necesitan de la colaboración de los LTh2 para producir Ac. Por ejemplo, el LB2 tiene capacidad de fagocitar y degradar agentes patógenos. El LB fagocita al virus, lo internaliza, lo degrada y presenta pedacitos de este virus en las moléculas del CMH de clase II. Así interactúa con un LTh2, el cual lo reconoce, no necesariamente por la misma región antigénica que reconoce el LB2, luego el LTh2 produce citoquinas y con ellas el LB2 se transforma en un plasmocito productor de Ac. FUNCIÓN EFECTORA DE LOS ANTICUERPOS Los Ac están constituidos por dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son centrales y las más pesadas, y las L son periféricas y las más livianas. Existen cinco clases de Ac: G, A, M, D y E. La Ig G se va a producir después de que los linfocitos sufren un proceso dentro del ganglio linfático llamado HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA y SWITCH de Ig; les va a permitir cambiar de IgM, que es la primera Ig que se producirá, a IgG. Esto se produce en lo que se llama centro germinativo. Los Ac tienen una función que está dada por una porción que se llama Fab y es el sitio de unión a los Ag. Aquí la porción que específicamente se une al Ag se llama paratope. El paratope se va a unir a una parte en particular del Ag que se llama epitope. Estas regiones de las Ig son muy variables. Esta variabilidad les permite reconocer los diferentes Ag. El receptor que tiene el LB es una IgM. Otra parte del Ac que tiene importantes funciones es el Fc (región constante). Está formada por las dos cadenas pesadas. Hay muchas células que tienen receptores para los fragmentos Fc, como los macrófagos. Si hay un microorganismo que está recubierto por Ac y este Ac por el Fc se une al macrófago, el macrófago lo va a fagocitar más fácilmente. �Porción Fab → reconoce al Ag por una parte de la cadena H y una parte de la cadena L. �Porción Fc → indica qué se va a hacer con el Ag unido.

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Entre sus funciones se pueden mencionar: • Sirven para reconocer al Ag en estado nativo, como la Ig de superficie de los LB (receptor antigénico), es decir, reconoce Ag sin procesar. • Pueden activar el complemento, neutralizar a los patógenos y opsonizarlos. • Sirven para participar de un mecanismo de citotoxicidad anticuerpo dependiente. • Participan en los procesos inflamatorios. • Son los que dan inmunidad a las mucosas (IgA). • Dan inmunidad prenatal y neonatal (Ig G, la única que puede atravesar placenta, e IgA). Cuando se producen los fenómenos inflamatorios, las citoquinas que se liberan estimulan la producción de estas quemoquinas. Las células dendríticas que han captado algún Ag expresan también este receptor y pueden dirigirse hasta los ganglios. Por ello en ese lugar se va a producir el encuentro entre la célula dendrítica con el LT. El LT virgen reconoce al Ag o no. Si hay reconocimiento, el LT se activa y pasa hacia el folículo linfoideo. Si no lo reconoce el LT sale del ganglio y pasa a circulación. Esta recirculación del linfocito permite que no se acumule un exceso de células en el ganglio y además que tengan la posibilidad de encontrar otros Ag. (Los linfocitos T cuando se activan van a poder generar linfocitos de memoria (LTm). Estos linfocitos pueden ser centrales y otros periféricos. Los LTm periféricos (LTmp) no van a poder expresar más el receptor, por lo que no van a poder volver al ganglio. En cambio los LTm centrales (LTmc) van a seguir expresando este receptor, pareciéndose más a los vírgenes y por eso van a poder volver al ganglio). Algo parecido ocurre con los LB. Los LB tienen otras quemoquinas que participan en su migración. Los LB vírgenes que circulan por sangre van a salir por las células del endotelio alto de las vénulas del área paracortical del ganglio linfático. Las células endoteliales de estas vénulas expresan quemoquinas que no expresan las células endoteliales de otros vasos. Los LB reconocen a las quemoquinas CXCL13 que se encuentran en el folículo linfoideo y salen del vaso ( por el receptor CXCR5 que tienen en su membrana que reconoce a CXCL13).

Los linfocitos T vírgenes van a ir a los órganos linfáticos secundarios a través de la sangre. Los Ag van a venir por la linfa hasta los ganglios linfáticos. Ahí se van a encontrar, se va a producir la presentación, la proliferación, la diferenciación y después los linfocitos van a poder volver a la sangre a través del conducto torácico, saliendo de los ganglios linfáticos. Los linfocitos T vírgenes se unen a las moléculas L-selectina del endotelio vascular. En los ganglios linfáticos, en el área paracortical, se expresan unas quemoquinas: CCL19 y la CCL21. Los linfocitos T vírgenes tienen un receptor que es el CCR virgen, el cual reconoce a estas quemoquinas y así los linfocitos vírgenes pueden dirigirse hacia el área paracortical.

�El LB que viene por sangre se fija a las paredes del vaso por quemoquinas que este tiene y que otros vasos no poseen. Los LB son atraidos hacia el folículo linfoideo por medio de quemoquinas CXCL13 que reconocen por medio de receptores CXCR5 de sus superficie, y migran hacia él.

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Cuando el LB virgen encuentra un Ag, disminuye la expresión de estos receptores CXCR5 y comienza a producir una mayor cantidad de receptores CCR7 para poder acercarse a los lugares donde están los LTh . Allí se encuentran con los LTh que se han encontrado con el Ag, se produce la cooperación T-B, se forma el foco primario que es donde hay proliferación de LB, algunos van a transformarse en células plasmáticas y van a producir Ac del tipo IgM, y otros van a formar el centro germinal donde van a seguir proliferando, se va a producir el switch y los linfocitos del centro germinal van a empezar a producir IgG, y se van a transformar en linfocitos de memoria. Los linfocitos que van a generarse en tejidos asociados a mucosas van a poder dirigirse a distintos lugares de acuerdo a los receptores de quemoquinas que tengan y del quemoquinas que se generan. Por ejemplo en LB que se generó en la médula ósea va a poder ir al tracto respiratorio, al urogenital, a las glándulas salivales, dependiendo de qué receptores para quemoquinas expresa y qué quemoquinas esta expresando el tejido. Todo esto se denomina TRÁFICO LINFOCITARIO , y los receptores que le permiten a los linfocitos hacer el viaje se denominan receptores de Homing.

Tráfico de linfocitos vírgenes Cada linfocito T o B vírgen debe poder llevar a cabo la tarea de encontrar y contactarse con su Ag específico, en el momento en que éste ingrese en el organismo, cualquiera sea la vía a través de la cual acceda. De no existir mecanismos especializados de migración, la probabilidad de que estos linfocitos encuentren a su Ag sería casi nula. Los linfocitos no ocupan posiciones estáticas, sino que recirculan según patrones de tráfico definidos, que incrementan marcadamente la probabilidad de encuentro con sus Ag específicos. Los linfocitos nativos, una vez maduros, pasan a la circulación sanguínea, para luego extravasarse en los organos linfáticos secundarios (OLS). Estos órganos incluyen, entre otros, ganglios linfáticos, bazo, placas de Peyer del intestino, amigdalas y adenoides. Si no encuentran a su Ag específico en estos órganos, los linfocitos retornan a la circulación sanguínea a través de los vasos linfáticos eferentes y el conducto torácico. En menos de media hora, volverán a extravasarse en un nuevo OLS, para recomenzar la búsqueda de su Ag específico. Esta ruta migratoria favorece el encuentro entre linfocitos y Ag, dado que, las células dendríticas capturan Ag en los tejidos periféricos y los transportan a los OLS drenantes para presentarlos a los LT. Del mismo modo, el drenaje lnfático, incrementado como consecuencia de la inflamación que acompaña a los procesos infecciosos, asegura el transporte de Ag al OLS drenante. Ello permite su reconocimieto por los LB específicos que se hayan extravasado en ese órgano. Ante señales coestimulatorias apropiadas, los LT y LB que encuentren a su Ag específico se activarán, sufrirán expansión clonal y después de unos días adquirirán funciones efectoras particulares y patrones de migración característicos. Así los LT que se diferencien a perfil LTh1 abandonan el OLS a través del linfático eferente y por el conducto torácico pasan a la circulación, para luego extravasarse en los tejidos periféricos inflamatorios. Los que se diferencian a LTh2 puden colaborar con los LB, una vez que estos han reconocido ya a su Ag específico, o bien, abandonan el OLS a través del linfático eferente, acceden a la circulación y se extravasan en la periferia para participar en la respuesta inmune antiparasitaria o en fenómenos de alergia. La mayoria de los LT que han proliferado en respuesta al Ag mueren una vez eliminado éste. No obstante una pequeña proporción permanece como células de memoria para proporcionar protección duradera.

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Dos poblaciones de células T de memoria patrullan los distintos órganos para montar respuestas inmunes rápidas ante el reingreso del Ag. Las células T de memoria centrales inmunovigilan los órganos linfáticos secundarios, mientras que las células T de memoria efectoras custodian los tejidos periféricos. Los LB que son activados por su Ag específico en los OLS dan origen a plasmoblastos (precursores de células plasmáticas) y células B de memoria. Los plasmoblastos pueden diferenciarse localmente en células plasmáticas, que permanecen en los OLS o pueden abandonar el OLS a través del linfático eferente y por el conducto torácico ingresar en el torrente sanguíneo para poblar sitios distantes, como la médula ósea, la piel y las mucosas. Las células B de memoria también sufrirán recirculación entre la sangre, el OLS y la linfa. Homing y activación de linfocitos vírgenes en el ganglio linfático Los LB2 y los LT vírgenes se extravasan en el HEV (vénulas del endotelio alto) de gánglios linfáticos merced a la expresión de CCR7 y L-selectina. Dado que los LB2 expresan también CXCR5, son reclutados a folículos linfoides por la quemoquina CXCL13. El reconocimiento del Ag incrementa su expresión de CCR7, lo que conduce a estas células a migrar hacia el área T en respuesta a CCL19 y CCl21. Los LT que son activados por el Ag en el área T neoexpresan CXCR5, el cual los conduce hacia el folículo. En el borde del folículo tiene lugar un primer evento de colaboración T-B, cuyo producto es un foco primario de proliferación. Algunas de las células allí generadas migran a los cordones medulares donde se diferencian a plasmocitos mientras otras migran al folículo donde fundan el centro germinal.

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ANTÍGENOS

CARACTERÍSTICAS GENERALES La inmunogenicidad es la capacidad que tiene una sustancia de generar una respuesta inmune y también de interactuar con los productos de ella. La antigenicidad se refiere solamente a la capacidad de interacciones con los productos de una respuesta inmune, los productos de la inmunidad humoral y los productos de la inmunidad celular. Los productos de la inmunidad humoral son los Ac y los productos de la inmunidad celular van a ser los LT sensibles.

� El inmunógeno siempre es antígeno. � El antígeno no siempre es inmunógeno. La alergenicidad es la capacidad de producir algún tipo de respuesta alérgica humoral o celular. La tolerogenicidad es la capacidad de una sustancia de inducir tolerancia. Muchas proteínas de la dieta son extrañas para el organismo e inducen tolerancia, es decir, hay mecanismos del sistema inmune que permiten ignorarlas. Dentro de los Ag, hay un grupo muy particular de moléculas que se llaman haptenos. Son grupos químicos definidos, orgánicos: dinitrofenol, trinitrofenol, todos compuestos a base de anillos aromáticos. Los haptenos no generan respuesta inmune, pero si son antigénicos porque pueden interactuar con los Ac preformados. Un hapteno se transforma en inmunogénico si se lo une a una proteína carrier o transportadora. En ese contexto el hapteno puede ser inmunogénico. Cualquier proteína inmunogénica puede ser transportadora, como la seroalbumina humana (SAH) o seroalbumina bobina (SAB), a la cual se le puede adosar químicamente el hapteno. Un conejo inmunizado va a generar Ac tanto para el carrier como para el hapteno. Si el hapteno lo unimos a una proteína diferente, los Ac generados contra el primer carrier no interactúan con el segundo, porque es una molécula distinta. Para la detección de Ac no puedo usar el mismo carrier.

Buscamos los Ac:

Inmunización Cambio de soporte

�

Inmunógeno: sustancia que introducida en un vertebrado adulto inmunológicamente maduro es capaz de generar una respuesta inmune y posterirmente raccionar con el producto de la misma.

Antígeno: sustancia capaz de reaccionar con el producto de la respuesta inmune in vitro (en el laboratorio). Puede generar una respuesta inmune.

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Es necesario siempre hacer un cambio de soporte o de carrier cuando se evalúa si se produjeron Ac contra el hapteno. Se evita así la detección de Ac anti-carrier. ALGUNAS DEFINICIONES DETERMINANTE ANTIGÉNICO: El determinante antigénico es una zona de la molécula de los Ag. Puede haber más de un determinante antigénico en una molécula, y pueden ser todos iguales o todos distintos. Pero puede haber un único determinante antigénico en una molécula. Es una zona restringida de la molécula antigénica que determina la especificidad. EPITOPE / PARATOPE: El epitope pertenece al determinante antigénico, pero es un área más restringida. El epitope siempre está definido si existe un paratope para él. El paratope es el área del Ac que va a reconocer el epitope. En un mismo determinante antigénico puede haber varios epitopes que se superponen. A veces el determinante antigénico tiene un solo epitope. En una proteína, un epitope puede estar restringido a 5 o 6 residuos aminoacídicos. En un hidrato de carbono, en 5 o 6 unidades de glucosa, etc. Esos 5 o 6 aminoácidos que van a determinar el epitope pueden ser continuos en la sustancia acídica de la estructura primaria de la proteína: Epitopes continuos, secuénciales o lineales. Los Epitopes discontinuos o conformacionales están relacionados también pero en la estructura terciaria o cuaternaria de la molécula (están cerca en la estructura tridimensional pero lejos en la secuencia lineal). VALENCIA FUNCIONAL: La valencia funcional se refiere a epitopes o determinantes antigénicos que están expuestos, se llaman funcionales porque son los que generan una respuesta inmune y provocan la síntesis de anticuerpos. VALENCIA TOTAL: La valencia total se refiere a los epitopes expuestos y ocultos. Hay muchos epitopes que por la estructura y plegamiento de la molécula no están en la superficie. Si por alguna causa quedan expuestos también generarían una respuesta inmune. � Ovoalbúmina: 30 epitopes funcionales � Bacilo tífico: 5,5 x 105 determinantes antigénicos ANTÍGENOS HETERÓLOGOS: Son antígenos que se dan entre especies diferentes. ANTÍGENOS ISÓLOGOS: Son antígenos de una misma especie. ANTÍGENOS AUTÓLOGOS: Son antígenos propios del individuo. El sistema inmune tiene mecanismos para no reaccionar contra estos Ag, salvo en las enfermedades autoinmunes. En estos casos hay un desconocimiento de lo propio que

Hapteno: sustancia de bajo PM que no induce respuesta inmunitaria, pero puede adquirir inmunogenicidad al unirse covalentemente a una proteína de mayor peso molecular (carrier).

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provoca que se genere una respuesta inmune humoral o celular contra estos Ag autólogos. La respuesta inmune humoral posee Ac que reconocen a la proteína nativa. Si la proteína nativa se desnaturaliza, se procesa y se presenta a los LT se genera la respuesta inmune celular. Un Ag multivalente puede tener determinantes antigénicos o epitopes diferentes o con todos los epitopes iguales. Un Ag multivalente con epitopes diferentes va a generar distintos tipos de Ac, cada uno de ellos para cada determinante antigénico. Esta es una respuesta poliespecífica. En cambio en un Ag multivalente con todos los epitopes iguales, la respuesta va a ser monoepecífica. Un Ag monovalente también generará una respuesta monoespecífica. �RESPUESTA MONOESPECÍFICA Antígenos multivalentes con epitopes todos iguales. Antígenos monovalentes. �RESPUESTA POLIESPECÍFICA Antígeno multivalente con epitopes diferentes.

CARACTERÍSTICAS QUE DETERMINAN LA INMUNOGENICIDAD FACTORES DE LA MOLÉCULA • La naturaleza de la molécula se refiere a si es una proteína, o un hidrato de carbono, o un lípido, o un ácido nucleico. Por excelencia las proteínas son las que generan la mejor respuesta inmune. Los polisacáridos también son inmunogénicos aunque en menor cuantía. En cambio los lípidos y los ácidos nucleicos son más difíciles como inmunógenos, sólo si forman parte de una estructura más compleja. El DNA monohebra generalmente es más inmunogénico que la doble hebra. El problema de los ácidos nucleicos es que generan Ac contra las bases y los azúcares, por lo que pueden dar reacciones cruzadas con otros Ac que no fueron generados por ese DNA sino por otro. • El carácter de no propio significa que la proteína o el hidrato de carbono es extraño al sistema inmune. Que sea extraño quiere decir que el organismo lo desconoce, porque proviene de otro organismo alejado filogenéticamente de nosotros.

Ag monoespecífico: posee todos los

epitopes idénticos.

Ag poliespecífico: posee epitopes a

repetición pero no todos idénticos. Cada tipo de

epitope genera un paratope distinto.

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• Con respecto al tamaño molecular, mientras mayor sea el tamaño más inmunogénica será la molécula. Pesos mayores a 10 KDa van a mermar la respuesta y proteínas o azucares menores a 4 KDa ya no generan respuesta inmune.

• La heterogeneidad de la composición química, se refiere a cuán compleja es la molécula. Esta va a estar dada por las ramificaciones y plegamientos de las moléculas. La configuración óptica también influye, al igual que la rigidez de la molécula. Generalmente los anillos aromáticos les confieren una rigidez a la molécula que las hace buenas inmunógenas. Los ácidos grasos, en cambio, tienen una cadena de hidrocarburos más o menos larga que le confiere cierta inestabilidad a la molécula.

• La degradabilidad: las proteínas están compuestas por L-aminoácidos, aunque hay sustancias en la naturaleza que son dextrógiras. Esas moléculas son poco inmunogénicas en vertebrados. Este hecho se debe a que no hay sistemas enzimáticos capaces de degradarlos, y la degradación de la molécula es una vía importante para llegar a la inmunidad celular. Por lo tanto cuanto menor degradabilidad, menor inmunogenicidad. OTROS FACTORES • Otros factores que afectan a que una molécula sea más o menos inmunogénica es el genotipo del receptor. Hay unas moléculas que son muy necesarias para el procesamiento y presentación del Ag a los LT que se llaman moléculas del COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH) . Estas moléculas son el lugar donde se van a montar los péptidos para ser presentados a los LT. El receptor del LT (TCR) reconoce tanto al péptido como a la molécula del CMH. Esta es la señal para que el linfocito T se active. La expresión de las moléculas del CMH va a depender mucho del genotipo del receptor de los linfocitos, TCR para los LT y BCR para LB, del genotipo de las moléculas del CMH, y también de los genes que codifican para las IL, que van a orquestar toda la respuesta inmune. • Las dosis y las vías de administración (oral o parenteral) también son importantes. Las dosis altas y las dosis bajas generan tolerancia, que es una inactividad del sistema inmune. • La concurrencia de antígenos se refiere a cuando hay más de un Ag en un inóculo. Esto es bueno cuando uno de los Ag actúa como adyuvante de los otros. Lo ideal es inocular Ag por Ag para evitar interferencias negativas. En algunos casos la interferencia puede ser positiva y uno de los inmunógenos potencia la respuesta inmune del otro, entonces de los utiliza como adyuvantes. Ejemplo: vacuna triple: Difteria, Bordetella pertusis y Tétanos. La Bordetella pertusis tiene una actividad adyuvante intrínseca. Esta vacuna tiene el toxoide de la Difteria, el toxoide del Tétanos y Bordetella pertusis, que actúa como adyuvante de los otros dos, mejorando así la respuesta inmune. A veces la concurrencia de Ag es mala, sobre todo dependiendo de la dosis con que se inoculan cada uno de los componentes del inóculo. Puede ser que se genere un fenómeno que se llama DOMINANCIA CLONAL , en el cual se va a activar predominantemente un solo clon con LB sobre el resto, con lo cual se van a tener

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muchos anticuerpos contra un solo Ag, el que domina, y muy pocos Ac contra los restantes Ag que componen el inóculo. Esto es muy importante en las vacunas, donde se intenta que el número de inoculaciones disminuya. Por lo que empiezan a aparecer vacunas triples, cuádruples, quíntuples, que reúnen distintos inmunógenos. En las vías de inoculación se ha visto que la subcutánea tiene mejores resultados que la intraperitoneal, y muchos mejores de resultados que las intravenosas. Esto se debe a que en la inoculación subcutánea, las células de Langerhans que son células dendríticas, toman el Ag y lo llevan al ganglio para presentarlo a los LT y a los LB. En la inoculación intravenosa, el inóculo va por sangre y termina en el bazo. Se usa mucho la vía intramuscular (casi todas), y también se está buscando la vía oral. Con ella se estimula el MALT (tejido linfoide asociado a mucosas). En un principio esto genera la producción de un Ac en particular que protege las mucosas, pero después termina produciendo IgG que son las más importantes y son las que confieren inmunidad de por vida. Este es el ejemplo de la Sabin. ADYUVANTES Mejora la presentación del Ag, a que acudan al lugar células inmunocompetentes. Por ejemplo: el adyuvante de Freud incompleto, que es una emulsión de aceite en agua, y el adyuvante de Freud completo es el que tiene el macerado de bacilos tuberculosos. El mecanismo de acción de la mayoría de los adyuvantes puede ser centrado en el efecto de depósito, lo que favorece la liberación retardada del Ag. Muy poco eficiente va a ser la respuesta inmune si el Ag se degrada rápidamente, por eso la vía intravenosa para muchos de los Ag solubles es contraindicada, porque el catabolismo los elimina de la circulación mucho antes de que lleguen a impactar con el sistema inmune. El efecto de depósito proporciona un lugar a partir del cual el Ag se libera lentamente. Esto produce estímulos a repetición. Cuando se inyecta un adyuvante de tipo oleoso, en la zona de inoculación se forma un granuloma, el cual es una estructura que forman los macrófagos al rodear al inóculo y puede en un futuro llegar a producir un absceso, sobre todo si el adyuvante es completo. Va a ser un absceso estéril porque no tiene el patógeno, pero provoca las mismas reacciones de tipo inflamatorias que van acompañadas por el acudimiento al lugar de macrófagos, células dendríticas, que toman el Ag y lo llevan al ganglio regional para ser procesado por los LT. Es una manera de asegurarse la eficiencia del sistema. Freud con MDP (muramildipéptido), es el componente activo que se ha sido aislado de la pared de Micobacterium tuberculosis.

�Modificadores de la inmunogenicidad: • Dosis de inmunógeno. • Cocurrencia de Ag. • Tipo de animal inmunizado (existen animales ideales para determinados Ag y viceversa)

• Adyuvantes.

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El hidróxido de aluminio es otro de los adyuvantes que se usan y es uno de los pocos que pueden usarse en seres humanos, a veces acompañado con Burdetella pertusis atenuada. Otros enfoques de los adyuvantes: • Las citoquinas: las IL participan desviando la respuesta inmune hacia humoral o celular. El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos y la IL-2 se utilizan mucho para favorecer la respuesta LTh2, y la IL-12 para los LTh1. La respuesta por LTh2→Ac (humoral), la respuesta por LTh1→celular. • Los liposomas también se usan (membranas fosfolipídicas con el Ag), favorecen el depósito y la liberación lenta del Ag. • Los ISCOMs (complejos inmuno estimuladores) se hacen con un surfactante, que van a formar micelas en las cuales uno puede introducir un Ag. Así la liberación del Ag es más lenta y a pulsos. Hay vacunas de uso veterinario cuyo adyuvante se llama Qui A, es un derivado de la saponina. ALTERACIÓN DE LOS ANTÍGENOS Se puede hacer por adición de anillos aromáticos para favorecer la rigidez de la molécula, siempre y cuando la idea sea mejorar la inmunogenicidad de esa molécula y no se estén alterando los epitopes que interesan. Lo mismo ocurre cuando a los anticuerpos o a los antígenos se le adicionan marcas: fluorocromos, átomos radiactivos, enzimas, etc. La marca no debe alterar epitopes ni paratopes. ANTÍGENOS TIMO-DEPENDIENTES Y TIMO-INDEPENDIENTES La colaboración de las células T es importante para una buena respuesta inmune, con lo cual la mayoría de las proteínas antigénicas y los haptenos unidos a carriers generan una respuesta de tipo T-dependiente. Existe una clase particular de Ag que no necesitan de los LT. Hay dos clases de antígenos T-independientes: los de clase I y los de clase II. Los de clase I son mitogénicos, esto es, activan a los LB inespecíficamente, produciendo una cantidad de clones indefinida de LB con muchas especificidades diferentes. Se tiene así una respuesta poliespecífica a partir de un solo Ag. No necesariamente entre los clones va a

Adyuvantes: son sustancias que incentivan la respuesta inmune de otras: hacen que inmunógenos débiles induzcan una respuesta inmune adecuada o convierten sustancias no inmunogénicas en inmunogénicas. Por si mismas no intervienen en la respuesta inmune. Algunos exaltan la inmunidad humoral y otros la inmunidad celular. La respuesta inmune se exacerba de modo que:

• Es más rápida en el tiempo. • Es más prolongada. • Existe producción de distintos isotipos de Ig.

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estar el que genera Ac específicos para ese Ag. Un ejemplo es el LPS que interacciona con receptores de la membrana que no son BCR, pero que terminan llevando a la activación del LB. Los Ag T-independientes de tipo II generalmente son Ag con secuencias repetidas, entonces lo que hacen es entrecruzar los BCR. Esto lleva a la activación del LB, y en este caso sí es específico porque entrecruzan los BCR que lo reconocieron. El ejemplo es el polisacárido del neumococo. Los Ag T-independientes se descubrieron en ratones nude, que tienen aplasia tímica (sin timo y sin LT) y aún así respondían al polisacárido del neumococo. Los Ag T-independientes I generalmente llevan a una producción de Ac IgM, que es el primer Ac que se genera y no necesita colaboración T para secretarse. Mayoritariamente se produce IgM en los Ag T-independientes II, aunque se ha visto pequeñas cantidades de IgG.

PROPIEDAD Ag T-DEPEN-DIENTES

Ag T-INDEPEN-DIENTES I

Ag T -INDEPEN-DIENTES II

Respuesta de Ac NO SI SI

en ausencia de LT Producción de Ac en

NO SI SI individuos congénita- mente atímicos

Activa LT SI NO NO Activación de LB no

NO SI NO Específicos

Requiere epitopes NO

NO, LPS bacteria Brucella abortus

SI, polisacarido del neumococo,

Repetidos flagelina polimerizada (Salmonella)

ANTÍGENOS BACTERIANOS Las bacterias son cúmulos de Ag.

Ag T- dependientes: necesitan la colaboración de los LT para inducir la respuesta inmune sobre los LB. Son mooléculas complejas que poseen determinantes a repetición y de todo tipo. Generan IgG e IgM. Ag T-independiente: inducen la respuesta inmune directamente sobre los LB. Poseen determinantes antigénicos lineales. Generan respuesta inmune del tipo IgM. Se agrupan en dos categorias: -Tipo I: Son mitogénicos de los LB, inducen respuesta policlonal de Ac, son activadores de macrófagos e inducen la producción de IL, INF y PG. -Tipo II: Son polímeros de polisacáridos que necesitan de factores solubles para inducir respuesta inmune. Favorecen la polimerización de los recptores antigénicos de los LB (Ig de membrana) iniciando la transducción de señales que llevan a la activación de la célula.

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VENENOS ANIMALES Y VEGETALES Los venenos vegetales y animales generalmente se transforman en toxoides con el tratamiento con formol. La diferencia entre el toxoide y el veneno es la inactividad de la molécula del toxoide. Por ejemplo, el veneno de serpiente es neurotóxico, el toxoide no es neurotóxico, pero sí genera respuesta inmune. (Este es el fundamento para la generación de suero antiofídico). ANTÍGENOS DE ESPECIE Y DE ÓRGANOS Hay Ag que se encuentran en una especie y no en otra (Ag de especie). Los Ag de órganos (privilegiados) están aislados del organismo y el propio sistema inmune no conoce (gónadas, ojos). ANTÍGENOS COMPARTIDOS Los Ag compartidos son los que se encuentran en varias especies vertebradas o no y pueden estar muy dispersados en la naturaleza. Los Ag heterófilos son Ag que se encuentran en la mucosa del estómago de especies como porcinos, bovinos, en GR de carnero. Cuando se los descubrió vieron que los GR de carnero se lisaban cuando se inyectaban con un suero obtenido de un conejo que fue inoculado con un riñón de cobayo. Estos se denominaron ANTÍGENOS DE FORSSMAN. Están en la superficie de los GR de carnero y en el riñón de cobayo. Los GR de carnero son muy importantes para técnicas serológicas. En el sistema ABO hay tres genes que codifican para la adición de azúcares en la membrana de los GR. La única diferencia que existe entre la sustancia A y la B es una N-acetilgalactosamina en el A y una galactosa en el B. El resto del esqueleto es el mismo para los tres Ag. El esqueleto no está codificado por el gen del sistema ABO, el gen A o B solo lleva a la adición de un residuo sobre ese esqueleto. Hay 8 genotipos posibles pero solo 4 fenotipos: GENOTIPOS FENOTIPOS AA o Ai A BB o Bi B AB AB ii O Repasando: Un hapteno se caracteriza por no generar una respuesta inmune por sí mismo, pero sí puede generarla si se une químicamente con un carrier o proteína transportadora. Para evaluar la respuesta anti-hapteno se debe cambiar el soporte. Esto es porque en la respuesta inmune se generan Ac tanto para el hapteno como para la proteína carrier. Si se quiere evaluar si en verdad se produjeron Ac anti-hapteno debemos usar un carrier diferente para no estar obteniendo un falso positivo.

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Los antígenos T-dependientes necesitan de los linfocitos T para orquestar la respuesta inmune. Los antígenos T-independientes generan una respuesta inmune sin la colaboración de los LT. Hay dos clases: los T-independientes I interactúan con receptores distintos de los BCR, se unen a otros receptores que terminan igualmente activando al LB. Los Ac que se van a producir del LB no van a ser específicos contra el Ag T-independiente I, y como activa muchos clones de LB, se van a obtener muchos tipos de Ac, cada uno proveniente de un LB diferente, pero activado por el mismo Ag inespecífico. Los Ag T-independientes II sí interactúan con los BCR, son generalmente Ag con epitopes repetidos, como los polisacáridos, que lo que hacen es entrecruzar los receptores y van a hacer que el LB se active. En este caso la especificidad va a ser contra el Ag T-independiente II, ya que el Ag se une a su receptor y hay un reconocimiento. En ambos casos, tanto para los del tipo I como para los del tipo II, los Ac que se producen son IgM.

De los venenos vegetales y animales generalmente la toxina se inactiva con un tratamiento con formol para poder inocularla en un animal para poder obtener un suero anti-veneno. MITÓGENOS Los mitógenos son sustancias que inducen la división de los LT y LB, inespecíficamente, por lo que las especificidades de los Ac y las células que se generan van a ser variadas. Esto es porque se activan muchos clones de LB y muchos de LT, es una activación poliepecífica. Ejemplo: concavalina A y fitohemaglutinina, son dos lectinas, son mitógenos de LT; el mitógeno de fitolaca (planta) activa LT y LB, el LPS es un mitógeno de los LB. No todos los mitógenos son antígenos T-independiente II (hay mitógenos que activan LT).

BCR LB LB IgM

Ag T-i I

Ag T-i II

Ac no anti-Ag T-i I muchos tipos de Ac

Ac específicos para Ag T-i II

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SUPERANTÍGENOS Son activadores policlonales de LT, con lo cual algunos superantígenos son mitógenos. Pero el superantígeno tiene un mecanismo particular de estimular al LT. El mecanismo que lleva a la activación del LT es por una unión lateral del superantígeno al complejo TCR-péptido-CMH clase II, con la salvedad que al superAg no le interesa el péptido presentado. El LT necesita que una célula le presente el péptido contra el cual es específico el LT, sobre las moléculas del CMH. El péptido proviene del Ag. Este péptido es el que le va dar especificidad a la célula que se activa. Se llegan a activar hasta el 20% de la población de LT totales que circulan. La activación de los LT puede llevar a la liberación de muchas sustancias que pueden llevar a un shock y a la muerte. Cuando ocurre dentro de una respuesta inmune normal, es un mecanismo regulado. Este es el mecanismo que tiene el síndrome del shock tóxico del Stafilococus aureus. LOS ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Se descubrieron con el rechazo de trasplantes e injertos. Analizando por qué un tejido era rechazado en un individuo de una misma especie fue como se lograron detectar por primera vez en la membrana de los linfocitos unas moléculas. Éstas eran blanco del sistema inmune del aceptor del transplante. Se los vio por primera vez en la membrana de los linfocitos, por lo que se los llamó HLA: Human Leukocyte Antigens. Después de 50 años de ser descubiertos se comprendió la verdadera función de las HLA, la cual es intervenir en el procesamiento y la presentación de Ag a los LT, evento necesario para la activación del LT. Se descubrió que hay una gran variedad de moléculas de HLA con gran homología entre si pero que igualmente se podían subdividir. Las moléculas del CMH de clase I y clase II son las que tienen que ver con el procesamiento y la presentación del Ag. Los de clase III, algunos están relacionados con la respuesta inmune y otras no. Este CMH está codificado por el cromosoma 6 humano, donde están todos los loci para cada una de las moléculas de clase I, II y III. El CMH clase I carga el péptido sobre dos de los dominios que tiene la molécula. En el CMH de clase II dos dominios de dos moléculas diferentes contribuyen a cargar el péptido. CARACTERÍSTICAS DEL CMH Se le dice “complejo” porque abarca muchos genes y comparten ciertas características. Una de ellas es el poligenismo, es decir, hay genes para varias moléculas HLA (varios genes para varias moléculas). El polimorfismo del complejo se refiere a que en los distintos individuos no todas las HLA son iguales, esto es lo que termina con el rechazo de un transplante o injerto. La codominancia del complejo indica que se expresa tanto el haplotipo paterno como el haplotipo materno, entonces por cada molécula de HLA hay dos genes alelos que se expresan. �El polimogenismo se refiere a que existen varios genes y moléculas lase I y II dentro del CMH. Cada uno de estos genes a su vez son polimórficos, entonces la secuencia de

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genes, y por lo tanto, de proteínas codificadas por ellos, difiere entre individuos y es responsable de la histocompatibilidad. La codominancia se debe a la expresión simultánea de genes paternos y maternos. MAPA GENÉTICO DEL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA 6 Entre los genes del CMH clase I y clase II están los genes de clase III. Las principales HLA del humano son: HLA-A HLA-DP CMH clase I HLA-B CMH clase II HLA-DQ HLA-C HLA-DR Como expresamos tanto el haplotipo paterno como el materno, expresamos al menos 12 moléculas de HLA diferentes expresadas en la membrana de las células. Con el tiempo se han ido secuenciando todas estas moléculas del CMH. Al principio se hacía por serología. Usar un Ac es algo inespecífico para reconocer una molécula, ya que reconoce una partícula de la molécula, y puede darse que esa partícula esté repetida en muchas moléculas de HLA. En workshop internacionales científicos se reúnen y presentan las secuencias de HLA que ellos han logrado aislar. La nomenclatura comienza con el nombre del complejo: HLA, después el locus al cual pertenece, a continuación se coloca un asterisco que indica que ha sido reconocida en un workshop o taller internacional, luego viene un número de cuatro dígitos de los cuales los dos primeros corresponden a la especificidad, que es la clase de HLA que se logró distinguir mediante Ac. Cada especificidad puede contener muchas HLA homólogas que por serología no se podrían distinguir, pero sí por técnicas del DAN recombinante, con lo cual se agregan lo dos últimos dígitos para la variante. Ejemplo: HLA - A* - 0102 Los HLA-A, HLA-B y HLA-C tienen una sola cadena codificada en el complejo, y forman la molécula uniéndose a otra molécula codificada fuera del complejo. ESTRUCTURA DE LAS MOLÉCULAS DEL CMH • CMH clase I: está compuesta por dos cadenas, una α y una β. La cadena β no está codificada dentro del complejo y se la conoce como ββββ2- microglobulina. Las cadenas α tienen un PM=44 KDa y la cadena β2- microglobulina un PM=12 KDa. La cadena α es muy polimorfa y la β2- microglobulina es la misma para todas las HLA clase I. La característica más importante es el plegamiento. Los dominios α1 y α2, que son los más alejados de la membrana forman una hendidura o ranura producto del plegamiento de la molécula. El dominio α1 forma a través de un plegamiento hélice-α una de las paredes de esa ranura, el dominio α2 forma la otra pared de esa ranura. El piso de la ranura está formado por 8 láminas de plegamiento β, 4 aportados por el dominio α1 y 4 aportados por el dominio α2. El dominio α3 es el que se une a β2- microglobulina no covalentemente, y es el más conservado de los tres dominios α. El polimorfismo va a estar ubicado en la ranura, que es el lugar donde va a estar el péptido. Hay 20 lugares críticos aportados por el

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dominio α1 y α2 que fundan la ranura y son determinantes de la especificidad de los péptidos que se van a presentar. • CMH clase II: la estructura es bastante similar en cuanto a los plegamientos. Está formada por una cadena α de 34 KDa y una cadena β de 29 KDa. Las cadenas α y β, ambas, pertenecen al complejo. El dominio α1 es el que contribuye a la formación de la ranura junto con el dominio β1. El dominio α2 y β2 aportan la base para los dominios α1 y β1. El plegamiento para formar la ranura es el mismo que para la clase I: lámina plegada β para el piso y hélice-α para los costados. Lo que sí es diferente es la forma de la ranura de los HLA clase I y clase II. En la clase II la ranura es más abierta hacia los extremos.

Hay un grupo de HLA no clásicas (o lb). Hay codificados genes para la repuesta inmune, por ejemplo para las moléculas MIC-A y MIC-B, que son ligandos para receptores que tienen las células NK, son receptores de citotoxicidad. Hay otras moléculas dentro de las HLA-lb que se conocen como: HLA-F, HLA-G, HLA-E, HLA-H o HFE. No interaccionan con el TCR. La HLA-H o HFE tiene que ver con el metabolismo del hierro. Los genes de clase III codifican para TNF-α y TNF-β, para factores del complemento, y hay enzimas, como la 21-hidroxilasa, que no tienen que ver con la respuesta inmune. En los genes de clase II, entre DO y DQ hay dos genes que codifican para unas moléculas que no presentan péptidos: TAP, TAPASINA, LMP2, LMPZ, que son moléculas que tienen que ver con la presentación antigénica.

α1 α2 α1 α2

Clase I Clase II

Ranura cerrada hacia los extremos. La

carga está limitada al tamaño del

péptido.

Ranura abierta hacia los extremos. El péptido se puede acomodar por los

extremos.

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Tipos de Ag: • Xenoantígenos o Ag heterólogos: son Ag que originan Ac en una especie distinta de la que ellos derivan. Dan lugar a inmunidad específica isotípica. • Aloantígenos o Ag isólogos: son Ag que originan Ac en individuos de la misma especie pero genéticamente distintos. Dan lugar a especificidad alotípica. • Autoantígenos o Ag autólogos: se hallan presentes en todas las células del individuo pero no se producen Ac contra ellos ya que son reconocidos como propios. • Ag heterófilos: son Ag similares presentes en varias especies diferentes (hongos, parásitos, bacterias, vertebrados, vegetales). Pueden reaccionar con Ac de otras especies. • Ag órgano-específicos o secuestrados: son propios de un órgano, están encerrados en él y no toman contacto con el sistema inmune. Si se liberan el organismo no los reconoce como propios. Ej: proteínas del cristalino del ojo. • Ag tumorales: son moléculas específicas expresadas en la superficie de tumores las cuales pueden ser reconocidas por el sistema inmune. Pueden ser utilizados como blanco de Ac monoclonales en inmunoterapia. • Superantígenos: son proteínas capaces de estimular a los LT sin procesamiento y degradación. Se unen a las moléculas del CMH-II por una zona distinta a la normal. La respuesta inmune generada es menor. • Ag de los GR humanos: los determinantes antigénicos sobre los GR permite su división en grupos sanguíneos. • Ag de leucocitos (HLA): Los leucocitos poseen en sus membranas Ag que sí están presentes en otras células pero que no están en los GR (Ag del CMH). Son importantes en la propagación de la respuesta inmune.

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PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS

La inmunidad adaptativa humoral lleva a la producción de Ac contra un patógeno que van a provocar la eliminación del mismo, y la celular lleva a la activación de LT, sensibilizados contra ese Ag en particular. Los dos procesos son necesarios en una respuesta inmune porque muchos de esos procesos se ven beneficiados con la ayuda de los LT. La manera que tienen los linfocitos de reconocer y de activarse es diferente en tanto sea un LT o un LB. El LB tiene, para reconocer al patógeno y desencadenar la respuesta inmune humoral, un receptor que se llama BCR. El BCR reconoce a la molécula nativa, al Ag de una molécula nativa. Para que un LT se active y genere la respuesta celular, tiene un TCR. El TCR tiene un modo diferente de ver al Ag patógeno. No reconoce la molécula nativa, sino pequeños péptidos de ella, pero no péptidos solubles en solución. Los reconoce montados sobre las moléculas del CMH. �Los LT reconocen péptidos lineales derivados del antígeno y montados en moléculas del CMH. Esto último se logra a través del procesamiento y presentación del Ag. CÉLULA PRESENTADORA DE ANTÍGENOS (CPA) Es la que procesa y presenta el Ag sobre las moléculas del CMH a los LT. Esta es la única manera que tiene el LT para activarse. Para poder llevar una proteína nativa a pequeños péptidos se necesitan de la actividad de proteasas. Las CPA tienen proteasas. Se requiere que se unan los péptidos a las moléculas del CMH a medida que se van sintetizando. Una vez que está cargado el péptido sobre el CMH debe expresarse en membrana. Todos estos eventos ocurren dentro de la CPA. CMH TCR

PÉPTIDO

� TODAS LAS CÉLULAS CON NÚCLEOS PUEDEN SER CPA. Las CPA se las puede subdividir en profesionales o no profesionales. Las CPA PROFESIONALES son aquellas células nucleadas capaces de poder expresar las moléculas del CMH de clase II. Son sólo una pequeña fracción:

• Macrófagos • Células dendríticas • LB • LT activados

CPA LT

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Todas las células del organismo son capaces de montar el péptido en moléculas del CMH de clase I, salvo las anucleadas: GR. Son CPA NO PROFESIONALES y utilizan una vía endógena. PRESENTACIÓN POR MOLÉCULAS DEL CMH DE CLASE I (VÍA ENDÓGENA O BIOSINTÉTICA) Generalmente los péptidos provienen de proteínas endógenas, del citosol de la célula. Estas proteínas provienen de patógenos intracelulares como virus o cualquier patógeno cuya parte del ciclo celular pase por el citosol. También provienen de proteínas endógenas del citosol (hsp, histonas, péptidos líderes). Estos péptidos pueden encontrarse montados en moléculas del CMH de clase I. Las proteínas propias no deben generar respuesta inmune.

EL PROTEASOMA Es una estructura compleja que se encuentra en el citosol de todas las células. Tiene un core (núcleo) y dos casquetes regulatorios. Es un complejo multimérico, pesa en conjunto 2000 KDa, los casquetes pesan 700 KDa cada uno y el núcleo, que es donde se encuentran las enzimas proteolíticas, pesa 650 KDa. El núcleo está compuesto por cuatro anillos apilados de los cuales, los anillos centrales son los que tienen la actividad proteolítica. Son los anillos β, los α no tienen actividad proteolítica. La proteína para poder entrar al proteosoma y ser degradada, debe ser reconocida por el proteosoma. Para ello la proteína debe ser poliubiquitinada . Hay enzimas E1, E2 y E3 que se encargan de adosarle a la proteína unidades de ubiquitina . La proteína poliubiquitinada es reconocida por los casquetes regulatorios, pasa al core y es degradada a péptidos. Solamente el 10% de los péptidos que se generan tienen el tamaño adecuado para montarse en las moléculas del CMH de clase I. Ciertas subunidades del proteosoma (del core) pueden ser sustituidas por: -β1 LMP2 -β5 LMP7 INF-γ -β10 LMP10 Estas proteínas están codificadas dentro del CMH. Estas moléculas LMP tienen actividad enzimática más eficiente para los péptidos que se cargaran en el CMH clase I. Es decir, se hace más eficiente el proceso para generar péptidos con longitudes apropiadas para el CMH clase I. Al producirse el reemplazo la estructura pasa a llamarse INMUNOPROTEOSOMA . TRANSLOCADOR TAP Son las proteínas encargadas de translocar los péptidos del tamaño adecuado producidos por el proteosoma hacia el retículo endoplasmático (RE). En el RE están las moléculas del CMH clase I. Las TAP pertenecen a la familia de transportadores ABC (ATP binding cassette), son proteínas que unen ATP para poder realizar el pasaje del citosol al lumen del RE.

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EN EL INTERIOR DEL RE La calnexina es una chaperona, ayuda a un buen plegamiento de la proteína, en este caso de la cadena α del CMH clase I. La calnexina es una chaperona de membrana, está anclada a membrana y promueve también la unión de β2-microglobulina (β2 m). Una vez unido el complejo α−β2-m, la calnexina se separa y se une la calreticulina al mismo. Esta es una chaperona soluble, ayuda al buen plegado del complejo α−β2-m. La calreticulina con la molécula del CMH clase I aún no totalmente plegada forma un complejo con tapasina y con el translocador TAP. Tapasina se ubica entre TAP y el complejo, haciendo de puente de unión. El CMH clase I no está correctamente plegado hasta que se une el péptido. El péptido induce un cambio conformacional en la molécula. Entonces los péptidos que salen del proteosoma pasan por TAP y son cargados sobre el CMH clase I. Una vez unido el péptido se pliega correctamente el complejo, se desprende calreticulina, tapasina y TAP, y el CMH clase I pasa a Golgi y de Golgi a membrana. En la unión de los péptidos a los CMH clase I es muy importante la interacción que ocurre en los extremos ya que esto estabiliza mucho la unión. Hay interacciones entre el péptido y residuos aminoacídicos de la ranura: los extremos N y C terminales del péptido se unen a residuos de aminoácidos conservados en la ranura. PRESENTACIÓN CRUZADA En algunos casos péptidos de microorganimos o patógenos endocitados pueden pasar desde el endosoma al citosol, o bien, una proteína exógena puede acceder al citosol, esto permite que Ag que penetraron a la célula por vía exógena sean presentados a los LT citóxicos por el CMH clase I.

PÉPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLÉCULAS DEL CMH DE CLA SE I • Las moléculas del CMH-I unen péptidos compuestos por 8 a 12 residuos de aminoácidos. • Los extremos N y C terminales se unen a residuos de aminoácidos conservados en la ranura: posiciones de anclaje definidas. • Los péptidos presentados derivan de la degradación de: proteínas endógenas propias (histonas, hsp, secuencias líderes) o patógenos intracelulares.

PRESENTACIÓN POR MOLÉCULAS DEL CMH DE CLASE II (VÍA EXÓGENA O ENDOCÍTICA) Las CPA toman proteínas del medio extracelular, las endocita y se forma así un endosoma temprano. El pasaje a endosoma tardío se caracteriza por la disminución del pH para activar enzimas que van a degradar la proteína fagocitada a sus péptidos. El endosoma tardío es el que se va a encontrar con el CMH clase II. La molécula del CMH clase II es sintetizado en el RE, donde ocurre el correcto plegado de la misma. Se sintetizan las cadenas α y β por separado, se pliegan por acción de las chaperonas con la particularidad de que participa un tercer componente llamado cadena invariante (li). La cadena invariante va a tapar el sitio de unión al péptido. Esto es porque en el lumen del RE van a estar los péptidos que se van a unir a las moléculas del CMH de clase I. La proteína li, además, hace a veces de chaperona,

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de péptido líder que va a guiar a la molécula del CMH clase II hacia las vesículas que “finalmente” se van a unir con los endosomas tardíos. Una vez producida la fusión del endosoma tardío con la vesícula que trae la molécula del CMH clase II, esta nueva vesícula va a contener las enzimas del endosoma, el pH bajo, y los péptidos junto con el CMH clase II con su li. Gracias a las catepsinas y al pH que hace que se activen esas catepsinas, la li va a ser clivada, pero no en su totalidad, queda un pequeño péptido en la ranura, llamado CLIP . La carga del péptido está mediada por dos componentes. La HLA-DM promueve la remoción del CLIP. Tiene sitios de alta afinidad que enseguida remueven al CLIP de la ranura y cargan un péptido. Si el péptido no tiene la afinidad suficiente es removido inmediatamente por DM y reemplazado por otro, y así hasta encontrar un péptido con la afinidad suficiente. A DM también se la conoce como proteína editora. Luego la molécula del CMH clase II con su péptido es llevado a membrana La proteína HLA-DO inhibe a DM. Ambas son dímeros con una cadena α y otra β. PÉPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLÉCULAS DEL CMH DE CLA SE II • Las moléculas del CMH-II unen péptidos compuestos por 8 a 30 residuos de aminoácidos. • Las posiciones de anclaje no están claramente definidas. • Los péptidos presentados derivan de la degradación de: proteínas propias que se expresan en membrana (receptores, CMH- I o II, etc.) o son secretadas (hormonas, albúmina, etc.) o proteínas extrañas de patógenos extracelulares fagocitados o de patógenos que se alojan en compartimentos endosómicos.

PRESENTACIÓN POR MOLÉCULAS NO CLÁSICAS DEL CMH-I Las moléculas del CMH clase I clásicas son HLA-A, HLA-B y HLA-C; las no clásicas también presentan Ag, pero son incapaces de interaccionar con el sistema inmune (HLA-E y HLA-G). Hay otras moléculas que presentan Ag que son las CD1. Forman parte del complejo CMH Ib, CD1 junto con FcRn (receptor para Fc neonatal). Son moléculas que están asociadas a los CMH I, pero no están en el mismo cromosoma. Su estructura es muy similar: una cadena α de tres dominios que se unen a β2–m y tienen la capacidad de formar una ranura que va a estar bastante tapada. Con esto la entrada va a estar bastante reducida. El interior de la ranura está tapizada por aminoácidos hidrofóbicos, esto la hace una molécula muy buena para fijar glucolípidos. La parte hidrofóbica entra en la ranura y la parte polar queda hacia afuera. Presentación de Ag mediada por CD1: • Presenta glucopéptidos, cosa que no hace ninguna otra molécula dl CMH. • Presenta derivados de micobacterias y péptidos hidrófobos.

Estos compuestos son reconocidos por los LT con el TCRαβ, con TCRγδ y por NKT.

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LAS INMUNOGLOBULINAS

PASOS PARA GENERAR UNA RESPUESTA INMUNE • Ingresa un Ag, un agente extraño � actúan los mecanismos innatos. Los mecanismos innatos son inespecíficos, inmediatos, no tienen memoria y siempre van a actuar igual ante entradas sucesivas del mismo Ag. • Se produce la inflamación. • Participan muchas células, entre las cuales está el macrófago. Produce muchas cosas, entre ellas la IL-1, IL-6 y TNF-α. • Si no se elimina el Ag con todos estos mecanismos, comienzan a desarrollarse otros mecanismos que se llaman adaptativos o mecanismos específicos. Son un poco más lentos porque tardan un poco más en desarrollarse, son específicos y tienen memoria. Las células más importantes en estos mecanismos son los LT y los LB. Estos dos linfocitos van a reconocer a esos Ag extraños. El LT reconoce solo pequeños péptidos del Ag, presentados por las CPA sobre las moléculas del CMH. Una vez que el LT reconoce al Ag se va a activar, va a proliferar y va a comenzar a ejercer sus funciones efectivas. De aquí van a salir LT efectores y LTm. El LT tiene un receptor que se llama TCR. El LB también reconoce al Ag que entró pero lo reconoce solo y reconoce al Ag en forma nativa. Tiene también un receptor, el BCR. Dependiendo de cual es el Ag que entró, el linfocito va a diferenciarse a plasmocito y producir Igs (Ag T I), o va a precisar que lo ayude un LT (Ag T D) Algunos LT, en particular los LTh2, van a ayudar a los LB para que se diferencie a plasmocito y produzca los anticuerpos o inmunoglobulinas. Algunos LB van a ser LBm. Depende de qué Ag sea, se va a favorecer un mecanismo u otro. El estudio de las inmunoglobulinas comenzó en el año 1939. Un científico descubrió que cuando inmunizaba un animal con un Ag, le sacaba sangre, aislaba el suero y hacía una corrida electroforética de ese suero, separando las proteínas por la movilidad que tienen, encontró una fracción que era la correspondiente a la fracción γ, que estaba muy aumentada. Después se dio cuenta de que si hacía este mismo procedimiento a lo largo de las inmunizaciones, esta fracción aumentaba más. Entonces se le ocurrió ver que pasaba si enfrentaba el suero de ese animal con el Ag que había usado para inmunizarlo, e hizo una corrida electroforética. Observó que esta fracción estaba muy disminuida. Esto pasó porque todos los Ac se habían pegado a sus Ag. Entonces dedujo que la actividad Ac se localizaba en esta fracción. Es por esta razón que a los Ac se los denomina muchas veces gamaglobulinas. A los Ac le fueron dando distintos nombres de acuerdo a las reacciones que podían realizar in vitro. Por ejemplo, se llamaban precipitinas a los que precipitan un Ag soluble; se llamaban aglutininas cuando aglutinaban a los Ag particulados; se llamó hemolisinas a los Ac anti-GR que producían la lisis de los GR cuando se agregaba el complemento. Es importante tener en cuenta que el Ac solo se fija o liga pero no pueden destruir por sí solo una célula, necesita de otros mecanismos, en este caso el complemento. Después vieron los investigadores que un mismo Ac puede tener varias funciones, es por esto que los términos anteriores se dejaron de utilizar.

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�Entonces las inmunoglobulinas o anticuerpos son toda una familia, porque son producidos por el mismo tipo celular. El plasmocito es el que produce el Ac, el cual deriva de un LB. Ac LB DIFERENCIACIÓN PLASMOCITO Ac

Ac El plasmocito va a secretar a las Igs. El LB tiene como receptor, anclado en la membrana plasmática para el Ag, a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana. LB Igs ancladas a membrana (BCR) PLASMOCITO Igs secretadas Las inmunoglobulinas las podemos encontrar de dos formas: ancladas a la membrana del LB constituyendo su receptor antigénico, o secretados en el medio por los plasmocitos. Las Igs tienen función anticuerpo. Todas las Igs que hay en un suero normal tienen una especificidad determinada, es decir, son capaces de reconocer un Ag determinado. Esta especificidad es desconocida para nosotros. Cuando inmunizamos con un Ag vamos a tener una mayor cantidad de inmunoglobulinas específicas para ese Ag que sí conocemos. Todos nosotros tenemos Igs, cada una de esas Igs tiene su especificidad o sitio de reconocimiento para un Ag determinado. Todos los sueros obtenidos al inmunizar un animal son policlonales. Esto quiere decir, que como los Ag tienen muchos determinantes antigénicos, cada uno de esos determinantes antigénicos puede ser reconocido por un linfocito distinto, cada linfocito puede producir Ac, entonces vamos a tener muchos clones de linfocitos que se van a activar ante un mismo Ag. �todos los antisueros utilizados comúnmente y obtenidos en el laboratorio son policlonales. ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas están constituidas por 4 cadenas. Las dos más largas se denominan CADENAS PESADAS o CADENAS H. Estas cadenas son iguales entre si y están unidas por puentes disulfuro. Las otras dos cadenas son las CADENAS L o CADENAS LIVIANAS , son iguales entre si y están unidas a las cadenas H por puentes disulfuros. Hay distintos tipos de cadenas H que permite clasificar a las Igs en clases, y hay dos tipos de cadenas L: pueden ser κ o λ, pero siempre son iguales en la misma Ig, es decir, si una Ig tiene una cadena L de tipo κ, la otra también será κ. Estas cadenas de inmunoglobulinas se organizan en dominios, que son estructuras constituidas por alrededor de 100 a 110 aminoácidos y tienen una conformación secundaria de estructura β–plegada o lámina-β.

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Estos dominios no están solamente en las moléculas de Igs, sino en muchas otras moléculas y todas ellas se denominan superfamilias de las Igs. Cuando los investigadores hicieron la secuenciación de los dominios de las Igs vieron que cerca de la región N-terminal, estos dominios tienen una mayor variabilidad. Se denominaron entonces dominios variables, VL para la cadena L y VH para la cadena H. Hacia el extremo C-terminal la composición de aminoácidos es más constante, por lo que se llaman dominios constantes. Tenemos CL para la cadena L y para la cadena H hay tres dominios CH: CH1, CH2 y CH3. La IgM y la IgE tienen un cuarto dominio: CH4. El lugar por el cual la inmunoglobulina reconoce al Ag se ubica en la parte variable, que es el sitio de combinación para el Ag. Va a estar formado por las partes variables de las cadenas pesadas y livianas. Cuando hicieron los estudios de secuencia descubrieron que dentro de las regiones variables hay zonas de alrededor de 10 aminoácidos que varían mucho más aún, por lo que se las llamó regiones hipervariables: CDR (regiones determinantes de complementariedad). Son los CDR los que se unen a los epitopes del Ag y se llaman por eso paratopes. Rodeando a las CDR hay zonas que son más constantes y se denominan FR o secuencias marco. Son secuencias más conservadas y ayudan a los CDR a la interacción con el Ag. Con ellos los CDR se proyectan hacia el exterior. Todas las Igs, excepto la E y la M, tienen una región rica en aminoácidos Pro, que no tienen una estructura globular y es lo que le va a dar la sensibilidad a las Igs. Permite que los dos brazos puedan rotar y unirse a los Ag. Las inmunoglobulinas al ser proteínas son antigénicas también, es decir, que pueden actuar como Ag. Si se inoculan a un animal se van a obtener Acs. Esta antigenicidad está dada por la secuencia de aminoácidos que tienen las Igs. Podemos distinguir entonces en esa secuencia tres tipos de variables:

• Variaciones isotípicas que están en todas las Igs de una misma clase de todos los individuos de una misma especie. Estas variaciones son las que nos permiten clasificar a las Igs en cinco clases; están en los dominios CH y nos permiten clasificarlos en: IgM, cuando la cadena H es de tipo µ; IgG cuando la cadena H es de tipo γ; IgA cuando la cadena H es de tipo α; IgE cuando es ε; IgD cuando es δ. Entonces todas las IgM tienen las mismas cadenas H de tipo µ. Para la IgG a su vez, hay cuatro subtipos, y para IgA hay dos subtipos.

• Variaciones alotípicas que se encuentran en algunas inmunoglobulinas de algunos individuos de una misma especie. Estas variaciones alotípicas se conocen como marcadores genéticos. Se denominan GM y KM. Las vamos a encontrar en la IgG (GM) y en las cadenas K (KM)

• Variaciones idiotípicas que son propias de cada Ig y están relacionadas con la especificidad que tiene la Ig. Están ubicadas en las regiones de mayor variabilidad. No siempre la variación idiotípica coincide con el paratope.

Todas estas variaciones contribuyen a la heterogeneidad de las inmunoglobulinas. El estudio de las Ig se efectúa muchas veces tratando a las Ig con distintas enzimas. Las que más se usan son la PAPAÍNA y la PEPSINA. Si tratamos a una Ig con papaína se van a clivar por encima de la región de la bisagra, y se va a generar un fragmento denominado Fc, que va a estar constituido por las partes constantes de las cadenas H, y dos fragmentos que se denominan Fab (fragmentos de

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unión al antígeno). Estos dos fragmentos mantienen el sitio de unión al Ag, pero se comportan como univalentes, no van a dar reacciones de interacción secundaria. LAS CINCO CLASES DE INMUNOGLOBULINAS INMUNOGLOBULINA G (Ig G) Es la que se encuentra en mayor concentración en el suero, entre 8 – 10 mg/ml. Es la que tiene mayor tiempo de vida media. Tiene capacidad de neutralizar agentes patógenos, de activar el complemento por la vía clásica. El complemento es un conjunto de proteínas que se activan en cascada, y si el complejo Ag-Ac que lo activó está formado por un Ag particulado, una célula o GR, tiene la capacidad de destruirlo. Es la principal Ig que se produce en una respuesta secundaria. En las respuestas primarias, que se producen cuando entra por primera vez un Ag, la principal Ig que se produce es la IgM, y en las respuestas secundarias, cuando entra el Ag por segunda vez, la principal que se produce es la IgG, porque los linfocitos ya hicieron el switch para poder producir otro tipo de Ig. La IgG es la que transfiere inmunidad al feto ya que es la única que atraviesa placenta. Siempre es monomérica. La estructura de la IgG es también de dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son del tipo γ, las cadenas L son de tipo κ o λ. En el hombre la mayoría de las cadenas L son de tipo κ (70% de las IgG son κ y un 40% del tipo λ). Clivaje de IgG con distintas proteasas: Si se tratara a la IgG con papaína se va a producir el clivaje y se van a generar dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Tienen una movilidad electroforética lenta. En el fragmento Fab va a estar el sitio de unión al Ag, los determinantes antigénicos que se han compartido por todas las Ig ubicadas en las cadenas L. Si el tiempo de digestión con la papaína es más largo el fragmento Fc se va a dividir en otros fragmentos más pequeños que se llaman Fc .̀ Entonces, en el Fab tenemos el sitio de unión al Ag y los determinantes compartidos por las Ig. En Fc están los determinantes propios de las Ig porque están formadas por cadenas H que son distintas para cada Ig, van a estar los marcadores genéticos KM, y esta región Fc es muy importante para todas las funciones efectoras que tienen los Ac. Existen muchos receptores para esos segmentos en distintas especies. Los fragmentos Fab van a poder unirse al Ag pero no darán interacción secundaria porque son monovalentes. El PM de la IgG es alrededor de 150 KDa, las cadenas H pesan 50 KDa y las cadenas L alrededor de 25 KDa. Si clivamos con otra enzima, la pepsina, corta por detrás de los puentes disulfuro, y va a quedar un fragmento que se denomina F(ab`)2, porque va a tener a los dos fragmentos Fab juntos. Este fragmento sí dará las reacciones de interacciones secundarias porque se comporta como bivalente. Con pepsina el fragmento Fc se degrada en pequeños péptidos, pero si se hace el tratamiento por menor tiempo se puede formar un fragmento pFc` que es parecido al que se generaba con la papaína.

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Si tratamos a la IgG con 2-mercaptoetanol, iodoacetamida y ácido propiónico, vamos a poder escindir las cadenas H de las cadenas L. Las cadenas se pueden separar por filtración con geles porque tienen distintos PM. Las cadenas H son las más estudiadas, se pueden dividir en dos fragmentos: Fd, que a su vez tiene una parte más variable y una parte constante, y un fragmento Fc constituido por dos dominios constantes de las cadenas H. El dominio variable de las cadenas H es el que se une al Ag. Con otros estudios se comprobó que la mayor participación en el sitio de combinación con el Ag lo tiene la cadena H. Las Ig tienen hidratos de carbono porque son glucoproteínas, se ubican el las cadenas H. En la IgG están ubicadas en el dominio CH2 del fragmento Fc. La IgG tiene alrededor de 2,5% de hidratos de carbono. Algunos autores consideran que los hidratos de carbono serían como protectores de las Ig para evitar su degradación. Otros autores dicen que solo participan en los procesos de secreción. En condiciones especiales de clivaje se puede generar un fragmento que se denomina Fv. El fragmento Fv estaría formado por el fragmento variable de la cadena L y por el fragmento variable de la cadena H. Sería la pequeña porción de la molécula que es capaz de unirse al Ag. En el espacio, los dominios VL y VH se superponen, los CL y CH1 ayudan a mantener la unión de los dominios VL y VH. Los últimos dominios CH3 también se superponen, dándole una cierta rigidez a la molécula. Los dominios CH2 en cambio están separados por los hidratos de carbono. • Subclases de IgG: se subdividen por la cantidad de puentes disulfuro que hay entre las dos cadenas H. Esto le va a conferir a cada subtipo de Ig una distinta funcionalidad o actividad.

- La IgG1 tiene capacidad opsonizante, puede recubrir a un patógeno para el cual tiene los sitios específicos de reconocimiento y a través de su fragmento Fc puede ser reconocido por un macrófago y ser fagocitado.

- La IgG2 no se fija a piel heteróloga, es decir, que no se fija a células que provengan de animales de otra especie.

- La IgG3 es la que tiene mayor cantidad de puentes disulfuro entre sus cadenas H, tiene capacidad opsonizante, fija el complemento y tiene un menor tiempo de vida media, porque es más fácilmente degradable por todas esas uniones que presenta.

- La IgG4 no es capaz de fijar el complemento. INMUNOGLOBULINA M (IgM) Es la inmunoglobulina que se produce mayoritariamente en las repuestas primarias. Es la única que se produce para los Ag TI. Es pentamérica o hexamérica, es decir, que los monómeros de Ig están unidos por un péptido que se llama J de alrededor de 15 KDa, que se une al fragmento Fc. En la estructura pentamérica, si bien presenta 10 sitios de unión al Ag, se comporta como pentavalente. Esto es porque uno de los sitios de combinación no funciona por impedimentos estéricos. Si tratamos a la IgM con 2-mercaptoetanol, la vamos a clivar en los monómeros que la constituyen, pero esos monómeros siguen teniendo una actividad monovalente. Es decir uno de los brazos sigue sin funcionar por impedimento estérico. El tratamiento con 2-mercaptoetanol es muy importante para poder diferenciar un proceso agudo de un proceso crónico, y es muy útil en la clínica.

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En un proceso agudo vamos a tener mucha cantidad de IgM. Si hacemos una reacción de interacción secundaria vamos a poder determinar un título de Ac para un determinado sistema. Este título es una medida de la cantidad de anticuerpos que hay. Por ejemplo, para un sistema Brucella abortus/ anti-Brucella abortus obtuve un título igual a 200. Si ahora deseamos saber si esto se debe a un proceso agudo o a un proceso crónico, puedo tratar al suero con 2-mercaptoetanol. Este va a actuar sobre la IgM y la escindirá en los monómeros. Esos monómeros, como se comportan como univalentes, no pueden dar las reacciones de interacción secundaria (de aglutinación). Si vuelvo a hacer la prueba con este suero y 2-mercaptoetanol y obtengo un titulo igual a 50, con el tratamiento escindí las IgM. Si el título baja es que en verdad escindí a las IgM.�El individuo está produciendo un proceso agudo. �El título era mayor antes del tratamiento con 2-mercaptoetanol, luego del tratamiento (las IgM son destruidas) el título baja. El proceso es agudo porque las IgM son las primeras Ig que se producen. Las cadenas H de la IgM son propias de ellas. No tiene marcadores genéticos en su cadena H. Tiene un PM de alrededor de 970 KDa por ser pentamérica. Este PM impide que pueda extravasar a los tejidos. La IgM es netamente vascular y es fundamental para defendernos contra los agentes que ingresan por vía sanguínea. Tiene capacidad aglutinante y también capacidad fijadora de complemento. Su actividad es pentavalente y si está escindida sus monómeros se comportan como monovalentes. No se sabe si hay en las células receptores para el fragmento Fc de la IgM. Su contenido en hidratos de carbono es de alrededor de 12%. Pueden dar reacciones cruzadas con IgG debido a las cadenas L. �La IgM es la primera que se produce y es la más importante en la respuesta primaria. La IgG es la mayoritaria en las respuestas secundarias. INMUNOGLOBULINA A (IgA) La cadena H de la IgA es de tipo α, y hay dos tipos: α1 y α2. La cadena α1 tiene un residuo de galactosamina, que no tiene la α2. No se sabe mucho sobre la IgA, todos los estudios que se han hecho fueron sobre inmunoglobulinas provenientes de mielomas. Los mielomas son tumores de células LB, donde la célula B produce una gran cantidad de Ig monoespecífica. La IgA se la puede encontrar en forma de monómero, o en forma de dímero o trímero. En el caso de dímero o trímero están unidas por el péptido J, que es el mismo péptido que unía a la IgM. La IgA es muy importante en las secreciones mucosas, donde se encuentra en la forma de dímero, por ejemplo en la saliva, en la mucosa intestinal, etc. En estas secreciones está asociada a un componente secretor, que tiene unos 70 KDa de PM. La IgA adquiere este componente secretor después que es producida. La IgA es secretada por el plasmocito que está ubicado en el subepitelio de la mucosa intestinal, por ejemplo, y esa IgA secretada se va a unir a un receptor (que contiene al componente secretor) que se llama poli-Ig , que es un receptor que específicamente va a fijar a la IgA. Se va a endocitar, se va a formar una vesícula, y esa vesícula con la IgA va a ser transportada hacia el otro extremo de la célula epitelial. Este proceso, que es un transporte a través de un receptor con formación de vesícula, se llama TRANSCITOSIS. Cuando la IgA llega al otro extremo de la célula se corta parte del receptor, y le queda una porción que es el componente secretor.

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IgA da básicamente inmunidad mucosal. La IgA está en forma monomérica en circulación y en forma dimérica en las secreciones. Conforman entre el 15 al 20% de las Ig séricas. Activan complemento por vía alterna. Las IgA secretoras no necesariamente destruyen al patógeno, sino que inhiben su adhesión al epitelio. INMUNOGLOBULINA D (IgD) No se sabe muy bien que función tiene. Parecería ser que interviene en el proceso de maduración del LB, y se encuentra en la membrana junto con la IgM, en los LB vírgenes. Representan menos del 1% de las Ig plasmáticas. INMUNOGLOBULINA E (IgE) Las cadenas H de la IgE son del tipo ε, el PM es de alrededor de 185 KDa. La concentración en suero es baja porque esta Ig está unida fundamentalmente a células por su porción Fc. Hay muchas células como los mastocitos y los eosinófilos que tienen receptores para el Fc de IgE, que se nombran FcRεεεε. Estos receptores tienen una muy alta afinidad por la IgE, sin necesidad que esta Ig esté unida a un Ag. Esto es una diferencia con los receptores FcRγ, cuya afinidad aumenta cuando la Ig está unida a su Ag. � Los receptores para IgG en las distintas células tienen baja afinidad por la IgG que no está unida a Ag, y la afinidad aumenta cuando la IgG se une a los Ag. En el caso del receptor de la IgE tienen muy alta afinidad por la Ig sin Ag. Su participación en la respuesta inmune se centra en inducir la degranulación de mastocitos uniéndose a estos a través de su Fc. La IgE es responsable de las acciones de hipersensibilidad y también participa de forma muy importante en las respuestas contra infecciones parasitarias. Tienen la particularidad de fijarse a piel homóloga, es decir, se fija a piel de individuos de la misma especie, no de otras especies. La IgG se puede fijar a piel de individuos de otras especies. RECEPTORES PARA LAS INMUNOGLOBULINAS No alcanza con que los Ac reconozcan al Ag, sino que deben hacer algo para poder eliminarlos. Lo que hagan con el Ag va a depender de la porción Fc, es decir, de donde esa Ig se vaya a unir. Para esto las células tienen receptores. Se nombran FcR y luego se indica la cadena a la cual se unen. Hay receptores para la IgG, para la IgE y la IgA. Dependiendo en qué células estén estos receptores va a ser la función que va a mediar la Ig. Cuando los receptores están en los macrófagos, si tenemos una bacteria que está recubierta de IgG, mediante el segmento Fc se va a poder unir y así se va a favorecer la fagocitosis de esa bacteria. Si los receptores están en un eosinófilo, la Ig se unirá y este eosinófilo se degranularía.

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Entonces la unión de las Ig a sus receptores puede producir fenómenos de endocitosis�fagocitosis; o fenómenos de exocitosis� liberación del contenido de las granulaciones. Pero para que esto ocurra siempre tiene que ocurrir lo que se llama ENTRECRUZAMIENTO DE RECEPTORES . Es decir dos Ig adyacentes se tienen que unir a dos determinantes antigénicos de un mismo Ag.

Debe ocurrir esto para que se puedan transmitir las señales al interior celular. Hay un receptor que se llama Receptor de Brambell, que es el receptor que le permite a la IgG atravesar placenta. Es un receptor diferente, está constituido por unas cadenas de tipo α que son parecidas a las del CMH y se unen dos moléculas del receptor por cada Fc de IgG. Entonces, este receptor le permite a la IgG atravesar placenta, le permite salir a los tejidos y permite el pasaje por las células endoteliales. También puede llamarse FcRn, que se ve en ratones. �FcRn: Receptor de Brambell FUNCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Los Ag van a ser reconocidos por un lado, por las Ig de la membrana del LB vírgen (BCR) y por otro lado, por los Ac secretados por los plasmocitos. Pueden neutralizar patógenos, pueden recubrir bacterias y evitar así que penetren en células. Las Ig que pueden hacer esto son las IgM, IgG y la IgA sobre todo en el tracto digestivo. Pueden activar el sistema complemento. Cuando se forman complejos Ag-Ac se puede activar el complemento que conduce a la lisis celular. Pueden activar el complemento las IgM, IgG y la IgA algunas veces. Pueden actuar como opsoninas y favorecer la fagocitosis (la IgG y la IgA). Pueden actuar mediante un mecanismo llamado ADCC: citotoxicidad anticuerpo dependiente. Dentro de los LT están los LT citotóxicos que tienen la capacidad de destruir células, pero no solo ellos. A través de los Ac las células NK, que tienen receptores para las Ig, pueden destruir patógenos. También pueden hacerlo los macrófagos y los eosinófilos. En el caso de los eosinófilos interviene la IgE, y en el caso de las NK y los macrófagos es la IgG. Pueden neutralizar toxinas. Las toxinas entran a la célula a través de receptores. Si se consigue un Ac que neutralice el sitio por el cual la toxina se une al receptor, se evita la entrada de la toxina y por lo tanto la enfermedad. Esto se busca con algunas vacunas. Por ejemplo con el toxoide de la difteria. En este caso es necesario que los Ac sean de muy alta afinidad porque las toxinas se encuentran en una proporción muy pequeña.

Una Ig se fija con un brazo al Ag y la otra Ig se fija con el otro.

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Pueden actuar en fenómenos inflamatorios o alérgicos, en la degranulación de los mastocitos. Los mastocitos se encuentran en los epitelios respiratorios y digestivos, y tienen la capacidad por sus receptores de fijar IgE sin unión a Ag. Entonces la mayoría de las IgE van a estar fijadas por su receptor a los mastocitos. Cuando entra un patógeno que es específico para usar IgE, se va a unir, se va a producir el entrecruzamiento de receptores y ese mastocito o ese eosinófilo va a liberar el contenido de sus gránulos. El principal mediador químico que tienen los mastocitos es la histamina, que es un potente vasodilatador. Entonces participa en los procesos inflamatorios. Muchas veces estos procesos de degranulación son perjudiciales para el organismo, como en la alergia. Pero en otros casos, como las infecciones parasitarias pueden ser beneficiosas, porque el contenido de los gránulos, sobre todo los eosinófilos, pueden llegar a destruir la membrana de los parásitos, sobre todo aquellos muy grandes que no pueden ser fagocitados. Participan en la inmunidad de los recién nacidos o del feto. La que participa en la fase embrionaria es la IgG y después en la lactancia participa la IgA. Toda la defensa del recién nacido va a estar dada por la IgG de la madre, pero llega un momento luego del nacimiento que esa IgG empieza a ser catabolizada, y los niveles de IgG que produce el bebé todavía no son suficientes. Entonces se produce un período de los 3 meses hasta casi el año donde los niños se enferman seguido porque no tienen aún el sistema inmune totalmente activo, y las Ig que les pasó la mamá fueron catabolizadas.

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ANTICUERPOS CO-PRECIPITANTES

Se empezaron a estudiar en el año 1935. Son anticuerpos que se generan en todas las respuestas inmunes y pertenecen a la clase de IgG. Los investigadores inmunizaron a una oveja con DNP (dinitrofenol) unido a un carrier. Obtuvieron un suero anti-DNP proteína. Hicieron una curva de precipitación (TP N˚3) y fueron agregando distintas cantidades del Ag soluble a volúmenes constantes de suero, y obtuvieron la siguiente curva:

x

e

Ag Determinaron el punto “x” que es la zona de equivalencia donde la concentración de Ac es máxima. Sacaron también a partir de la curva la cantidad de Ag que se tenían que agregar para precipitar la máxima cantidad de Ac. Luego pensaron que ocurriría si a esa cantidad de Ag la iban agregando de forma repetida y de a poco al suero. Entonces, en un tubo donde estaban los Ac anti-DNP le agregaron una cantidad menor a esa cantidad máxima de Ag, una cantidad 20 veces menor. Vieron un precipitado. 1/20 e precipitado Separaron el sobrenadarte y le volvieron a agregar la misma cantidad de Ag (1/20 e) y se volvió a formar precipitado. 1/20 e nuevo precipitado Así sucesivamente hasta que llegó un punto en donde no vieron más precipitado. Con este sobrenadante repitieron la curva de precipitación pero esta vez agregándole a cada tubo este último sobrenadante. Cada tubo tendrá: suero de la oveja, Ag y sobrenadante. Observaron que la curva nueva era más alta:

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e’

x’

En el punto “x’” tenían una mayor cantidad de Ac. Dijeron que había Ac en el suero que no alcanzaban a precipitar, pero que sí podían unirse a los complejos ya precipitados. Los llamaban anticuerpos co-precipitantes. Lo que siguió es averiguar por qué estos anticuerpos co-precipitantes se comportaban de esta manera, no tenían la capacidad de precipitar sino la capacidad de pegarse a un precipitado. Entonces, a partir del último sobrenadante donde no hubo precipitado lo pasaron por una columna de afinidad, que se la había preparado con el Ag DNP. Aislaron así los Ac co-precipitantes. De todos los precipitados, los disolvieron y obtuvieron los Ac precipitantes. Ambos eran anti-DNP, es decir tenían la misma afinidad. Ahora, lo que hicieron fue inmunizar un ratón con ambos Ac. Las Ig al ser proteínas también se comportan como Ag. Obtuvieron Ac que eran anti-Ac-precipitantes y otros Ac que eran anti-Ac-coprecipitantes. Utilizaron una reacción de interacción secundaria que se llama (TP N˚4) INMUNODIFUSIÓN . Se hace un agar, se prepara la placa de agar en un portaobjeto, por ejemplo, se le hacen agujeritos y se siembra el Ag y el Ac en las concentraciones óptimas, precipitan formando una línea. Estas bandas que se observan son bandas de identidad. En nuestro caso quiere decir que el Ac estudiado reconoce los mismos determinantes antigénicos en ambos Ag. Ac coprecipitante Ac precipitante

Anti-Ac precipitante

Repitieron la experiencia pero en vez de poner el Ac anti-Ac-precipitante pusieron el anti-Ac-coprecipitante, y obtuvieron el mismo resultado: Ac coprecipitante Ac precipitante

Anti-Ac-coprecipitante

Esto indicaba que no había diferencias en el isotipo de los Ac, eran iguales.

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Esto llevó a que si el problema no era el Fc, entonces era el Fab. Para estudiar las valencias da los Ac están las técnicas de interacción primaria. Con estas técnicas se dieron cuenta que los Ac coprecipitantes tenían dos sitios de combinación para el Ag, es decir eran Ac completos, pero esos dos sitios tenían distinta afinidad. Cuando hicieron una cromatografía gaseosa vieron que los Ac coprecipitantes tenían más hidratos de carbono que los precipitantes. Entonces cortaron al Ac coprecipitante con papaína para obtener los fragmentos Fab. Al Ac precipitante lo trataron de igual manera. Pasaron una columna de afinidad con el Ag DNP y vieron que para el Ac precipitante todos los Fab eran retenidos, pero para el coprecipitante el 50% era retenido y un 50% fluía. Esto ya indicaba que la afinidad era diferente. Ahora usaron una columna de afinidad que ligara residuos de hidratos de carbono como sepharosa-concavalina A. Esta columna es capaz de retener moléculas que están glucosiladas con residuos de manosa. Pasaron los Fab por esta columna. El 50% de los Fab de los Ac coprecipitantes eran retenidos en la columna. Cuando investigaron cómo estos Fab se fijaban al Ag se dieron cuenta que el 50% que quedaba retenido en la columna sepharosa-concavalina A tenía una baja afinidad por el Ag y el resto una alta afinidad. Conclusión: los ANTICUERPOS COPRECIPITANTES o ASIMÉTRICOS tienen un sitio de combinación de baja afinidad que se debe a la presencia de residuos ricos en manosa. Si se emplea una enzima capaz de remover esos residuos de manosa los Ac coprecipitantes se transforman en precipitantes, ya que al no tener ese residuo los dos sitios tendrían la misma afinidad. Los investigadores buscaron si había alguna diferencia en cuanto a si para generar esos Ac se usaban Ag solubles o particulados. Entonces, siguieron durante un año un plan de inmunización. Para el caso de los Ag solubles, se generaban esos Ac coprecipitantes pero en una proporción que iba del 1 al 10-15%. Si inmunizaban con Ag particulados, las concentraciones de los Ac coprecipitantes iba aumentando hasta llegar a un 70%, es decir, que había mayor cantidad de Ac coprecipitantes que de precipitantes. Esta es una característica de la multiestimulación con antígenos particulados. Los Ac coprecipitantes compiten por masa con los Ac precipitantes. CARACTERÍSTICAS Tienen un fragmento Fab glicosilado, por eso se llaman asimétricos, no activan el complemento, son citofílicos, es decir, tienen la capacidad de fijarse a células por el Fc ya que no está afectado. No tienen igual poder protector que los precipitantes y aglutinan GR de carnero sensibilizados. Esta aglutinación de los GR no se debe a la formación de la red, se debe a que los GR de carnero tienen receptores para el Fc de IgG. Entonces, si a un GR de carnero le pegamos el Ag DNP y lo enfrentamos a un suero con Ac asimétricos específicos para el Ag, algunos Ac se van a unir por el Fab con el Ag, y se van a unir por el Fc a otro GR pero por el receptor para Fc. Las redes que se van a formar se van a producir por la unión específica del Fab al Ag y por la unión del Fc a su receptor. En el caso de GR humanos, hay que hacerles un tratamiento previo con tripsina para que expongan los receptores Fc.

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FUNCIONES Aparecen en las infecciones por Ag particulados, las multiestimulaciones generan estos Ac, pero no son protectores. Pueden aparecer frente a tumores, muchos de los Ag tumorales inducen la producción de estos Ac que hacen que se evite la eliminación de ese tumor (protegen al tumor). Pueden aparecer Ac coprecipitantes anti-insulina, se unen a la insulina y la protegen, evitan que se degrade y entonces baja la glucosa. Pero también tienen una función de protección en las enfermedades autoinmunes. Hay muchos Ag propios que generan este tipo de Ac coprecipitantes y, como no pueden activar una función importante que es la activación del complemento, evitan que estos Ag propios sean destruidos. Podrían participar en mecanismos regulatorios de la respuesta inmune idiotipo-anti idiotipo. Parece ser que son muy beneficiosos en la preñez: los Ac que se generan contra los Ag paternos que porta el feto son de este tipo, coprecipitantes, y se evita que se agreda al feto. Se tratan de inducir en terapias anti alérgicas. Hay una interleuquina que parece ser la que favorece la producción de Ac coprecipitantes que el la IL-6. En mujeres embarazadas esta IL-6 está muy aumentada. Algunos autores creen que esto también puede depender de células presentadoras de Ag (CPA) y de cómo las células procesan a los Ag. También puede ser que haya estimulación de las enzimas que participan en los procesos de síntesis de los hidratos de carbono de las Ig. Para investigar la presencia de estos Ac incompletos se utiliza la Reacción de Coombs, otras son las Reacciones de interacción primaria, como la inmunofluorescencia o el ELISA. Para estas reacciones no es necesaria la formación de ningún tipo de red. Es importante tener en cuenta estos Ac incompletos en el momento de hacer un diagnóstico, sobre todo en brucelosis. La brucelosis es una patología donde se producen una gran cantidad de estos Ac y muchas veces las reacciones de aglutinación dan negativas. Esto no quiere decir que el individuo no tiene Ac, sino que tienen estos Ac coprecipitantes.

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ANTICUERPOS MONOCLONALES

Si inmunizamos a un conejo con ovoalbumina (OA), por ejemplo, obtenemos un suero policlonal. En ese suero va a haber muchos Ac que tengan distinta especificidad y que reconocen a ese Ag. Entonces, va a haber muchos clones de LB que produzcan distintos Ac, pero cada uno de estos Ac es producido por un solo tipo de célula. Esta es la TEORIA DE LA SELECCIÓN CLONAL . Por ejemplo, si inmunizamos con OA a un conejo A y obtenemos un suero A; luego inmunizamos a un conejo B y obtenemos el suero B; y con un conejo C obtenemos el suero C, estos sueros A, B y C son diferentes porque los animales son diferentes, y se van a comportar de manera distinta. Los investigadores querían tratar de encontrar un Ac que se comportara de la misma manera, es decir, que el suero reconociera un solo epitope. En una experiencia inmunizaron un ratón con un Ag y le sacaron el bazo. A ese bazo lo disgregaron y se lo inyectaron a otro ratón que previamente había sido irradiado, con lo cual se había inhibido todo su sistema inmune. A este ratón irradiado, luego de inmunizarlo con el bazo disgregado del primer ratón, también le inyectaron el Ag. A este ratón también le sacaron el bazo y repitieron el proceso con otro ratón. Siguieron así hasta que obtuvieron los LB que ellos buscaban. Este era un proceso bastante tedioso de realizar. Luego se descubrió que se podían fusionar células somáticas y se podían producir mielomas, que son los tumores de los LB que producen Ig de una sola clase. Milstein, en 1975 ideó la técnica de producción de Ac monoclonales. Las células de mieloma, que tienen la capacidad de crecer indefinidamente, van a fusionarse con un LB específico para el Ag. El mieloma no debe ser cualquiera, ya que los mielomas producen inmunoglobulinas. Se usan mielomas que no produzcan Ig, y como se va a necesitar luego seleccionar las células de alguna forma, tiene que ser mielomas deficientes en una enzima, son hipoxantina guanil fosfato tibosil transferasa negativas: HPGRT (-). Esta enzima es necesaria para que se sinteticen las bases púricas. Estos mielomas HPGRT (-) no van a poder crecer en un medio HAT, que es el que se utiliza para seleccionarlos. El medio HAT tiene hipoxantina, aminopterina y timidina . La aminopterina inhibe la síntesis de novo de nucleótidos. Los mielomas que tienen estas características se llaman NSO y son de ratón. El LB a utilizar debe ser también de ratón, al cual se lo inmunizó con el Ag específico. (Funcionan mejor los híbridos que pertenecen a la misma especie). Milstein utilizó GR de carnero. Se sigue un plan de inmunización común, por ejemplo inoculaciones una vez por semana durante un mes, y se observa si el animal produce o no Ac. Tres días antes de observar la fusión se le vuelve a inyectar el Ag, esto es para que haya una mayor cantidad de LB específicos. Se extrae el bazo, se disgregan las células y se realiza la fusión. Para la fusión se utilizan distintos agentes, el más usado es el polietilen glicol (PEG). No se conoce muy bien el mecanismo de la fusión, ni qué es lo que hace el PEG. Algunos creen que son las impurezas del PEG las que actúan. En fin las células se fusionan y se forman los HIBRIDOMAS . Ahora viene la selección.

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La selección es en medio HAT, en el cual solo van a poder crecer los hibridomas. Los linfocitos no sobreviven porque no crecen durante mucho tiempo en cultivo. Los mielomas no son capaces de sobrevivir en el medio HAT. La siguiente etapa es saber si los hibridomas producen o no el Ac buscado. Como es muy probable que la concentración de Ac sea muy poca, se debe usar un método de muy alta sensibilidad. Conviene usar una Inmunofluorescencia o una técnica de ELISA . Si algunos hibridomas producen los Ac buscados, hay que clonarlos. Hay dos formas: uno es el CLONADO EN AGAR y otra es el CLONADO POR DILUCIÓN LÍMITE . Se asegura así que los Ac provengan de una sola célula. Luego de la clonación hay que purificarlos. Para obtenerlos en gran cantidad se pueden hacer cultivos masivos o se puede obtener el líquido ascítico en un ratón. La producción de líquido ascítico permite obtener una gran cantidad de Ac monoclonal. Para ello se inyecta intraperitonealmente el hibridoma al ratón. El hibridoma dentro del ratón comienza a producir los Ac que se van a encontrar dentro del líquido ascítico. Los Ac monoclonales luego de obtenerlos deben ser purificados, usando, por ejemplo, columnas de afinidad. DIFERENCIAS ENTRE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES La primer diferencia es que los Ac monoclonales son homogéneos, mientras que los Ac policlonales son heterogéneos. Como los Ac policlonales son muchos Ac distintos, sus propiedades van a ser un promedio de las propiedades de cada uno de ellos. En cambio, en el caso de los Ac monoclonales las propiedades van a depender de esa única molécula.

La técnica de Milstein para la obtención de Ac monoclonales requiere el uso de LB de un animal previamente inmuizado con el Ag de interés, y una célula plamática maligna (mieloma) que son capaces de crecer bien en cultivo. Se procede a la fusión de ambas células, mediada por el PG. Los híbridos se seleccionan en un medio selectivo que contiene: aminopterina, la cual es un inhibidor que bloquea la ruta normal de biosíntesis de nucleótidos, hipoxantina y timidina (HAT). Por consiguiente, las células deben utilizar una ruta paralela para poder sintetizar sus ácidos nucleícos, siendo esta vía defectuosa en la línea celular mutante a la que se fusionan los LB normales. Una célula B es incapaz de crecer bien en cultivo por si sola por largos períodos. Durante la fusión, los cromosomas de las células se mezcla, resultando células híbridas con capacidad de crecer en cultivo y de producir Ac. Las células del hibridoma pueden crecer ya que las células B contribuyen con enzimas que pueden sintetizar nucleótidos por una ruta paralela a la bloqueada por aminopterina y por poseer las propiedades de crecimiento de las células de mieloma. Como el hibridoma deriva de una sola célula B, su Ac está restringido a una sola forma molecular, es decir, es un Ac monoclonal (Ac idénticos con un centro de unión al Ag idéntico).

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Los Ac monoclonales son más lábiles a los procesos de congelación y descongelación, menos resistentes a variaciones de pH. La avidez es un término que se relaciona con la fuerza de unión y la afinidad. En el caso de los policlonales va a depender del promedio de todas las afinidades de todos los Ac. En los monoclonales va a depender de esa única molécula. Los Ac monoclonales solamente van a dar interacción secundaria si el epitope está repetido muchas veces en el Ag. Solo de esta manera va a poder formarse la red.

Los Ac policlonales, en cambio, igual forman la red, porque tienen distintos Ac para distintos epitopes en el Ag. En cuanto a la especificidad, no importa en qué momento se produzcan, los Ac monoclonales tendrán siempre la misma especificidad. Los policlonales no, porque al ser producidos en distintos animales van a depender de la variabilidad individual de cada animal. Los Ac policlonales pueden dar más reacciones cruzadas, sin embargo los monoclonales, si el mismo epitope está en otra molécula diferente también van a poder dar una reacción cruzada. APLICACIONES Como los Ac monoclonales son más homogéneos y son monoespecíficos, pueden servir para purificar proteínas que están formando una mezcla compleja. Se utilizan para identificar y aislar ciertas poblaciones celulares. Se usan mucho en citometría de flujo, para identificar los TCD4, TCD8 y para inmunofluorescencia. Sirven para detectar y tratar los tumores. En ciertos tumores hay expresión de Ag que no se expresan en las demás células. En investigación se han utilizado mucho para estudiar los sitios de combinación y para estudiar de terminados epitopes. Se pueden usar Ac catalíticos si se consigue un Ac monoclonal que sea capaz de interactuar con algún producto de alguna reacción química, acelerando la reacción. DESVENTAJAS Si se los utilizan como terapéuticos hay que tener en cuenta que son Ac producidos en ratones. Si la inyectamos a un humano vamos a provocar una respuesta inmune contra esa molécula de otra especie.

No hay formación de red Hay formación de red

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Se ha querido solucionar este problema. Se probó creando un hibridoma humano-ratón, pero son muy inestables y no sobreviven en cultivo. Quisieron fusionar un LB humano con una célula de mieloma humano, pero los mielomas humanos siempre producen Ac y además tampoco viven. Gracias a la tecnología del ADN recombinante se pudo fabricar un Ac que tuviera la mayor parte de la molécula de origen humano, y que solo las regiones variables provinieran de ratón. Estos Ac se llaman ANTICUERPOS QUIMÉRICOS . Fab de ratón, se trata de que solo el Fv sea de ratón Anticuerpos quiméricos Fc humano Uno de los Ac que se está usando en algunas enfermedades es el Rituximab , que reconoce el CD20 del LB. El CD20 se expresa en todos los LB, pero se expresa en mucha mayor cantidad en cierto tipo de linfoma. Entonces, el Ac rituximab estaría interactuando directamente con la molécula CD20 y desencadenaría algún tipo de mecanismo que lleva a la destrucción de esa célula B.

In vitro se sabe lo que pasa, se genera un mecanismo de destrucción por activación del complemento, pero in vivo se desconoce. Otro Ac monoclonal que se utiliza en terapéutica es el simulet, que es un Ac contra el receptor de IL-2 y se usa en transplantes para generar inmunosupresión. También se han podido expresar Ac monoclonales en plantas, usando plásmidos que codifican para las Ig que se quieren expresar. Se lo puede introducir en una bacteria que transforme a la célula vegetal y se han generado plantas que expresan cadenas H con una determinada especificidad, y plantas que expresan cadenas L. Después cruzaron estas plantas y obtuvieron una planta que expresaba el Ac y lo extraían de las hojas.

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INMUNIZACIÓN

La inmunización en el hombre tiene como objetivo conferir una inmunidad protectora contra una enfermedad. Esto es, productos de una respuesta inmune que nos protejan contra la entrada de un patógeno. La inmunización así entendida se puede adquirir de dos maneras: una forma pasiva y una forma activa. A su vez la forma pasiva se puede adquirir artificialmente como naturalmente. INMUNIZACIÓN PASIVA O SEROTERAPIA • La forma natural es el pasaje de los Ac IgG que la madre le pasa al feto a través de la placenta. Esto es la causa de que los recién nacidos tengan un repertorio de especificidad muy similar al de la madre. Esto asegura que en los primeros meses de vida tenga una protección. Además de la transferencia placentaria está la transferencia a través del calostro y la leche materna. Estos Ac son principalmente del tipo IgA, que dan protección en las mucosas. También a través de la leche materna puede haber una transferencia de LT. Se denomina transferencia pasiva porque el niño no fue quien generó estas especificidades de Ac. • Una forma artificial de adquirir inmunidad es a través de los antisueros, ya sean heterólogos u homólogos (distinta o misma especie respectivamente). Los antisueros específicos heterólogos están en desuso, sobre todo aquellos que son para una enfermedad. Es decir, son sueros generados en una especie distinta a la del hombre y transferidas al hombre. Sí se siguen usando los sueros antiofídicos que se producen en caballos, lo máximo que se ha avanzado mediante un tratamiento enzimático para escindir la porción de ese gen. Los antisueros homólogos son los producidos en el hombre, que pueden ser específicos contra una enfermedad, o directamente preparados de sueros. Se busca la gammaglobulina humana obtenida de dadores sanos. La gammaglobulina humana es una fracción del suero que contiene los Ac. También puede usarse gammaglobulina humana inmune. En ello se inicia un plan de inmunización a dadores voluntarios para obtener Ac sobre todo contra algo en especial. En este caso el suero va a estar enriquecido en los Ac que necesitemos. Las gammaglobulinas se usan generalmente en personas que sufren inmunodeficiencia, las gammaglobulinas inmunes, por ejemplo, se usan para mujeres sensibilizadas con el Rh. Las complicaciones con la seroterapia provienen sobre todo con los antisueros heterólogos, ocurren reacciones de hipersensibilidad, sobre todo las alergias producidas por la IgE, que pueden llevar a que cuando vuelve a ingresar al organismo el mismo suero se produce un shock anafiláctico que lleva a la muerte. La “enfermedad del suero” ocurría con los heterólogos, que como perduran durante un tiempo en el organismo, el paciente genera Ac contra esos Ac. Se forman complejos Ag-Ac, que a su vez fijan complemento y pueden depositarse en piel, riñón y desatar una serie de síntomas. La transmisión de enfermedades con el tiempo ha desaparecido por los extensos controles que se le hacen a los sueros.

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La transferencia adoptiva de células T citotóxicas es más complicada porque debe existir una compatibilidad de las moléculas del CMH I. Si no hay alelos compartidos la transferencia no será exitosa por producirse rechazo. INMUNIZACIÓN ACTIVA O VACUNOTERAPIA La inmunización activa tiene como objeto establecer niveles adecuados de Ac y generar una población programada de células de memoria tanto T como B capaces de expandirse rápidamente y producir Ac ante un segundo encuentro con el Ag, y para poder así eliminar más rápidamente y eficientemente el patógeno. Para que una vacuna sea exitosa debe: • Activar las CPA y la producción de IL y otros factores necesarios para que se activen los LT y LB, es decir, que se generen Ac a partir de los LB y se generen células de memoria tanto B como T. • El inmunógeno debe persistir en su conformación nativa en las células foliculares, para poder así mantener un estímulo perdurable en el tiempo. • Debe se fácil de obtener, ser estable, económica y segura. • El primer contacto no debe ser nocivo. TIPOS DE VACUNAS Las vacunas virales son las que se van a inocular para obtener una inmunidad contra ese virus, ya sean a través de Ac o células, en este caso la inmunidad humoral es muy importante para la neutralización del virión. Las vacunas virales pueden estar compuestas por los virus vivos atenuados, es decir, se trata del mismo virus que ocasiona la enfermedad. La atenuación se logra generalmente en cultivos de tejidos de especies no humanas, aunque también se pueden generar cepas atenuadas en el hombre. De vez en cuando por mutación del virus en el contagio de persona a persona puede generarse una cepa atenuada. Si se recupera esa cepa atenuada puede utilizársela para inmunizar. Una cepa atenuada mantiene su capacidad infectiva intacta, va a poder ingresar a la célula y replicarse, pero no tiene el efecto patogénico, no va a desatar la enfermedad en el hombre. Ejemplo: la vacuna de la viruela estaba compuesta por un virus pariente de la viruela humana que era la viruela bovina, llamada vaccina. Comparte determinantes antigénicos con la viruela humana. Los virus inactivados están muertos, no conservan su capacidad de replicarse. Se los puede inactivar con agentes físicos como la radiación, el calor, o químicos como tratamientos con formol. Aún conservan la capacidad de generar una respuesta inmune protectora. celular Con virus atenuados�inmunidad humoral Con virus inactivados�solo inmunidad humoral, por lo tanto el número de inoculaciones debe ser mayor.

por lo tanto el numero de inoculaciones es menor (generalmente una sola dosis).

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De acuerdo al mecanismo infectivo del patógeno va a ser la estrategia de vacunación. Con los virus atenuados, como van replicándose hay una estimulación del sistema inmune a responder. El problema es también la posible reversión a la virulencia que puede sufrir la cepa. Ejemplo: Sabin, anti poliomielítica, es a virus vivos y contiene tres cepas, todas son necesarias para adquirir invasibidad. Una de ellas tiene mayor posibilidad de revertir y así desatar la enfermedad. Estas cepas tienen solamente 10 mutaciones en su genoma que la hacen no patogénica para el hombre. Con una reversión de alguna de estas mutaciones es suficiente para que la cepa retome su virulencia. Las otras dos cepas también son mutadas pero tienen mayor número de mutaciones. Lo que más se utilizan son vacunas de subunidades virales. Son las subunidades importantes para poder generar Ac solamente para esa subunidad. Debe generar Ac con capacidad neutralizante. Ejemplo: HBs Ag contra la hepatitis B, solamente contiene Ag de superficie del virión. En cuanto a las vacunas bacterianas se tienen las mismas consideraciones. Ejemplo de bacterias vivas atenuadas es la BCG que es para la tuberculosis. Se inocula una cepa atenuada de Mycobacterius tuberculosis bovino. Para las cepas inactivadas se utilizan los mismos métodos de inactivación que en virus. Los toxoides bacterianos también pueden ser utilizados para generar una respuesta inmune y producción de Ac, por ejemplo el de la difteria y el tétanos, que componen la doble. �El TOXOIDE es la toxina inactivada, tratada con formol generalmente. Los polisacaridos bacterianos son generalmente Ag T-I, generan una respuesta de tipo inespecífica. Generan igualmente una respuesta inmune con sus Ac efectores, pero no perdurable en el tiempo ya que no generan LBm y LTm. Hay una estrategia de vacunación que es la de los polisacaridos bacterianos conjugados a toxoides como la difteria o tétanos y así en el contexto de respuesta frente a un Ag de tipo T-D, logre convertir a los linfocitos que se activan en linfocitos de memoria. Ejemplo: la cuadruple: Difteria Tétanos triple B. pertusis Haemophylus influenzae �La inmunidad en general cuando es a virus vivo es de por vida, no así la de virus muertos, que requieren refuerzos. En la de virus vivos es posble la reverción a la virulencia, no así en la de virus muertos o inactivados. Los adyuvantes más utilizados en el hombre son el hidróxido de aluminio y el MF59 que también es una mezcla de aceite-agua. Las vacunas ADN y vectores microbianos aún es un campo nuevo en las estrategias de vacunación. Se inocula directamente con el ADN.

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VACUNAS COMO AGENTES TERAPEÚTICOS Es utilizar el Ac generado fuera del hombre, en una especie diferente, que serán anti-idiotipos específicos, por ejemplo. ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPICOS Las regiones de unión al Ag son los idiotipos del Ac. Son regiones variables, entonces se puede generar Ac contra esta parte, por eso se los denomina anti-idiotipo.

Por ejemplo si un LB tiene una Ig de una determinada especificidad, hay muchos tumores de LB que van a expresar muchos Ac iguales con una determinada especificidad. Si se dispone de un Ac anti-idiotipo que reconozca el idiotipo de la Ig de superficie, se va a poder desencadenar algunos mecanismos que lleven a la destrucción de la célula. Este es un uso con fines terapéuticos, no para prevenir.

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTORES O ANTI-MOLÉCULAS SOLUBL ES Se usan para el tratamiento contra el HIV. El HIV infecta a las células a través de la unión a una molécula CD4. Si se tiene un Ac anti-CD4 se puede bloquear ese sitio e impedir que se una el virus.

idiotipos Anti-idiotipo

LB

Fc

Fc

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GENÉTICA Y DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Siempre se trató de explicar la gran diversidad de Ac. Existían dos teorías a principios de siglo que trataban de explicar esta diversidad: TEORÍA DE LA LINEA GERMINAL Esta teoría decía que en el genoma estaban todos los genes que se necesitaban para codificar todas las inmunoglobulinas de todas las especificidades que pudieran existir. Postulaba que había un gen para cada tipo de Ig, o sea que el repertorio de Igs era hereditario. TEORÍA DE LA VARIACIÓN SOMÁTICA O DE LA RECOMBINACI ÓN Decía que si bien había muchos genes de inmunoglobulinas, estos genes podían mutar o recombinarse de tal manera de obtener una mayor variabilidad. Para su momento estaba la teoría que decía que cada proteína era codificada por un solo gen. 1 gen una proteína La teoría de la diversificación somática postulaba que el repertorio se generaba de un conjunto de genes hereditarios que codificaban la porción V de las Ig, los cuales se modificaban de manera particular en cada una de las células B. Estas se empezaron a complicar cuando se empezaron a secuenciar las Ig. Se vio que las Ig tenían una parte que era muy variable y otra parte muy constante.

La generación de diversidad se produce por rearreglos o reordenamientos del DNA que codifican los dominios V de las Ig, proceso que ocurre durante la maduración de los LB. Esta divesidad se incremente aún más por el proceso de hipermutación somática que sufren los LB maduros activados MODELO DE DREYER Y BENNET (1965) Entonces apareció la hipótesis de que las cadenas H y las cadenas L eran codificadas por dos tipos de genes, uno que codificaba para la parte variable y otro para la parte constante. Estos genes estaban separados en la línea germinal y después se unían para formar un gen que se podía expresar en un LB. También decía que había varios genes que codificaban para la parte variable, y algunos genes que codificaban para la parte constante. Las cadenas H y L de las Ig están codificadas por distintos grupos de genes. En tods las células, salvo en los LB, los genes que codifican el dominio V de las Ig están muy lejos de los que codifican la porción C. En los LB maduros, los genes V están mucho más

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cerca de los genes que codifican la porción C, como consecuencia de rearreglos de material genético producidos durante la maduración B. Las células cuyos genes de Ig no sufren este arreglo (todas las células, salvo los LB) poseen los genes de Ig en una coniguración denominada “configuración germinal” mientras que los LB maduros poseen los genes de las Ig “ rearreglados”. Este proceso de rearreglo génico se conoce con el nombre de RECOMBINACIÓN SOMÁTICA. Los genes que codifican para las cadenas H están codificadas en el cromosoma 14. Las cadenas L pueden ser de dos tipos, las κ y las λ. Los genes para estas cadenas están en cromosomas diferentes, los genes que codifican para la cadena λ están en el cromosoma22, y los de la cadena κ en el cromosoma 2. Para las cadenas L, los genes que van a participar son: • Genes L: codifican para el péptido líder • Genes V: codifican para la parte variable. • Genes J: codifican para la unión. • Genes C: codifican para la parte constante. Recordar que hay dos alelos para cada gen. Las cadenas H además de contener los genes anteriores, tienen un segmento más: • Segmento de diversidad (solo para las cadenas H). Cada dominio está codificado por un segmento génico. Por ejemplo para la IgM, la cadena H tiene 4 dominios, entonces van a haber 4 genes. Estos genes están separados en la línea germinal y no se expresan. Tampoco se expresan en ninguna célula del organismo, solo en los LB. En los LB estos genes sufren un procesamiento que es un REORDENAMIENTO GÉNICO que permite que estos genes se expresen. Cada segmento a su vez tiene variantes, por ejemplo para los genes V de la cadena λ hay 30 variantes, para los segmentos J hay 4. Esto da muchas posibilidades de recombinantes. Para un proceso de recombinación son necesarias enzimas y SSR o secuencias señal de reconocimiento. Las secuencias SSR están ubicadas en los extremos 3`de todos los genes V, en el extremo 5`y 3`de los genes D, y en el extremo 5`de los genes C. Hay dos tipos de SSR, uno formada por un heptámero palindrómico (7pb) separados por 12 pb de una secuencia monomérica (9pb). El otro tipo de SSR está formado por 23 pb del monómero. Esto se conoce como “regla del 12 + 23”. Estas secuencias son el sitio de reconocimiento de las enzimas y permiten que el reordenamiento se lleve a cabo en forma correcta. Siempre se va a combinar una secuencia con un separador de 12 pb con una secuencia con un separador de 23 pb. Dentro del conjunto de enzimas que participan hay dos propias de los LT y los LB. Se llaman RECOMBINASAS , están codificadas por dos genes el RAG1 y el RAG2. Las demás enzimas son las mismas de todas las células eucariotas: DNA ligasa, proteín quinasa, etc..

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RECOMBINACIÓN Dos complejos de estas enzimas RAG se unen uno a una SSR separada por 23pb y el otro a otra SSR separada por 12 pb. Las secuencias se van a alinear, se va a formar un loop de ADN y se van a cortar. Se generan así dos segmentos que después tienen que ser unidos. Esos fragmentos que se generan tienen extremos palindrómicos. Para unirlos se deben adicionar nucleótidos que se llaman NUCLEOTIDOS P por enzimas que reparan el DNA. En ese momento también puede actuar otra enzima que se conoce como TdT: DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASA TERMINAL . Esta enzima adiciona más nucleótidos. Los nucleótidos que adiciona esta enzima se denominan NUCLEOTIDOS N . Este es otro evento que conduce a generar una mayor diversidad. Se agregan nucleótidos que no están codificados por la línea germinal. �Un evento que contribuye a la diversidad es la adición de nucleótidos P y N. Esta adición de nucleótidos se produce en la región más hipervariable de la Ig. Entonces tenemos dos factores que generan la diversidad: • Múltiples segmentos génicos para los distintos dominios. • Adición de nucleótidos P y N. Como se sabe las Ig pueden presentarse unidos a las membranas o pueden ser secretadas. Las primeras Ig que se van a sintetizar son la IgM y la IgD. Estas dos se sintetizan de forma simultánea. Para que se sintetice la IgD no se necesita un reordenamiento genético, se sintetiza por un splicing alternativo del ARN transcripto primario. Entonces a partir del mismo ARN transcripto primario se van a generar dos ARNm diferentes, uno lleva a la síntesis de IgM y otro a la síntesis de IgD. En los LB ocurre también un proceso que se denomina de EXCLUSIÓN ALÉLICA . Cada linfocito debe expresar una Ig de una sola especificidad, pero cada gen está codificado por dos alelos. En todos estos procesos de reordenamiento, si el reordenamiento es productivo, esto quiere decir que se puede sintetizar la proteína, entonces el otro alelo no se reordena. Reordenamiento productivo en un alelo ����el otro alelo no se reordena. En cambio, si el reordenamiento en un alelo es no productivo, se intenta reordenar el otro, si ocurre otro reordenamiento no productivo en el otro alelo la célula induce apoptosis y muere. Reordenamiento no productivo ����se reordena el en un alelo otro alelo ����si vuelve a ser no productivo �APOPTOSIS La adición de los nucleótidos P y N pueden ocasionar el corrimiento del marco de lectura, esto anula la síntesis de una proteína funcional y conduce a un reordenamiento no productivo.

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Supongamos que ya se reordenaron los genes y se está sintetizando la IgM. Para que esta vaya a membrana necesita asociarse a otras dos proteínas que se van a llamar Igα e Igβ. Igα e Igβ son necesarias para que la IgM pueda expresarse en la membrana del LB. Son proteínas constantes, sin variaciones. Son las encargadas también de transmitir las señales de activación al linfocito. Esto es porque la porción citoplasmática de la IgM de la membrana es muy corta, las Igα e Igβ tienen una porción citoplasmática más larga y les es más fácil transmitir señales. Una vez que el LB se encuentra con el Ag, la IgM que estaba en membrana se comienza a secretar.

Para que la IgM se pueda secretar se va a dejar de expresar los genes que le permitía anclarse a la membrana y se van a empezar a expresar otros genes que codifican para secuencias de secreción. Para este proceso no hay reordenamiento genético, sino splicing alternativo del ARNm transcripto primario. A medida que se va avanzando en un plan de inmunización, si se pudieran separar los Ac y secuenciarlos (por ejemplo una IgM), a la semana se observarán las secuencias de las partes variables de las Ig, y se verán ciertas regiones con mayor variabilidad. Esto ocurre tanto para las cadenas H como para las cadenas L. Dos semanas después se observará que la variabilidad aumenta muchísimo más. Estas variaciones se producen por un fenómeno de HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA . Todos los genes pueden tener una determinada tasa de mutación. En los genes de Ig, y en estas zonas en particular de hipervariación, estas mutaciones están muy elevadas. Estas hipermutaciones pueden generar Ac que pueden tener mayor afinidad por el Ag o que pueden tener menor afinidad. Por un proceso se van a ir seleccionando los Ac que tengan mayor afinidad, y se conoce como MADURACIÓN DE LA AFINIDAD . Se produce a lo largo de una respuesta inmune. La enzima que participa en el proceso de hipermutación se llama histidina deaminasa (AID) y es inducible por activación. Existe otra variación que se puede producir en las Ig que se llama CAMBIO DE CLASE o CAMBIO DE ISOTIPO . Las IgM y la IgD se sintetizan en conjunto y no necesitan de un reordenamiento de genes para poder expresarse las dos. Para poder expresar las otras Ig (IgG, IgE e IgA) se necesita un proceso de recombinación que se produce gracias a unas secuencias que hay en las cadenas H que se denominan secuencias S o de Switch. Son motivos repetitivos de nucleótidos. Se ubican en la región 3`de los genes de cadena µ, y en la región 3`de cada uno de los otros genes de la cadena H. No en el gen de la cadena δ.

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La enzima que participa es la misma que produce hipermutación somática. No se sabe el mecanismo que le permite a esta enzima actuar en dos procesos distintos. Entonces, cuando se unen una de estas dos secuencias repetidas S se forma una horquilla de ADN que después es cortada. De esta manera se pierde la expresión de las IgM e IgD y se puede empezar a expresar las otras cadenas H. Este proceso depende de las citoquinas que produzca el LT y se produce a lo largo de una respuesta inmune activa. Entonces, se van a poder expresar las distintas Ig que van a tener la misma especificidad por el antígeno pero que van a tener distintas regiones constantes y por lo tanto van a poder ejercer distintas funciones. Recordando como es una molécula de Ac:

Tiene cuatro cadenas, dos cadenas pesadas H y dos cadenas livianas L. Cada una de estas cadenas tiene una parte constante y una parte variable. La parte que se une al Ag es la parte variable. En la parte variable hay una zona que son los CDR que son las regiones determinantes de complementariedad y hay tres: CDR1, CDR2 y CDR3 en cada cadena, tres en las H y tres en las L. Son las zonas de unión al Ag. La más variable es la región CDR3. Las cadenas H pueden ser de 5 clases: µ, ε, γ, δ y α. Las cadenas L pueden ser de dos clases: κ o λ. Las más comunes en el hombre son las cadenas κ. Estas Ig están codificadas por distintas familias de genes, que en la línea germinal tenían un cierto orden. Para que se puedan expresar en los linfocitos esos genes tienen que reordenarse o recombinarse. Las enzimas que participan se llaman recombinasas, la RAG1 y la RAG2. Estas también participan en la recombinación del receptor de los LT. Además hay unas secuencias señal de recombinación o SSR que le indican a las enzimas donde deben unirse. Para cada cadena se producen distintos procesos. Cuando se unen los segmentos se produce la adición de nucleótidos con la enzima deoxinucleotidil transferasa terminal o TdT. Esta enzima agrega los nucleótidos N y los nucleótidos P en los puntos de corte, lo que aumenta la diversidad. Entonces la diversidad se genera antes que el linfocito se encuentre con el Ag y después. Los eventos que ocurren antes del encuentro con el Ag son la recombinación de los genes VDJ y la adición de nucleótidos N y P. Los eventos que ocurren después de encuentro con el Ag son la hipermutación somática, en la cual se generan mutaciones en las regiones hipervariables de las Ig; y el otro fenómeno es el cambio de isotipo, que se conoce como Switch. Para este switch se debe producir una recombinación, participa la enzima citidil deaminasa inducida por activación y participan unas secuencias de reconocimiento que se conocen como secuencias S.

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Rearreglos de la porción variable de las cadenas liviana (VL) y pesada(VH): El dominio V de la cadena L está codificado por dos genes diferentes: el primer gen (VL) codifica la mayor parte del dominio variable. El segundo gen (JL) codifica los restantes aminoáciodos del dominio V. La asociación de un gen VL con un gen JL produce un exón continuo que codifica todo el domio VL. Una vez que se produjo la asociación VL-JL este segmento queda seprado de la región CL por un intrón y es esta configuración la que se trascribe al RNAm. Para producir una cadena liviana completa, luego de la transcripción, el intrón que separa al fragmento VL-JL del gen CL se elimina por corte y empalme del RNAm (splicing). El dominio V de la cadena H está codificada por tres genes diferentes denominados VH, DH y JH. El proceso de recombinación somática que produce un dominio VH involucra dos etapas. En la primera se produce la asociación del gen DH con el JH y, luego, la porción DH-JH rearreglada se asociará con el gen VH para generar el exón completo (VHDHJH) que codifica el dominio VH. Al igual que para la cadena L la asociación de la región VH con la región CH vecina se produce por corte y empalme del RNAm. El DNA en configuración germinal contiene múltiples genes V, D y J. La selección de un segmento u otro hace la posible la gran diversidad de dominios V en las Ig. Es posible generar distintas porciones variables de las Ig gracias a la selección de alguno de los múltiples genes V, D y J para la cadena H, o V y J para la cadena L: -Para la cadena Lκ existen al menos 40 genes funcionales Vκ y 5 genes Jκ - Para la cadena Lλ existen 30 genes funcionales Vλ y cuatro genes Jλ - Para la cadena H humana existen 65 genes VH funcionales, aproximadamente 27 genes DH y 6 genes JH. Durante la ontogenia B se produce en primera instancia el rearreglo de la cadena H. Luego la célula comienza varios ciclos de proliferación y posteriormente, cada una de las células hijas cuyas cadenas H ya fueron rearregladas, comienza un arreglo independiente de la cadena L. La diversidad es aún mayor devido a la unión impresisa de los segmentos génicos y al proceso de hipermutación somática que sufren los LB maduros activados.

El proceso de recombinación somática está guiado por secuencias señales de recombinación e involucra distintas enzimas:

Debe existir un sistema que asegure el ensamblado correcto de los distintos fragmentos génicos durante el proceso de recombinación somática, de manera que un fragmento V se asocie con uno D o J, pero no con otro gen V. La recombinación solo ocurre entre fragmentos génicos que se encuentran en el mismo cromosoma y está guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante denominadas secuencias señales de recombinación (SSR). Estas se encuentran adyacentes a los puntos donde se lleva a cabo la recombinación. La recombinación somática está guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante. Esta secuencias consisten en un bloque de 7 nucleótidos (heptámero), contiguo a la secuencia codificante, seguido por otro bloque de 9 nucleótidos (nonámero). Mientras que los heptámeros y nonámeros presentan una secuencia conservada, los espaciadores varían en su secuencia pero conservan su longitud (12 o 23 nucleótidos). La región heptámero-espaciador-nonámero recibe el nombre de secuencia señal de recombinación (SSR).

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La recombinación somática suele seguir la “regla 12+23”. Esto es, que un segmento génico flanqueado por una SSR que integra une espaciador de 12 nucleótidos se podrá unir a otro segmento flanqueado por una SSR con espaciador de 23 nucleótidos. Para la cadena H, esta regla asegura la asociación correcta de fragmentos VH-DH-JH, ya que los genes VH y JH (flanqueados por SSR con espaciadores de 12 pb) pueden asociarse con los fragmentos DH (flanqueados por SSR con espaciadores de 23 pb), pero no pueden asociarse entre sí. Los mecanismos por los cuales se produce la recombinación somática que dará lugar a la cadena H son similares a los utilizados para generar la cadena L. la forma más común de recombinación involucra la formación de un bucle (loop) de DNA y la pérdida posterior de material genético que se encuentra entre los fragmento recombinados en forma de DNA circular La unión entre los fragmentos recombinados (VL-JL, o VH-DH-JH) es imprecisa y esta característica representa una fuente adicional de variabilidad para la porción variable de las Ig. El complejo enzimático que actúa para producir la recombinación V(D)J se conoce con el nombre recombinasa V(D)J. Los productos de los genes RAG-1 y RAG-2 forman parte de esa recombinasa y solo se expresan en linfocitos en desarrollo. Estas enzimas poseen actividad de endonucleasa y son las responsables del corte de la cadena de DNA. Por el contrario, el resto de las enzimas que forman parte de las recombinasas presentan una expresión ubicua y están involucradas en la reparación, modifcación y plegado del DNA de todas las células. Las enzimas de reparación de las cadenas de DNA incrementan aún más la diversidad, ya que son capaces de agregar o eliminar nucleótidos al azar en los sitios de unión de los fragmentos génicos. Los nucleótidos adicionados se conocen como nucleótidos P y N. Los nucleótidos P se adicionan por las enzimas responsables de la reparación del DNA y reciben este nombre debido a que generan secuencias palindrómicas. Los nucleótidos N son adicionados sin molde por la enzima TdT, y se encuentra principalmente en las uniones VH-DH y DH-JH. La presencia de nucleótidos N en la cadena L es menos común porque la enzima TdT, en los LB, solo se expresa durante el rearreglo de la cadena H que es previo al rearreglo de la cadena L. Los nucleótidos también pueden ser eliminados por mecanismos no muy bien definidos hasta el momento, que involucran enzimas con actividad exonucleasa. Como el número de nucleótidos eliminados y adicionados por estos mecanismos es al azar, en el cambio de lectura que lleven a la reducción de proteínas no funcionales (rearreglos no productivos). Para que un LB pueda desarrollarse normalmente debe lograr un rearreglo productivo de su Ig, de no ser así, no podrá continuar con su desarrollo y morirá por apoptosis. Resumiendo: La generación de diversidad en el repertorio de Ig se produce por los siguientes mecanismos: -La existencia de distintos segmentos V, (D )y J de H y L. Mientras que un LB durante su ontogenia utiliza un determinado conjunto de segmentos génicos para la generación de sus dominios variables, otro LB utilizará un conjunto diferente y generara diferentes dominios VH y VL. -La asociación de la cadenas H y L. El paratope o sitio de reconocimiento del Ac involucra los dominios variables de las cadenas H y L, cada una de las cuales se rearregla en forma independiente.

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-La unión imprecisa de los segmentos génicos, que produce diversidad por la adición y sustracción de nucleótidos. -La hipermutación somática, que incrementa el repertorio de Ig luego del reconocimiento antigénico. Un mismo exón VH puede asociarse con distintos genes CH durante el curso de la respuesta inmune: El cluster de la cadena H presenta distintos sets de regiones CH, cada uno de los cuales corresponde a un diferente isotipo de Ig. Todos los linfoncitos comienzan expresando un BCR que contiene IgM, esto ocurre en el estadío de LB inmaduro, lo que implica que el exón del dominio VH debe asociarse, en primera instancia, con el gen Cµ. Inmediatamente después del gen Cµ se encuentra el gen Cδ, el cual codifica la porción constante de la cadena H de la IgD. Los LB maduros coexpresan en la membrana Ig de isotipo IgM e IgD, como parte del BCR. Ambas Ig presentan una única especificidad ya que comparten los mismos dominios V tanto en la cadena L como en la cadena H. Esto se explica gracias a que el exón VH generado por recombinación somática puede ser transcripto junto con los genes Cµ o Cδ. La asociación de un mismo dominio VH con la región Cµ o Cδ se produce por corte y empalme alternativo del RNAm. Los LB activados pueden realizar un cambio o switch de isotipo, en donde también un mismo dominio VH se asocia con distintos isotipos. Sin embargo, los mecanismos responsables de este proceso son distintos de los responsables de la coexpresión de IgE IgD en los LB maduros.

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VIDA DE UN LINFOCITO B

Se puede dividir en 4 etapas: • 1˚ etapa: producción y maduración en la médula ósea. • 2˚ etapa: eliminación de LB que reconozcan Ag propios. • 3˚ etapa: activación del LB por el encuentro con el Ag. • 4˚ etapa: diferenciación a célula plasmática productora de Ac. PRIMERA ETAPA: ONTOGENIA B Todas las células hematopoyéticas se originan de un precursor común, esta es una stem cell o célula troncal que tiene la capacidad de multiplicarse independientemente. La célula troncal en la médula ósea tiene los genes de las cadenas H y cadenas L en la configuración de la línea germinal, es decir, que no va a expresar ni cadenas H ni cadenas L, por lo tanto ninguna Ig. Esta célula se va a transformar en una célula pro-B temprana cuando empiece a reordenar los genes de la cadena H. Entonces, los primeros genes que se reordenan son los de la cadena H, sus segmentos DJ. En este estadio las cadenas L siguen estando en la configuración de la línea germinal y todavía no se expresa ninguna proteína. Cuando se comienzan a reordenar los genes V de la cadena H, el LB pasa a llamarse célula pro-B tardía. Todavía no se reordenan los genes de la cadena liviana, y aún no se expresa ninguna proteína. Cuando terminan de reordenarse los genes de cadena H, el LB se llama célula pre-B grande. Este linfocito ya reordenó los genes VDJ de cadena H, todavía no reordenó los genes de la cadena L, empieza a producir muchas cadenas H. La primera Ig que se produce es la IgM, es decir, que las primeras cadenas H que se producen son de tipo µ, pero para que estas cadenas H se puedan expresar, deben estar asociadas a una cadena L. Como los genes de cadena L aún no se reordenaron se sintetiza una cadena liviana sustituta. Así, en el estadío de célula pre-B grande se expresan cadenas H asociadas a unas cadenas L sustitutas. Para que la Ig se pueda expresar en la membrana debe asociarse a otras dos proteínas que se llaman Igβ e Igα. Estas dos proteínas siempre se asocian cuando la Ig se expresa en membrana, y forman parte del receptor B (BCR). En esta etapa de célula pre-B grande se inhiben las enzimas de la recombinación y la célula se multiplica, es decir, la célula empieza a proliferar. Se generan así alrededor de 30 a 70 células pre-B pequeñas. En el estadio de célula pre-B pequeña comienzan a reordenarse los genes de las cadenas L. Las cadenas H se siguen sintetizando, pero no se van a expresar, se almacenan en el RE. También se sintetizan las moléculas Igα e Igβ. El próximo estadío, cuando ya se reordenan los genes de cadena L, se llama célula B inmadura. Esta célula B inmadura ya puede expresar una IgM entera en su membrana. La IgM junto con la Igα e Igβ conforman el BCR. Para que el linfocito pase a célula B madura debe expresar además la IgD en membrana. La IgM y la IgD se expresan simultáneamente sin necesidad de reordenamiento genético, sino solo un splicing alternativo del mismo ARN transcripto primario. El reordenamiento de los distintos segmentos con la adición de los nucleótidos puede generar secuencias que no estén en el correcto marco de lectura. Cuando se generan ese

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tipo de secuencias se dice que el reordenamiento es un REORDENAMIENTO NO PRODUCTIVO . La célula B tiene la posibilidad de reordenar los genes de ambos cromosomas. En el LB existe la EXCLUSIÓN ALÉLICA , es decir, que solo se expresan genes de un cromosoma. El LB en su estadio de pro-B temprano reordena los genes de cadena H de los dos cromosomas. �El primer reordenamiento D-J se produce en los dos cromosomas. En el estadio de célula pro-B tardía, cuando ya se produjo el reordenamiento V-D-J en uno de los cromosomas, si ese reordenamiento es productivo, la célula continúa la evolución. Si no es productivo, es decir, si se generó alguna secuencia que no estaba en el marco de lectura adecuado, la célula intenta reordenar el otro cromosoma. Si este nuevo reordenamiento es productivo la célula sigue, si no es productivo la célula muere por apoptosis. Supongamos ahora que la célula reordenó las cadenas H de forma correcta. Llegamos al estadio de célula pre-B, donde comienzan a reordenarse los genes de la cadena L. El reordenamiento comienza siempre por las cadenas κ. Entonces, comienzan a reordenarse las cadenas κ de un cromosoma. Si el reordenamiento es productivo la célula sigue, si no es productivo la célula intenta reordenar los genes del otro cromosoma. Si este reordenamiento es productivo se llega a un LB inmaduro que va a expresar una IgM que va a tener las cadenas H de tipo µ y las cadenas L de tipo κ. Si el reordenamiento de las cadenas κ no fue productivo, comienzan a reordenarse las cadenas λ. Se reordena la cadena λ de un cromosoma, si es productivo la célula sigue y se obtiene un LB que va a expresar una IgM con cadenas pesadas µ y cadenas livianas λ. Si el reordenamiento no fue productivo la célula trata de reordenar el otro cromosoma, si no es productivo se muere por apoptosis, y si es productivo se tiene un LB inmaduro que está expresando una IgM con cadenas L λ. Para que todo esto se lleve a cabo de forma ordenada y semicojugada, el linfocito tiene que saber cuando tiene que dejar de expresar las enzimas de la recombinación, sino se estarían recombinando las cadenas indefinidamente. Entonces, hay puntos de control para que el linfocito deje de expresar las recombinasas y cesen los procesos de recombinación. Los puntos de control van a estar dados en el estadío de célula pre-B grande, cuando el linfocito expresa la IgM con la cadena sustituta. La expresión de esta molécula en membrana le envía señales al linfocito para que deje de sintetizar recombinasas. En esta etapa en que no hay recombinación el linfocito prolifera. El otro punto para que el linfocito deje de recombinarse es cuando ya está en el estadio de célula B inmadura. Ya produjo la IgM correcta. La expresión de este producto en membrana también le indica al linfocito que debe dejar de recombinarse. La cadena L sustituta esta formada por una región que se llama V pre B y otra λ5λ5λ5λ5, que sería la parte constante. La IgM es el receptor de los LB vírgenes, los LB de memoria pueden tener otros isotipos, fundamentalmente IgG. Durante todo este proceso de ontogenia B, que la célula pluripotencial se empieza a diferenciar, participan de manera muy activa las células del estroma de la médula ósea. Entonces, es importante la interacción entre el linfocito y las células estromales de

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médula ósea. Y no solo es importante la interacción, sino también los factores que estas células producen. Un factor muy importante en el inicio de esta transformación es la IL-7. A medida que el linfocito va evolucionando se va haciendo menos dependiente de todos estos factores hasta que puede salir de la médula ósea y dirigirse hacia los órganos linfoides secundarios. Todos estos procesos deben estar muy bien regulados y la expresión de los genes para las distintas enzimas también tiene que estar controlado. La enzima TdT se expresa siempre que se reordenen las cadenas H, cuando se reordenan las cadenas L esta enzima no se expresa. Por eso en el reordenamiento de las cadenas L no hay adición de nucleótidos. Antes de que se produzca cada evento de recombinación, se produce una pequeña transcripción de los elementos que se van a recombinar. Esto se hace para que las enzimas recombinasas se dirijan hacia los genes de las Ig y no hacia los genes del receptor T. Todo esto es para un tipo particular de linfocito: LB2. Hay tres tipos de linfocitos B: LB1, LB2 y LBZM. Los LB2 son los mayoritarios. La otra población, los LB1, que son los primeros que se producen durante el desarrollo embrionario (por eso se llaman LB1), tiene un BCR que es menos diverso. Los primeros que se producen durante la vida fetal tienen muy poca diversidad en las uniones, y en esa época no se expresa la enzima TdT. Por lo tanto no se adicionan los nucleótidos N. Entonces, estos receptores de estos linfocitos tienen una menor variabilidad. Después del nacimiento aumenta la variabilidad porque sí se expresa la enzima TdT. Pero de todos modos la variabilidad es menor que para los LB2. Este tipo de linfocito va a producir solamente IgM en su mayoría y muy poca cantidad de IgG. Son células que no van a generar células de memoria y son linfocitos donde tampoco se va a producir el fenómeno de hipermutación somática. Después del nacimiento se produce durante algún tiempo en la médula ósea, pero llega un momento en que la médula ósea no la produce más. Se mantienen por autorrenovación. Estos linfocitos producen Ac contra polisacáridos y contra ciertos hidratos de carbono. Estos son Ag TI-2. Como los Ac que producen son de menor afinidad se pueden unir a una gran cantidad de Ag, entonces se dice que son poliespecíficos. Los LB1 se localizan principalmente en la cavidad peritoneal y pleural, en cambio los LB2 están en los órganos linfoides. La autorrenovación de los LB1 parece que depende de IL-10. SEGUNDA ETAPA: SELECCIÓN Y DESARROLLO ADICIONAL DE LB El receptor de los LB debe ser capaz de no reconocer a los Ag propios. Los Ag propios se denominan autoantígenos. Estos autoantígenos pueden ser glucoproteínas, proteoglicanos o glucolípidos de las membranas celulares. Otro tipo de autoantígeno pueden ser proteínas que se encuentren en elevada concentración en el plasma o en la linfa. Este reconocimiento de autoantígenos se puede dar en el estadio de LB inmaduro. Entonces, en el estadío de LB inmaduro, que tiene Ig en su membrana con las otras dos moléculas asociadas, el LB va a sufrir un proceso que se puede denominar como INDUCCIÓN DE TOLERANCIA CENTRAL , que se produce en la médula ósea,

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aunque también puede ser cuando el linfocito recién haya salido de la médula ósea. Este proceso va a hacer que los LB que reconozcan Ag propios mueran por apoptosis o se transformen en anérgicos. Que ocurra una cosa u otra va a depender del tipo de autoantígeno con el que se encuentren y del tipo de señal que reciban. Si el linfocito no recibe ninguna señal, no reconoce ningún Ag, entonces va a transformarse en un LB maduro que expresa las dos Ig: la IgM y la IgD. Si el linfocito se encuentra con un Ag multivalente recibe una señal muy fuerte e intensa, entonces este linfocito muere por apoptosis. Si en cambio el linfocito recibe una señal débil, como las que dan las proteínas que están en concentración elevada en plasma o en linfa, el linfocito no muere sino que entra en estado de anergia o no respondedor. Este linfocito deja de expresar la IgM y empieza a expresar más IgD. Este linfocito no va a poder después activarse. �célula B anérgica: expresa poca IgM y mucha IgD. Así este linfocito por más que valla a un órgano linfoide secundario no va a responder. Pero los LB tienen una propiedad que les permite volver a sintetizar un nuevo receptor, que se conoce como RE-EDICIÓN DEL RECEPTOR B . Si el LB se une a un autoantígeno multivalente y lo reconoce con una intensidad fuerte, antes de entrar en apoptosis intenta reordenan otra vez los genes de cadena L. Entonces se activan nuevamente las recombinasas, se reordenan los genes de cadena L y se intenta sintetizar una nueva cadena L. Si la nueva Ig de membrana no reconoce ningún Ag propio, el linfocito sigue su curso. Si lo reconoce muere por apoptosis. Esto es una particularidad de los LB que se llama re-edición del BCR, y les da una nueva posibilidad de continuar el proceso de maduración. Las cadenas L nuevas que se sintetizan reemplazan a las otras y se expresan en membrana. Ese linfocito inmaduro que expresa la IgM, que no reconoce ningún Ag propio se transforma en linfocito maduro y puede quedar en médula ósea o salir de ella. Cuando el LB maduro sale de médula ósea puede ir al ganglio linfático. Es decir, que los LB maduros van a los órganos linfoides secundarios. Pueden ubicarse algunos en los tejidos linfoides asociados a mucosas, pueden ubicarse en el bazo o en los ganglios. Prácticamente ocurre lo mismo en los tejidos linfoides secundarios. El LB maduro entra al ganglio por la sangre, y sale de los vasos sanguíneos por las vénulas del endotelio alto. Estas vénulas tienen características especiales que no tienen las otras células endoteliales del resto del organismo. Los LB a través de las moléculas de adhesión van a entrar en contacto con las moléculas de adhesión que expresan estas células endoteliales y van a poder salir. En el ganglio va a haber algunas zonas donde van a predominar los LT y otras donde van a predominar los LB. El linfocito que salió del vaso sanguíneo se va a ubicar en un folículo primario o FOLÍCULO LINFOIDE PRIMARIO. En este folículo van a estar los LB vírgenes que nunca se contactaron con un Ag, va a haber macrófagos y va a haber un tipo particular de célula dendrítica llamada célula dendrítica folicular (CDF). Esta CDF no fagocita ni presenta Ag. Es decir, que no tiene la misma función que las otras células dendríticas. Todos los LB para poder sobrevivir deben pasar por el folículo linfoide primario. Si no encuentran ningún Ag están un tiempo en este folículo primario y después salen, y vuelven a circular. Continuamente en el folículo primario están ingresando LB vírgenes, hay un continuo recambio de linfocitos. Los LB salen del ganglio por un vaso linfático eferente.

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Si el linfocito contacta a un Ag lo va a reconocer a través de la Ig que tiene en su membrana. Este reconocimiento le va a mandar una serie de señales hacia el interior celular, pero a su vez este LB, para poder seguir montando la respuesta inmune necesita encontrarse con un LTh que previamente fue activado con el mismo Ag. El LB así activado comienza a proliferar. Algunos LB que proliferan van a transformarse rápidamente en PLASMOCITOS y van a producir Ac. Los plasmocitos se van hacia la médula del ganglio, algunos salen del ganglio y van a la médula ósea. Estos primeros Ac que se producen son del tipo IgM. Siempre en una respuesta primaria lo mayoritario que se produce es IgM. La respuesta primaria es la reacción ante la primera entrada del Ag al organismo. Otra parte de los LB que proliferan comienzan a formar un FOLÍCULO LINFOIDE SECUNDARIO. Los folículos secundarios son simplemente LB proliferantes, con macrófagos y CDF. Así, después del contacto con el Ag y con el LTh se generan una mayor cantidad de LB específicos para el mismo Ag. Los LB en proliferación se llaman centroblastos y forman lo que se conoce como CENTRO GERMINAL . Los centroblastos son LB que ya reconocieron al Ag, no son vírgenes. Por ello los centroblastos no expresan Ig en su membrana. A los centroblastos les ocurre la hipermutación somática y el cambio de clase o isotipo (switch). Estos dos procesos ocurren mientras los linfocitos están dividiéndose. Estos linfocitos van a producir Ac de mayor afinidad, porque sufrieron hipermutación somática, y que pueden ser de distinta clase: IgG, IgA o IgE. El cambio de clase depende de citoquinas producidas por los LTh. Los centroblastos dejan de dividirse en algún momento y se transforman en centrocitos. Los centrocitos ya sufrieron la hipermutación somática y el cambio de isotipo. Pero cuando se produce el fenómeno de hipermutación somática se pueden generar receptores que tengan mayor afinidad por el Ag o menor afinidad por el Ag. Esto es porque las mutaciones son al azar. Es por eso que se produce un proceso de selección de los centrocitos. Por supuesto que sobreviven los más fuertes, por lo que quedan los que tengan mayor afinidad. Para esta selección tienen que interactuar con el Ag. El Ag va a estar pegado a la CDF. Las CDF tienen receptores para el complemento, receptores para el Fc de las Ig, o receptores que pegan al Ag solo. Los Ag pegados a la membrana de las CDF forman como perlitas que se denominan icosomas: acumulo de Ag en la membrana de las CDF. Entonces, el LB a través de su receptor tiene que contactarse con el Ag que está pegado a la CDF. Las que tengan un receptor de alta afinidad se van a contactar fuertemente al Ag. Los de baja afinidad no. Los LB de mayor afinidad se seleccionan y van a poder transformarse en células B de memoria o en plasmocitos de larga vida. Para que puedan hacer esto también necesitan el contacto con los LTh. En resumen, una parte de la vida del linfocito es independiente del Ag, que va desde la célula troncal al LB maduro virgen. Es independiente porque nunca se contacta con ningún Ag. A partir del LB maduro comienzan fases que dependen del Ag. Si un LB no reconoce a ningún Ag tiene un tiempo de vida de 3 a 4 semanas y después muere. -no expresan Ig en su membrana Células plasmáticas -no expresan MHC �solo secretan Ac. -no presentan Ag

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Las células de memoria pueden quedarse en los órganos linfoides secundarios o pueden recircular y volver a otros órganos linfoides secundarios. Estas células de memoria son las primeras que actúan cuando ingresa un Ag por segunda vez y producen sobre todo IgG. Esta es una característica de la respuesta secundaria. Los linfocitos que reconocían al Ag proteicos propios recibían una señal de baja intensidad y se transforman en LB anérgicos. Los LB anérgicos no responden porque no pueden entrar en los folículos primarios; otras teorías dicen que necesitan más concentración de los factores necesarios para que se activen. Uno de ellos se llama BAFF. TERCERA ETAPA: ACTIVACIÓN DE LOS LB Para que un LB se active debe reconocer al Ag y necesita un entrecruzamiento de receptores. Esta interacción envía señales al interior celular. Esta interacción aún no es suficiente, se necesitan señales de otras moléculas que también están insertas en la membrana y que son la CD19, el receptor CR2 y la molécula CD81. En particular, el CR2 es un receptor para una fracción del complemento, la fracción C3d. Si algún microorganismo tiene fijada esta fracción C3d, el LB necesita menos cantidad de Ag para activarse porque estará recibiendo mayores señales. Este receptor es importante en la activación de los LBZM y responde rápidamente a Ag que entran por sangre. Estos LBZM no necesitan de la colaboración T. La activación del LB va a depender del tipo de Ag. Algunos Ag no necesitan la colaboración T, estos son los Ag TI de los cuales hay dos tipos: los Ag TI-1 y los Ag TI-2. De los Ag TI-1 el más conocido es el LPS (el lipopolisacarido) de la pared

Hipermutación somática y aumento de la afinidad de los Ac: La hipermutación somática (HS) es un mecanismo por el cual la porción variable de las cadenas pesadas y livianas de las Ig sufren mutaciones puntuales con una tasa muy alta. Como consecuencia, luego de cada mitosis, la células hijas expresan porciones V(D)J diferentes del LB que les dio origen. Ninguna otra célula somática posee un nivel de mutaciones tan alto como los centroblastos. Este mecanismo constituye la base molecular de un proceso muy ventajoso para el organismo: la generación de Ac de mayor afinidad a medida que progresa la respuesta inmune humoral. Los centrocitos, que se originan de los centroblastos, expresan en su membrana Ig mutadas. Esto significa que expresan Ig distintas de las del LB que reconoció por primera vez al Ag. Como las mutaciones se producen al azar, muchas de ellas son perjudiciales para el LB que las porta ya que, por ejemplo, pueden impedir la expresión de la Ig en la membrana, lo que conduce a apoptosis de la célula B. Otras mutaciones disminuyen la capacidad de reconocimiento del epitope antigénico, lo que provoca también apoptosis celular. Las mutaciones nocivas son frecuentes y por ello en el centro germinal también se encuentran numerosos macrófagos que son los encargados de fagocitar a los centrocitos apoptóticos que se generen. Algunas mutaciones de las porciones V(D)J van a incrementar la afinidad del la Ig por el Ag y serán los LB que han sufrido estas mutaciones los que sean seleccionados en el centro germinal.

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celular de la bacteria. Este Ag puede ser reconocido tanto por otros receptores de la célula B, como por una molécula que se llama CD14. Esta se une a otra que es ligadora de LPS, la LBP, y si el LB tiene su BCR específico para el LPS estas interacciones hacen que se activen, proliferen y produzca IgM específica para el LPS. A su vez, el LPS puede inducir la activación de un linfocito que tenga un receptor para un Ag diferente en esa misma bacteria. Otra vez no es necesario la colaboración T porque las señales que provee el LPS intensifica el resto de las señales. Entonces el LB se activa y puede producir Ac que no son específicos para el LPS, sino para otra proteína de la bacteria. Así, el LPS induce la producción de Ac específicos contra Ag sin necesidad de colaboración T. Los Ag TI-2 son los que tienen epitopes repetitivos, de hidratos de carbono por ejemplo. Pueden ser polisacáridos, fosfatidilcolina, etc. Como tienen muchos epitopes repetidos producen una fuerte señal en el LB y lo activan. Esto es, porque tienen capacidad de inducir entrecruzamiebto del BCR en la superficie del LB1. Los LB que se activan por este tipo de Ag son los LB1. Los LB1 que se activan proliferan y se diferencian a plasmocitos para producir fundamentalmente IgM. Los otros Ag son TD, por ejemplo las proteínas. Los principales linfocitos que responden a este tipo de Ag son los LB2 que sí necesitan la colaboración del LTh. Entonces, el LB2 reconoce al Ag en forma nativa a través de su Ig de membrana. Esto ya le provee al linfocito una primer señal, pero que no es suficiente. El LB2 además tiene la capacidad de poder endocitar el Ag que tiene unido, lo puede degradar y lo puede presentar a un LT. Así, la Ig de membrana del LB2 tiene dos funciones: por un lado reconocer al Ag con entrecruzamiento de receptores necesaria para la activación, y por otro lado lo puede endocitar, procesar y presentar en el contexto de una MHC-II. El LTh está activado porque ya reconoció antes al mismo Ag, aunque no precisamente el mismo epitope que reconoció el LB. El LTh reconoce al Ag que le muestra el LB2 a través del receptor TCR, pero no es suficiente, debe haber interacción con otras moléculas de membrana. Una de ellas, muy importante para todo el proceso es la CD40 del LB2. Esta tiene un ligando en el LTh llamado CD40L.Esta interacción es la que envía la segunda señal al LB2 y es la que hace que en el LB se comience a expresar la molécula IKAM 1. IKAM 1 favorece el contacto con el LTh. El linfocito también va a producir citoquinas durante el contacto que van a actuar sobre receptores del LB. Una citoquina muy importante del proceso es la IL-4. Esta hace que el LB empiece a proliferar: una parte se diferencia a plasmocitos para producir IgM y la otra parte forma el centro germinal. Los LTh también proliferan después del contacto y migran con el LB al centro germinal y se ubican en la periferia. Las citoquinas que intervienen en el cambio de isotipo son IL-5, IL-6 y TGF-β. Estas IL favorecen que se empiece a sintetizar otras Ig. Los centrocitos deben volver a encontrarse con un LTh. Los centrocitos toman el Ag de los CDF, lo procesan otra vez y se lo presentan al LTh. Se vuelven a producir las mismas interacciones: CD40-CD40L, y el centrocito va a poder diferenciarse a célula de memoria o a célula plasmática.

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Parece ser que las interleuquinas que tienen que ver en esto son la IL-4 y la IL-10. La IL-4 favorece a las células de memoria y la IL-10 a los plasmocitos. Las interacciones entre el LB y el LT a través de las moléculas de adhesión es la que se conoce como SINAPSIS INMUNOLÓGICA . Los LB como tienen la capacidad de expresar las moléculas del CMH-II se llaman células presentadoras de antígeno profesionales. Repasando: Vimos que la producción del LB maduro se produce en la médula ósea. Durante todo el proceso el LB va reordenando los genes de las Ig. Reordena primero los genes de la cadena H y después los genes de la cadena L. De los de la cadena L reordena primero los κ y luego los λ. En los LB hay exclusión alélica y siempre se intenta el reordenamiento en un cromosoma y si no es productivo se intenta en el otro. En estos procesos actúan las recombinasas, las SSR, las enzimas TdT que participa solo en las cadenas H. El LB recibe la señal para dejar de reordenar sus genes cuando se comienza a expresar una molécula de membrana. Cuando el LB expresa el receptor pre-BCR cesa el reordenamiento y comienza a proliferar. El receptor pre-BCR está formado por las cadenas pesadas de tipo µ y la cadena liviana sustituta, siempre acompañado por Igα e Igβ. El otro momento donde cesa el reordenamiento es cuando se expresa el BCR que es una IgM acompañado por una Igα e Igβ. En este momento es un LB inmaduro. En el estadío inmaduro se produce una selección para solo sobrevivir aquellos LB que no reconozcan Ag propios. Entonces, si no reciben ninguna señal a través de su BCR pasan a sen LB maduros. Estos van a expresar la IgM y la IgD. Los LB inmaduros que reciben señales muy fuertes e intensas que provienen de Ag propios multivalente de tipo particulado directamente mueren por apoptosis. Pero estos LB tienen la posibilidad de reeditar su receptor: antes de morir pueden intentar un nuevo reordenamiento de sus cadenas L para que no reconozcan Ag propios. Si la señal era débil, producida por los autoantígenos de tipo proteína, el LB se transforma en LB anérgico, un linfocito que no es capaz de responder ante una respuesta inmune. El LB maduro sale de la médula ósea y se dirige a los órganos linfoides secundarios, por ejemplo un ganglio. Aquí puede ser que se encuentre con un Ag o no. Si no se encuentra con ningún Ag permanece un tiempo en el ganglio y luego sale y recircula. Si reconoce a un Ag se activa: por un lado se une al Ag y esto ya le da una señal, y después necesita entrar en contacto con un LTh2, el que le dará la segunda señal para ayudar en la activación. El LB endocita al Ag, lo degrada y lo presenta en una MHC-II, así el LTh lo puede ver. El LTh2 previamente había sido activado por el mismo Ag. Pero para que el LB se active no solo se necesita de la colaboración del LTh, necesita que el LT tenga otras moléculas. Una de ellas es la CD40 del LB que va a interactuar con una CD40L que está en el LT. Cuando se produce esta interacción el LT empieza a producir citoquinas que se llaman interleuquinas. Una importante es la IL-4 que induce la proliferación del LB. El LB prolifera, algunos van a diferenciarse en plasmocitos y van a producir un Ac de clase IgM. Esto es la respuesta primaria. Algunos LB que proliferan van a formar el centro germinal y se van a empezar a dividir otra vez. Se los llama centroblastos, que no tienen Ig en la membrana porque se están dividiendo. Los centroblastos sufren el fenómeno de hipermutación somática y el cambio de Ig o switch. Luego de estos dos

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fenómenos se transforman en centrocitos, que ya no se dividen y van a tener una alta afinidad por el Ag y otros pueden llegar a tener una baja afinidad. En este momento se seleccionan por contacto con el Ag. El Ag va a estar en las CDF de los centros germinales. Las CDF no procesan al Ag, solo lo tienen pegado a la membrana. Este Ag puede estar pegado junto a Ac que lo reconocieron o recubierto por el complemento. El Ag pegado forma los icosomas de la CDF. Los LB que tengan la mayor afinidad por el Ag se lo van a sacar a la célula CDF, lo van a procesar y se lo van a poder presentar a un LTh. Estos son los que van a sobrevivir. Los LB de baja afinidad no van a poder sacar el Ag de la CDF y van a morir por apoptosis. Cuando el LB se contacta con el LTh pueden transformarse en células plasmáticas productoras de Ac o en células de memoria. Las células de memoria pueden salir y volver a entrar al ganglio linfático, las células plasmáticas no pueden recircular. Las células B de memoria son las que actúan ante una segunda entrada del Ag, producen más rápidamente Ac que tienen una mayor afinidad por el Ag, y generalmente son del tipo IgG. Estos LB van a tener como BCR una Ig distinta de la IgM, porque sufrieron el cambio de isotipo.

Activación del los LB2 por los Ag TD: El LB2 para activarse necesita la colaboración T-B, esto se produce mediante reconocimiento ligado. Para la activación del LB se necesitan dos señales: -Primera señal: El LB se une al Ag por el BCR, lo endocita, lo procesa y presenta sus péptidos en el CMH II. -Segunda señal: colaboración T-B. Para que este proceso se produzca los LB y Th2 deben reconocer epitopes antigénicos en el mismo Ag. Esto se denomina reconocimiento ligado. Esto no significa que el LB y LTh2 reconozcan el mismo determinante Ag, de hecho en la gran mayoria de los casos se trata de epitopes diferentes, ya que el LB reconoce el epitope en conformación nativa, mientras que el LT reconoce péptidos presentados y procesados por CMH. Los LTh2 que han sido previamente activados por células dendríticas con el mismo Ag, reconocen el péptido presentado por el CMH II del LB. Este reconocimento se produce gracias a que el LTh2 activado expresará en su membrana CD40L (tipo de TNF-α) que reconocerá de CD40 (tipo de receptor TNF-α) en la membrana del LB. Al producirse la unión LT-LB, el LTh2 va a secretar IL-4 necesaria para la activación del LB. Por lo tanto la activación del LB y el LTh2 es mutua. Cooperación del LTh2- LB en el ganglio. Formación del centro germinal: Los Ag que ingresan en el organismo a través de los tejidos periféricos son endocitados por CPA profesionales, en particular por células dendríticas, que luego los transportan a los ganglios drenantes a través de los linfáticos aferentes. Por su parte, los LT vírgenes ingresan en la zona paracortical de los ganglios atravezando las vénulas del endotelio alto (HEV) y los que reconocen el péptido antigénico presentado adecuadamente por la CPA son retenidos y activados, produciéndose la expansión clonal de estos linfocitos. Los LB vírgenes que ingresan en el ganglio atravezando las HEV son atraidos hacia los folículos primarios por la quemoquina CXCL13 secretada por las células foliculares dendríticas. Cuando el LB virgen del folículo primario entra en contacto con el Ag a través de su BCR, aumenta la expresión del receptor CCR7, específico para las quemoquinas CCL19 y CCL21 predominantes en la zona paracortical T del ganglio linfático e inicia por consiguiente la migración hacia esa región.

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En ausencia de IL-12 en su entorno, los LT que se activaron en respuesta al Ag presentado por la CPA se diferencian a LTh2 y migran hacia el borde del folículo primario. En este sitio interactuan col los LB específicos, se produce la colaboración TB y ambas poblaciones linfocitarias proliferan durante varios días. Alguno de los LB abandonan este primer foco de prliferación y se dirigen a la médula del ganglio linfático diferenciándose en plasmocitos. Estos producen los primeros Ac de la respuesta humoral, que son clase IgM. Otros LB del foco de proliferación migran hacia el exterior del folículo primario ataridos por la quemoquina CXCL13. Una vez en el interior del folículo primario, los LB siguen proliferando en forma muy activa y dan lugar al centro germinal. A estos LB proliferantes se los conoce como centroblastos. Debido a su rápida expansión, desplazan a los LB en reposo que conforman el folículo primario, los cuales se disponen formando la zona del manto alrededor del núcleo de células proliferantes. Los centros germinales están compuestos mayoritariamente por los centroblastos que se disponen formando lo que se conoce como zona oscura. También integran parte del centro germinal LTCD4+ (denominados también LT foliculares) y células foliculares dendríticas (CFD) que proveen las señales estimulatorias necesarias para la expansión y diferenciación de los LB. Las CFD no están relacionadas con las células dendríticas presentadoras de Ag. Cuando los centroblastos dejan de proliferar, se transforman en centrocitos, que junto con los LTCD4 y las CFD conforman la zona clara del centro germinal. Si bien los Ac producidos por el LB del foco primario cumplen un papel protector importante, la diferenciación de los LB en el centro germinal provee al organismo de Ac más eficaces para el control de los patógenos, de mayor afnidad por el Ag y diferente isotipo: hipermutación somática y cambio de isotipo (switch). Diferenciación de los centrocitos en LB de memoria o en plasmocitos: Los centrocitos que han sobrevivido al proceso de selección da lugar a dos tipos de células: plasmoblastos, que abandonan el centro germinal para completar su diferenciación a células plasmáticas productoras de Ig de alta afinidad, y los LB de memoria (LBm). En la diferenciación del centrocito en uno u otro inciden varios factores: 1) La afinidad del BCR por el Ag: a mayor afinidad de la unión tiende a diferenciarse a plasmoblasto. 2) Interacciones entre células T y B durante el proceso de colaboración T-B. 3) Las citoquinas producidas por las células T: IL-10 favorece la diferenciación a célula plasmática, e IL-4 favorece la diferenciación hacia LBm. Los plasmocitos que abandonan el centro germinal migran a la médula ósea y dan lugar a plasmocitos de vida media corta (días) o vida media larga (meses). En una respuesta inmune secundaria, la mayor parte de los Ac séricos provienen de los plasmocitos de vida media larga que siguen produciendo Ac, aún cuando el Ag no esta presente. Los LBm que abandonan el centro germinal recirculan por los tejidos linfáticos secundarios, o hacen homing en estos tejidos y quedan retenidos transitoriamente. La reexposisción al Ag induce una rápida y masiva expansión clonal de los LBm, generándose entre 8 a 10 vaces mayor número de plasmocitos que en la respuesta primaria. Los LBm expresan BCR de alta afinidad por el Ag como consecuencia de su paso por el centro germinal y niveles incrementados de moléculas de clase II del CMH.

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Ambas características contribuyen a que los LBm contacten más rápidamente con los LTh2 activados en comparación con los LB vírgenes en la respuesta primaria. Esto contribuye a que la producción de Ac sea más rápida en la respuesta secundaria. Si los niveles de Ac que persisten en la circulación son suficientemente altos, el reingreso del Ag al organismo no genera una respuesta secundaria, ya que los Ac son capaces de neutralizar al Ag favoreciendo su inmediata depuración por el sistema mononuclear fagocítico. Si los niveles de Ac no son suficientes para neutralizar por completo al Ag, los LBm que expresan BCR de mayor afinidad son los primeros en activarse por el Ag. Esta activación puede dar lugar a una nueva respuesta del centro germinal.

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EL RECEPTOR DEL LT

El TCR siempre va a estar en membrana, nunca se va a secretar como la Ig de membrana del LB. Está constituido por dos cadenas. Hay dos tipos de TCR. Los LT tienen en su mayoría el TCR αβαβαβαβ, que está constituido por una cadena α y una cadena β. Estas cadenas tienen una región variable y una región constante, también una región transmembrana y una pequeña porción citoplasmática. La región transmembrana es muy rica en cargas positivas (+). Las regiones de combinación con el Ag son regiones hipervariables que se encuentran en las regiones variables de las cadenas. Son como las de las Ig: CDR1, CDR2 y CDR3. Son regiones determinantes de complementariedad que les permiten al TCR interactuar con el Ag. Si se compara el TCR se parece al fragmento Fab de las Ig, pero el TCR no está compuesto solo por estas dos cadenas, necesita de una molécula que se llama CD3. El CD3 está compuesto por varias moléculas a su vez. Hay dos heterodímeros que se llaman εδ y εγ, y un homodímero constituido por una molécula llamada ζ. Estas moléculas neutralizan las cargas positivas que tenían las dos cadenas α y β y le permiten una mayor estabilidad. Entonces la función que tienen las moléculas CD3 es la de dar estabilidad al TCR y la de transmitir las señales. El TCR tiene una cola citoplasmática muy corta, entonces la molécula de CD3 va a ayudar a transmitir las señales al interior celular. Hay otros LT que son minoritarios que tienen un TCR de tipo γδγδγδγδ. Estos LT no reconocen a los Ag en el contexto de las moléculas del CMH I y II clásicas; parece ser que reconocen Ag presentados por moléculas no clásicas I b. Estos LTγδ están ubicados en piel, en el epitelio respiratorio, en el epitelio del aparato reproductor y en epitelio intestinal. Actúan ante condiciones de estrés. Se postula que reconocen a las proteínas del shock térmico, que son proteínas que se incrementan en condiciones de estrés. Son los LT que primero se producen en la vida embrionaria y muchos autores postulan que actúan en los mecanismos innatos de la respuesta inmune. Son los análogos a los LB1. Los genes que codifican para estos receptores tienen una determinada estructura en la línea germinal. Después se van reordenando como los genes de las Ig. En estos reordenamientos participan las mismas enzimas recombinasas y también tienen las mismas SSR. Los genes de la cadena α están codificados en el cromosoma 14, y los genes de la cadena β están codificados en el cromosoma 7. Hay genes que codifican para la parte variable y un gen que codifica para la parte constante. Hay también segmentos J que van a estar en las cadenas α y en la cadena β están además los segmentos D. Existen muchísimas más variantes para estos genes que las que existían para los genes de las Ig. Entonces la variedad de receptores TCR es mucho mayor que la variedad de Ig que se pueden producir. Los procesos de reordenamiento se van a producir en forma similar a los genes de Ig. En la cadena β existe el mecanismo de exclusión alélica, si se reordena el gen de un cromosoma no se reordena el gen del otro, pero para las cadenas α no. En las cadenas α se pueden reordenar los genes de las dos cadenas. El reordenamiento empieza por los genes de cadena β, y cuando se reordena este gen en forma exitosa se expresa un receptor que se llama pre-TCR. Este receptor va a estar constituido por una cadena β y por una cadena αααα sustituta. Cuando se expresa este pre-TCR el LT prolifera, dejando de reordenarse.

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Todos estos procesos ocurren en el TIMO . Si bien los LT se originan en médula ósea, van a migrar al timo, que es un órgano linfoide primario porque en él se produce la maduración de los linfocitos. En el timo no entran Ag extraños, es decir, no es un lugar donde se genera una respuesta inmune. El timo tiene solo circulación sanguínea, no hay circulación linfática. Luego, se reordenan los genes de cadena α. Los genes de cadena δ están ubicados en el mismo cromosoma que en el que se encuentran los genes de cadena α, y están en el medio de esos genes. Si se reordenan primero los genes α se excluyen los genes δ. Además del TCR y la molécula CD3, el LT tiene otras moléculas de membrana que son muy importantes para su función. Una de ellas es la CD4 y la otra es la CD8. La molécula CD4 está formada por cuatro dominios semejantes a los de Ig, y la molécula CD8 está formada por dos cadenas: α y β. En estos procesos de recombinación para generar los receptores van a estar los mismos eventos que ocurren en el LB para generar la variabilidad. VARIABILIDAD EN EL TCR Están las distintas posibilidades de recombinación por la gran variedad de segmentos V, D y J. También participa la enzima TdT, es decir, hay adición de nucleótidos en los sitios de unión, pero lo que no ocurre es hipermutación. Entonces, el CD4 se va a unir a las MHC-II, y el CD8 se va a unir al MHC-I. Esto es importante en el proceso de activación de linfocito. El dominio α del CD8 interacciona con el dominio α3 del CMH-I. Estos linfocitos CD8+ son LT citotóxicos. La molécula CD4 va a estar presente en los LTh. El dominio D1 del CD4 interacciona con la cadena β2 del CMH-II. Estas son moléculas co-receptoras que va a ayudar a la activación del LT.

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ONTOGENIA T El LT se produce en médula ósea y luego va al timo. En el timo se forman LT maduros que pueden ir a los órganos linfáticos secundarios. El timo aumenta mucho de tamaño durante la niñez y al llegar a la pubertad comienza a involucionar. La involución del timo no afecta a la inmunidad porque ya se produjeron los LT necesarios para actuar ante la entrada de cualquier agente al organismo. El timo está formado por muchos lóbulos y cada uno tiene una corteza y una médula. La corteza es una zona mucho más compacta, mientras que la médula es más laxa. En la corteza hay células epiteliales corticales y LT en proceso de maduración. En la médula hay células dendríticas, macrófagos y células epiteliales medulares. Las células epiteliales, tanto medulares como corticales, se originan en el propio timo, los macrófagos y las células dendríticas provienen de la médula ósea. En el proceso de maduración de LT se va a producir una migración de los mismos por todos los sectores del timo: por corteza y médula. Durante el proceso de maduración, los LT se van a nombrar según expresen determinados marcadores en su membrana. Cuando no expresan ni CD4 ni CD8 se llaman dobles negativos (DN). El LT va a pasar por tres estadíos de DN hasta que empieza a expresar una parte del TCR en su membrana. En el primer estadío expresa la molécula CD2: DN1. Luego pasa al estadío de DN2, donde sigue expresando la molécula CD2 y empieza a expresar la CD25. La CD25 es la cadena αααα del receptor de IL-2. Después el LT pasa por el estadío DN3, donde comienza a reordenar los genes de la cadena β. Cuando pasa al estadío DN4 ya expresa el pre-TCR. En este estadío el LT prolifera y reordena los genes α. En este momento empieza a expresar CD4 y CD8: doble positivo (DP). En el estadío DP se expresa CD4, CD8 y un TCR. En este momento el LT sufre unos procesos que le permiten reconocer MHC propias, y que no reconoce Ag propios. Son procesos de SELECCIÓN POSITIVA Y NEGATIVA . En el estadío DP, cuando expresan CD4 y CD8, sufren una selección positiva que le permitirá al LT reconocer MHC propias, condición para que el LT se active. Esta MHC se las muestran las célula de la corteza tímica. Le muestra péptidos propios, provenientes del propio timo, los que las reconocen van a sobrevivir, los que no mueren por apoptosis. Aquellos DP que reconocen un péptido en el contexto del CMH-I dejan de expresar la CD4, y expresan solo CD8. A partir de este momento pasan a ser simples positivos (SP). Los DP que reconozcan al péptido presentado en el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4. Van a ser LTh . Luego se produce el proceso de selección negativa, por el cual los SP que reconozcan Ag propios son eliminados por apoptosis. Los que no los reconocen sobreviven. Las teorías sobre estas selecciones positivas y negativas postulan que hay diferencias en la intensidad del reconocimiento. Cuando el reconocimiento es muy fuerte, el LT es seleccionado en forma negativa. Cuando hay pocos péptido el LT se selecciona de forma positiva. Otros autores indican que dependen de las señales que se transmiten al interior celular, o al péptido al cual se unen.

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ACTIVACIÓN DEL LT

Los LT maduros salen del timo y se dirigen a un ganglio linfático. Entran por las vénulas del endotelio alto y se ubican en una zona propia de los LT. Si el LT no encuentra ningún Ag en esa zona sale por los vasos linfáticos y vuelve a circular. Si encuentra algún Ag, se va a activar, va a proliferar y se va a transformar en LT efector. Para salir de los vasos sanguíneos, los LT sufren los mismos procesos que los macrófagos. Es un proceso de varias etapas en el que intervienen varias moléculas que tiene el LT en su membrana y moléculas que van a expresar las células endoteliales. Las células endoteliales de los vasos del endotelio alto tienen una molécula llamada GlyCAM 1 y la CD34. Estas dos moléculas reciben la denominación de adhesinas vasculares. Las adhesinas vasculares no aparecen en otros endotelios. Estas permiten el pasaje solo de linfocitos. Las moléculas del LT que interactúan con las adhesinas vasculares son las L-selectinas. La L-selectina uniéndose a una u otra de estas moléculas hace que el LT ruede por el endotelio. A su vez el LT tiene receptores para factores quimioatractantes. Un receptor se llama CCR7, que se une a las quemoquinas que está produciendo la célula endotelial. Esta quemoquina es la CCL21. Cuando interactúa CCR7 con CCL21, se produce una adhesión más fuerte del LT con la célula endotelial, que está mediada por otras moléculas: la LFA-1 del LT y la ICAM-1 de la célula endotelial. En este momento el LT se frena y empieza a pasar por células endoteliales por diapédesis y migra hacia el interior del ganglio. Esto está todo mediado por las quemoquinas que están produciéndose en el ganglio. Dentro del ganglio si el linfocito se topa con un Ag para el cual tiene un receptor lo va a reconocer. Este Ag va a estar presentado por macrófagos, células dendríticas y los LB. Las células dendríticas son muy importantes en la activación, porque estas células pueden migrar, así pueden llegar al ganglio desde otros lugares del cuerpo. Por ejemplo, las células de Langerhans en la piel son células dendríticas, si algún Ag entra por la piel, estas células lo pueden captar y lo pueden llevar hasta el ganglio. Estas células son inmaduras al captar el Ag, luego de capturarlo lo procesan y llegan al ganglio donde se transforman en células maduras que tienen disminuida la capacidad de captar Ag, pero tienen muy aumentada la capacidad de presentarlos, expresando muchas moléculas del CMH tanto de clase I como de clase II. Estas células también pueden ser infectadas por virus, entonces van a presentar Ag virales en el contexto de las MHC-I. Los macrófagos, que son muy buenos para presentar Ag a los LT vírgenes, son los que están en el ganglio. Los macrófagos que están en los tejidos periféricos son células residentes, no pueden migrar, entonces solo van a actuar con LT efectores. Entonces las células más importantes para presentar Ag a los LT vírgenes son las células dendríticas. Se necesita una colaboración estrecha entre el LT y la célula que le presenta el Ag. Esta unión estrecha se produce a través de distintas moléculas de adhesión. La célula dendrítica expresa varias moléculas que se tienen que unir a varias moléculas del LT. Estas uniones son necesarias para que el LT pueda “inspeccionar” toda la membrana de la célula dendrítica o de la CPA buscando si hay algún complejo de MHC que pueda reconocer. Por lo tanto, primero se tiene que producir la interacción entre las moléculas de adhesión de la CPA y del LT. Así, el LT puede “ver” si en la

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CPA hay algún Ag que él pueda reconocer. Si hay algún complejo MHC-péptido, se une. Esta unión envía señales al interior celular. Si el LT es un CD4+ o helper se va a unir la molécula de CD4 a la MHC-II. Pero esto no alcanza para que el LT se active, se necesita otra interacción más, mediada por otra molécula que es la molécula CD28 que está en el LT. Se tiene que unir a una molécula que está en la CPA que se llama B7. La B7 puede denominarse también CD80 o CD86, o B7.1 o B7.2. Sin la señal de la molécula B7 el linfocito no se activa. Las moléculas B7 normalmente no se expresan. Para que se expresen el macrófago o la célula dendrítica debe haber reconocido algún agente extraño. Esto es una manera de control de la activación, sino los LT se estarían activando continuamente. Esto, de que se necesitan tantas señales pasa con los LT vírgenes, es decir, LT que nunca vieron un Ag. Para los LT efectores que se generan después del proceso de activación, las señales que se necesitan no son tan fuertes, y no se necesita de la molécula B7. Repasando: Los LT maduraban en el timo para que al salir fueran LT capaces de reconocer las MHC propias, que es la condición necesaria para que se genere la respuesta inmune, pero que no reconocieran Ag propios. Para que se logre esto a los LT les pasaba dos cosas: primero un proceso de selección positiva y después un proceso de selección negativa. En la selección positiva seguían madurando los que reconocían MHC propias, y en la selección negativa morían por apoptosis los que reconocían Ag propios. Durante el proceso de maduración en el timo los LT van expresando distintas moléculas en sus membranas, pasando por distintos estadíos: cuando no expresaban ni CD4 ni CD8 se llaman DN, después empiezan a expresarse las dos, entonces se llaman DP. Cuando experimentan el proceso de selección positiva, donde reconocen MHC propias, dejan de expresar una de las dos moléculas. Las que reconocen el CMH-I dejan de expresar CD4 y expresan solo CD8. Los que reconocen el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4. CMH-I expresa CD8 CMH-II expresa CD4 Durante este proceso de maduración se van recombinando los genes para poder expresar el TCR. En este proceso participan las mismas enzimas que participan en el LB: las recombinasas. Las cadenas que componen el TCR también tienen una parte constante y una parte variable. También existen mecanismos que permiten aumentar la diversidad de estos receptores. Por ejemplo, hay muchos segmentos que codifican para cada gen, se adicionan nucleótidos por la TdT, todo esto aumenta la variabilidad. Después de todo el proceso de maduración en el timo, que se van produciendo en las distintas zonas del timo, algunas se producen en la corteza y otras en la médula, se generan entonces LT capaces de reconocer Ag. Los LT maduros van a los órganos linfoides secundarios, por ejemplo el ganglio linfático, al cual entran a través de las vénulas del endotelio alto. Este es un mecanismo de reconocimiento sobre las células endoteliales y que los LT expresan en su membrana,

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después la diapédesis y la migración. Una vez en el ganglio linfático, si el LT encuentra un Ag se puede activar. Este Ag debe estar presentado por una CPA: células dendríticas, macrófagos o los LB. Para que el LT se active es necesario el contacto con la célula que le presenta ese Ag, y ese contacto se hace a través de moléculas de membrana del LT y de la CPA. LT CPA CD2 LFA-3 LFA-1 ICAM-1 LFA-2 ICAM-2 ICAM-3 DC SING Esta interacción va a permitir al LT recorrer toda la célula y ver si hay algún complejo péptido-MHC que pueda reconocer a través de su TCR. Si hay alguna molécula que el LT pueda reconocer, se genera una primera señal de activación, aunque no es suficiente para que el LT se active. Necesita la presencia de otra molécula co-estimulatoria que es la B7 de la CPA, y que se une a la CD28 del LT. Esta interacción es condición indispensable para que el LT virgen se active. La molécula B7 no la expresan todas las células, solo las CPA. Es decir, las dendríticas, los macrófagos y los LB. La expresan cuando existen condiciones de infección o ante la presencia de un patógeno. Esta interacción es necesaria para que se transmitan señales al interior celular. Estas señales van a estar mediadas por distintas fosforilaciones de diferentes proteínas, que lo que va a hacer es inducir la síntesis de ciertos factores de transcripción, entre los cuales están NKF-β y AP-1. Estos factores de transcripción lo que van a hacer es estimular la síntesis de IL-2, y del receptor de alta afinidad de IL-2. La IL-2 induce la proliferación celular. �la misma CPA tiene que mostrar el Ag en la MHC y además proveer la señal co-estimulatoria de la B7. Esto ya no es necesario cuando el LT es un linfocito efector.

�el LT efector no necesita de la interacción con B7. Es decir, cuando ya sufrió un impacto con el Ag, para un segundo encuentro con el mismo Ag no necesita de esta interacción. Cuando el LT se activa empieza a expresar una molécula que se llama CTLA-4. Esta molécula es muy parecida a CD28, y también se va a unir a B7, pero tiene una función contraria: inhibe la proliferación celular. Lo que inducía la proliferación celular es la IL-2. Entonces la interacción entre CTLA-4 B7 inhibe la proliferación celular. Esta es una forma de control, porque sino el LT estaría proliferando independientemente. Entonces, una vez que el LT se activa, para controlar su propia proliferación empieza a expresar CTLA-4. Los vírgenes no la expresan.

Presencia de un agente extraño

Síntesis de B7 en la CPA

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Ahora, los LT pueden ser de dos clases: CD4+ y CD8+. Los CD4+ son los LTh o colaboradores, y los CD8+ son los citotóxicos. El mecanismo de activación es distinto para cada tipo de linfocito, pero el CD8+ tiene la particularidad de que necesita señales co-estimulatorias. Esto es porque la acción que ejerce el CD8+ es mucho más drástica que la del CD4+: va a matar a las células infectadas. Es por eso que necesita una mayor acción de las moléculas co-estimulatorias. El linfocito CD8+ se va a poder activar de tres formas diferentes: 1) Una célula dendrítica infectada por virus que expresa en su membrana una MHC-I con un péptido. Cuando los Ag son intracelulares el virus se comportaría como una molécula propia, y son presentados en el contexto del CMH-I. La célula dendrítica infectada por virus además expresa mucha cantidad de moléculas B7, las cuales inducen una fuerte señal para que el linfocito CD8+ se active. 2) Puede ser que la célula dendrítica no exprese muchas moléculas B7. Esta célula muestra un péptido en el contexto del CMH-II y es reconocido por un LTCD4+. El LTCD4+ ya ha sido previamente activado, es un linfocito efector. Este LT va a secretar citoquinas que van a actuar sobre la célula dendrítica y van a hacer que esta célula dendrítica exprese la molécula B7. Ahora la célula dendrítica está en condiciones de activar al LT CD8+ que estaba unido al péptido que se le estaba presentando. Esta activación induce la producción de IL-2 y el receptor de IL-2. 3) Por ultimo, puede interactuar un LTh virgen. Este LT CD4+ va a activarse cuando la célula dendrítica le muestra la molécula B7. No hay muchas moléculas B7, por eso el LT CD8+ no se puede activar. Entonces se activa el LT CD4+ virgen, este empieza a producir IL-2 que va a actuar sobre el LT CD8+ y lo va a activar haciendo que prolifere. FUNCIONES EFECTORAS DE LOS LT Los LT CD8+ son los citotóxicos, van a actuar en las infecciones virales, y su función va a ser la de destruir células infectadas por virus. Para ello debe activarse, luego puede salir del ganglio (todos los procesos de activación de los LT vírgenes se producen en el ganglio). Los que salen del ganglio son los LT CD8+ y algunos LT CD4+ que son los LTh1. Los LTh2 se quedan en el ganglio linfático ya que son los que estimulan a los LB. El LT CD8+ efector no necesita la colaboración de la molécula B7 para actuar. Si reconoce una célula que está infectada por un virus, la cual está expresando un péptido viral en el contexto del CMH-I, se va a volver a activar y va a ejercer sus funciones efectoras. El LT sintetiza unas proteínas y las almacena en unos gránulos. Estas proteínas son las perforinas y las grazimas. Cuando se produce la interacción de su receptor con el péptido presentado por la MHC-I, y además hay interacción con otras moléculas de membrana, se necesita un contacto íntimo, el LT libera éstas enzimas, las perforinas y granzimas, se produce la exocitosis de los gránulos. Para explicar este proceso, algunos autores postulan que primero se libera la perforina, la cual se polimeriza y forma poros en la membrana de la célula. Luego entran las granzimas y son las que inducen la apoptosis. Otros autores dicen que se liberan en forma de complejos las perforinas y las granzimas. Son endocitadas por la célula diana, después las perforinas perforan las membranas de las vesículas endocíticas y se liberan las granzimas.

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El mecanismo, en definitiva, se polimeriza y forma poros en la membrana. A través de estos poros penetran las granzimas, que son proteasas que van a actuar sobre distintos sustratos y se generarían moléculas que activan a las DNAasas. Entonces, se produce el clivaje del DNA de la célula diana o blanco, que en este caso está infectada por virus. Entonces esta célula entra en apoptosis. Algunos textos también dicen que las perforinas lisan las células por permitir el ingreso de líquido al interior celular. Los LT CD8+, una vez que liberaron el contenido de sus gránulos, se desprenden de la célula diana y pueden ir a actuar sobre otra célula vecina que también esté infectada por virus. Los LT CD8+ también expresan el ligando Fas. La interacción entre una molécula Fas, que está expresada en la célula blanco, y el ligando Fas induce la apoptosis de la célula que expresa Fas. �LT CD8+ expresa ligando Fas esta interacción induce la apoptosis de la célula Célula diana expresa Fas infectada por virus. Además, el LT CD8+ puede producir citoquinas: INF-γ, TNF-α y TNF-β. El INF-γ tiene un efecto antiviral y además activa a los macrófagos. El TNF-α y el TNF-β pueden inducir apoptosis celular y también actúan sobre las células endoteliales alterando su permeabilidad. Los LT CD4+ vírgenes también se denominan LTh0. Luego de impactar con el Ag van a diferenciarse en dos poblaciones: LTh1 y LTh2. Estas dos poblaciones van a tener funciones diferentes y producen distintas citoquinas. Ambas poblaciones se autorregulan: las citoquinas que producen los LTh2 inhiben a los LTh1 y viceversa. El proceso de activación es el mismo. Para que se diferencien a Th1 o Th2 tienen mucho que ver las citoquinas del entorno. Para que el LT se diferencie a Th1 son muy importantes la IL-12 y el IFN-γ, para que se diferencien a Th2 es muy importante la IL-4. Por lo tanto, para que se diferencien hacia un perfil o hacia otro, un factor clave son las citoquinas que existen en el entorno durante su activación. Los LTh1 se llaman comúnmente linfocitos inflamatorios. Son los que participan en las respuestas mediadas por células, y son fundamentales en las repuestas inmunes contra Ag intracelulares. Los LTh2 actúan contra Ag extracelulares, y participan en las respuestas de tipo humoral: respuesta inmune humoral. Son los que participan en la producción de Ac. El LTh1 fundamentalmente activa macrófagos. El macrófago capta un Ag, lo endocita, lo procesa y lo presenta en el contexto con la MHC-II. El LT además necesita del contacto con la molécula CD40. Entonces, hay interacción MHC-II-péptido con TCR y CD40 con CD40L. Luego de esta interacción el LT libera sus citoquinas: INF-γ, GM-CSF (factor de crecimiento de granulocitos y monocitos), TNF-α, IL-3 e IL-2. La IL-2 va a hacer que el LT pueda proliferar. Estas citoquinas incrementan la actividad microbicida o bactericida que tiene el macrófago. El macrófago de por si, en forma natural, tiene esta actividad. Cuando actúa en la respuesta inmune no hay LT efectores, pero el macrófago actúa igual. En la respuesta específica esta actividad se incrementa mucho. Si el macrófago no puede

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eliminar el agente que fagocitó, puede ser destruido por el TNF-β o del FasL. Es decir, que los LTh también pueden llegar a comportarse como citotóxicos. Producen IL-2 que induce la proliferación celular. La IL-3 y el GM-CSF actúan sobre la médula ósea y van a inducir la producción de más monocitos después que después se van a diferenciar a macrófagos. El TNF-α va a estimular la migración de los macrófagos a través del endotelio, y también se va a secretar la quemoquina CXCL2 que va a favorecer la llegada de más macrófagos al sitio de infección. Para que el macrófago se active debe interactuar la molécula CD40 con el ligando del LT, además de la unión al Ag. El LTh2 reconoce el mismo Ag que el LB que está activado. El LB reconoce un Ag por la IgM de su membrana, lo endocita, lo procesa y lo presenta al LTh2. El LTh2 previamente fue activado con el mismo Ag, aunque no necesariamente reconozca el mismo epitope que el LB. Se necesita también la molécula CD40 y el CD40L. Entonces, el LB se activa y pasa a plasmocito o a célula de memoria. Las citoquinas que producen los LTh2 son los IL-4, IL-5, IL-15, IL-10, TGF-β. Todas ellas intervienen en la diferenciación de los LB a plasmocitos y en el cambio de isotipo.

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RESPUESTA INMUNE HUMORAL ESPECÍFICA

Es la que está mediada por Ac. Van a actuar eliminando patógenos extracelulares y evitando la diseminación de los intracelulares. Los patógenos intracelulares para infectar otras células deben estar un tiempo en los fluidos, en ese momento pueden actuar los Ac. FUNCIÓN DE LOS Ac Los anticuerpos son inmunoglobulinas. Estos pueden inactivar toxinas, pueden neutralizar virus. Esto es por la unión de Ac con virus o toxinas a través del Fab. También tienen otras funciones mediadas por el Fc, que está formado por las cadenas H de la Ig. Una de las funciones del fragmento Fc es la de activar el complemento. El complemento puede activar la lisis celular, puede participar en la quimiotaxis porque cuando se activa el complemento se generan unas moléculas: C3a y C5a que tienen la capacidad de atraer neutrófilos o macrófagos. Cuando se activa el complemento también se generan otros fragmentos como el C3d y el C3b que tienen función de opsoninas, es decir recubren a los patógenos y permiten que sean más fácilmente fagocitadas. Los Ac también pueden opsonizar, que es recubrir por ejemplo una bacteria de Ac y facilitar su fagocitosis por un macrófago que tiene receptores para el Fc. También participan de un mecanismo llamado citotoxicidad anticuerpo dependiente (ADCC). El mecanismo también destruye células, pero no es producido por los LT CD8+, es producido por las NK, los macrófagos o los eosinófilos. FASES DE LA RESPUESTA HUMORAL Se puede dividir a la respuesta humoral en dos fases: la inducción de los Ac y la efectora (acción de los Ac). La fase de inducción de la producción de Ac tiene como primer punto la activación de los LTh vírgenes: • El LTh virgen debe unirse a la CPA que presenta el péptido en el contexto del CMH-II. La CPA fagocitó una bacteria extracelular, la procesó, la degradó y le presentó un péptido al LTh 0. El LTh 0 lo reconoce a través de su TCR (del tipo α−β) acompañado de la molécula CD3 (que estabilizó al TCR, permite que se exprese en membrana y participa en la transducción de señales), de la CD28 que se combina con B7, y el CD4 que reconoce a la MHC-II. Entonces el LTh2 se activa. Esto se produce en la corteza del ganglio. • Un LB, que reconoce al mismo Ag que el LTh2, tiene un BCR que es una IgM ya que el LB es virgen, acompañado de Igα e Igβ. El LB reconoce el Ag, lo endocita, lo procesa y lo presenta en la MHC-II. • El LB interactúa con el LTh2 que había sido activado, ya que los dos reconocen el mismo Ag, se produce una interacción en la cual es importante la molécula CD40 del LB y la CD40L en el LT. Esto es para que el LB pase a plasmocito y produzca Ac.

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El LB prolifera porque el LT produce citoquinas: IL-4, IL-2, IL-10 e IL-5. Los primeros Ac que se van a producir son de tipo IgM. Todos estos procesos ocurren en la corteza del ganglio linfático. Parte de los LB que proliferan se van a ubicar en un folículo secundario donde se forma el centro germinal y los LB van a llamarse centroblastos y van a proliferar. Van a sufrir hipermutación somática y el cambio de isotipo. Los LB luego son seleccionados por las CDF, que tienen pegado en su membrana al Ag. Los LB que tenían mayor afinidad seguían proliferando y pueden pasar a plasmocitos productores de Ac o células de memoria. Los LB de memoria pueden expresar en la membrana IgM o IgG. Los plasmocitos no presentan ninguna Ig en su membrana, solo secretan Ac. Todo esto es para los Ag-T-dependientes, que son proteínas fundamentalmente. Estos Ag-T-dependientes tienen una respuesta que se caracteriza porque tiene memoria, va a haber maduración de afinidad y también se van a producir Ig distintas de la IgM. Para los Ag-T-independientes, que no son proteínas sino polisacáridos y lipopolisacáridos, que tienen epitopes repetitivos, para ellos no hay memoria, no hay maduración de afinidad y solamente se producen Ac IgM. Ante la entrada de un Ag se va a producir la respuesta primaria, que es la respuesta que se produce cuando entra el Ag por primera vez; es básicamente de IgM al principio, luego puede producirse algo de IgG. La respuesta secundaria se produce cuando entra por segunda vez el Ag, que es más rápida, más intensa, y se generan una gran cantidad de IgG. Ante esta segunda entrada del Ag se van a impactar las células de memoria.

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RESPUESTA INMUNE CELULAR

A) INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS FAGOCÍTICAS Las células fagocíticas son los neutrófilos y los macrófagos. Estas células participan en los mecanismos innatos, y los macrófagos son el nexo entre la inmunidad innata y adaptativa, porque además de fagocitar, los macrófagos tienen la capacidad de presentar Ag. 1)El primer paso es la quimiotaxis, es decir llegar al sitio de infección o al sitio de entrada de un agente agresor. Se sienten atraídos por péptidos que producen las propias bacterias, son péptidos cortos derivados de proteínas bacterianas, y generalmente son péptidos formilados. También pueden llegar por acción de las moléculas C3a y C5a que se generan cuando el complemento se activa por cualquiera de las tres vías. 2)Después necesitan unirse al agente agresor, por lo tanto lo tienen que reconocer, y lo reconocen a través de receptores que tienen los neutrófilos y los macrófagos. Estos receptores reconocen patrones moleculares conservados en los patógenos, Pueden reconocer lectinas, y también están los receptores toll. Pero también pueden reconocer moléculas propias del organismo, como las Ig, ya que tienen receptores para el Fc. Es por eso que si hay una bacteria recubierta por una Ig el macrófago la puede reconocer y fagocitar. También tienen receptores para la molécula C3b del complemento. 3)Una vez fagocitado el patógeno puede ser destruido por dos mecanismos, algunos que degradan el O2 y otros que no dependen del O2. Los mecanismos dependientes del O2 abarcan los intermediarios reactivos del O2 (ROI) y los intermediarios reactivos del N2 (NOI). En los NOI se genera NO que es tóxico para la célula, y en el ROI se genera el H2O2. Los mecanismos dependientes del O2 se conocen también como “estallido respiratorio”. En los mecanismos independientes del O2 alteran la membrana de la bacteria. Las defensinas, las catepsinas y la lisozima actúan alterando las membranas de las bacterias, y la lactoferrina lo que hace es secuestrar Fe (hierro) que es indispensable para el desarrollo del microorganismo. El macrófago tiene un lugar preponderante en la respuesta inmune, porque no solamente participa en los mecanismos innatos, sino que es el nexo para que se generen las respuestas adaptativas, ya que es una CPA. Por lo tanto, en la fases iniciales el macrófago no está activado, pero igualmente tiene capacidad para fagocitar y destruir microorganismos. En la fase efectora, cuando ya se generan los LTh, este macrófago se puede activar y se estimula mucho más sus funciones microbicidas. El macrófago produce la IL-1, la IL-6 y el TNF-α que inducen el aumento de la temperatura corporal y la síntesis de proteínas de fase aguda.

B) INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS T Los LT son los que determinan la especificidad de la respuesta ya que reconocen un Ag específico, y también eligen el mecanismo por el cual el Ag va a ser eliminado. Los

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CD8+ va a eliminar las células infectadas por virus. Los CD4+ van a participar ya sea colaborando con los LB o activando los macrófagos.

C) CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CÉLULAS En este se destruye la célula infectada y se puede llevar a cabo por varios mecanismos. Un mecanismo directo específico es el mediado por LT CD8+. Hay otras células que pueden ejercer citotoxicidad pero de manera inespecífica, estas son las células NK o Natural Killer , son linfocitos granulares grandes. No tienen ni marcadores T ni marcadores B. Actúan en la inmunidad innata, en los primeros mecanismos de defensa. Pueden destruir células infectadas por virus u otros agentes intracelulares. También tienen gránulos donde almacenan perforina y granzima. Tienen receptores KIR que inhiben la activación de la célula NK. Detectan cuándo son normales o hay una disminución en el número de MHC. Tienen varios receptores, algunos, como el NKR-P1, puede reconocer alguna glicoproteína en una célula infectada, una glucoproteína anómala. Están los otros receptores NKG-2, que están unidos a una MHC y por lo tanto la célula NK no se activa. Es decir, que estos receptores ejercen una señal inhibitoria. Si en cambio esta célula que está infectada por un virus deja de expresar la MHC, o expresa otras moléculas distintas, cambiadas, los receptores que protegían a la célula de la activación no funcionan, entonces la célula NK se activa y puede producir la lisis de la célula infectada. Las células NK pueden participar en el mecanismo de ADCC. Las células NK tienen receptores para el Fc, y tienen la particularidad de unirse a la IgG cuando está unidada a un Ag. Entonces si una célula es reconocida por Ac que se fijan a su membrana celular, y como la célula NK tiene receptores, se induce a la célula NK a la activación y liberación de sus gránulos que puede conducir a la lisis de la célula infectada. Este mecanismo también lo pueden llevar a cabo los macrófagos y los eosinófilos. Los eosinófilos a través de la IgE, el macrófago y la célula NK a través de la IgG.

La actividad de las célukas NK está regulada por diversos receptores expresados en su superficie. Algunos de ellos son receptores inhibitorios que disparan señales intracelulares que mantienen a las células NK en reposo, sin desarrollar su actividad citotóxica ni secretar citoquinas. Otros, los receptores estimulatorios, disparan señales intracelulares de activación de las células NK. Un delicado equilibrio establecido entre señales inhbitorias y activadoras determinará, en última instancia, si la célula NK permanece en reposo o activará su poderoso arsenal citotóxico antimicrobiano y antineoplásico. Este equilibrio puede ser alterado en el transcurso de un proceso infeccioso. Un patógeno podrá transformar una célula del huésped en un blanco potencial de las células NK por dos mecanismos: - stimulando la expresión en la célula diana de ligandos para los receptores activadores de las células NK. - Inhibiendo la expresión en la célula diana de ligandos para los receptores inhibitorios de las células NK. Los ligandos de receptores inhibitorios mejor conocidos son las moléculas de clase I del CMH. Su reconocimiento por parte de los receptores inhibitorios evitará que las NK destruyan células normales. En cambio, células infectadas o neoplásicas, que

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D) CÉLULAS NKT Son células que tienen receptores T de cadenas α, β y además marcadores de células NK. Tienen la particularidad de que no reconocen a los Ag a través de la MHC de clase II o I, sino que reconocen glucolípidos presentados por la molécula de histocompatibilidad CD1d. Lo que hacen es producir citoquinas. Existen dos tipos de células NKT, de acuerdo a si expresan o no la molécula CD4 en su membrana. Las células NKT CD4+ van a estimular con sus citoquinas a los LTh2. Las células NKT CD4– van a estimular con sus citoquinas a los LTh1.

suelen expresar menores niveles de moléculas clase I del CMH (como consecuencia de la infección o de la neotransformación) desencadenarán una señalización intracelular de menor intensidad, lo que permite en estos casos que prevalescan las señales de activación desencadenadas por lo receptores correspondientes. Esta ausencia de señales inhibitorias mediada por moléculas de clase I del CMH inclina la balanza hacia señales que activan a las NK. Las células NK realizan un control permenente de los niveles de expresión de moléculas de clase I del CMH en las células del organismo y se activan cuando estos niveles disminuyen.

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MECANISMOS REGULATORIOS DE LA RESPUESTA INMUNE

Los mecanismos de regulación no están totalmente dilucidados, y son bastante complejos. En él intervienen todas las células del sistema inmune. El sistema inmune puede interaccionar con otros sistemas: nervioso, neuroendócrino. Es decir, que hay muchos factores que influyen en cada uno de estos procesos, y es por eso que los mecanismos no están completamente establecidos. Además muchas funciones de la células se han determinado en cultivo in vitro, que no es lo mismo que lo que puede ocurrir in vivo. Aún así existen algunos factores que intervienen: EL ANTÍGENO Si tenemos mucha cantidad de Ag el sistema inmune va a actuar y se va a generar una buena respuesta. � A mayor cantidad de Ag mayor respuesta para tratar de eliminarlo. Si hay una mezcla de Ag, algunos pueden potenciar la respuesta de otros menos inmunogénicos, pero también puede ocurrir que algunos Ag inhiban los receptores de otros. Lo mismo ocurre en una molécula. En una molécula puede haber epitopes que induzcan una mayor respuesta, y esos epitopes pueden hacer que sean disminuidas las respuestas hacia otros epitopes. � En una mezcla un Ag puede disminuir la respuesta hacia otro Ag. � Un epitope en una molécula ejerce un efecto negativo sobre la generación de una respuesta contra otro epitope. Por ejemplo, si se quieren obtener Ac contra el Fab de la IgG, se puede inmunizar a un animal con la IgG entera o con el Fab. Cuando se inmuniza con la molécula entera a un animal se obtienen los Ac contra todos las partes de la Ig. Si inmunizamos solo con el Fab se obtendrán Ac contra el Fab. � En la inmunización con la molécula entera se obtienen menos Ac anti-Fab que si se inmuniza con el Fab solo. Esto da una idea que los epitopes del Fc pueden estar modulando en forma negativa la respuesta hacia los otros epitopes. Esto tiene que ver con la INMUNODOMINANCIA . Está determinada por: • El número de LB capaces de reconocer un determinado Ag o un determinado epitope. • La afinidad del BCR por el epitope. • La protección que la Ig de membrana (BCR) le otorgue al Ag. Cuando el LB le presenta un Ag al LT, primero reconoce al Ag y después lo engloba. La unión del BCR al Ag puede proteger algunas regiones del Ag, justamente los que están unidos al BCR. Entonces puede ser que las enzimas que lo tienen que degradar no actúen. • La competencia de los péptidos generados por unirse a la MHC. Las MHC tienen una unión al péptido de tipo degenerada, es decir, que pueden unir muchos péptidos. Si esos

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Ag tienen determinadas secuencias que pueden ser más accesibles a las proteasas que los degradan, se van a formar más péptidos con mayor afinidad por las MHC (“se degradan más fácil y son más rápidamente presentados”). Entonces van a haber: Epitopes dominantes: se unen con mayor facilidad a las MHC (se unen más y mejor). Epitopes subdominantes: van a tener una capacidad de unirse intermedia. Epitopes crípticos: no se unen a la MHC o se unen muy poco y por lo tanto no son presentados. Cuando se elaboran vacunas se deben tener en cuenta estas características. En cuanto al tipo de Ag, los extracelulares o solubles van a tender a producir respuestas mediadas por Ac. Si los Ag son intracelulares las respuestas van a estar mediadas por células. La dosis del Ag es muy importante. Si se inoculan altas dosis se puede generar en vez de respuesta, TOLERANCIA . Esto depende en particular de cada tipo de Ag. Otro punto importante es la vía de administración. Las vías que más respuesta generan son las intra dérmica y la subcutánea. La vía intravenosa también puede generar una buena respuesta pero si no se inoculan cantidades muy grandes, ya que se generaría tolerancia. La vía oral de administración generalmente produce tolerancia. Esto puede deberse a una inadecuada presentación antigénica, en este caso los enterocitos pueden presentar Ag, pero no pueden suministrar la segunda señal co-estimulatoria, no tienen la molécula B7 y por lo tanto no se van a activar los LT adecuadamente. También puede deberse a que se activen LT reguladores. Todo depende del tipo de Ag EL ANTICUERPO La unión de los Ac debe diferenciarse en lo que hace una IgG de lo que hace una IgM. Elevadas concentraciones de IgG inhibe la respuesta. Esto es porque la IgG compite por el Ag con los receptores de membrana de los LB. Es decir, mucha IgG circulante no va a dejar Ag libre para que se unan a los BCR. Entonces solo se van a poder activar los LB que tengan mayor afinidad. Con la IgM ocurre un fenómeno del cual no se conoce muy bien su causa, pero si se inocula un Ag con un Ac monoclonal IgM específico para este Ag, se estimula la respuesta. Esto se puede dar por dos mecanismos: una de formación de redes idiotipo-antiidiotipo, o por una mayor estimulación de las CPA. Estos dos mecanismos se postulan pero no se pueden explicar aún. EL COMPLEMENTO El complemento va a actuar en varias etapas de la respuesta inmune. En la respuesta innata, cuando el complemento se activa por las lectinas o por la vía alterna, va a generar moléculas como C3a y C5a que tienen actividad quimiotáctica, esto es, que

Tolerancia: es la capacidad específica y adquirida por el sistema inmune para no responder a uno o más Ag, mientras mantiene su capacidad para responder a todos los otros.

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pueden llegar mayor cantidad de neutrófilos y macrófagos al sitio de ingreso del agente agresor. Así está modulando de algún modo la respuesta. También cuando el complemento se activa puede generar C3b, que puede unirse a los patógenos, proceso de opsonización, y favorece la fagocitosis. También se puede generar C3d, que puede unirse a los Ag. La unión de un Ag recubierto por C3d puede estimular una segunda señal en un LB y puede activarlo. Por ejemplo, el BCR se une al Ag, si ese Ag está unido a C3d, C3d se une a la molécula CD21 del LB e induce su activación. En este caso no se necesita del LT. Así, el complemento está actuando en la inmunidad inespecífica y en la inmunidad adaptativa. LOS INMUNOCOMPLEJOS Son complejos formados por uniones Ag-Ac. Pueden actuar de distintas formas. Se pueden formar inmunocomplejos con exceso de Ag o con exceso de Ac. Los inmunocomplejos con exceso de Ag tienen la función de activar el complemento. Cuando esos complejos están con exceso de Ac pueden favorecer la fagocitosis. Pero también la formación de estos complejos puede causar la inhibición de la respuesta. Por ejemplo, una IgG se une a dos Ag. Esta IgG se puede unir a un receptor para su Fc de un LB. Si el LB es específico para el mismo Ag que está unido a la IgG, el entrecruzamiento de receptores inhibe al LB. Este mecanismo parece ser el que ocurre en el caso de mujeres Rh- que tienen un primer hijo Rh+. A esas madres se les da una vacuna que tiene Ac anti-D. La vacuna se llama RHOGAM. Esos Ac anti-D van a funcionar a través de este sistema: se van a unir a los GR del feto que tenían el Ag D. Estos inmunocomplejos van a ir a los LB de la madre que puedan reconocer el Ag D entonces estos clones de linfocitos se van a inhibir. Ante una nueva entrada del Ag D no van a responder. LAS CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENOS Se necesita que las dos señales para la activación partan la misma CPA: se necesita la señal de reconocimiento específica del péptido y la señal co-estimulatoria a través de la molécula B7. LA REGULACIÓN POR LAS CÉLULAS T Las células T producen una gran cantidad de citoquinas. Se considera que existen células T supresoras que son CD8+. Hay dos tipos de estas células: CD8+T1 y CD8+T2. Estas células producen citoquinas que inhiben a las poblaciones Th. Las CD8+T1 producen INF-γ e inhiben a los LTh2. Las CD8+T2 producen IL-4, IL-10 e inhiben a los LTh1. La IL-10 es siempre inhibitoria. A su vez las poblaciones de LTh se inactivan mutuamente unas a otras. La IL que producen los LTh1, que la principal es el INF-γ, va a inhibir a los LTh2. Los que producen los LTh2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, van a inhibir a los LTh1. Hay otras células reguladoras que tienen marcador CD4 en la membrana. Algunas de estas células se generan como tales en la médula ósea y se denominan LTreg y son células T reguladoras naturales, se generan ya con este fenotipo en médula ósea. Tienen el marcador CD4, el CD25 y expresan el gen Foxp3. Este gen codifica para una proteína que se llama escurfina, la cual inhibe la proliferación T. Estos LTreg actúan ya sea para eliminar a los linfocitos autorreactivos o también regulan las respuestas contra agentes microbianos. Se activan con bajas concentraciones de Ag y pueden inhibir a los LTh1, LTh2 y LTc, aunque no sean específicos para ese

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Ag. Es decir, su acción es inespecífica, inactivan a cualquier población de LT sin importar su especificidad. Producen IL-10 y TGF-β, que son citoquinas inhibitorias. Hay otras células T reguladoras que son las LTr1 , que son inducibles. Se cree que la generación de estas células se debe a que se activan con un tipo particular de célula dendrítica llamada semimadura. Son cd que captaron un Ag pero en condiciones de estrés. Expresan una menor cantidad de moléculas CD40 y de IL-2. Los LTr1 producen también IL-10 y TGF-β, y también inhiben a todas las poblaciones de LT. Otros son los LTh3, aparecen en gran cantidad en la mucosa intestinal, y parece ser que son responsables de la tolerancia a los Ag que ingresan por vía oral. Todas las células T reguladoras producen IL-10 y TGF-β. Las células NKT actúan sobre los LTh1 y LTh2. Las NKT CD4+ estimulan a los LTh2 y las NKT CD4- estimulan a los LTh1. Hay un tipo de célula CD8+ que también puede ser reguladora. La célula TCD8+reg actúa como los LTr1. LA MUERTE INDUCIDA POR ACTIVACIÓN Está mediada por Fas-FasL que induce apoptosis. El LT expresa de forma constitutiva la molécula Fas. Cuando se activa empieza a expresar el FasL. Es por eso que los LT efectores no tienen una vida media muy larga. Otra es la expresión de la molécula CTLA-4, es parecida a la CD28, la comienza a expresar el LT después de que se activa, también se une a B7 pero inhibe la producción de IL-2, e inhibe la proliferación. LAS REDES IDIOTÍPICAS Los idiotipos de los Ac están ubicados en las regiones hipervariables del Fab. Son las regiones que se van a unir al Ag. Cada Ac va a tener un idiotipo diferente. Un investigador llamado Jerne propuso que si las Ig tienen distinto idiotipo, y esos idiotipos son capaces de reconocer una gran variedad de Ag, esos idiotipos estarían reflejando la variedad antigénica del mundo exterior. Propuso que si hay un Ac capaz de reconocer un Ag a través de su idiotipo, puede haber otro clon de LB que fuera capaz de reconocer este idiotipo. Esto es porque las Ig también actúan como Ag. En la época fetal estas proteínas se van produciendo, y las porciones Fab que son las más abundantes van a generar una cierta tolerancia, es por eso que el individuo es poco probable que sea capaz de responder a la Fc de las Ig. Por eso las porciones Fab, que están en una concentración menor, van a poder ser generadoras de Ac. En esta teoría se postula que si un LB generó un Ac1, este Ac puede actuar como Ag para otro LB. Este LB va a producir un Ac2 contra el Fab del Ac1. La acción es inhibitoria. A su vez, los Ac2 pueden ser Ag para otros LB. Van a producir Ac3 contra el idiotipo del Ac2, e inhibe al clon del LB2. Son redes llamadas idiotipo-antiidiotipo que son inhibitorias. Esto se aprovecha para la vacunación: un Ag es reconocido por un LB1. Otro clon de LB2 reconoce el paratope del Ac del LB1. Este nuevo paratope 2 va a ser la imagen del

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epitope del Ag. Este LB2, en su BCR estaría mostrando la imagen del Ag que entró. Esto permite que se siga manteniendo la respuesta aun cuando el Ag no esté. Esto se utiliza para vacunaciones contra agentes que son muy peligrosos para el organismo. Entonces, en vez de inmunizar con el Ag, se utiliza un Ac antiidiotipo, que es la imagen del Ag. Esto se ha ensayado para la rabia. Estas redes idiotipo-antiidiotipo son fundamentales para que funcione bien la respuesta inmune. Esta teoría de la red está asociada con la HIPÓTESIS DE LA HIGIENE . Esta hipótesis sostiene que si se cría a un individuo en un ambiente excesivamente protegido, hace que su sistema inmune no esté preparado para responder a los agentes agresores. Se necesita una interacción con el ambiente para que el sistema inmune pueda funcionar de forma adecuada ante un agente agresor. LOS FACTORES GENÉTICOS Tienen que ver con las MHC. Estas son heredadas del genotipo paterno y materno. Se han detectado asociaciones de determinados alelos de la MHC con una mayor susceptibilidad a padecer infecciones o a veces con una mayor resistencia. Entonces el polimorfismo de las MHC se asocia con una mayor resistencia a padecer una enfermedad, a una mayor susceptibilidad. Los mecanismos por los cuales se produce esto no están establecidos. En un individuo altamente respondedor la CPA le presenta el Ag al LT y este lo reconoce. Si la CPA no tiene la adecuada MHC para poder presentar el Ag no hay ningún LT que lo pueda reconocer. Puede ocurrir también que la CPA presente bien el Ag, pero el LT haya sido seleccionado en el timo. Si el péptido extraño tiene algún parecido con un péptido propio, el LT capaz de reconocer a ese péptido fue eliminado. También puede ocurrir que haya una buena unión CPA-LT, pero puede que actúe una célula reguladora e impida la activación. LAS REDES INMUNOEDÓCRINAS La regulación se complica aun más porque el sistema inmune puede interaccionar con hormonas, péptidos provenientes del sistema nervioso, etc. Los glucocorticoides que se generan en situaciones de estrés inhiben las respuestas, fundamentalmente las de tipo inflamatorias, donde están involucradas los macrófagos y los LTh1. Los estrógenos estimulan mucho las respuestas inmunes, en las mujeres hay mayor producción de Ac y mayor cantidad de proteínas en suero. Esto puede aumentar la probabilidad de producir enfermedades autoinmunes, por una mayor estimulación de toda la respuesta. LOS EFECTOS DE: A) La dieta: la desnutrición calórica-proteica va a afectar a la inmunidad celular por atrofia de los tejidos linfoides. Los déficit de vitaminas D y E disminuyen la respuesta, pero un exceso de la vitamina D inhibe la proliferación T. B) El ejercicio: es una situación de estrés, esto genera mucho cortisol que a su vez disminuye la respuesta. C) La edad: hace que varíe las citoquinas que se producen.

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REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA La parte del Ac que se une al Ag se llama paratope, está ubicado en el Fab y está determinado por las regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad: CDR. Estas son tres: CDR1, CDR2 y CDR3 y son las que se van a unir al Ag. La parte del Ag que se une al Ac se llama epitope. La interacción entre el Ag y el Ac es una interacción de tipo reversible, se forman enlaces que no son covalentes y pueden ser disociados por variaciones de pH o por variaciones de concentración salina. La unión entre el Ag y el Ac puede ser a través de un pequeño hueco hasta una región mucho más extensa, todo dependiendo del tamaño que tenga el Ag. Cuando el Ag es muy grande la región de unión puede abarcar inclusive las zonas constantes que están entre las regiones hipervariables, que se llaman regiones marco. La unión Ag-Ac es de tipo llave-cerradura y tanto el Ag como el Ac se van moldeando para poder interactuar. Las fuerzas que van a intervenir en esta unión son cuatro. Las fuerzas que más participan en la interacción son las fuerzas hidrofóbicas, que se generan cuando se excluyen las moléculas de agua. Otras fuerzas son las uniones electrostáticas que se producen entre grupos cargados, por ejemplo un grupo amino de una proteína con un grupo carboxilo de otra proteína. El otro tipo de fuerza son las uniones o puentes de hidrógeno, que si bien son enlaces débiles son muy importantes en esta interacción. Las otras fuerzas son las de Van der Wals. Dependiendo del complejo Ag-Ac va a predominar un tipo de fuerza sobre las otras. Una característica que tienen todas estas fuerzas es que son inversamente proporcionales a la distancia, es decir, que cuanto más cerca están las moléculas de Ag y Ac, más fuerte va a ser la interacción. Para poder estudiar este tipo de interacción Ag-Ac se utiliza un Ag que sea univalente, es decir, que tenga un solo sitio de unión al Ac, por ejemplo un hapteno (Hp). Si recordamos, el Hp por sí solo no puede no puede generar una respuesta inmune, debe estar fijado a una proteína. Un Hp muy usado es el DNP, entonces si queremos generar una respuesta inmune contra el DNP debemos fijarlo a OA, por ejemplo. Obtendremos una molécula de OA que va a tener pegadas muchas moléculas de DNP. Esto se inocula a un conejo y se obtiene Ac anti-DNP-OA. Si pensamos en la interacción Ag-Ac como una fórmula química:

Ac + Hp AcHp Cuando el complejo AcHp se puede disociar se tendrá una constante de asociación k y una constante de disociación k`. A esta ecuación química se le puede asociar una fórmula: [ AcHp ] = k = K (1) [Ac] x [Hp] k` Esta relación se llama CONSTANTE DE ASOCIACIÓN INTRÍNSECA . Esta constante determina el parámetro de afinidad. La AFINIDAD es una medida de la fuerza de unión entre dos moléculas (Ag y Ac) a través de un sitio de combinación.

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Para poder determinarla se elige una condición de equilibrio. Entonces, la constante de afinidad en el equilibrio se define cuando el 50% de los sitios de combinación de un Ac están ocupados. Las unidades de la constante de afinidad son M-1 o L/ mol. Cuanto mayor sea la Ka mayor será la afinidad, es decir, se van a necesitar menos moléculas de Hp para saturar el 50% de los sitios de combinación. Por pasajes de términos se puede llegar a la ecuación (2): K x [Ac] x [Hp] = [AcHp] (2) La [Ac] libre se puede expresar en función de la [AcT] total: [Ac] = [AcT] - [AcHp] (3) Si reemplazamos (3) en la ecuación (2) obtenemos: [AcHp] = K x [Hp] x [AcT] (4) 1 + K x [Hp] A partir de la ecuación (4) se han desarrollado distintos métodos matemáticos que permiten calcular la constante de afinidad K. MÉTODO DE SCATCHARD En este método la fórmula va a tener dos formas de expresión, una expresión que no tiene en cuenta la valencia del Ac y otra que sí tiene en cuanta la valencia del Ac. Si llamamos b = [AcHp] y c = [Hp] , a partir de la fórmula (4) podemos obtener: 1 = 1 + 1 (5) b [AcT] x K x c [AcT] La representación gráfica de la ecuación (5) es una recta: Para el punto donde la recta corta el eje de las ordenadas, 1/c = 0, lo que significa es que c tiende a infinito. Esto se interpreta como que la [Hp] está saturando todos los sitios de unión al Ac. Entonces, a partir de este valor se puede despejar c que será la concentración de [AcT]. La Ka se define en el equilibrio, que es cuando estaba el 50% del Ac saturado. Entonces, si al valor b se lo divide por 2, se le hace la inversa y entramos en la curva se puede sacar la Ka.

1/b

1/c

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Entonces, con la [AcT], se lo divide por 2, se entra en la curva y se obtiene un valor de 1/c que corresponde a la ka. Scatchard se puede graficar de otra forma si se tiene en cuanta la valencia del Ac: n. Se establece una relación r entre la [AcHp] / [AcT] . r = n x K x c � r = n x K – r x K 1 + K x c c La representación gráfica de esta fórmula es una hipérvola: Cuando la [Hp] o c es muy grande, la curva va a cortar el eje de las absisas. Entonces, para r/c = 0 se va a obtener r que es la valencia del anticuerpo. Si el Ac es bivalente, es decir, que su valencia es igual a 2, y como la Ka se definía cuando estaban la mitad de los sitios de combinación ocupados, cuando r = 1 se puede obtener la Ka. MÉTODO SIPS Este método introduce el término a que involucra heterogeneidad de los Ac. Se trabaja con un suero policlonal, estos son muy heterogéneos, es decir, que los Ac no van a tener la misma afinidad por el Ag. Entonces la ecuación queda: r = n x ( K x c)a 1 + ( K x c)a Haciendo pasajes de términos y aplicando log se obtiene: log r = a x log K – a x log c n – r Cuya gráfica es una recta:

r/c

r

Log r n-r

Log c

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Esta recta nos permite determinar el índice de heterogeneidad, que está dado por la pendiente. Este índice puede variar entre 0 y 1. El valor 1 corresponde a un Ac monoclonal. Cuando es 0 se puede determinar la Ka. Estos métodos sirven para determinar Ko dependiendo de los parámetros conocidos. Estamos trabajando con Ac bivalentes y Ag multivalentes, entonces no se puede hablar de afinidad, por lo tanto se define la AVIDEZ , en la cual están involucrados más de un sitio de unión. Generalmente, cuando se produce la unión del otro paratope es mucho más fuerte. Con la avidez se define la constante de asociación múltiple: Km. La Km se define como: Km = F x Ko n = valencia del Ac n F = valencia del Ag La Km es una medida de la fuerza de unión de un Ag multivalente con un Ac. Entonces, se habla de: La AFINIDAD no es lo mismo que la ESPECIFICIDAD . Un Ac puede tener una afinidad muy alta y no ser específica. La especificidad va a estar dada por la complementariedad de unión, es decir, un Ac es específico para el Ag que le dio origen. Un Ag2 que se relacione con el Ag1 que dio origen al Ac1, también puede ser reconocido por el Ac1. Esta es una reacción cruzada. Cuando los Ag se relacionan y comparten ciertos determinantes antigénicos, un Ac generado contra uno de ellos puede reaccionar con el otro. Los factores que van a influir en la especificidad van a ser: • La pureza del Ag que se usa para inmunizar. Cuanto más puro sea el Ag se obtendrán Ac que solo reconozcan al Ag. • La ubicuidad del Ag, es decir, cuando hay una gran posibilidad de encontrarlo en muchos lugares. La estructura de un Ag relacionada con otros Ag va a disminuir la especificidad del Ac. �La especificidad está muy relacionada con el Ag, por su pureza y ubicación. La afinidad va a estar también influida por el Ag, pero por su concentración. Cuanto menor concentración de Ag haya se van a impactar aquellos linfocitos con receptores de mayor afinidad. Si tenemos una concentración de Ag muy grande se van a impactar tanto con los receptores de baja como de alta afinidad. Otro fenómeno que influye en la afinidad es la hipermutación somática. Generalmente son de mayor afinidad para un Ag, los Ac que se obtuvieron inmunizando con ese Ag.

AFINIDAD: Para un Hp, es decir, un Ag con un único determinante antigénico.

AVIDEZ: Para un Ag con múltiples determinantes antigénicos.

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A veces, un Ac de muy alta afinidad puede llegar a unirse a otros Ag que estén relacionados con el que le dio origen. �EPECIFICIDAD: coplementariedad. �AFINIDAD: fuerza de unión. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN PRIMARIA Algunos métodos necesitan el Ac purificado y otros no. Estos tres métodos son para un Ac anti-Hp. • EQUILIBRIO DE DIÁLISIS Se tiene una cámara de diálisis, constituida por dos compartimientos separados por una membrana de diálisis. Esa membrana tiene un determinado poro y va a permitir el pasaje de las moléculas de Hp. En uno de los compartimientos se coloca el Ac y en el otro el Hp. El Ac es específico para el Hp. Las moléculas de Hp van a difundir y va a llegar un momento en que se van a equilibrar las concentraciones de Hp de los dos lados de la cámara. Si el Ac es específico, parte del Hp que se pase por la membrana se va a unir. Se generan entonces distintos estados de equilibrio con distintas cámaras. El Ac se coloca en cantidad constante y se va variando la concentración de Hp. Se deja un determinado tiempo para que se llegue al equilibrio, y como el Hp que se usa es el DNP que se puede medir a 360nm, se hacen lecturas del contenido de cada una de las cámaras.

La diferencia entre AcHp + Hp libre y Hp libre nos da la cantidad de Hp que está unido al Ac (AcHp). Con estos datos se construye una gráfica (cuadro 8-1). • EXTINCIÓN DE FLUORESCENCIA (quenching de fluorescencia) Se bloquea la fluorescencia que puede emitir un Ac. En el sitio de combinación del Ac hay algunos aminoácidos, como el Trp que son capaces de emitir fluorescencia. Cuando ese sitio de combinación se une al Ag, disminuye la fluorescencia del Ac. En este caso se debe trabajar con un Ac purificado, porque pueden haber otras proteínas que también emitan fluorescencia.

Hp Ac

Medimos Hp libre

Medimos el AcHp + el Hp

libre (equilibrio)

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Es muy útil esta técnica cuando se usan Ac anti-DNP porque el DNP absorbe a 360nm, que es la λ donde emitiría el Ac. Se trabaja con una determinada concentración de Ac, en una cubeta de espectrómetro se van agregando distintas concentraciones de Hp, y se va midiendo como para cada concentración de Hp agregada va disminuyendo la fluorescencia del Ac. Se necesita hacer un control para determinar el bloqueo máximo (Q max) o una cantidad muy grande de Hp como para que se bloqueen todos los sitios del Ac y también se necesita hacer un control de bloqueo de fluorescencia con un suero. En este caso es necesario tener en cuenta la valencia del Ac. Para cada punto se puede hacer los gráficos antes vistos. • PRECIPITACIÓN CON (NH 4)2SO4 Cuando se enfrenta un Ag con un Ac, se va a producir el fenómeno de precipitación si el Ag es multivalente. En este caso, como el Ag es monovalente, para lograr la precipitación hay que agregar (NH4)2SO4. Este precipita los complejos Ag-Ac. En este caso se debe trabajar con un Ac libre de albúmina, ya que puede fijar el Hp en forma inespecífica. Se hacen dos series de tubos. En una serie se colocan concentraciones de Ac constantes y concentración de Hp crecientes. En la otra serie se agrega diluyente y concentración de Hp creciente, no hay Ac. Se agrega (NH4)2SO4 luego de incubar. Van a precipitar los complejos Ag-Ac. Centrifugamos y medimos en el sobrenadante la cantidad de Hp que quedó. En la serie A (Ag-Ac) medimos Hp libre. En la serie B se tiene Hp total, ya que no hay Ac. Con estos valores se hacen los gráficos. • POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA Se basa en medir la diferencia de velocidad de rotación que tiene una molécula. Se usa un Ag que tiene una determinada velocidad de rotación. Cuando el Ag se une al Ac, la velocidad de rotación disminuye, porque el tamaño es mayor. Hay aparatos que permiten medir esta diferencia. REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA PARA LA DETECCIÓ N DE ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS Las reacciones de interacción secundaria tienen fenómenos visibles asociados. Las reacciones de interacción primaria no tienen fenómenos visibles asociados. Hay métodos que se utilizan para determinar Ag o Ac que están basados en las reacciones de interacción primaria, y se usan porque son muy sensibles. Pueden ser utilizados para detectar pequeñas cantidades de Ag o de Ac. Miden directamente la primera interacción, la unión del Ag con el Ac. No necesitan ningún otro fenómeno asociado. �estos métodos de interacción primaria son útiles porque tienen una alta sensibilidad y también porque permiten medir Ac incompletos 1) INMUNIFLUORESCENCIA (IF) Se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente: isotiocianato de fluoresceína o lisamina-rodamina. La desventaja es que se debe disponer de un microscopio de fluorescencia para ver todas estas interacciones.

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El Ac marcado se denomina conjugado. En este caso puede estar conjugado con una sustancia fluorescente. La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. La inmunoflourescencia directa se utiliza para detectar Ag y usa un Ac marcado específico para el Ag. Se produce en un solo paso. La inmunofluorescencia indirecta se produce en dos pasos. En una primera etapa se une un Ac sin marca al Ag, y ese complejo es detectado por un segundo Ac marcado, que es un Ac anti- el primer Ac. Esta técnica es altamente sensible pero corre con la desventaja de que necesita un operador muy entrenado para poder detectar lo que es positivo de lo que es negativo. Estos métodos de inmunofluorescencia se pueden hacer en medio líquido, y es lo que se utiliza para la CITOMRTRÍA DE FLUJO . En citometría de flujo se usan Ac fluorescentes para detectar Ag de membrana de diferentes poblaciones celulares, por ejemplo. 2) RADIO INMUNOANÁLISIS (RIA) Se utilizan Ag marcados con una sustancia radiactiva, que puede ser 125I y 131I, que son los más usados. Se utilizan para determinar hormonas, y se basan en la competencia entre el Ag de la muestra que se quiere determinar y un Ag*. Se necesita un Ac de muy alta afinidad, y un trazador que es el Ag* que se puede colocar en cantidades pequeñas. La competencia se produce entre el Ag y el Ag* por el Ac. Otra técnica que utiliza compuestos radiactivos se llama IRMA o ANÁLISIS INMUNO RADIO MÉTRICO . Hay dos técnicas de IRMA que se utilizan en la detección de alergias. Son PRIST y RAST y se utilizan para detectar IgE. En el PRIST se pega en un papel o soporte en Ac anti-IgE. Se agrega el suero del paciente, la IgE está aumentada en las alergias, después se agrega un Ac* anti-IgE. Si habría IgE en el suero del paciente se va a unir al anti-IgE*. Los Ac que se unen deben reconocer distintos epitopes de la IgE. El RAST se utiliza para detectar una IgE que sea específica para un Ag. En el papel se pone el alergeno o Ag. Se agrega el suero que posee los Ac tipo IgE que pueden ser específicos para este alergeno, y luego se agrega un Anti-IgE*. Entonces, la PRIST detecta IgE total, y la RAST utiliza una IgE específica para algo. 3) TÉCNICA ELISA Emplea Ac o Ag marcados con una enzima. Las enzimas que más se usan son la peroxidasa del rábano o la fosfatasa alcalina. Los métodos se pueden clasificar en homogéneos y heterogéneos. Los homogéneos se hacen en fase líquida y los heterogéneos son los que fijan algún reaccionante a un soporte. Los homogéneos se utilizan para detectar drogas o haptenos, y se usan drogas o haptenos marcados con una enzima. Cuando a estos compuestos se les une un Ac específico, la actividad enzimática va a disminuir porque se bloquea la enzima. Los ensayos son siempre competitivos. Se coloca la muestra a investigar, se agrega la droga o el hapteno marcado con la enzima y el Ac. Cuanto más hapteno haya en la

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muestra, más se va a unir al Ac, menos Ac se va a unir al compuesto marcado con la enzima y, por lo tanto, la actividad enzimática no se va a ver disminuida. En los heterogéneos uno de los reactantes, o el Ag o el Ac se fija al soporte. Se pueden dividir en métodos que se utilizan para analizar Ac o para analizar Ag. Para detectar Ac uno de los métodos es indirecto. Se tiene un Ag pegado a una placa, todas las proteínas son capaces de fijarse a las placas de poliestireno. Siempre que se hace la fijación de un Ag se debe hacer luego un bloqueo para que no se unan los Ac, que también son proteínas. Estos bloqueos se hacen con leche descremada, también se pueden hacer con otras proteínas que no reaccionen, pero lo más común es usar leche descremada. Después se hacen lavados para eliminar todo lo que no se unió, y después se agrega el suero con el Ac a investigar. También se hacen lavados para eliminar todo lo que no se haya pegado y se agrega un Ac contra el Ac en estudio, marcado con una enzima. Se agrega el sustrato y se mide el color del producto de reacción. En el método competitivo hay que realizar dos determinaciones en paralelo. Se fija el Ag a la placa, se bloquea para evitar cualquier reacción posterior, y se trabaja con un Ac marcado con la enzima. Se mezcla el Ac* con el Ac del paciente, se agrega al pocillo donde está el Ag. Va a haber una competencia con los dos Ac por el Ag fijado. Si en el suero del paciente hay Ac se van a pegar y no van a dejar que se pegue el marcado. Cuando acaba la reacción luego del agregado del sustrato se va a tener una determinada lectura. Paralelamente, en otro pocillo se agrega solamente el Ac*. Después de agregar el sustrato se obtendrá una DO. La diferencia entre las dos DO va a ser proporcional a la cantidad de Ac que tiene el suero del paciente. Para detectar Ag se tienen tres métodos. Un método es competitivo, se hacen dos determinaciones en paralelo. En este método se pegan Ac a la placa. Se bloquean las uniones inespecíficas y se hace una competencia entre el Ag* y el Ag que se encuentra en la muestra. Se pone Ag* y la muestra en el mismo pocillo, si hay Ag en la muestra va a competir con el Ag* por la unión al Ac, y luego del agregado del sustrato se va a obtener una determinada DO. En el otro pocillo solo se agrega el Ag*, luego de la adición del sustrato se va a tener otra DO. La diferencia entre la DO da idea de la cantidad de Ag que había en la muestra. Otro método es el sándwich. Se tiene un Ac pegado a la placa, se agrega la muestra con el Ag a investigar y después se agrega un segundo Ac* contra el Ag. Si había Ag en la muestra el segundo Ac se va a unir, y va a haber medición. Después está el método de inhibición. Se tiene un Ag pegado a la placa y se va a mezclar un Ac* con la muestra donde se supone que hay Ag. Puede ocurrir dos cosas: Si en la muestra hay Ag, se une al Ac* y cuando se agregue la mezcla al pocillo donde hay Ag pegado, como todo el Ac* se unió a la muestra no queda nada para unirse al Ag fijado, entonces, luego del lavado, aunque agreguemos el sustrato no se producirá degradación. Si no hay degradación de sustrato, la muestra contiene Ag. En la otra situación, cuando en la muestra no hay Ag, aunque se mezcle con el Ac*, no hay interacción y cuando se agregue la mezcla al pocillo, el Ac* se unirá al Ag pegado a la placa y va a haber degradación de sustrato.

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4) QUIMIOLUMINISCENCIA Se basa en generar luz a través de una reacción química. El compuesto que más se usa en este tipo de reacciones es el luminol . El luminol se oxida por una reacción catalizada por enzimas y se libera luz que se detecta. Se puede utilizar luminol unido a Ag o a Ac. También se puede usar el luminol para una detección western blot. El Ac* con enzimas a utilizar puede ser la peroxidasa, si luego se agrega luminol como sustrato se observa emisión de luz. 5) INTERACCIÓN AVIDINA-BIOTINA Es simplemente una amplificación de las señales. La avidina se extrae de la clara de huevo, y la biotina es una vitamina del complejo B. La biotina se puede unir con una gran avidez, con una gran fuerza, a la avidina. Si se marcan Ag o Ac con biotina o avidina se puede amplificar mucho más la señal, esto hace que el método sea más sensible y que se puedan detectar menores concentraciones de Ag o de Ac.

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INMUNOQUÍMICA

La inmunoquímica trata sobre métodos y técnicas químicas que se emplean en la inmunología para aislar aquellas macromoléculas de interés biológico, es decir, Ag y Ac. �La inmunoquímica estudia las técnicas y métodos que se emplean para separar, purificar y caracterizar Ag y Ac. Los métodos se basan en distintas propiedades y características que tienen las moléculas. Es decir, de acuerdo a la propiedad en que están basados los métodos se van a usar: • El tamaño molecular diferente, cuya técnica es la filtración por geles. • La diferente carga eléctrica que tienen las moléculas, cuyos métodos son la cromatografía de intercambio iónico y la electroforesis en gel de poliacriamida. • La especificidad que existe entre el Ag y el Ac, en la cual se basa la cromatografía de afinidad. • Otras propiedades, como la cromatografía de covalencia. SEPARACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS POR EL DIFERENTE TAM AÑO La técnica se llama FILTRACIÓN POR GELES o CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN ESTÉRICA o CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS . La separación de las moléculas se basa en el volumen hidrodinámico, que es la forma que adquiere la macromolécula en solución. Es decir, que la separación no está dada solo por el PM, sino también por la forma que adquiere y el grado de hidratación que sufre cuando está en solución. Todo este conjunto de factores definen lo que se llama VOLUMEN HIDRODINÁMICO . Este tipo de cromatografía es líquido-sólido, la FM va a ser un buffer y la FE es sólida y está dada por un material microparticulado y poroso que va a estar contenido dentro de una columna cromatográfica, que es un tubo de acero que se llena con otro material a alta presión. Este material que forma la FE tiene un diámetro de 3 a 10 µm. Es un material poroso, cuyos poros tienen una dimensión determinada. Además tiene la capacidad de adsorber sustancias. Existen distintos materiales, son polímeros orgánicos derivados de la sílica. Por ejemplo, está el dextrán (nombre comercial sephadex), la agarosa (sepharosa), la poliacrilamida y mezcla de agarosa y acrilamida. La FM es un buffer acuoso que produce condiciones de elusión muy suaves. Por lo tanto, el grado de desnaturalización que va a producir en la molécula va a ser mínimo. Tiene una fuerza iónica elevada que va a impedir las adsorciones inespecíficas de cualquier macromolécula a la fase sólida o FE. Va a minimizar la aparición de las fuerzas de Van der Wals o fuerzas electrostáticas que produzcan una adsorción del material. Las características a tener en cuenta del gel son que tenga un diámetro de poro apropiado. Si es muy pequeño no separará las sustancias porque ninguna entrará en

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ellos, si es muy grande entran todas las moléculas. En ambos casos no puede producirse una separación fraccionada de la muestra. Otra de las características es que debe ser inerte, no debe ser atacado por ninguno de los componentes de la FM. También tiene que tenerse en cuenta que el tamaño de partícula sea adecuado. Las partículas pueden venir en distintos tamaños: grueso, mediano, fino y superfino. Este tamaño no va a influenciar en el rango de funcionamiento, sino que va a afectar la eficiencia de la separación, es decir, los picos de elusión tendrán base más angosta. Es decir, que en un volumen determinado va a fluir toda la sustancia. Hay parámetros del gel que son importantes conocer. Uno de ellos es el diámetro de poro adecuado. Esto se conoce con el nombre de límite de exclusión: menor PM incapaz de entrar al poro. Aquellas moléculas que tienen un volumen hidrodinámico grande no pueden entrar dentro de los poros de las partículas del gel, van a quedar afuera, por entre las partículas, por eso son las primeras en eluir. Las moléculas más pequeñas son capaces de ingresar a los poros, por lo tanto van a ser más retenidos y eluirán con posterioridad. Otro parámetro es el volumen libre o Vo, que es el volumen que existe entre las partículas, y es le volumen donde se encuentran las macromoléculas que tienen un volumen hidrodinámico mayor que el diámetro del poro. Aquellos que pueden ingresar al poro, acuden a lo que se llama volumen incluido (Vi), que es el volumen adsorbido dentro de los poros. Se calcula como: Vi = a x Wr a = gramos del gel Wr = agua embebida El Wr viene especificado en el envase. Para calcularlo en forma experimental se llena una columna con un gramo de producto, se tapa la salida con una maya de nylon 400 y se ejerce presión hasta que no se pueda más. El volumen desalojado corresponde al Wr. El volumen incluido: Vi = Vt – Vo Cuando el volumen hidrodinámico de esa molécula sea superior al diámetro del poro directamente va a quedar en el Vo. Este es el caso de una proteína que excede el límite de exclusión. Si el volumen hidrodinámico de la molécula es menor al diámetro del poro, va a acceder tanto al Vi como al Vo. Esto es lo que ocurre con las moléculas del buffer. Hay una situación intermedia, una molécula que tenga un volumen hidrodinámico que no sea muy pequeño, va a poder ingresar a los poros y va a estar un cierto tiempo dentro de la partícula. Entonces, van a eluir con un volumen de elusión Ve que va a ser superior a aquellas moléculas que son totalmente excluidas pero a su vez menores al de aquellas moléculas que como el buffer pueden acceder al volumen total. El Ve de una sustancia va a depender del coeficiente de distribución Kd. El Kd es la relación que existe entre la concentración del soluto en la FE respecto a la concentración del soluto en la FM. Por lo tanto, el Kd es característico de cada sustancia. Aquellas sustancias que tienen un PM muy elevado van a tener un Kd = 0, porque en la FE no va a haber nada, va a estar todo en la FM. Entonces el Kd = 0 corresponde a aquellas sustancias que no pueden ingresar a los poros. En cambio un Kd = 1 corresponde a aquellas sustancias que tienen un PM muy bajo, por lo tanto, van a entrar en los poros, y se va a dar que en la FE hay la misma cantidad que en la FM.

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Entonces para un soluto que entra a los poros: Ve = Vo + Kd x Vi Cuando se tienen dos sustancias, cada una va a tener su Ve, y nos es necesario conocer el volumen que separa una sustancia de la otra, entonces se define el volumen de separación Vs: Vs = Vi (Kd`- Kd``) Entonces se puede decir que el orden de elusión de una mezcla compleja de proteínas de distinto peso molecular es inversamente proporcional al diámetro hidrodinámico de cada una de ellas. Las matrices están compuestas por el material adsorbente y poroso. Hay columnas de tipo analítico y columnas separativas. Las columnas analíticas son más cortas, de 8 a 300 mm, pueden cargar un pequeño volumen con muy pocos mg de proteínas, y se saturan rápidamente. En cambio las columnas separativas son columnas más largas, de 20 a 400 mm y permite sembrar una muestra que tiene mayor concentración de proteínas, hasta 100 mg de proteínas. Para las columnas analíticas siempre hay que centrifugar la muestra para evitar saturaciones. Con respecto al sephadex, viene clasificado de acuerdo al grado de entrecruzamiento. Se le asigna una letra G y un número. Cuanto más chico sea el número mayor será el entrecruzamiento entre las moléculas dextrano, por lo tanto el diámetro de poro será menor. Esto también hace a la matriz más rígida y permite aumentar la velocidad sin problemas. Requisitos del solvente (FM): se usan buffers acuosos con un pH compatible con la matriz del gel. La fuerza iónica debe ser elevada para minimizar cualquier tipo de interacción inespecífica que pueda existir entre las macromoléculas que quieren separar y la matriz sólida: fuerzas electrostáticas, de Van der Wals, etc. El buffer más usado es la solución salina tamponada de pH = 7,5, es decir, un buffer fosfato 0,001M + NaCl 0,15M. La filtración por geles sirve para el desalado de los solutos y diálisis rápida. Caracterización molecular a partir de la siembra de sustancias de PM conocido. SEPARACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS POR LA CARGA ELÉCTRI CA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC) La molécula se separa por la carga eléctrica que posee. Las sustancias que se emplean como FE se conocen con el nombre de RESINAS. Tienen grupos fijos que están

Característico de una sustancia que

no ingresa

Proporción del Vi

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cargados, estos se asocian con iones de carga opuesta y que son intercambiables. Estos iones están unidos electrostáticamente. La muestra tendrá biomoléculas con grupos cargados con la misma carga que los iones intercambiables. Entonces la muestra reemplaza a esos iones intercambiables y queda unida electrostáticamente la molécula que se quiere separar. Las resinas, según el ión que intercambien se las clasifica en resinas de intercambio aniónico o resinas de intercambio catiónico. Según la fuerza del ión intercambiado, se clasifica en resinas de intercambio fuerte o débil. La separación se va a producir por un mecanismo de adsorción reversible. El ión intercambiable va a ser sustituido por las biomoléculas cargadas. Las proteínas son sustancias anfóteras, de acuerdo al pH con el que se trabaje, las proteínas pueden llegar a tener carga (+), carga (-) e inclusive carga neta 0 (pI). Entonces, es muy importante elegir un buffer adecuado para que la biomolécula esté cargada. La separación se realiza en dos pasos: 1) se une la sustancia a separar en la resina. 2) se eluye la sustancia unida. La elución se puede realizar, o bien incrementando la fuerza iónica del buffer, o bien modificando el pH hasta llegar al pI. El incremento de la fuerza iónica del buffer va a producir una interferencia en la unión electrostática temporaria que hay. ELECTRFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA También es una separación por carga. El gel de poliacrilamida se prepara mezclando acrilamida y bisacrilamida. De acuerdo a las proporciones de cada uno de ellos se formará un diámetro de poro determinado. Esta metodología cambiará la migración de estas moléculas por la acción de un campo eléctrico con una filtración por geles, es decir, un tamizado molecular. El tamaño de ese tamiz estaría dado por las proporciones de acrilamida y bisacrilamida. Esta técnica se puede hacer tanto en tubo como en placa. Es muy común utilizar en esta técnica el detergente no iónico Dodecil sulfato de sodio (SDS). El SDS se fija con una proporción constante a los péptidos. Se utiliza además el 2 mercapto etanol (2ME) que reduce los puentes disulfuro de los péptidos. Se fija 1,4 g de SDS por g de péptido. Como el SDS tiene carga (-) hace que todas las cadenas polipeptídicas adquieran todas la misma carga (-). Así, el único factor que incide en la velocidad de migración va a ser el PM. SEPARACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS POR ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Aprovecha la especificidad estructural: hormona-receptor, enzima-ligando, antígeno-anticuerpo. Estas uniones son débiles y se pueden disociar en determinadas condiciones. Se realiza en tres pasos: 1) Se insolubiliza uno de los reactivos, que va a ser una sustancia fijadora insoluble que tiene afinidad biológica por la sustancia a separar. Pero no debe perder esa capacidad de fijación. 2) Unión de la sustancia a separar a la matriz fijadora, por uniones no covalentes.

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3) Elución de la sustancia a purificar. Se puede hacer de tres modos distintos: modificando el pH, la fuerza iónica, o por competencia. Generalmente se utiliza para separar Ac. Se prepara entonces el INMUNOADSORVENTE . El Ag se insolubiliza mediante un tratamiento con glutaraldehído, y se debe trabajar a un pH próximo al pI de la proteína. Frente a esas condiciones se va a producir la polimerización del Ag. Este tratamiento se hace durante 24 hs en heladera. Se obtiene un gel, que con un agitador magnético se rompe todo. La desventaja es que solo quedan expuestos un 10% de los determinantes antigénicos. Otra forma es prepararlo en una columna. SEPARACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS POR OTRAS INTERACCIO NES CROMATOGRAFÍA DE COVALENCIA Se produce un enlace covalente. Las resinas thiol-activadas permiten fijar solutos que tengan grupos tiol. La separación se produce por acción de un agente reductor.

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE Ig

Nos ocupamos de aislamiento y purificación de Ig que tienen actividad de Ac. Las Ig difieren entre si y con el resto de las proteínas presentes en el suero en distintos aspectos: la solubilidad que tienen en solución acuosa, también difieren en el PM, en la densidad electrostática y en el pI. Los métodos que se utilizan en la separación se los puede dividir en: • Métodos inespecíficos: permiten la separación de las Ig totales purificadas, sin distinguirlas en inmunes y no inmunes con respecto a un Ag en particular. • Métodos específicos: permiten separar aquellas Ig que tienen actividad Ac contra un Ag específico. MÉTODOS INESPECÍFICOS Partiendo de un suero total, mediante una metodología lograremos la precipitación total de las Ig, que recibe el nombre de FRACCIONAMIENTO . MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN La precipitación se puede lograr de dos formas distintas. a) precipitación salina: Con el agregado de una sal en alta concentración se produce una interferencia entre la relación que existe entre los grupos cargados que tienen las proteínas y las moléculas de H2O. Al perderse esa relación las moléculas se van a volver insolubles. La concentración salina que se requiere para volver insolubles a cada una de las proteínas es particular de cada una de ellas. En general la fracción de las Ig tienen aproximadamente la misma concentración salina para volverse insolubles. Esta precipitación salina permite purificar Ig y también para concentrar un suero que tenga baja concentración de estas Ig. Se pueden utilizar dos sales: • La más usada es el (NH4)2SO4, sirve para obtener una fracción cruda, que es una fracción grosera de Ig impurificada. El (NH4)2SO4 es una sal muy soluble, y su solubilidad no se modifica en un rango de temperatura de 0ºC-25ºC. • El Na2SO4 es más soluble a 25ºC, luego baja su solubilidad hacia 0ºC. El (NH4)2SO4 se agrega hasta saturación, al 33%. b) Precipitación alcohólica: debe hacerse en frío. SEPARACIÓN DE LAS FRACCIONES PROTEICAS DE UN SUERO Y SU PURIFICACIÓN 1) PURIFICACIÓN DE ALBÚMINA Protocolo: A un volumen de suero se lo mezcla con un volumen igual de (NH4)2SO4 33% (a saturación). En estas condiciones las α, β y γ globulinas se vuelven insolubles, en cambio la albúmina se mantiene en solución. Al sobrenadante, que contiene las albúminas, se le agrega (NH4)2SO4 sólido hasta saturación. En estas condiciones la albúmina sí se vuelve insoluble y precipita.

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Este precipitado está enriquecido en albúmina. En estos casos en que se tienen muy pocas impurezas se emplea una resina de intercambio iónico. Se usa un buffer con un pH próximo al pI de la macromolécula que se quiere aislar. De este modo al pasar la muestra todas las impurezas quedarán pegadas a la resina y la macromolécula de interés queda eléctricamente neutra y eluye primero. pI ~ 5 � se trabaja con una resina catiónica débil, y un buffer pH 5; la albúmina estaría eléctricamente neutra, y el resto de las proteínas tendrán carga (-). Entonces eluye la albúmina pura. 2) PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS G Protocolo: A un volumen de suero se le agrega un volumen igual de (NH4)2SO4 33%, van a precipitar las α,β y γ globulinas. Con H2O destilada se disuelve el precipitado y se lo dializa frente a NaCl 0,15M. Luego se lo vuelve a re-precipitar (NH4)2SO4 33% pero en una proporción de dos volúmenes de muestra y un volumen de (NH4)2SO4 saturado. El precipitado va a ser rico en inmunoglobulinas. Se dializa el precipitado con un buffer pH = 8, las Ig adquieren carga (-). Se utiliza una resina de intercambio aniónico, como la DEAE-celulosa, y por lo tanto, se van a pegar las Ig a la resina. Las Ig difieren entre sí en la intensidad de carga eléctrica. Se hace un fraccionamiento variando la fuerza iónica del buffer. Variando la molaridad del buffer se generará interferencias de forma fraccionada. La IgG es la que eluye en mayor concentración. La IgA está en mucha menor concentración que la IgG, y la IgM en muchísima menor concentración. 3) PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS A Protocolo: Es idéntico al de IgG, pero como la IgA está en menor concentración se parte de un suero rico en IgA, como el de un paciente con un mieloma a IgA. Todo el procedimiento es igual, pero los picos finales tendrán una concentración diferente. 4) PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINA M Protocolo: Se utiliza un suero de un mieloma a IgM, en el cual la IgM va a ser más abundante. La IgM tiene la particularidad de ser poco soluble en agua y precipita en agua boricada al 7%o. Al sobrenadante se lo re-precipita dos veces, después se lo dializa frente a solución fisiológica y luego se realiza una filtración por geles. Como la IgM tiene elevado PM va a fluir primero. MÉTODOS ESPECÍFICOS Separan Ig que sean específicas contra un Ag en particular. 1) PURIFICACIÓN DE UN Ac CONTRA UN Hp Ejemplo: purificación de IgG específica contra DNP. a) Se puede hacer empleando resinas de intercambio iónico.

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Al suero de un animal inmunizado con un Hp, se le realiza una curva de precipitación cuantitativa para calcular cuanta concentración de Ac se dispone. Con este dato se puede determinar la cantidad de Ag que se debe agregar en la zona de equivalencia para lograr una precipitación cuantitativa. Para hacer esto es necesario cambiar el soporte del Hp. El precipitado se lava con NaCl 0,15M Luego hay que disociar los complejos Ag-Ac, y se puede hacer de dos formas: acidificando, y de esa manera desplazar la unión, y también agregando el Hp, por competencia. Así se obtiene un sobrenadante que, si la disociación se realiza por competencia, va a estar compuesto por: el Ag prot-DNP, el Hp DNP, el complejo Ag-Ac y los Ac anti-DNP. Se agrega una resina de intercambio iónico mixta. En la columna se agregan dos resinas diferentes: una resina aniónica débil y una resina aniónica fuerte. Trabajando con un buffer pH = 8, como la SST, el Ag prot-DNP está cargado (-), los anti DNP están eléctricamente neutros. La DEAE-celulosa va a fijar al Ag, y la otra resina: IRA400 es capaz de fijar al DNP. Al producirse esto también disminuye el complejo Ag-Ac, ya que al fijarse el DNP se desplaza la unión al anti-DNP. Quedan así libres los Ac anti-DNP. En estas condiciones fluye el anti-DNP puro. b) Por cromatografía de afinidad Primeramente se determina la cantidad de Ag que se debe agregar para lograr la precipitación cuantitativa de los Ac anti-DNP. Se prepara el inmunoadsorvente produciendo la polimerización del Ag con el agregado de glutaraldehído y con un pH próximo al pI. Recordar que quedan expuestos solo el 10% de los determinantes antigénicos, entonces se debe multiplicar por 10 la cantidad de Ag determinados por precipitación cuantitativa. Cuando se agrega el suero se van a pegar todos los Ac anti-DNP. Se lava para eliminar todo lo que no se unió, y se disocia con medio ácido. 2) PURIFICACIÓN DE Ac CONTRA UNA PROTEÍNA COMPLEJA Ejemplo: purificación de Ac anti-OA. Una de las técnicas es la inmunoadsorción. Otra es empleando una filtración por geles. Se hace una precipitación cuantitativa del Ac, se lava el precipitado, se lo disocia con medio ácido y se pasa la muestra por sephadex G-200. En solución hay complejo Ag-Ac sin disociar, Ac libre y Ag libre. Como tienen PM distintos, van a separarse.

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DEGRADACIÓN DE Ig POR MÉTODOS ENZIMÁTICOS

Dependiendo de la Ig son los fragmentos que se obtienen. Nosotros trabajamos sobre la IgG, que es la que aparece en una respuesta secundaria. Se puede hacer una ruptura de la IgG usando enzimas. Cuando a la IgG se la somete a la acción de la papaína se produce una ruptura por encima del puente disulfuro y se obtienen dos fragmentos Fab y el fragmento Fc. La papaína, en presencia de cisteína y EDTA y a 37ºC por 4 hs produce la ruptura de la IgG en Fab, Fc, queda algo de IgG sin digerir y unos péptidos pequeños (entre los cuales está el Fc`). La IgG1 y 4 por acción de la papaína sola se rompe, en cambio la IgG3 necesita que esté presente la Cys y la IgG2 es resistente a la digestión. Si se prolonga la incubación a 16 hs la cantidad de IgG sin digerir va a disminuir a expensas de un aumento del fragmento Fc`. Los fragmentos Fab y Fc tienen un PM alrededor de 55 KDa cada uno. Entonces con una filtración por geles se pueden separar los fragmentos de la proteína sin digerir y de los péptidos pequeños. Fab y Fc tienen intensidad de carga distinta, el de mayor intensidad de carga es Fc a pH=8 (carga (-)). Entonces con una resina de intercambio aniónico como la DEAE-celulosa y variando la fuerza iónica del buffer pH=8 se puede separar el Fab (que eluye primero) del Fc (de densidad de carga mayor). Otra de las enzimas que se utilizan es la pepsina. El tratamiento de la IgG con pepsina en medio ácido (la pepsina para que se active debe estar al pH del estómago) produce una parte de Ig sin digerir, y la pepsina corta por debajo del puente disulfuro, produciendo un fragmento F(ab`)2 y péptidos pequeños. Con el uso de sephadex G-200 va a eluir primero la IgG sin digerir, luego F(ab`)2 y por último los péptidos pequeños. La IgG puede sufrir también una ruptura química, que es un tratamiento con 2ME en presencia de iodoacetamida en medio ácido que logra romper la IgG en los péptidos constituyentes: cadena L y cadena H. El 2ME reduce los puentes disulfuro, y a su vez, la iodoacetamida impide que se vuelvan a unir los grupos por regeneración de los puentes disulfuro. El ácido propiónico da el pH=3, reduce las fuerzas de interacción de Van der Wals. Como los PM son distintos se utiliza una filtración por geles.

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INTERACCIÓN SECUNDARIA

Cuando un Ag se pone en contacto con su Ac específico, se forma el complejo Ag-Ac en el cual participan uniones no covalentes, por lo cual es posible disociar esta interacción. Cuando un Ag con un Ac específico se ponen en contacto lo primero que ocurre es la INTERACCIÓN PRIMARIA (las reacciones primarias son detectadas por fenómenos de interacción primaria). El fenómeno de interacción primaria es simplemente la unión que forma el complejo Ag-Ac. Esta interacción se da inmediatamente entre el Ag y su Ac correspondiente y es un fenómeno no visible. Es inmediato y no visible. Este fenómeno es independiente de la concentración de electrolito y de la temperatura. Si se dan ciertas condiciones se pueden llegar a tener reacciones de INTERACCIÓN SECUNDARIA . Este fenómeno es visible mediante reacciones de precipitación o de aglutinación, según el tipo de Ag. Este tipo de reacciones ocurren in vitro. Hay otro tipo de interacción que se puede dar entre Ag y Ac y se llaman INTERACCIÓN TERCIARIA y se producen in vivo. Una de ellas tienen como manifestación la necrosis, y la otra es la anafilaxia, en la cual la consecuencia de la interacción del Ag-Ac en la superficie de una célula produce la liberación de gránulos con una gran cantidad de mediadores químicos que producen contracción de musculatura lisa, pérdida de la permeabilidad capilar, etc. Para que se den las reacciones de interacción secundaria y terciaria se requieren unas determinadas relaciones de concentración entre Ag y Ac. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN Este tipo de interacción secundaria ocurre cuando un Ag soluble entra en contacto con su Ac específico. Si esto ocurre en un medio salino adecuado se va a visualizar la formación de un precipitado blanquecino. Esto ocurre si los Ac son precipitantes, es decir, que tienen la capacidad de precipitar, y estos tienen una alta afinidad por el Ag en ambos sitios de combinación. En cambio, en los Ac no precipitantes tienen una baja afinidad por el Ag; y otro caso es el de los Ac bloqueantes, incompletos o coprecipitantes. Son Ac bivalentes pero con distinta afinidad por el Ag en cada sitio de combinación, tienen un sitio de alta afinidad y otro de baja afinidad. Es por esto que solamente van a dar reacciones de precipitación aquellos Ac que sean capaces de precipitar. La precipitación puede ser total o zonal. El Ring Test es un método de precipitación zonal, y una precipitación cuantitativa para la curva de precipitación es una precipitación total. La precipitación se puede dar en medio líquido o en medio gelosado. PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO Se puede realizar en forma cualitativa o cuantitativa. A) PRECIPITACIÓN CUALITATIVA La precipitación cualitativa puede servir para identificar un Ag o un Ac, según el caso. Ocurre en dos etapas. Una primera fase de reacción primaria, se produce de manera rápida cuando el Ag y su Ac correspondiente se ponen en contacto. Esta etapa es muy

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poco influida por la temperatura y la concentración de electrolitos. En esta etapa se forman los complejos primarios. Ahora, si se dan las siguientes condiciones: • Ag multivalente. • Ac bivalente como mínimo. • Concentración adecuada de Ag y Ac. • Concentración adecuada de electrolito. • Temperatura. • Agitación. Se podrá visualizar la reacción secundaria. Cuando los complejos Ag-Ac se van agregando constituyendo micelas, esta micelas cuando adquieren un determinado volumen, y por lo tanto, peso, van a sedimentar haciendo visible la reacción. La velocidad a la cual sedimentan va a ser directamente proporcional al volumen que tiene la micela, a la diferencia entre las densidades de la partícula y del sobrenadante, y a la aceleración de la gravedad. No siempre se pasa de la reacción primaria a la secundaria, ya que se requieren determinados requisitos para esto. Esto no ocurre por ejemplo cuando el Ag es monovalente (por ejemplo con un Hp). Tampoco cuando el Ag tiene un solo determinante antigénico, ni cuando el Ac es monovalente. Cuando se inmuniza a un animal vertebrado inmunológicamente maduro, con la inoculación de un Ag multivalente, con determinantes antigénicos iguales o distintos (mono o poliespecíficos respectivamente), el sistema inmune va a responder produciendo Ac específicos para cada epitope. El suero va a ser una mezcla de Ac dirigidos contra distintos epitopes. Por ello se dice que es poliespecífico. Si se pone en contacto el suero del animal frente al Ag que se utilizó para inmunizar se formaran complejos Ag-Ac mixtos. En un caso particular si se enfrenta el Ag multivalente con un solo determinante antigénico que tiene especificidad para un Ac monoclonal bivalente se va a formar el complejo Ag-Ac, pero no va a dar precipitado porque el determinante antigénico es único. Teoría de la red o de Marrack La formación del precipitado es una consecuencia del modo en como el Ag y el Ac se han unido. Además de tener un Ag multivalente y un Ac bivalente como mínimo, también debe haber relaciones adecuadas entre el Ag y el Ac. Debido a esto pueden ocurrir tres casos: • Un caso donde las proporciones entre el Ag y el Ac son las adecuadas. La relación Ac/Ag depende del PM del Ag, se forman las micelas y se puede observar la formación de un precipitado. • Cuando hay un exceso de Ag respecto de Ac, se forman complejos Ag-Ac que son solubles. • Cuando el Ac está en exceso no alcanza la cantidad de Ag como para formar micelas. La reacción de Ag-Ac es de tipo reversible y se da en condiciones estrictas de equilibrio. El complejo Ag-Ac ante un exceso de Ag pasa a ser soluble. Esto también puede lograrse agregando Hp en exceso, ya que se obtiene la formación de los complejos solubles Hp-Ac.

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B) PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA Permite cuantificar tanto Ag como Ac. Generalmente se desea cuantificar los Ac de un suero de un animal que ha sido inmunizado. Hay dos casos: 1) Cuando se quieren obtener Ac específicos contra un Ag no proteico, como puede ser un polisacárido. En este caso cuando esté formado todo el complejo Ag-Ac, de todo ese complejo lo único que va a ser proteico es el Ac. Se lee el contenido proteico disuelto en NaOH por espectrofotometría a 280nm, ya que a esa longitud de onda las proteínas absorben. Si se grafica µg de Ag añadido vs. mg de proteína Ac en el precipitado se obtiene la curva de precipitación. Se fueron añadiendo cantidades crecientes de Ag, y se van formando mayores cantidades de complejo Ag-Ac, en este caso mayor cantidad de proteína Ac. Esto va aumentando hasta un momento donde la cantidad de proteína Ac precipitada es máxima. Luego, al seguir agregando Ag la cantidad de proteína Ac precipitado va a ir disminuyendo. Si al sobrenadante de cada tubo se lo divide en dos y a uno se lo enfrenta al Ag que se utilizó para hacer la curva, y al otro al Ac, en los primeros tubos van a dar reacción (+) cuando se enfrente al Ag, ya que se tienen Ac sin reaccionar. Esta se llama zona de exceso de Ac. En los últimos tubos cuando lo enfrente al Ac va a dar reacción (+), es la zona de exceso de Ag. En el lugar donde se alcanza el pico máximo, con mayor cantidad de proteína Ac precipitada, tanto frente a Ag como frente a Ac el sobrenadante dará reacciones (-). Esta zona o tubo donde hay doble reacción (-) es la zona de equivalencia, y corresponde a la zona donde la precipitación es máxima y es total para todos los Ac precipitantes. 2) Cuando se quiere valorar un suero que se obtuvo por inmunización con un Ag proteico. Hay dos casos: a) El Ag es una proteína, pero tiene un marcador que es un Hp con la capacidad de dar una señal. Por ejemplo el DNP tiene la propiedad de poder absorber a 360nm. Se realiza el mismo procedimiento anterior pero con dos lecturas: la lectura a 280nm se va a leer el complejo Ag-Ac como proteína total. La lectura a 360nm se puede determinar la cantidad de Ag. La diferencia entre la concentración del complejo Ag-Ac (280nm) en la zona de equivalencia y la cantidad de Ag (360nm), puede determinar la concentración de Ac. b) El Ag proteico es una molécula compleja, como la OA, sin marca. El protocolo de trabajo es exactamente el mismo, pero en este caso debe determinarse la zona de equivalencia haciendo la determinación cualitativa a través del método del anillo. Se hace también una lectura espectrofotométrica a 280nm del precipitado en la zona de equivalencia que corresponde al complejo Ag-Ac, y se le resta la cantidad de Ag agregado. INHIBICIÓN DE LA PRECIPITACIÓN POR EL AGREGADO DE H p El Hp es la parte reaccionante del Ag, es la región específica que se une al Ac. Si el suero que contiene los Ac se lo enfrenta al Hp, se formará una interacción primaria por la unión Ac-Hp que no es visible. Esto se puede hacer cualitativa o cuantitativamente, y la lectura se hace al 50% de inhibición. Se usa para hacer estudios de especificidad de Ac y también para hacer estudios de Hp que estén relacionados y comparar esas afinidades con el Ag.

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REACCIONES DE FLOCULACIÓN En ellas hay precipitado abundante en la zona de equivalencia. Lo que ocurre en la zona de exceso de Ag y de exceso de Ac es una redisolución del precipitado. Esto se debe a una característica del Ac. El caso típico es cuando se inmuniza el caballo con proteínas como la toxina tetánica o difteria. Los sueros H (de horse: caballo) son sueros que floculan. Los sueros R (de rabit: conejo) son precipitantes. PRECIPITACIÓN EN MEDIO GELOSADO Estos métodos se pueden realizar porque las macromoléculas tienen la propiedad de poder difundir por un medio que contiene geles. Esa difusión va a estar limitada por la cantidad de gel que haya en el medio. Mucha concentración de gel va a poner mucha mayor resistencia a la difusión de la macromolécula. Obviamente el agar debe estar disuelto en una solución de electrolitos adecuada: NaCl 0,15M (fisiológica). Si en una placa de gel practicamos dos pocillos, en uno se siembra un Ag y en el otro pocillo se siembra el Ac correspondiente, estas macromoléculas van a ir difundiendo y cuando se encuentren, si existe especificidad, es decir, si son complementarias, aparecerá una banda de precipitación. Los geles que se pueden usar para hacer la precipitación por geles pueden ser varios: pectina, poliacrilamida, acetato de celulosa, agar. Las técnicas que se basan en la precipitación en medio gelosado pueden ser cualitativas o cuantitativas. A) DIFUSIÓN SIMPLE MONODIMENSIONAL (técnica de Oudi n simple) La técnica consiste en colocar en un tubo de ensayo una mezcla de agar disuelto en solución fisiológica y el suero a investigar, mezclado en partes iguales. Se deja solidificar y después se coloca por encima una solución del Ag conocido disuelto en solución fisiológica. Se deja difundir, y en una zona próxima a la interfase entre el agar y la solución del Ag no se va a ver precipitado porque el Ag va a difundir por el agar y como estaría en mucha mayor proporción se producirá redisolución del precipitado. Cuando se llega a las concentraciones adecuadas, si existe especificidad, aparecerá una banda de precipitación Ag-Ac específica en una determinada posición dentro del gel. Este sistema sencillo permite discernir si hay especificidad Ag-Ac, y además permite diferenciar si hay más de un sistema Ag-Ac interaccionante. B) DIFUSIÓN SIMPLE BIDIMENSIONAL En esta técnica se coloca en la parte inferior del tubo de ensayo agar al 1% en solución fisiológica mezclado en partes iguales con el suero a investigar. En una fase intermedia se pone agar disuelto en solución fisiológica, y en una tercera fase superior se coloca nuevamente agar disuelto al 1% en solución fisiológica mezclado en partes iguales con la solución antigénica. Nuevamente va a haber difusión, el Ag migrará hacia abajo y el Ac hacia arriba, y si existe especificidad Ag-Ac aparecerá una banda de precipitación en la zona del agar solo. En este sistema también se puede investigar si hay especificidad Ag-Ac, si hay uno o varios sistemas interaccionantes, y la posición de la banda da información sobre las concentraciones relativas del Ag y el Ac.

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Si la banda de interacción aparece en una zona intermedia del agar solo se puede decir que las concentraciones del Ag y del Ac son correspondientes a la zona de equivalencia. Esto no significa que sean iguales, sino que la proporciones son las adecuadas como para producir el fenómeno de precipitación. Si la banda aparece cerca del gel que contiene el Ag se debe a que el Ac está en exceso, por ello tuvo que migrar mucho más hasta llegar a las concentraciones adecuadas del Ag. Cuando el Ag está en exceso la migración de éste va a producir redisolución del precipitado hasta que se llegue a las concentraciones adecuadas y se forma la banda, en este caso cerca del gel con el Ac. C) DOBLE DIFUSIÓN BIDIMENSIONAL (Método de Ouchterl ony) Este método consiste en preparar una placa con el agar disuelto en solución fisiológica y homogéneamente distribuido. Se practican dos orificios, en uno se siembra el Ag y en el otro el Ac. Se va a producir la difusión en forma radiada, y si se dan las condiciones óptimas, aparecerá una banda que indica que hay especificidad Ag-Ac. Si hay más de un sistema interaccionante se verán varias bandas. Siempre permite identificar el mínimo de sistemas interaccionantes. Puede darse el caso de que un sistema no se halle en las proporciones adecuadas, por lo tanto no dará banda, y también puede ocurrir superposición de bandas. Este sistema nos da información acerca de si hay o no especificidad Ag-Ac, si hay más de un sistema interaccionante, según la posición de la banda se puede tener idea de las concentraciones relativas de Ag y Ac (siempre la banda se aproxima más al más diluido). El espesor de la banda nos indica si hay mucha o poca cantidad de Ag y Ac. Otra información que se puede obtener es sobre el PM. Cuando el PM del Ag es aproximadamente igual al PM del Ac la banda será recta, si los PM son distintos, la banda será curva, y esa curvatura será cercana hacia el de mayor PM. Esto se corresponde con las leyes de la difusión, que dicen: “La distancia a la cual una sustancia difunde está en relación directa con su concentración (a mayor concentración mayor migración) y a su vez está en relación inversa a su PM (a mayor PM menor migración)”. Otro tipo de información que es muy útil y que se puede obtener a partir de esta técnica es sobre la similitud antigénica entre dos o más soluciones enfrentados a un antisuero obtenido contra ellos. Ochterlony observó que entre los dos Ag analizados pueden darse tres tipos de reacciones: 1. Reacciones de identidad, cuando aparecían bandas que se fundían y era que los Ag compartían los mismos determinantes antigénicos. 2.Reacciones de no identidad, cuando cada sistema Ag-Ac actúa de manera independiente uno del otro, por lo cual las bandas se cruzan. 3.Reacciones de identidad parcial, se da cuando un Ag comparte algunos determinantes antigénicos con otro, entonces aparece un espolón que apunta al Ag con menor determinantes antigénicos. D) DIFUSIÓN SIMPLE EN PLACA O DIFUSIÓN RADIAL Es una técnica muy importante como método cuantitativo, permite cuantificar Ag aún en muy pequeñas cantidades. Esto es posible por la forma en que se prepara la placa: se coloca una placa de agar al 3% en solución fisiológica mezclada en partes iguales con el suero monoespecífico del Ag que se quiere estudiar. Si en los pocillos se siembra el Ag aunque esté con impurezas, si está el Ag, va a interactuar solamente con su Ac monoespecífico que está homogéneamente en concentración constante en la placa de agar.

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Como la concentración de Ac es constante en toda la placa, el Ag va a difundir en forma radial y el diámetro del halo va a ser directamente proporcional a la concentración del Ag en el pocillo. Se deja difundir hasta halo constante, y se siembran junto con la muestra tres disoluciones patrones de Ag de concentración conocida, junto con testigos. Se construye una curva de calibrado graficando el r2 de los halos testigos vs. concentración de Ag. Luego se entra con el r2 de la muestra y obtenemos su concentración en mg/ml. Todo producto comercial trae ya su tabla con los diámetros de halo y su correspondiente concentración, por lo tanto no es necesario sembrar testigos. Este método permite cuantificar Ag en mezclas complejas aún en cantidades mínimas. E) REOFORESIS Es una técnica que utiliza una placa de agar disuelta en solución fisiológica. Se hacen pocillos, en el centro se siembra el Ac y en la periferia distintos Ag. Por fuera de todos los pocillos se hace una canaleta circular donde se pone buffer. Se tapa con una tapa que posee un orificio central. Se va a producir una evaporación del buffer y la corriente de evaporación va a salir hacia el orificio, y en el gel también se va a formar una corriente. Esto va a facilitar la migración de los Ag de forma convergente al centro. Entonces van a aparecer las bandas de precipitación Ag-Ac entre los pocillos de Ag y de Ac, y la ventaja de este método es que las bandas se ven más nítidas. F) INMUNOELECTROFORESIS Es un método analítico y está basado en dos procesos, una combinación de dos metodologías. La primer etapa consiste en una separación electroforética de las proteínas de la muestra antigénica. En una segunda etapa se siembra un antisuero específico contra el Ag que se separó en la primer etapa. Es la etapa de inmunodifusión. En la zona que exista interacción específica aparecerán bandas de precipitación. La ubicación de la banda de precipitación va a depender de la movilidad electroforética y de la velocidad de difusión de cada Ag que constituye la muestra. La primera etapa aprovecha la capacidad que tienen las macromoléculas de tener carga según el pH del medio. Las proteínas son anfóteras. Se trabaja generalmente con un buffer pH = 8,4, en el cual la mayoría de las proteínas del plasma tendrán carga (-). Entonces, en una electroforesis van a migrar al polo (+) o

Diferencias entre Ac monoclonal y Ac monoespecífico El Ac monoclonal es un Ac que es químicamente idéntico en su patrón molecular. Es decir, en una solución de Ac monoclonal todas las moléculas son idénticas, hasta en su especificidad por el Ag. En cambio, un Ac monoespecífico es aquel Ac o suero que tiene un conjunto de Ac que van a reconocer un mismo determinante antigénico, pero son distintos paratopes los que actúan. Recordar que la unión del epitope con el paratope no es específica, hay complementariedad, es por eso que pueden existir distintos paratopes que sean capaces de interactuar con un mismo epitope. Un monoclonal es siempre el mismo paratope el que reacciona, repetido millones y millones de veces.

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ánodo. La intensidad de la carga depende de la diferencia que existe en unidades del pH de trabajo y el pI. Fenómeno de electroendosmosis Es un movimiento opuesto al campo eléctrico. Esto ocurre porque el gel no es eléctricamente neutro, y al pH=8,4 de trabajo las moléculas de agar adquieren carga (-). Como se usa medio acuoso, las moléculas de agua se cargan (+) y en presencia de un campo eléctrico se desplazan las moléculas de agua hacia el cátodo. La fuerza del flujo electroendosmótico va a variar según el soporte o gel que se utilice. De esto depende donde se colocará el punto de siembra. La inmunodifusión va a consistir en sembrar el antisuero correspondiente. G) INMUNOFIJACIÓN Se hace en acetato de celulosa, se siembra el Ag y se hace una electroforesis común. Se obtiene la separación de todas las porciones del suero. Se agrega luego el Ac y la banda de precipitación permite localizar la posición del Ag buscado. Entonces, sabiendo la posición agrego a otras tres placas distintos isotipos de Ig, se deja interactuar y se hace la coloración. Se utiliza cuando se quiere investigar mielomas, detectar gamapatías monoclonales, que da una banda muy intensa en la electroforesis en el sector de las γG. Con el enfrentamiento de las distintas Ig se puede determinar cual es el isotipo que está aumentando. Con Ac monoclonales se puede determinar qué tipo de cadena está afectada en la gamapatía: λ o κ. H) INMUNOELECTROFORESIS O ROCKET ELECTROPHORESYS Es un método cuantitativo, consiste en preparar una placa de agar que tiene disuelto homogéneamente el Ac monoespecífico. Se siembra el Ag junto con distintos patrones y se aplica un campo eléctrico. Se va a producir la migración del Ag y van a aparecer picos, porque a medida que el Ag migra se produce redisolución del precipitado hasta que alcanza las concentraciones adecuadas donde aparecerá una banda. Si se siembra un patrón puede cuantificarse el Ag. I) CROSSING-OVER ELECTROPHORESIS O CONTRA INMUNOELECTRFORESIS Como las Ig van a migrar en una placa de agar hacia el polo (-) por un efecto electroendosmótico, y la mayor parte de las proteínas del plasma que pueden presentar Ag contra esa Ig van a migrar hacia el polo positivo, se van a encontrar y va a aparecer una banda de precipitación entre los dos pocillos. Es una técnica cualitativa que va a permitir identificar al Ag.

Ac Ag

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REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Para que se dé el fenómeno de aglutinación se describen dos etapas. La interacción primaria que no es visible, se produce cuando se ponen en contacto el Ag con su correspondiente Ac. Se produce así un complejo primario, que es prácticamente independiente de la temperatura, de la concentración de electrolito, etc. Solo es necesaria la especificidad Ag-Ac. Si se dan otras condiciones: • Ag multivalente • Ac bivalente • Proporciones adecuadas entre Ag y Ac • Se ve favorecido por la concentración de electrolito adecuada (NaCl 0,15M) y es acelerado por la temperatura (37ºC) y la agitación. Si se cumplen todos los requisitos y los factores que lo favorecían se va a poder visualizar el fenómeno de interacción de manera visible. Esto se llama reacción secundaria y se produce in vitro. Según el tipo de Ag se va a producir precipitación o aglutinación. Para la aglutinación el Ag debe ser particulado. Los fenómenos de aglutinación sirven para hacer determinaciones cualitativas y también semicuantitativas. DETEMINACIONES CUALITATIVAS Sirven para investigar tanto un Ag o un Ac, dependiendo de lo que se tenga conocido. Un uso muy común es para investigar Ag en un muestra incógnita, un inmunógeno microbiano. Se hace una suspensión del suero, y si se dispone de un antisuero específico para distintas especies bacterianas, se puede identificar mediante la aglutinación específica. Es para identificar Ag hemáticos, Ag ubicados en la superficie de los glóbulos rojos. Importante: el control negativo es simplemente una suspensión de microorganismos con solución fisiológica (NaCl 0,15M). Permite identificar las aglutinaciones inespecíficas. Con ello se diferencia lo que es una suspensión de un aglutinado. También se pueden hacer investigaciones cualitativas de la presencia de Ac específicos. En un suero incógnita, si se dispone del Ag conocido se puede enfrentar al Ag conocido con el suero incógnita. En un banco de sangre, cuando hay que garantizar que una persona tenga un grupo sanguíneo determinado, no solamente se hace la determinación de antígenos en la superficie del GR, sino que se hace una contraprueba. Si se determina que una persona tiene grupo sanguíneo A porque dio un aglutinado positivo. Si es así, en su suero existen Ac naturales (isoaglutininas) tipo anti-B. Se enfrenta el suero del paciente con GR B, y deben dar aglutinación. VALORACIONES SEMICUANTITATIVAS En aglutinación no hay un método cuantitativo. Los métodos que se emplean son semicuantitativos.

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Se informa siempre un título, que es la inversa de la máxima dilución aglutinante. Con estos métodos se puede hacer un seguimiento de una enfermedad provocada por una bacteria. Cuando hay un incremento de un solo tubo no es significativo, pero con diferencias de dos o más tubos en función del tiempo sí es evidencia de infección bacteriana, porque el microorganismo se va reproduciendo y está haciendo reestipulaciones. Según el tiempo que se emplea para hacer la lectura se va a tener metodologías de aglutinación rápida y lenta. Las reacciones de aglutinación rápida van a usar el Ag en una concentración mucho mayor. La técnica se realiza directamente en una placa de vidrio, se colocan volúmenes decrecientes del suero directo y se lo enfrenta al Ag en una cantidad constante. Se mezcla con varilla y se lee de 3 a 5 minutos. Se informa también un título que se asigna por convensión. AGLUTINACIÓN LENTA EN TUBO: se utilizan diluciones crecientes del suero. �el título es la inversa de la máxima dilución aglutinante. AGLUTINACIÓN RÁPIDA EN PLACA: se utilizan volúmenes decrecientes del suero �el título se asigna por convensión. FENÓMENO DE PROZONA Se produce cuando hay exceso de Ac, ya que al haber mucha cantidad de Ac, como los dos Fab son de alta afinidad, los dos Fab se unen a determinantes antigénicos de la misma molécula de Ag. Entonces, aunque parezca que no hay interacción AgAc específica, lo que ocurre es que hay tantos Ac que no se ve la real. Debe hacerse una dilución del suero. ANTICUERPOS INCOMPLETOS (REACCIÓN DE COOMBS) Cuando se hacen estimulaciones con Ag particulados a repetición pueden obtenerse Ac incompletos. Respuesta inmune: 1º estimu- 2º estimu- 3º estimu- lación lación lación

IgG

IgM

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La IgG es una inmunoglobulina que reúne Ac con distintas características: Las IgG que tienen la capacidad de precipitar o aglutinar, las que se llaman coprecipitantes o bloqueantes, y las no precipitantes. Cuando el Ag es soluble, la mayor cantidad, del 70 al 80%, son Ac precipitantes, con ambos Fab de alta afinidad. De los coprecipitantes o bloqueantes y los no precipitantes, cada uno de ellos representa un 10% de la IgG. Por más que se reestimule, la mayor cantidad de Ac que producen los Ag solubles son Ac precipitantes. • Ac coprecipitantes o bloqueantes tienen un Fab con alta afinidad por el Ag y el otro, debido a que tiene un residuo de manosa, tiene baja afinidad. • Ac no precipitantes tienen los dos Fab con tan baja afinidad que no se unen al Ag. Representan siempre el 10% de las IgG, sin importar si la estimulación se hizo con un Ag soluble o particulado. Cuando se estimula con Ag particulados se producen también estos tres tipos de Ac. Pero cuando el estímulo se hace a repetición empiezan a aumentar mucho los bloqueantes, y disminuyen aquellos que tienen la capacidad de aglutinar. Los bloqueantes pueden aumentar del 30 al 70% de las IgG. Para investigar estos Ac hay tres métodos: Por bloqueo: en una batería de tubos se coloca una cantidad constante del Ag. Se agrega un volumen constante del suero a investigar y se hacen diluciones razón 2. Entonces se van a unir los Ac bloqueantes al Ag, pero como va a ir aumentando las diluciones, va a empezar a quedar Ag libre. En un segundo paso se añade, después de lavar los precipitados, una cantidad constante de Ac específico contra el Ag, pero bivalente. Si en el primer tubo había Ac incompletos, ya van a estar todos los determinantes antigénicos bloqueados y entonces el Ac bivalente no va a dar aglutinación. Esto se llama inhibición de la aglutinación. Como luego se fue agregando diluciones crecientes del suero, empiezan a aparecer determinantes antigénicos libres y cuando se agregan los Ac bivalentes va a aparecer aglutinación. El resultado se informa como la última dilución que produce inhibición. Por conglutinación: el medio de reacción no solo tiene solución fisiológica sino además la proteína albúmina al 2 %. Se hace la dilución del suero razón 2 con esta solución. El Ag también se prepara en la misma solución de albúmina al 2%. En este caso se va a producir aglutinación en caso de haber Ac incompletos. El título se expresa como antes. Esto se explica porque en el suero están las proteínas del complemento. Una de las proteínas es la fracción C3. Esta se une al complejo Ag-Ac incompleto, la albúmina tiene conglutininas, que tienen la capacidad de unirse a los residuos hidrocarbonados de la proteína C3, y así se forma un aglutinado. Además la albúmina ayuda a neutralizar cargas. Por reacción de Coombs o de la antiglobulina: se agrega el Ag frente al suero y se lo deja en baño a 37ºC para que se produzca la interacción Ag-Ac. No aparece aglutinado. Se lava para eliminar todas las proteínas que no interaccionaron. En el control negativo no se pone suero sino solución fisiológica. Después se agrega Ac anti-especie contra la especie que produjo los Ac bloqueantes. Entonces se va a producir aglutinado.

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AGLUTINACIÓN PASIVA Consiste en transformar al Ag soluble en particulado. Se puede usar como soporte distintos tipos de Ag particulados, partículas inertes como bentonita, poliestireno, colodión o GR. Si se elige como soporte el GR se llama hemaglutinación pasiva. Cuando el Ag soluble es hidrato de C, la unión se hace por mezclado directo. Cuando el Ag soluble es una proteína hay que hacerle un acondicionamiento previo al GR por tratamiento con ácido tánico, aldehído o CrCl3. Cuando se agrega el Ag soluble se une firmemente al GR. Se dice que el GR está sensibilizado. Cuando se analice un suero con Ac específicos contra el Ag, se observará un fenómeno de aglutinación. REACCIÓN DE FIJACIÓN DE COMPLEMENTO El complemento es un conjunto de proteínas con actividad enzimática, una actúa sobre la siguiente y finalmente se obtiene un complejo que va a tener la capacidad de fijarse de manera inespecífica a cualquier complejo Ag-Ac presente. Si el Ag es un GR se va a producir la hemólisis. Una reacción serológica utiliza como material biológico un suero. La hemolisina es un Ac contra el GR. Se hace en dos etapas: 1) se coloca el suero incógnita frente al Ag. Luego se añade C en una dilución apropiada. Si hay especificidad se formarán complejos Ag-Ac y el C se unirá a estos complejos. No se observa nada. 2) se añade GR unido ya a su hemolisina. Esto se llama sistema hemolítico. Si el C ya está unido a otro sistema Ag-Ac, no va a haber C libre como para unirse al sistema hemolítico no va a haber lisis. Si en la primera etapa no hubo especificidad Ag-Ac, al agregar el sistema hemolítico el C que está libre se unirá al complejo GR-hemolisina y se producirá la hemólisis. � NO LISIS: especificidad Ag-Ac. �LISIS: no hay especificidad Ag-Ac. Este método también se puede realizar de forma semicuantitativa, informando un título.

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RESPUESTA INMUNE DE LAS MOCOSAS

Las mucosas son una puerta de entrada muy importante para los Ag. Esto se debe a que existe una gran superficie mucosa, unos 400 m2, por eso deben tener un sistema inmune adecuado para poder impedir la entrada de esos agresores. En particular, la mucosa del sistema gastrointestinal está poblada de una gran cantidad de microorganismos. Estos se denominan microorganismos comensales y no ocasionan daño. Se ha visto que la presencia de esos microorganismos es fundamental para un adecuado funcionamiento del sistema inmune. Se han hecho experimentos en animales, criados en condiciones asépticas, sin gérmenes y el desarrollo de los órganos del sistema inmunológico es deficiente, y esos animales tampoco pueden montar respuestas inmunes adecuadas. La presencia de estos microorganismos comensales en la mucosa gastrointestinal es de suma importancia para un adecuado montaje de la respuesta inmune, y para un adecuado desarrollo de todos los órganos que participan en el montaje de la respuesta. Los agentes agresores se encuentran con una primer barrera mecánica en las mucosas que es el moco. Todas las mucosas, tanto del tracto respiratorio como del digestivo poseen secreción de moco. Esto está impidiendo la entrada de determinadas bacterias. La estructura de una mucosa es:

- Una capa de células epiteliales. - Una membrana basal. - Un tejido conectivo o lámina propia, donde van a estar ubicadas las

células efectoras. En las mucosas vamos a encontrar sitios inductivos o inductores, que son los lugares donde se van a generar la respuesta, y también sitios efectores, que son los lugares donde van a actuar las distintas células generadoras. Existe una interrelación muy importante entre todas las mucosas de los diferentes tractos. Es decir, las células que se produzcan en determinados sitios inductivos van a poder actuar en sitios alejados a los lugares donde se produjeron. Los sitios inductivos del tracto respiratorio se pueden dividir es sitios inductivos del tracto respiratorio superior (NALT): las amígdalas, las adenoides, y los tejidos linfoides asociados a los bronquios, que se conocen como BALT. Después en el tracto gastrointestinal las placas de Peyer por un lado y los ganglios mesentéricos y el apéndice por otro. Las células que se generan en los sitios inductores van a poder actuar en las glándulas salivales y lagrimales, en los bronquios, en las glándulas mamarias, en el intestino delgado y grueso y en el tracto urogenital. Esto se debe a las moléculas de adhesión que tengan, a los receptores para quemoquinas y a las quemoquinas que expresen. Las mucosas tienen funciones importantes, una de ellas es la de inducir tolerancia, sobre todo la mucosa gastrointestinal, hacia los Ag locales. Se está sometido a un ingreso muy importante de Ag durante la dieta. Sin embargo, estos Ag no desencadenan respuestas inmunes. Entonces, una función de la mucosa gastrointestinal es generar tolerancia ya sea a los Ag dietarios o contra los microorganismos comensales.

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La otra función es la de la vigilar o la de montar una respuesta adecuada contra los Ag patógenos. MUCOSA GASTROINTESTINAL En la mucosa gastrointestinal van a estar las células epiteliales intestinales. Todas ellas se originan a partir de precursores comunes, que se encuentran en las bases de las criptas de Lieberkühn. Son células madres, que a partir de ellas se van a originar todas las células epiteliales: los enterocitos, las células caliciformes que van a producir el moco, las células enteroendócrinas y la células M. Entonces, a partir del mismo progenitor común en la mucosa gastrointestinal se van a originar todas estas células, que tienen como principal función la de ser barreras mecánicas para evitar la entrada de agentes extraños. Para poder ejercer esta primera función tienen uniones entre células que son muy estrechas. En esas uniones intervienen complejos macromoleculares con distintas proteínas. Estas proteínas son claudinas, ocludinas y zonulinas. Estas producen una interacción muy estrecha e impiden la entrada de moléculas que tengan diámetros mayores a los 6-12 A, o PM mayor a los 500-900 Da. La expresión de estas proteínas está regulada por citoquinas, por la presencia de toxinas bacterianas y también por la acción de distintos fármacos. En particular las citoquinas inflamatorias como la IL-6 y TNF-α lo que hacen es disminuir la expresión de estas proteínas. Al disminuirse va a aumentar la permeabilidad y va a permitir el ingreso de Ag. En cambio, otras citoquinas como la IL-10 y TGF-β aumentan la expresión, por lo tanto van a aumentar la resistencia al pasaje de agentes agresores. Por otro lado, producen glicoproteínas que van a constituir el moco, algunos factores del complemento, que son las fracciones C3, C4 y el factor B. También producen péptidos antimicrobianos: las defensinas α y β, la bactofenina y la lisozima. El principal Ac que se encuentra en las mucosas es la IgA. Se pueden encontrar todos los tipos de Ig, pero la mayoritaria es la IgA. La IgA de las secreciones es de forma dimérica, a diferencia de la IgA sérica que es monomérica. Hay dos clases de IgA: la IgA1 y la IgA2. La IgA1 es mayoritaria en el intestino delgado y la IgA2 es mayoritaria en el intestino grueso. Cuando hay deficiencias en la producción de IgA, pasa a ser la principal en producir el mecanismo de defensa la IgM, que aumenta su producción y la suplanta. La función de la IgA de mucosas es la de neutralizar bacterias, virus y toxinas. La IgA no activa complemento (C) por la vía clásica, esto es beneficioso ya que al haber tantos complejos Ag-Ac que pueden formarse en las mucosas por la presencia de tantas bacterias, si la IgA activa C se estaría en un constante entorno inflamatorio. Agregados de IgA pueden activar el C por la vía alterna, pero esto no ocurre en condiciones normales. El mecanismo de transporte de la IgA es por transcitosis. Las células epiteliales intestinales tienen una porción apical que se encuentra hacia la luz intestinal, y una porción basolateral o basal que se encuentra hacia el lado de la lámina propia de la membrana basal. Los linfocitos que producen la IgA se encuentran en la lámina propia. La IgA producida en la lámina propia debe ejercer su función en la luz intestinal, por lo cual debe ser transportada. Existe un receptor que es el poli-Ig que es el encargado de captar la IgA que se produce en la lámina propia. Este receptor tiene cinco dominios semejantes a los de Ig, capta a la IgA a través de su extremo N-terminal, la endocita y la

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transporta en una vesícula hacia la región apical. Este transporte se llama TRANSCITOSIS. Cuando llega a la región apical el receptor se corta y una parte queda unida a la IgA y es lo que se llama COMPONENTE SECRETOR. Actuaría ejerciendo una cierta protección sobre la IgA para evitar degradación. Los LB que producen IgA sufrieron un cambio de isotipo o switch, favorecido por la IL-10 y el TGF-β. Estas son citoquinas regulatorias producidas por los LTh2 y los LTh3 o reguladores. Estas citoquinas inhiben a los LTh1, que participan en los procesos inflamatorios. Esto también da una idea de que el entorno de la mucosa es un entorno no inflamatorio, para que no se generen reacciones adversas. Los LB que producen IgA van a dirigirse a estos lugares porque presentan en su membrana determinadas moléculas de adhesión, ellas son la α4β1 y la α4β7. Estos interactúan con determinadas moléculas de adhesión que se encuentren en ciertos epitelios importantes. Los LB que tengan la molécula α4β1 van a llegar a los tejidos de médula ósea y del tracto respiratorio, urogenital y glándulas salivales. En estos lugares hay una molécula de adhesión que es la VCAM1 que es el ligando de la α4β1. Otra cosa que influyen son los receptores para quemoquinas. El CCR10 y el CXCR4 interactúan con quemoquinas que se expresan en la médula ósea y en los tractos respiratorio, urogenital y glándulas salivales. Otra población de LB, que se va a dirigir al intestino delgado, tiene otras moléculas de adhesión. La α4β7, y otros receptores para quemoquinas. Así, los LB efectores que se generaron en el intestino delgado van a poder actuar en las glándulas mamarias, en el colon y en el intestino delgado. Esto indica que hay una comunicación muy importante entre las mucosas. En las células epiteliales hay otro receptor para las Ig que es el FcRn o receptor de Brambell. Es un receptor para IgG y es muy importante para la captación de la IgG del recién nacido, quien recibe la IgG a través del calostro. Se unen dos moléculas del receptor al Fc de la IgG. Este receptor va a estar en la porción apical del enterocito, porque capta una Ig que está en la luz intestinal. En la producción de la IgA participan los LB1, que no necesitan de la colaboración T y que producen en su mayoría IgM, pero también producen IgA. Parece ser que son los que responden a todas las bacterias comensales que se encuentran en el intestino. SITIOS INDUCTIVOS Tanto en el tracto gastrointestinal como en las vías respiratorias superiores se han desarrollado sitios específicos para la captura, procesamiento y presentación antigénica que, en conjunto, se denominan sitios inductivos Los sitios de inducción de respuesta inmune en la mucosa intestinal son fundamentalmente las placas de Peyer, los ganglios mesentéricos, el apéndice y hay también pequeños agregados linfoides. En las placas de Peyer, el tejido linfoide asociado está muy relacionado con el epitelio que lo separa de la luz y forma una unidad integrada llamada FAE (epitelio asociado con el folículo), en la que el elemento distintivo es la célula M. Tanto las células epiteliales como las células M se originan en las criptas a partir de células progenitoras. La proximidad del folículo linfoide genera un gradiente de señales que estimula la diferenciación a células M.

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Las células M tienen poco ribete en cepillo, secretan muy poca mucosidad, no tienen prácticamente glucocalix, tampoco tienen enzimas degradativas y no participan en el transporte de la IgA. Este tipo de célula está en estrecho contacto con las células efectoras, con los linfocitos, los macrófagos y cd. Su función es la de permitir el pasaje de Ag: bacterias, parásitos, virus. Algunos agentes se valen de este punto de entrada para poder diseminarse, como por ejemplo el virus del polio. Los Ag que penetran por las células M van a poder ser captados por las células dendríticas o los macrófagos, para que se inicie una respuesta. Las células M, para captar el Ag, pueden reconocerlo a través de receptores e internalizarlo mediante vesículas de clatrina, por endocitosis en fase fluida o por fagocitosis. La célula M no es una célula presentadora de Ag, solamente permite el pasaje. Una vez que pasan por las células M, los Ag pueden ser captados por las células dendríticas. Las cd son bastante abundantes en la lámina propia. Hay distintas poblaciones de células dendríticas: algunas inducen tolerancia, otros favorecen la respuesta y tienen la particularidad de que pueden emitir prolongaciones, algunas de las cuales pueden pasar entre dos enterocitos, y van a poder reconocer y captar Ag que se encuentren en la luz intestinal. Para ello deben expresar las moléculas de adherencia a las células epiteliales, por ejemplo moléculas de claudinas. Estos Ag son procesados y llevados a los ganglios mesentéricos o a las placas de Peyer para presentarlos a los LB. También las cd pueden captar los Ag que atraviesan las células M y los Ag también pueden atravesar los enterocitos, por entre dos de ellos si la impermeabilidad está alterada (paracelular), o por un proceso de transcitosis (transcelular). Estos mecanismos no son muy eficientes en forma individual, pero si se tiene en cuenta la gran superficie mucosal, estos mecanismos se tornan relevantes. En los ganglios mesentéricos o las placas de Peyer los LT van a reconocer los Ag presentados por las cd, se van a transformar en LT efectores y van a poder salir de los ganglios mesentéricos, entrar a circulación, por el conducto torácico y se van a trasvasar a los sitios efectores. Los LB y los LT van a poder encontrarse en las placas de Peyer, donde van a estar los linfocitos vírgenes y van a ser impactados por el Ag. En la lámina propia y los linfocitos intraepiteliales van a ser linfocitos efectores. �los linfocitos van a encontrarse en tres sitios: - Placas de Peyer, que son los linfocitos que también se encuentran en los órganos linfoides secundarios: LTCD4+ y LTCD8+, son mayoritarios los LTCD4+ con perfil Th2. -Los LT efectores van a ser los de la lámina propia y los linfocitos intraepiteliales. Estos linfocitos efectores van a tener un fenotipo de memoria, van a expresar la molécula CD45RO y van a ubicarse en la lámina propia o entre los enterocitos por las moléculas de adhesión que tienen. Los que se ubican en la lámina propia van a tener la molécula α4β7, la cual es reconocida por un receptor presente en la vasculatura de la mucosa intestinal. Esa molécula α4β7 no va a estar en los linfocitos intraepiteliales, de los cuales la mayoría son CD8+. Algunos de los linfocitos intraepiteliales presentan la molécula CD8 que va a estar formada por cadenas α, es decir un dímero αα. Además van a tener un receptor TCR de tipo αβ o de tipo γδ. Un 50% de ellos tienen el TCR γδ, y estos también tienen un receptor de células NK, el receptor NKG2D, que reconoce MHC no

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clásicas: MIC-A y MIC-B que se expresan en condiciones de estrés. Entonces estos linfocitos son capaces de destruir células epiteliales que se hayan infectado. La luz gastrointestinal está poblada de numerosos microorganismos, pero que, sin embargo, no generan una respuesta inmune. No está muy claro cómo es que ocurre esto. Se piensa que la IgA que se encuentra en estas secreciones estaría bloqueando a estos microorganismos y entonces impedirían que fueran reconocidos. Otra explicación sería por los receptores que presenta la flora normal. Las células reconocen a los agentes agresores a través de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP); algunos investigadores sostienen que estas PAMP son diferentes en la flora comensal y en la flora patógena. Otros dicen que la flora comensal no tiene PAMP, o si tienen y son iguales a las demás PAMP, se activan de forma diferente, y estos receptores de la flora comensal no generan una respuesta inmune. Para que se desencadene una adecuada respuesta inmune es necesario un proceso inflamatorio. Parecería ser que estas bacterias comensales no ejercen o no inician la respuesta inflamatoria. Un factor clave para iniciar la respuesta inflamatoria es el factor de transcripción NFK-β, el cual es necesario para la liberación de las citoquinas inflamatorias. La flora comensal estaría ejerciendo una acción inhibitoria de ese factor de transcripción. Parece ser que las células dendríticas que captan los Ag provenientes de los microorganismos comensales, serían células dendríticas tolerogénicas, es decir, que carecen de ciertas señales coestimulantes, por lo tanto no activan a los linfocitos. La tolerancia oral, es decir, la tolerancia que se genera a partir de Ag que ingresan por la mucosa digestiva, depende de la dosis del Ag. Si hay dosis muy altas del Ag se genera tolerancia, que se va a producir por anergia, es decir, una falta de respuesta de los LT, o por una deleción clonal que es la muerte de los linfocitos por apoptosis. Si se está en presencia de bajas concentraciones de Ag, por vía oral, se generan células T reguladoras. En la mucosa están los tres tipos de células T reguladoras: las células T reguladoras naturales que se generan como tales en la médula ósea, y otros dos tipos que son inducibles: Th3 y Tr1. La más importante en la mucosa intestinal es la célula Th3, la cual produce IL-10 y TGF-β que son citoquinas supresoras. Otra cosa importante en la inducción de tolerancia es el tipo de Ag. Los Ag proteicos, que son mayoría en la dieta, son solubles e inducen tolerancia. Es decir, que la tolerancia se induce más fácilmente con los solubles que con los particulados. También es importante el estado de inflamación. En condiciones normales, con una mucosa intestinal intacta, no hay estado de inflamación, se genera tolerancia. Otro factor importante es el fenotipo que tenga el individuo en sus MHC. También es importante la forma en que se administre el Ag. Si se administra de forma tal que puede estar mucho tiempo en el organismo, puede inducir tolerancia. Muchas veces se utiliza este mecanismo de inducción de tolerancia oral como terapéutico, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes. Se trata de inducir a través de la administración oral de un Ag una falta de respuesta contra ese Ag. Así, cuando ese Ag se administre en forma sistémica, no cause una respuesta. También se utiliza para el tratamiento de las alergias. Entonces, cuando ingresa un Ag a las mucosas, se puede generar una inmunidad secretoria y también tolerancia, o alergia. La generación de tolerancia y de inmunidad

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secretora no son autoexcluyentes. Puede ingresar un Ag, generar la producción de IgA, pero a su vez generar tolerancia. INDUCCIÓN DE TOLERANCIA EN LAS MUCOSAS La tremenda carga antigénica que supone la ingesta de alimentos no suele acompañarse por el desarrollo de una respuesta inmune contra sus componentes, sino por un estado de tolerancia (ausencia de respuesta frente a ellos). La modulación de la respuesta inmune mediante la administración de Ag a través de los tractos ha sido reconocida como uno de los mejores métodos para generar tolerancia periférica. La administración de Ag por vía oral o nasal en conjunto con adyuvantes puede emplearse para modular la respuesta inmune, no solo local sino también sistémica. Esta vía constituye una potencial herramienta para la inducción de tolerancia frente a autoantígenos en el tratamiento de diferentes enfermedades autoinmunes. El fenómeno de tolerancia oral puede explicarse por tres mecanismos: • Deleción clonal: la administración oral de una alta dosis de Ag conduce a la deleción por apoptosis de los clones T específicos para el Ag administrado. La inducción de apoptosis por el sistema Fas/FasL desempeñaría un papel central en este fenómeno. • Anergia clonal: los LT se anergizan si el reconocimiento antigénico (señal 1) ocurre en ausencia de la señal 2 (coestimulación). La presentación de Ag a LT vírgenes por parte de los enterocitos o células dendríticas que no expresen un tenor coestimulatorio adecuado podría inducir este fenómeno. • Inducción de LTreguladores (CD4+ CD25+), Tr1 y Th3.

Resumen: El epitelio contribuye de modo crítico a la inmunidad innata en las mucosas. Cumple una función de barrera y reduce el ingreso de Ag desde la luz. Por otra parte, secreta diversos agentes que incrementan la resistencia a la invasión de la mucosa por patógenos. Estos factores pueden ser producidos en forma constitutiva o inducidos por el reconocimiento de PAMPs por RRP expresados en las células que integran el epitelio. Incluyen citoquinas, quemoquinas, glucoproteínas que forman el moco, y una variedad de péptidos antimicrobianos, como defensinas, lisozima, lactoferrina y lactoperoxidasa. La IgA es la Ig mayoritaria de las secreciones y constituye cerca del 80% del total en las lágrimas, la saliva, el calostro, la leche y las secreciones nasales e intestinales. Más del 90% de las IgA de las secreciones se presenta en forma de dímero asociado con el componente secretorio (CS). La IgA secretoria actúa, fundamentalmente, como Ac neutralizante. En el GALT (tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal) es posible diferenciar los sitios donde se genera la respuesta inmune adaptativa, llamados sitios inductores, de aquellos en donde los mecanismos efectores ejercen su acción, llamados sitios efectores. Las Placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos son las principales estructuras organizadas que funcionan como sitios inductivos. En particular, en las placas de Peyer, el tejido linfoide está muy relacionado con el epitelio que lo separa de la luz y forma una unidad integrada llamada FAE (epitelio asociado con el folículo), en que el elememto distintivo es la célula M. Los sitios efectores de la mucosa intestinal comprende una amplia conexión de plasmocitos productores de IgA, células T efectoras CD4+ (Th1 y Th2) y CD8+ (citotóxicas), macrófagos y células NK, dispuestas en forma difusa en la lámina propia.

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La inducción de la respuesta inmune adaptativa requiere que los Ag de la luz intestinal puedan ser reconocidos adecuadamente por LT y LB. Tres diferentes tipos celulares participan en la captura de Ag: células M, células dendríticas y los propios enterocitos. Las células M tienen alta capacidad endocítica y baja capacidad degradativa. Esto permite que los Ag endocitados sean pronto exocitados en la membrana basolateral, que se encuentra en intimo contacto con células dendríticas, macrófagos y linfocitos. Las células dendríticas inmaduras pueden capturar Ag presentes en la luz emitiendo prolongaciones llamadas dendritas, que pasan entre las uniones estrechas y acceden directamente a la luz. El epitelio que recubre el intestino está formado por una monocapa celular con espacios intercelulares sellados por estructuras denominadas uniones estrechas. En condiciones fisiológicas esta capa celular permite, en forma limitada, el pasaje de moléculas desde la luz por dos vías: paracelular (entre los enterocitos) y transcelular (endocitosis y tránsito transcelular). Los LT en el intestino se distribuyen en tres compartimentos anatómicos. Las placas de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos presentan LT en estructuras linfoides organizadas. Estos linfocitos poseen características similares a los LT localizados en los ganglios linfáticos periféricos. En los otros dos compartimentos los LT se distribuyen en forma difusa junto a células no linfoides e incluyen a los LT presentes en la lámina propia y los LT intraepiteliales (LIE), que se disponene en forma individual entre las células epiteliales. Los linfocitos del compartimento intraepitelial son, en su gran mayoria, células T. Más del 80% son CD8+. Presentan marcadores fenotípicos propios de las células T de memoria. No constituyen una población homogenea. Pueden distinguirse en función del TCR que expresan (αβ o γδ) o de las moléculas correceptoras expresadas: TcR α/β CD4+, TcR α/β CD8+ y TcR γδ CD8+. Los LT intraepiteliales TCR αβ+ CD8 αβ+ representan un tipo convencional de céllas T de memoria reactivas frente a Ag extraños, que provienen de órganos linfáticos secundarios. En cambio, los linfocitos TCR αβ+ CD8 αα+ migrarían directamente desde el timo y parecen cumplir funciones asociadas con la modulación (inhibición) de la respuesta inmune local mediando efectos antiinflamatorios protectores de la integridad de la mucosa. Los LT γδ, en particular los que expresan las cadenas γ1/δ1, reconocen moléculas de clase I del CMH no convencionales, como MIC A y MIC B, cuya expresión en el epitelio se incrementa en situaciones de estrés celular. Mediarían la eliminación de células propias alteradas que comprometen la integridad de la barrera endotelial

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EL SISTEMA COMPLEMENTO

Para su mejor estudio, se ha separado la respuesta inmune en la respuesta innata y la adaptativa. Tanto una como la otra tienen elementos celulares y elementos solubles. La inmunidad innata es la primera que se dispara ante la presencia de cualquier agente microbiano. Su especificidad es muy acotada, reconoce estructuras compartidas que se encuentran en el grupo de patógenos, los PAMP o patrones moleculares altamente conservados, a través de los lipopolisacáridos. La especificidad en la respuesta adaptativa es más amplia. La respuesta innata no tiene memoria. Sea el microorganismo que sea, y si es la misma vía de ingreso, el mecanismo de acción de la respuesta innata es siempre el mismo. La adaptativa es específica para cada microorganismo en particular, si el microbio entra por segunda vez la respuesta es mucho más amplia, más amplificada y con presencia de Ac de elevada afinidad y especificidad. La posibilidad de que la respuesta innata monte una respuesta contra algún componente propio es muy difícil. Sí ocurre con la adaptativa. De las proteínas sanguíneas, en la inmunidad innata hay factores solubles. Entre ellos está el complemento, los reactantes o proteínas de fase aguda y los interferones α, β y γ. Las proteínas del complemento son también llamados proteínas de fase aguda. En la respuesta adaptativa los factores solubles son los Ac. El complemento es un sistema proteico, polimolecular, formado por varias proteínas, aproximadamente más de 30, en concentraciones diversas. Algunas están en muy baja concentración (µg/ml) y otras en el orden de mg/ml. Mayer lo definió como un sistema reaccional citocida, es decir, el complemento tiene acción lítica, sobre un GR va a producir hemólisis, sobre una célula produce histólisis y sobre una bacteria, bacteriólisis. Mayer dice que el complemento es un sistema reaccional citocida, que se activa en presencia de complejos Ag-Ac específicos, agregados de γ globulinas y otros materiales. El complemento “complementa” la acción del Ac. Actúa como agente depurador de los complejos inmunes. En el estudio del complemento hay 4 principios rectores: a) En primer término el C aparece en el plasma y circula en forma inactiva. Está presente en casi todos los mamíferos vertebrados. b) Se activan por proteólisis enzimática. La forma con que se activa involucra un potente mecanismo amplificatorio. c) Como es un sistema tan destructivo, con un potencial tan agresivo, requiere estar bajo estrictos mecanismos regulatorios. d) Durante la cascada enzimática se van formando péptidos que tienen una importante función biológica, aumentando notoriamente el potencial inflamatorio. El complemento se activa de tres formas: -vía clásica -vía alterna -vía lectínica

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VÍA CLÁSICA Se activa por la presencia de inmunocomplejos Ag-Ac específicos. Por Ac solos no, requiere la interacción in vivo de ese Ac con su correspondiente Ag. Además no cualquier Ac: IgM, IgG1, IgG2 e IgG3. La primera porción del complemento se va a fijar al dominio CH2 de la IgG, y al dominio CH3 de la IgM.

Si no hay complejos Ag-Ac específicos, puede ocurrir fijación del C al Ac, pero no hay activación en cascada. Se han denominado a los componentes del C pertenecientes a la vía clásica como: C1→ unidad de reconocimiento C2, C3, C4→ unidades de activación C5, C6, C7, C8, C9→ complejo de ataque a las membranas (MAC o CAM) C1 o unidad de reconocimiento tiene forma de ramillete de flores. Está constituido por tres tipos de polipéptidos: C1q, dos C1r y dos C1s. C1q está formado por seis subunidades unidas, cada tres subunidades, a un tallo central. Las zonas están bien diferenciadas: las cabezas globulares y la microfibrillas. Las microfibrillas son muy similares a las fibras de colágeno (son símil colágeno). Las cabezas globulares son las responsables de la unión al Ac. Por los tallos se transmite la señal de activación a las restantes proteínas. El C1r tiene movilidad electroforética γ, está en concentración sérica del orden de los 70-80 µg/ml, es termolábil , es decir se destruye con calor, incluso a temperatura ambiente. Contiene un 20% de hidratos de carbono y un 20% de aminoácidos. Toda la estructura del C1 está estabilizada por puentes disulfuro. Las cabezas globulares tienen aproximadamente 200 residuos aminoacídicos. Cuando el Ac ya está fijado a la membrana, el C1q se une por las cabezas globulares al Fc. Eso induce un cambio conformacional al C1r. El C1r es una β globulina, con movilidad electroforética β, tiene un PM aproximado a 85 KDa y una concentración sérica de 30-35 µg/ml. El C1r produce la activación del C1s y se forma el complejo C1 activado que se lo simboliza como C1. C1q y el C1s tienen actividad serínica de enzima, y actúa frente a dos sustratos: C4 y C2.

CH1

CH2

CH3

IgG�dominio CH2 del Fc

IgM�dominio CH3 del Fc

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AgAc C1q C1r C4 C2 C1s �C1 C4a C2a

C4b C2b

El C1 va a clivar al C4. El C4 se sintetiza como precursor intracitoplasmático. Se secreta al plasma, donde se degradan las regiones globulares y el C4 aparece formado por tres cadenas: α, β y γ. Cuando se cliva el C4 se forma el C4a y el C4b. El C4 es una β globulina termoestable, tiene un peso de aproximadamente de 200 KDa y una concentración sérica de 200 µg/ml. El C4b se ancla en la membrana. Indirectamente, por acción de C1 se cliva C2, que da C2a y C2b. C2a es un pequeño péptido vasoactivo que recibe el nombre de quinina. C2 es una β2 globulina y tiene una concentración sérica del orden de los 30 µg/ml. Las porciones C4b y C2b se unen para formar una enzima que se llama CONVERTASA DE C3 (C4b2b). C3 es una globulina termoestable, tiene movilidad electroforética β, contiene 3% de hidrato de carbono y está en una concentración sérica de 1400-1500 µg/ml. También se sintetiza como un precursor citoplasmático en forma de cadena única. Se libera al plasma y por unión de la convertasa C3, que es la C4b2b se va a clivar en C3a y C3b. El C3a es una anafilotoxina quimioatractante. C3 C4b + C2b = C4b2b C3a C3b C3b se acopla a C4b2b y forma la CONVERTASA DE C5 (C4b2b3b). C4b2b3b actúa sobre C5 clivándolo en C5a y C5b. C5a tiene potentes acciones biológicas. El C5 es una β1 globulina y contiene un 20% de hidrato de carbono, la concentración sérica está en el orden de los 200 µg/ml. El C5b se fija a la membrana, próximo a C4b2b3b. Ahora comienza una cascada donde se activan proteínas y se pegan formando un macrocomplejo, primero C6, luego C7 y C8. El C8 tiene una cola hidrofóbica que le permite anclarse en membrana. El complejo C5bC6C7 es bastante inestable, el C8 tiene una cadena α, hidrofóbica, que cuando se une le permite anclar el complejo. Cuando se forma el complejo C5bC6C7C8 comienza la activación y polimerización de una proteína integral que es la C9. Se acoplan muchas moléculas de C9 que se van polimerizando hasta formar un canal transmembrana, que es un poro en la membrana plasmática. Esto produce la salida de componentes celulares, la entrada de iones y agua, hasta producir la lisis. Es importante la presencia de Ca2+ y Mg2+ para la activación de esta cascada.

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VÍA ALTERNA Tanto la vía alterna como la lectínica son vías de activación del C más antiguas desde el punto de vista evolutivo. Ambas no requieren la presencia de Ac. Se desencadenan ni bien se detecta la presencia del microorganismo patógeno. A bajas tasas moduladas aparece C3b aún cuando no hay inflamación. Es decir, que normalmente en fase fluida actúa como una opsonina, y se activa por presencia de ciertas estructuras que tienen los microorganismos patógenos: polisacáridos, lipopolisacáridos, manosas, los PAMPs. Entonces, la vía alterna se activa en presencia de estructuras microbianas como lipopolisacáridos, polisacáridos, manosas, poliósidos. La presencia de bajas concentraciones de C3b en fase fluida se debe a que existen proteasas específicas que actúan sobre C3, dando proteólisis. Si la vía clásica se activa, obviamente habrá niveles comprobables de C3b en plasma. En la acción de la vía alterna hay factores que intervienen en la cascada. Los componentes del C que intervienen en la vía alterna son: • C3 proteólisis inespecífica C3b • Factor B: actividad serino proteasa • Factor D: cliva el factor B que está unido a C3b • Properdina El C3b que está unido a la pared de algún microorganismo se une al factor B. El factor B tiene una concentración sérica de 200 µg/ml. �El factor B se pega al C3b que estaba pegado a la pared de un microorganismo. Cuando se produce la interacción de C3b con B, aparece una proteína con actividad semiproteasa, el factor D, y cliva al Factor B, formando un péptido pequeño que aún no tiene función conocida, el Ba, y el Bb. Queda entonces, en la membrana del microorganismo el complejo C3bBb. El complejo C3bBb recibe el nombre de CONVERTASA DE C3, sigue estabilizado por properdina. CONVERTASA DE C3 C4b2b (vía clásica) C3bBb (vía alterna) C3bBb va a clivar a moléculas de C3, y va a formar C3a y C3b. El C3b formado también se une al complejo C3bBb para producir un nuevo complejo C3bBb3b, siempre todo estabilizado por properdina. Se pueden unir varias moléculas de C3b, es decir, puede ser (C3b)nBb. Esta nueva enzima recibe el nombre de CONVERTASA DE C5.

C3b unido a la membrana

C3bB

C3bBb

Factor D Ba

Factor B

Estabilizado por properdina

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CONVERTASA DE C5 C4b2b3b (vía clásica) (C3b)nBb (vía alterna) ¿Cómo hace el C3b que patrulla por el plasma para discriminar lo propio de lo ajeno? El C3b no produce la lisis de células propias debido a la presencia de ciertas proteínas. Casi todas las células de los mamíferos tienen unas proteínas regulatorias. Evitan que el C3b se deposite en las membranas del huésped: • Factor H de los grupos sanguíneos • CR1 • MCP • DAF Son proteínas integrales de membrana. Hay un elemento crítico a la hora de discriminar lo propio de lo ajeno. El nivel elevado de ácido siálico, presente en todas las células de mamíferos, está unido al factor H. Si hay alta cantidad de ácido siálico, como está unido al factor H, el C3b no se deposita sobre las células. Entonces estas proteínas regulatorias impiden que C3b se una; evitan la interacción con el factor B, y aumentan la proteólisis de C3b. La proteólisis de C3b produce fragmentos de menor cuantía: C3bi, C3bd y C3bgd. Una función de C3b es actuar como opsonina. Se han clasificado los receptores de C3b en cuatro tipos: CR1, CR2, CR3 y CR4. El CR1 es la proteína marcadora típica de eritrocitos. Se denomina también CR35. Tiene la capacidad de ligar C3b, C4b y C1q. C4b no solamente activa el C por la vía clásica, sino que es una opsonina, pero su poder opsonizante es menor que C3b. Cuando el CR1 + C3b estimulan a un monocito o un macrófago, potencia la fagocitosis. El eritrocito tiene CR1, capta el C3b unida a inmunocomplejos y lo llevan al hígado o al bazo. Descarga allí el microorganismo o inmunocomplejo opsonizado por C3b y se va. El eritrocito se va intacto. Los productos de la proteólisis de C3b también actúan como opsoninas. El CR2 está solo en cd y LB. Entonces potencian la respuesta adaptativa. Provoca activación de las cd. En última instancia, la vía clásica y la vía alterna se unen a nivel de la convertasa de C5 que cliva el C5 a C5a y C5b. El C3b por vía alterna puede reconocer IgA e IgE humanas formando inmunocomplejos. C3a y C5a producen quimiotaxis y reúnen gran cantidad de células fagocíticas en el foco infeccioso. Además, son anafilotoxinas, producen algún fenómeno de hipesensibilidad. También producen modificación de la permeabilidad vascular. Importante: cuando se produce la lisis celular, se liberan fosfolipasas, y se activan, iniciando la vía de las prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos, que potencian la inflamación.

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�La vía clásica se activa por la presencia de inmunocomplejos tipo IgG e IgM, y la vía alterna por la presencia de lipopolisacáridos, polisacáridos, agregados de IgA e IgE humanas, e IgG de cobayo.

La vía alterna del sistema complemento fuciona como un mecanismo de vigilancia inmunitaria a través del cual los microorganismos son opsonizados por C3b en eusencia de Ac específicos. La activación de esta vía involucra cuatro proteínas: -C3 -factor B -factor D -properdina (P) A diferencia de la vía clásica, que suele requerir la presencia de Ac a fin de ser activada, la vía alterna es activada, en forma directa, por ciertas estructuras presentes en la superficie de una amplia variedad de microorganismos. Conduce a la generación de una actividad inflamatoria antimicrobiana, similar a la generada por la vía clásica de activación. En relación con la vía alterna deben considerarse dos marcos diferentes en los cuales puede transcurrir su activación, según se haya producido en forma previa o no, la activación de la vía clásica. En este sentido es necesario destacar que la activación de la vía clásica conduce a la activación de la vía alterna. La activación de la vía clásica conduce a la generación de numerosas moléculas C3b, que se unen de modo covalente a la superficie del blanco. En presencia de C3b, el factor B (estructural y funcionalmente homólogo al C2) se une a C3b y es escindido por el factor D (que expresa una actividad serinoproteasa). La escición de B origina dos fragmentos: -uno de bajo peso molecular que es liberado a la fase soluble, llamado Ba -un fragmento mayor Bb, que permanece unido a C3b sobre la superficie de la célula diana y forma el complejo biomolecular C3bBb, convertasa de C3 de la vía alterna. Su interacción con properdina, conducente a la formación de C3bBbP, potencia la actividad de la proteasa alterna de C3, al incrementar su estabilidad. La convertasa de C3 de la vía alterna escinde numerosas moléculas de C3 y genera cantidades adicionales de C3b, que contribuyen a la opsonización de la célula diana. Algunas de las moléculas de C3b generadas se unen a la convertasa de C3 de la vía alterna y dan lugar a la formación de los complejos (C3b)nBb, convertasa de C5 de la vía alterna. Estas convertasas escinden C5 y generan C5a y C5b, componente que inicia el ensamblado del complejo de ataque litico o complejo de ataque a la membrana (CAM). La convertasa C5 resulta también estabilizada merced a su interacción con properdina. La activación de la vía alterna, secundaria a la activación de la vía clásica, contribuye a la inmunidad antimicrobiana ya que potencia los efectos inducidos por la activación de la vía clásica, es decir, funciona como un mecanismo amplificador. En condiciones normales, es decir en ausencia de procesos infecciosos, se generan de manera espontánea en fase fluida bajas concentraciones de C3b. Este proceso suele involucrar la acción de proteasas plasmáticas, que con muy baja eficiencia escinden el componente C3 y/o la hidrólisis espontánea del grupo tioéster localizado en C3. El C3b así generado puede permanecer en fase fluida y es rápidamente inactivado. Por otra parte, puede interactuar con la superficie de células propias o células extrañas (microorganismos), lo que permite la formación de la convertasa C3 de la vía alterna.

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VÍA LECTÍNICA Se pone en marcha por acción de una proteína conocida como MBL , de la familia de las colectinas. Es la Manosa Binding Lectin, es una lectina ligadora de manosa. Esta

La eficiencia de la vía alterna depende, en gran medida, de su capacidad de distinguir lo propio de lo que no lo es. En otras palabras, de permitir el ensamblado de la convertasa de C3 sobre la superficie de células extrañas pero no sobre la superficie de células propias. La vía clásica de activación no enfrenta este problema, ya que sus activadores (Ac) no suelen reconocer a las células propias y confinan, por lo tanto, el ensamblado de su convertasa de C3 a la superficie de aquellas células reconocidas como extrañas. El mecanismo discriminatorio que permite el ensamblado de la convertasa de C3 de la vía laterna sobre la superficie de ciertos microorganismos, pero no sobre la superficie de células propias, es mediado básicamente, por un cojunto de proteínas reguladoras de la actividad de C3. Ellas incluyen una proteína sérica denominada factor H y tres proteínas integrales de membrana: -CR1 (CD35) -MCP (proteína cofactor de membrana, CD46) -DAF (factor acelerador de decaimiento o CD55) Todas pueden unirse a C3b y mediar dos actividades centrales: 1) inhiben su interacción con el factor B y/o deplazan a los factores B y Bb del complejo formado con C3b. 2) tornan suceptible a C3b a la acción proteolítica del factor I, una serinoprotesa que circula en forma activa, escinde al C3b y origina C3bi y productos posteriores de degradación. Por lo tanto, las proteínas reguladoras de C3 actúan inhibiendo la formación de la convertasa de C3 de la vía alterna. CR1, MCP y DAF se expresan en la superficie de células propias y no en la superficie de microorganismos. Por consiguiente, operan solo sobre las primeras. El factor H al ser una proteína plasmática, podría actuar en ambos casos. Sin embargo, no es así porque para actuar debe interactuar con la superficie celular. Tal interacción se encuentra mediada por el reconocimiento de residuos de ácido siálico por parte de diferentes dominios expresados en el factor H. Las células de los mamíferos suelen expresar un alto contenido de ácido siálico, mientras que en los microorganismos patógenos su expresión no es uniforme. Los microorganismos que expresan un alto contenido de ácido siálico unirán el factor H y por lo tanto, se verán protegidos de la acción de la vía alterna del complemento. Por el contrario los microorganismos que expresen un bajo contenido de ácido siálico no lograrán unir el factor H y en consecuencia, permitirán el ensamblado de la convertasa de C3 de la vía alterna, y procederán a la activación del sistema del complemento. La incapacidad del factor H de asociarse con la superficie de un microorganismo constituye la condición permisiva crítica que conduce a la activación de la vía alterna. En ausencia del factor H asociado con la sueprficie, el C3b podrá interactuar con el factor B y dar lugar a la formación de C3bB que, merced a la acción proteolítica del factor D dará lugar a la fomación de C3bBb (convertasa de C3 de la vía laterna), en primera instancia y BbC3b(n), convertasa de C5 de la vía alterna.

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proteína es una serín-proteasa, tiene una estructura muy parecida al C1q, y tiene las microfibrillas características del colágeno. Esta MBL tiene la propiedad de reconocer sobre las paredes celulares de los microorganismos los hidratos de carbono, entre ellos glucosa, manosa, fucosa, N-acetiglucosamida, manonas, y se va a acoplar produciéndose la interacción de la proteína ligadora con el hidrato de carbono, y eso induce la activación de dos serinoproteasas que son la MASP-1 y la MASP-2. Estas tres proteínas actúan como complejo, es decir, la MBL está unida a MASP-1 y a MASP-2. Estas dos enzimas van a actuar sobre C4 y sobre C2, dando C4a y C4b, C2a y C2b. Esto pone en marcha la rápida activación de todos los mecanismos para eliminar el patógeno. Entonces, el evento final luego de la activación del complemento es la eliminación del patógeno, la muerte por lisis. En la opsonización tienen un papel muy importante el C3b, C4b y los productos de degradación del C3b: C3bi, C3bd y C3bdg, para producir la depuración en el hígado o el bazo. El C3b participa en la neutralización de ciertos virus, en la inmovilización de treponemas.

MBL MASP-1/MASP-2

C4 C2

C4a C4b C2b C2a

C4b2b

C3a C3b

C3

C4b2b3b

C5

C5b C5a

C5bC6C7C8(C9)n

(convertasa de C3)

(convertasa de C5)

(complejo de ataque a las membranas)

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FORMACIÓN DE ANAFILOTOXINAS Durante la activación del C se van generando péptidos de bajo PM que son vasoactivos: C3a y C5a. El C4a también es anafilotoxina, pero con una potencia menor. El C3a y el C5a, vía receptor, producen efectos biológicos sobre gran cantidad de células sanguíneas, sobre todo en macrófagos, monocitos y polimorfonucleares. Se ha visto, en especial el C5a, que además de efecto anafilotóxico tienen acción quimioatractante o quimioatrayente, es decir, quimiotáxis. Esto significa que reclutan las células inmunes hacia el lugar de la infección. El C5a sobre los neutrófilos produce un estallido respiratorio, el neutrófilo comienza a sintetizar numerosas sustancias: quemoquinas, citoquinas. Así, el metabolismo celular se acelera y forma sustancias nocivas para el microbio, como los aniones superóxido, peróxidos, NO3. Si todo esto no está bien controlado, puede generar lesiones hísticas al huésped. Los neutrófilos, basófilos y eosinófilos tienen vesículas con gránulos potencialmente tóxicos. En esta activación ese contenido se descarga y colabora con el potencial microbicida. Sobre los macrófagos, y también neutrófilos, hay un aumento en la síntesis de moléculas de adhesión. Esto permite que rueden por los capilares y, al estar aumentada la permeabilidad vascular, por diapédesis se trasladan al foco infeccioso. También se incrementa la exposición de MHC I y II, sobre todo en las CPA. Esto indica que hay un mejoramiento en la presentación antigénica. Sobre las células dendríticas, si están en forma inmadura, favorece su maduración. En el macrófago aumenta la producción de distintos tipos de receptores, aumentando la fagocitosis. El macrófago sintetiza TNF-α, IL-1, IL-12, IL-10. Cuando se produce la lisis celular, se rompe la membrana plasmática, se liberan fosfolipasas y esto inicia la vía de la PG (prostaglandinas), tromboxanos, leucotrienos e hidroxiderivados. Esto tiene un elevado potencial inflamatorio. Sobre los mastocitos y los basófilos, C3a y C5a actúan como anafilotoxinas.

El C3a y el C5a, vía receptor específico del mastocito basófilo, transmite una señal endoquímica al interior. Los basófilos y los mastocitos tienen vesículas en su interior que contienen gránulos de histamina, serotonina y bradiquinina, es decir, una serie de sustancias vasoactivas que normalmente están dentro de las vesículas. Cuando hay interacción del C3a o C5a con el receptor, en presencia de Ca2+ citoplasmático, las vesículas se fusionan con la membrana plasmática y liberan estas sustancias al exterior celular. Estas sustancias actúan sobre los vasos sanguíneos y capilares, son vasoactivos, aumentan la permeabilidad vascular. Esto hace que los capilares se hinchen. Sobre el

C3a

C5a �Ca2+

histamina

serotonina

bradquinina

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endotelio van a permitir el aumento de su permeabilidad, aumento en la expresión y actividad de adhesinas y producción de mediadores lipídicos de la inflamación. Al aumentar la permeabilidad vascular, va a aumentar el flujo sanguíneo al lugar de la inflamación, y con ello numerosos monocitos, neutrófilos, etc. Sobre el músculo liso el C2a produce contracción. MECANISMOS REGULATORIOS Estos mecanismos aseguran que cuando se eliminó el patógeno, el C deje de funcionar. El freno de la acción citotóxica del C está dado por dos tipos de proteínas: proteínas séricas libres en el plasma y proteínas asociadas a la membrana. Las proteínas del C se están sintetizando constantemente, circulan en forma inactiva, y cuando se cuantifican en el laboratorio se tiene una información estática, porque luego de la extracción de sangre el C se sigue sintetizando. De las proteínas reguladoras séricas, una de las más importantes es el C1 inhibidor (C1 Inh) . Pertenece a la familia de las serpinas, es una serina proteasa. La familia de las serpinas la integran también la antitrombina 3 y la α1- antitripsina. El C1 inhibidor va a actuar sobre el C1, impidiendo que siga la cascada de activación a través de C1s y C1r. Esto frena la activación por la vía clásica. Otra proteína sérica importante es la C4BP (C4-binding protein), impide que el C4b se fije a la membrana celular. El factor o sustancia H es una proteína que puede presentarse de forma libre en el plasma o como proteína integral de membrana. Cuando está fija a la membrana plasmática se une al ácido siálico e impide que el C3b se pegue a la célula y la opsonice. Otras proteínas están ancladas en la membrana. El DAF o Factor acelerador de decaimiento inhibe el ensamblaje de la convertasa de C3. El CR1 es un receptor que se encuentra en eritrocitos. El CD59 y el HRF (factor de restricción homólogo) impiden la formación del CAM o complejo de ataque a las membranas. Aparentemente se une a la cadena α hidrofóbica del C8 e impide el ensamblaje del complejo lítico. DEFICIENCIAS DEL COMPLEMENTO Hay dos tipos: las genéticas y las adquiridas. Las genéticas se refieren a un déficit hereditario de algún componente del complemento. Son trastornos muy raros y generalmente autosómicos recesivos. Las deficiencias adquiridas pueden deberse a un consumo elevado del complemento, por ejemplo por aumento de activadores (microorganismos, patógenos), o también por déficit de proteínas regulatorias. Tanto la persona que tiene un trastorno genético como aquella que tiene un déficit de C de forma adquirida, las manifestaciones que posee son de tres tipos: • Angioedemas (en personas con déficit de C1 inhibidor): aumenta C3a y C5a. • Trastornos reumatológicos. • Infecciones a repetición.

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VALORACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL COMPLEMENTO Se utiliza una suspensión de GRc (de carnero) en un buffer. Para saber la cantidad de GRc que se dispone se realiza una curva de calibrado, que permite, tomando una alícuota determinada y haciendo una lectura espectrofotométrica, saber la cantidad. La curva de calibrado para GRc sirve para determinar la concentración o el porcentaje de GRc dentro de los rangos bien determinados y en cualquier momento. Luego de la extracción de sangre hay que lavar los GRc. Este lavado tiene tres fines: • Primero, eliminar el anticoagulante, ya que tiene citrato que secuestra Ca2+, el cual es necesario para la activación del C. • Elimina el C propio del carnero • Permite ver el estado de los GRc en cuanto a su fragilidad osmótica. El último sobrenadante del lavado debe estar límpido e incoloro, si es rojizo significa que hubo hemólisis. Generalmente se hacen tres lavados en buffer C 1-5, se desecha el último liquido de lavado, se resuspende en dos volúmenes de buffer y se realiza un micro hematocrito, utilizando capilares. Luego de la centrifugación se mide la columna total y la columna de GRc. Así obtengo el porcentaje de suspensión de GRc. A partir de la suspensión obtenida, de GRc al 20%, se preparan otras tres suspensiones al 10%, al 5% y al 2,5%. Luego se preparan tres tubos de ensayo con el mismo grosor y altura, y se agrega a cada uno de ellos 9,8 ml de agua destilada, 200 µl de la solución correspondiente (a un tubo la de 10%, a otro la de 5% y al otro la de 2,5%). Se va a producir hemólisis. Se lee la Hb a 530 nm (ver la curva en la fotocopia). Si se grafica % de hemólisis vs. C agregado, se obtiene: La curva tiene una máxima pendiente entre los 25%-75%, y en este sector se encuentra mayor sensibilidad porque con pequeñas variaciones de suero, se puede hacer una disminución del porcentaje de lisis. Von Krough determinó la expresión matemática de la curva: X = K x Y 1/n 1-Y X: cantidad de C expresado en ml de suero. Y: grado de lisis: 0,1; 0,25; 0,5 K: cantidad de complemento capaz de producir el 50% de lisis, es una constante.

100

75

50

25

% hemólisis

Suero agregado

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Cuando Y = 0,5 la expresión se reduce a LogX = LogK. Se prepara una batería de 7 tubos, donde 2 son controles. El tubo 6 contiene SH y tiene buffer, es el control de 0% de hemólisis. El tubo 7 contiene el SH y suero muy concentrado, es el control con 100% de hemólisis. Los otros cinco tubos tienen distintas diluciones del suero. Se incuba 1 hs a 37°C, se centrifuga y se lee la oxihemoglobina a 541nm. Se lee primero el tubo 7, y su DO se corresponde al 100% de hemólisis. Los demás se sacarán por regla de tres simple. Con los valores de LogX y Log (Y/(1-y)) se grafica la recta. En el punto donde la recta corta al eje de los x, tiene un valor de 2,18, el Log 2,18 corresponde a una dilución del suero 1:150, por lo tanto el suero tiene 150 unidades hemolíticas 50%.

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AUTOINMUNIDAD

La autoinmunidad es una respuesta adaptativa contra Ag propios o autoantígenos. En ella participan los Ac y los LT. Esto ocurre porque se rompen los mecanismos de tolerancia o autotolerancia. Recordar que también existe tolerancia contra Ag externos, como los del alimento. La tolerancia se va a ejercer a dos niveles: a nivel central y a nivel periférico. TOLERANCIA CENTRAL A nivel central se habla de tolerancia en aquellos órganos donde las células de los LB y LT se van generando y madurando. El proceso de tolerancia central de los LB ocurre en la médula ósea, para los LT ocurre en el timo. Durante la ontogenia B, los LB inmaduros expresan una IgM en su membrana, que es el receptor para el Ag (BCR), y en este estadío impactan con Ag propios. Esos autoAg pueden estar en la superficie de las células del organismo. Si el LB recibe una señal contra esos Ag propios que están en la superficie celular, alguna lipoproteína por ejemplo, ese LB va a morir por apoptosis. En ese momento puede ocurrir la edición del BCR, donde el LB intenta generar un Ig de membrana que no reconozca un Ag propio y así seguir viviendo. Si no lo logra, muere por apoptosis. Si los LB reciben señales de Ag solubles, por ejemplo las proteínas propias, el LB entra en un estado anérgico o de no respuesta. No muere, puede salir de la médula ósea, pero no va a responder. Si el LB no recibe ningún tipo de señal, continúa su proceso de maduración hasta llegar a ser un LB maduro. El proceso de tolerancia central para los LT ocurre en el timo. En la ontogenia T, los LT se pueden clasificar en dobles positivos y en dobles negativos. Eran dobles negativos cuando no expresan ni la molécula CD4 ni la molécula CD8. Después empiezan a expresar las dos moléculas, pasando al estadío doble positivo, cuando llegan a la zona de la corteza tímica, experimentan el proceso de selección positiva. El proceso de selección positiva permite que sobrevivan solo aquellos LT capaces de reconocer a las MCH. Aquellos que reconocen a las MHC-I, dejan de expresar el marcador CD4 y solamente expresan el CD8, pasando a ser linfocitos citotóxicos. Los LT que reconocen a las MHC-II dejan de expresar el marcador CD8, continúan expresando el CD4 y pasan a ser los LTh. Todo esto ocurre en la corteza tímica. El proceso de maduración de los LT continúa cuando estos migran a la médula tímica, donde experimentan el proceso de selección negativa, por el cual los LT que reconocen Ag propios mueren por apoptosis. Los que no lo hacen continúan el proceso de maduración. De este modo salen del timo LT que no reconocen Ag propios. TOLERANCIA PERIFÉRICA Puede ocurrir que algún linfocito escape de los procesos de regulación y salga del timo o de la médula ósea y reconozca Ag propios. Un factor que participa en la activación de los LB una vez que salen de la médula ósea es el factor BAFF. Se ha visto que este factor está aumentado en pacientes que tienen enfermedades autoinmunes. Cuando el factor BAFF está en gran concentración puede activar a los LB anérgicos.

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Los procesos de tolerancia periférica van a estar mediados por LT reguladores o supresores. La célula supresora o reguladora ejerce su acción a nivel tanto de la activación de los LT como de la proliferación. Las células T supresoras producen diferentes citoquinas, de las cuales las principales son la IL-10 y el TGF-β. La IL-10 actúa a nivel de la CPA e inhibe la producción de IL-12 y de la expresión de la molécula B7. La interacción B7-CD28 es esencial para que el LT se active. Por lo tanto, si hay menor expresión de B7, es menos probable que el LT se active. La IL-12 es muy importante para la activación de los LTh1, entonces al haber menor cantidad de IL-12 el LTh1 va a recibir menor señal para activarse. El TGF-β inhibe la proliferación celular, entonces puede ser que el LT se haya activado pero va a haber menor cantidad de LT porque la proliferación está disminuida. Otra interleuquina que producen las células T supresoras es la IL-4 que inhibe la acción del IFN-γ. El INF-γ es esencial para que se activen los macrófagos. Entonces se regula tanto la función de los LT como la función de otras células que participan en el proceso inflamatorio. Existen distintos tipos de células T reguladoras. Hay una población que son CD8+ pero no son mayoritarias, las más importantes son las CD4+. Dentro de estas últimas están aquellos que se generan como tal en el timo, son las células T reguladoras naturales. Se caracterizan por la expresión en su membrana de la molécula CD4, la CD25 y de FOXP3. El FOXP3 es un gen que codifica para la proteína escurfina que inhibe la proliferación celular. Otra población de células T reguladoras se inducen en la periferia y son los LTh3 y la células T reguladoras tipo I. Los LTh3 son muy importantes en la mucosa intestinal y participan en los mecanismos de tolerancia hacia los Ag extraños de la dieta. Es importante resaltar que no solamente se van a controlar las respuestas autoinmunes, sino también toda respuesta inmune que se desencadene contra cualquier Ag. Si la respuesta no se regula, un exceso puede ser perjudicial para el organismo. �Las células T reguladoras naturales liberan las citoquinas supresoras IL-10 y TGF-β, inhiben a las CPA, LTCD4+ y LTCD8+. Estas células se activan con concentraciones muy pequeñas de Ag, menores a las que se necesita para activar un LT común. �Las células T reguladoras inducibles producen las mismas citoquinas y aparentemente se inducen por unas células dendríticas que se denominan semimaduras o tolerogénicas, que tienen una menor expresión de las moléculas B7 y de IL-12. También inhiben a todos los LT. �Los LTh3 producen TGF-β e inhiben toda respuesta, tanto de Th1 como Th2. Son muy importantes en la mucosa intestinal. ENFERMEDADES AUTOINMUNES Se habla de una enfermedad autoinmune cuando la presencia de autoanticuerpos o de los LT sensibilizados ocasionan daños en los tejidos u órganos. Esos daños afectan a la función del órgano y es generalmente irreversible. Las enfermedades autoinmunes más comunes son las de tiroides que prevalece en mujeres adultas, la artritis reumatoidea que afecta al 1% de la población de mujeres, el lupus eritematoso sistémico que corresponde al 0,1% de las mujeres, la diabetes tipo I

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que afecta a niños, y la miastenia gravis que también se produce preferentemente en mujeres. Hay una tendencia de que estas enfermedades afecten a las mujeres, es decir, que uno de los factores que contribuye al desencadenamiento de la enfermedad es el factor hormonal. Las enfermedades autoinmunes son multifactoriales, juegan aspectos genéticos, hormonales y ambientales. MECANISMOS PATOGÉNICOS Los mecanismos por los cuales se puede generar una respuesta autoinmune y causar un daño en el organismo son: • La liberación de antígenos recluidos: Hay Ag que están secuestrados en el organismo, como por ejemplo los Ag del globo ocular. Están detrás de una barrera y el organismo no necesita generar una tolerancia contra esos Ag porque no están expuestos. Sin embargo, si un traumatismo libera esos Ag, van a ser reconocidos como extraños y el sistema inmune genera una respuesta adaptativa contra ellos en un ganglio cercano, y los LB que se generan, a través de la sangre van a poder llegar hasta los ojos y ocasionar reacciones inflamatorias en ambos globos oculares. • Autoinmunidad por epitopes crípticos: En una molécula proteica hay muchos epitopes que son dominantes, son los que se presentan más fácilmente y contra los cuales se monta más fácilmente una respuesta. Hay otros epitopes que están ocultos, por lo que el organismo no necesita ejercer tolerancia contra ellos. Si por alguna razón esa proteína es procesada de forma diferente y ese epitope críptico es expuesto, el organismo lo va a desconocer y va a montar una respuesta contra ellos. • Inducción microbiana: Se tiene por ejemplo un Ag microbiano que tiene dos epitopes, uno que es un epitope extraño y otro que es un autoepitope, es decir, que es un epitope que también es propio del organismo. Este Ag es procesado por una célula dendrítica, esta presenta un determinado péptido en su MHC, y ese péptido impacta a un LT. Ese mismo Ag puede ser reconocido por un LB que tiene una Ig de membrana capaz de reconocer el epitope propio, lo procesa y presenta un péptido. Como el péptido presentado es el mismo que el mencionado anteriormente, el LT que había sido activado por el Ag va a activar al LB que reconoció el autoepitope, por lo tanto este LB va a producir Ac contra el epitope propio, es decir autoAc. • Dispersión de epitopes: Un autoAg, que tiene diferentes epitopes, es reconocido por un LB que tiene una Ig de membrana que reconoce a un epitope, es presentado a un LT, el cual se activa y genera una respuesta autoinmune. Este LT puede activar a otros LB, que reconocen del mismo Ag, otros epitopes diferentes. Así, a partir de un mismo autoAg que tiene distintos epitopes, se pueden activar varios clones de LB. • Mimetismo molecular: Este caso se da cuando las proteínas comparten cierta homología de secuencia lineal, y se da en algunos péptidos compartidos con microorganismos patógenos. Se puede llegar a montar una respuesta contra un microorganismo patógeno que después reconocerá en forma cruzada epitopes propios. • Desconocimiento de lo propio debido a la presentación antigénica: Es un hecho que se ha experimentado en forma experimental. Habla de la importancia que tiene la presentación del Ag para que un LT se active. Han hecho estudios con autoAg que se han presentado a los LT sin que la célula presentadora sea una CPA profesional, es decir, sin que la célula tenga todas las moléculas co-estimulatorias necesarias para que el LT se active. Se vio que el Ag no activaba al LT. Sin embargo, si el Ag era presentado por una CPA profesional el LT se

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activa. En esto tiene mucha importancia la molécula CTLA-4 que está en el LT. Esta molécula es capaz de unirse a la molécula B7 de las CPA. Es equivalente a la CD28 pero con una función contraria. La CTLA-4 ejerce una acción inhibitoria, y la CD28 ejerce una función estimulatoria. La CTLA-4 tiene mayor afinidad por la molécula B7, esto significa que cuando hay menor cantidad de moléculas B7, la molécula del LT que se va a unir va a ser la CTLA-4, y va a transmitir señales inhibitorias. • Modificación de lo propio: Un Ag propio modificado se denomina neoantígeno o neoepitope. Un Ag propio se puede modificar cuando se une alguna droga o algún hapteno, o cuando alguna proteína propia es procesada de forma diferente. Un ejemplo son las inmunoglobulinas de los pacientes que tienen artritis reumatoidea. Estos pacientes tienen una IgG que tiene alterado el patrón de glicosilación. Entonces, esta IgG ya no es reconocida como propia y se generan Ac contra ella. • Defectos en la tolerancia central o periférica: Si hay fallas en la apoptosis no se pueden eliminar las células B autorreactivas. Si hay fallas en la presentación a nivel del timo tampoco se pueden presentar adecuadamente los péptidos para que los LT sean seleccionados o en forma positiva o en forma negativa. • Desbalance entre las poblaciones de LTh1 y LTh2: Las citoquinas que produce una población inhiben a la otra población. Cuando hay deficiencia en los LTh1 se puede inducir la producción de LT autorreactivos y pueden generar enfermedades organoespecíficas. Si el desbalance es sobre los LTh2 se pueden generar enfermedades sistémicas por producción de Ac. • Activación policlonal de LB y LT: Los SUPERANTÍGENOS son capaces de unirse al TCR pero solamente por la región variable de la cadenaβ. Así pueden activar una gran cantidad de LT, aunque no sean específicos para ellos. De esta manera pueden activar LT autorreactivos que generarán una respuesta autoinmune. En el caso de LB, el LPS puede llegar a activar una gran cantidad de clones de LB. Esa activación policlonal de LB por el LPS genera Ac del tipo IgM. Si bien en muchas de las enfermedades autoinmunes los Ac que se producen son del tipo IgG, existe la posibilidad de que las IgM también tengan un tipo de participación. • Predisposición genética: Hay ciertos alelos de las MHC (o HLA: Ag leucocitario humano) que se asocian a ciertas enfermedades. Generalmente las MHC que intervienen son las de clase II, porque los que tienen mayor participación en las enfermedades autoinmunes son los LTCD4+. Otros genes que pueden estar involucrados son los del TCR, del BCR y los genes de Ig. CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES Se las puede clasificar en si son específicas de órgano o si son sistémicas. Dentro de las dos puede haber alguna sintomatología que se interponga. Dentro de las enfermedades específicas de órgano las más comunes son la diabetes tipo I, las enfermedades de tiroides y la miastenia gravis. Dentro de las enfermedades autoinmunes sistémicas está la artritis reumatoidea y el lupus eritematoso sistémico. Existe una clasificación de acuerdo al tipo de respuesta que generen, y es: -TIPO II: enfermedades autoinmunes mediadas por Ac. -TIPO III: enfermedades autoinmunes mediadas por inmunocomplejos. -TIPO IV: enfermedades autoinmunes mediadas por células.

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Estos tres tipos de enfermedades autoinmunes tienen relación con las reacciones de hipersensibilidad. Las que están mediadas por Ac son Reacciones de hipersensibilidad de tipo II, y los Ac que participan en estas reacciones son de tipo IgM, IgG o IgA. Los Ac tipo IgE participan en Reacciones de hipersensibilidad de tipo I. Dentro de las enfermedades mediadas por Ac está la miastenia gravis, la anemia hemolítica, el síndrome de Goodpasture, la fiebre reumática aguda. En la anemia hemolítica autoinmune el Ag es la molécula del factor Rh. La consecuencia de la presencia de Ac contra el factor Rh es la activación del complemento y la destrucción del GR. En el caso de la miastenia gravis los Ac son contra el receptor de acetilcolina, y lo que se produce es fatiga muscular porque no se puede producir la transmisión nerviosa. En las enfermedades autoinmunes mediadas por inmunocomplejos está el LES: lupus eritematoso sistémico. Los inmunocomplejos se forman siempre en una respuesta inmune, están formados por la unión del Ag al Ac específico. Esos inmunocomplejos fijan el complemento y pueden ser depurados del organismo. En algunos casos, como en el LES, puede haber deficiencia en los componentes del complemento por lo que esos complejos Ag-Ac no se pueden eliminar y se depositan ocasionando problemas, por ejemplo en el riñón. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células responden a las Reacciones de hipersensibilidad tipo IV, y las células que en su mayor parte participan son los LTCD4+. Dentro de estas enfermedades está la artritis reumatoidea. TRATAMIENTOS En muchos casos se hace un tratamiento a nivel de los órganos blanco, por ejemplo, en el caso de la diabetes, si se necesita insulina se administra insulina, en el caso de tiroides se administra tiroxina. En otros casos se trata de inyectar LT que sean específicos para un Ag de ese órgano pero que produzcan algún factor de crecimiento. Así, cuando el LT se activa produce factores de crecimiento que tratan de hacer que las células de ese órgano blanco se recuperen. Este caso se da en una encefalitis autoinmune. Si no se controla el órgano blanco se pude tratar con fármacos anti-inflamatorios, como en la artritis, para disminuir las respuestas mediadas por células. También se pueden usar fármacos inmunosupresores. En este caso, si bien pueden ser beneficiosos por un lado, pueden ser perjudiciales por otro. En otros casos se trata de controlar la respuesta inmune. Ese control se puede hacer a nivel de las células, por ejemplo se pueden inyectar Ac contra las MHC, se pueden inyectar Ac contra la molécula CD4. Es decir, bloquear de alguna forma la activación de los LT. Se pueden inyectar Ac contra el receptor de IL-2 para aislar la proliferación celular. Es decir, consiste en manipular la respuesta inmune de alguna forma para evitar el desencadenamiento de otras reacciones. ARTRITIS REUMATOIDEA Es una reacción de hipersensibilidad tipo IV y está mediada por células T. Esta enfermedad se produce frecuentemente en mujeres. Se caracteriza por dolores en las articulaciones, sobre todo en las articulaciones de las manos y de los pies. Una

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característica típica es la rigidez matutina y es simétrica, se produce en ambas manos y en ambos pies. En una radiografía se aprecia un estrechamiento entre las dos articulaciones, debido a la gran respuesta inflamatoria que se produce. Algunos investigadores sostienen que la generación de esta enfermedad se puede deber a la presencia de ciertos microorganismos, porque se ha detectado a través de PCR el ADN de algunos microorganismos en las articulaciones. Pero en realidad, el Ag que desencadena todo el fenómeno inflamatorio es desconocido, puede ser algún Ag propio de la articulación, puede ser algún microorganismo, pero lo que se produce es una importante respuesta inflamatoria. En la articulación, la membrana sinovial habitualmente está formada por una sola célula, esta comienza a engrosarse, aparecen hasta 5 células y se forma el pannus. Esa articulación se empieza a poblar de un montón de células que participan en el montaje de una respuesta inmune. Dicen algunos autores que hasta puede aparecer un pequeño ganglio en la articulación. Aparecen macrófagos, neutrófilos, linfocitos y hay Ac. Lo que se genera es una continua respuesta inflamatoria. En el mecanismo propuesto para la respuesta inmune continua de la artritis reumatoidea, una célula dendrítica presenta un Ag, hasta ahora desconocido, a un LT. Ese LT se activa, prolifera y va a impactar con un LB. Las citoquinas que se produzca van a favorecer la llegada de los polimorfonucleares neutrófilos y se va a desencadenar una fuerte respuesta inflamatoria. Los complejos inmunes que se producen van a ser fagocitados por ejemplo por los neutrófilos o macrófagos, se liberan las enzimas lisosomales y estas son las que ocasionan el daño en el cartílago y hasta su destrucción. Las citoquinas que producen los macrófagos que se activan por este proceso también son potentes agentes inflamatorios. En esto es importante la IL-1 y el TNF-α. Entonces, la patología es básicamente la respuesta inflamatoria que se genera en la articulación. Otra cosa que les ocurre a estos pacientes es que aparecen autoAc, que se conocen como Factor reumatoideo, que son IgM, IgG, e IgA, y se generan contra el fragmento Fc de las IgG. Se ha visto que este fragmento tiene un patrón de glicosilación anormal, le falta moléculas de galactosa. Esto hace que esa IgG sea reconocida como extraña y se generen Ac contra ella. Al estar alterado el Fc también puede estar alterada la función de estas IgG. Estas IgG además tienen la capacidad de autoasociarse: una IgG a la cual le faltan residuos de galactosa en su Fc, es capaz de reconocer el Fc de otra IgG con las mismas características. Pero también estas IgG pueden tener especificidades para otros Ag. Por los tanto, hay factores reumatoideos que se asocian entre sí, factores reumatoideos que tienen especificidad para otros Ag. Todos estos complejos son capaces de ser reconocidos por una IgM que reconoce el factor Fc alterado de la IgG. Se forman así inmunocomplejos que son capaces de fijar complemento. Se desencadena toda la cascada de activación del complemento, se producen las anafilotoxinas que contribuyen a aumentar aún más la inflamación. Muchas veces estos inmunocompejos también se pueden depositar en las articulaciones. El diagnóstico de esta enfermedad se hace a través de la clínica y se pueden emplear algunas pruebas para medir el factor reumatoideo. Una prueba que se utiliza se llama LAR y es simplemente una prueba de aglutinación rápida en placa. Se usan partículas de latex recubiertas de IgG humana y se enfrentan con el suero del paciente. Si hay Ac que reconozcan al Fc de las IgG se va a producir una aglutinación. Esto se puede ver a simple vista, o se puede leer en aparatos como el nefelómetro o el fluorómetro. Pero esta determinación no es exclusiva de la artritis, hay otras patologías reumáticas que

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también producen este tipo de autoAc. Así esta reacción puede dar positiva y el paciente no tener artritis reumatoidea. Otra cosa que se puede hacer para llegar al diagnóstico es la determinación de la velocidad de sedimentación globular o eritrosedimentación, que va a estar aumentada porque se trata de un proceso inflamatorio, y la determinación de la proteína reactiva (pcr), que es una proteína de fase aguda. En el tratamiento se utilizan fármacos de primera línea, segunda línea y tercera línea. Loa antiinflamatorios de primera línea puede ser la aspirina para disminuir la síntesis de prostaglandinas. Se pueden dar antirreumáticos, lo que se administra son sales de oro que no se sabe exactamente cómo actúa, pero disminuye mucho los síntomas. Los fármacos de tercera línea que se administran son los corticoides. Estos ejercen una supresión del sistema inmune y ayudan a reducir el proceso inflamatorio. MIASTENIA GRAVIS Es una enfermedad donde se produce debilidad muscular. Primero hay una debilidad en los párpados, después la debilidad comienza a aumentar cada vez más hasta que llega a los músculos respiratorios, produciéndose la parálisis respiratoria. En esta enfermedad aparecen Ac contra el receptor de acetilcolina. Son de tipo IgG y son específicos para la subunidad α del receptor de Ach. Se demostró que esta enfermedad está mediada por Ac, porque si se inyecta sueros de pacientes con la enfermedad a animales, se produce toda la sintomatología. Estos Ac pueden actuar de tres formas: pueden bloquear el receptor directamente e impedir que se una la Ach, pueden unirse a los receptores y hacen que estos complejos sean endocitados y degradados, o la unión a los receptores puede activar complemento y producir lisis. Hay alguna asociación de esta enfermedad con algunos haplotipos de HLA y en otros casos se asocia a tumores de células B. Para el tratamiento se debe eliminar el timo, se puede hacer plasmaféresis, es decir, liberar al plasma de los Ac, o si no, se pueden dar inhibidores de la proliferación linfocitaria o mediadores anticolinesterasa. Esto es para evitar la degradación de Ach, así permanece por más tiempo en el terminal simpático y así favorecer la transmisión del impulso nervioso. LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Es de la categoría III. Aparece preferentemente en mujeres y la característica de esta enfermedad es que hay Ac contra componentes nucleares: anti-ADN, anti-ribonucleoproteínas. Se llamó lupus porque los pacientes tienen un enrojecimiento en la cara que los asemeja a un lobo (lupus en latín). Esas manchas en la piel se producen por los depósitos de los complejos AgAc debido a la deficiencia de C3 y C4 del complemento, y se identifica mucho por la luz UV. El lupus tiene una gran variedad de presentaciones, varía mucho de un individuo a otro, tiene períodos de remisión y períodos de brote. La característica es la producción de Ac contra ADN. Por ejemplo, una célula B que tiene una Ig de membrana o BCR que es capaz de reconocer a una histona. El LB procesa esto y se lo presenta a un LT, que reconoce por ejemplo a las histonas. El LB se activa por acción del LT y empieza a producir Ac anti histona.

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Puede ser que el LB tenga un receptor BCR que reconozca al DNA. Entonces reconoce al mismo Ag (un nucleosoma) por el DNA, lo procesa, presenta los péptidos y aquellos péptidos que pertenecían a la histona van a ser reconocidos por el LT que reconoce histonas. El LB se activa pero, como el BCR reconoce al ADN, va a producir Ac anti-ADN. Este es un ejemplo de un mecanismo de dispersión de epitopes. Hay muchas enfermedades autoinmunes que pueden ser transmitidas al bebé por placenta, sobre todo aquellas mediadas por Ac del tipo IgG. En la miastenia gravis y en la enfermedad de Graves, donde hay Ac contra la hormona estimulante de tiroides, los Ac pueden pasar a través de la placenta y el bebé puede sufrir la misma sintomatología que la madre. Se mejora cuando se eliminan los Ac del organismo.

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INMUNOLOGÍA DE LOS TRANSLANTES

Clasificamos a los transplantes según el origen del órgano o tejido que va a ser transplantado. Transplante o injerto es lo mismo. Un transplante autólogo o autotransplante es un transplante de tejido del mismo individuo. Se hace mucho en los casos de quemaduras. Un transplante singeneico es un transplante de tejidos de individuos de la misma especie y genéticamente iguales. Esto se da en el caso de los gemelos. Estos dos tipos de transplante no generan ningún tipo de rechazo. Un transplante alogeneico es entre individuos de la misma especie pero genéticamente diferentes. Un transplante xenogeneico es entre individuos de distinta especie, son los que producen más rechazo, los que se hacen de muy poca frecuencia. Las moléculas que van a estar implicadas en los rechazos de transplantes van a ser las MCH. Las MCH tienen como principal función la presentación de Ag. Están las moléculas del complejo mayor y las del complejo menor de histocompatibilidad, son las principales moléculas que participan en el rechazo. Otras moléculas son aquellas del sistema ABO, que definen el grupo sanguíneo. La compatibilidad ABO es una barrera importante que puede producir un rechazo de transplantes, esto es porque están no solamente en la superficie de los eritrocitos, sino también en las células del endotelio vascular. ANTÍGENOS DEL SISTEMA ABO Los Ag del sistema ABO tienen una estructura común pero con un hidrato de carbono diferente. Los GR pueden tener el Ag H, el Ag A o el Ag B. Los individuos que tienen en sus GR el Ag A, en su suero tienen Ac anti-B. Los que tienen GR B, en su suero tienen anti-A. Los que tienen GR O tienen anti-A y anti-B. Los que tienen GR AB no tienen Ac en su suero. La transfusión sanguínea es un transplante, ya que se introducen células de un individuo a otro. Un donante potencial de un órgano del grupo O, y el receptor posible también es del grupo O, la transfusión es posible. El receptor O tiene en su suero Ac anti-A y anti-B, los cuales reaccionarán con células que tengan esos Ag en su membrana. Entonces el recetor O solo va a poder recibir un órgano que sea del grupo O. El mecanismo es el mismo que para las transfusiones sanguíneas.

CMH CmH

Presentación de péptidos Comunicación entre células �

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Un donador del grupo A tiene el Ag A en su membrana, por lo tanto ese órgano lo podrá recibir de individuos que no posean los Ac anti-A en el suero. Si no se producirá la destrucción de las células por mecanismo mediado por el complemento. Recordar que estos Ac son naturales, los individuos no necesitan ser sensibilizados previamente para adquirirlos. COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Estas moléculas tienen características particulares, son polimórficas, es decir, son muy diferentes entre los distintos individuos. Se heredan en forma codominante, es decir, que hay una molécula materna y una molécula paterna, codificadas por un gen paterno y un gen materno. Además son muy inmunogénicas, es decir, son capaces de provocar respuesta inmune, la cual puede ser celular y humoral. En el genoma están los locus para las MHC de clase I, clase II y también hay un locus clase II que codifica para las fracciones C2 y C3 del complemento y para el TNF-α, que no están relacionadas con la presentación antigénica, sino que participa en otros procesos inmunes. Las MHC-I están ubicadas en todas las células nucleadas del organismo, excepto en los GR. Se denominan HLA-A, HLA-B y HLA-C. Su función es presentar Ag a los LTCD8+ citotóxicos, y presentar péptidos que provienen del interior celular, que resultan del procesamiento de proteínas endógenas o de microorganismos que viven dentro de la célula (intracelulares). Las MHC-II tienen una distribución más restringida, solo están en los LT y LB activados, en las células dendríticas, en los macrófagos y en células del epitelio tímico. En los LT activados están en baja proporción. La función biológica es presentar péptidos a los LTCD4+ o LTh, y presentan péptidos provenientes de Ag externos o extracelulares. Se denominan HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. Las MHC-I tienen el sitio de unión al péptido cerrado en los extremos por lo que permite unir péptidos pequeños, con un promedio de 9 aminoácidos. Las MHC-II tienen esos extremos abiertos, por lo que permiten unir péptidos más largos, de hasta 22 aminoácidos. Al ser tan inmunogénicas, pueden producirse Ac contra las MHC. Esto ocurre en los embarazos, si el haplotipo del padre es diferente al de la madre, en el momento del parto de va a producir el intercambio sanguíneo con células del bebé y la madre quedará sensibilizada por las MHC diferentes. También ocurre en las transfusiones, ya que no se realiza un estudio de histocompatibilidad, sino solamente de la presencia de los determinantes del grupo ABO. Entonces cuando se transfunde sangre, si las MHC son diferentes se puede llegar a generar Ac. Otro modo de sensibilización es por un transplante previo. El rechazo de los transplantes se produce porque el sistema inmune del receptor va a recibir células vivas de un donador que tiene MHC probablemente diferentes, y el sistema inmune las va a reconocer como extrañas y va a generar una respuesta. Los LT que reconozcan a estos Ag extraños pueden actuar directamente, si son LTCD8+, o van a producir distintas citoquinas, si son LTCD4+.

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Se habla de rechazo del transplante cuando se trata de órganos sólidos, como riñón, hígado. Se habla de rechazo porque el receptor es quien rechaza el órgano que proviene del donador. En los casos de transplante de médula ósea no se habla de rechazo de transplante, sino de enfermedad injerto vs huésped. Esto es porque cuando se hace un transplante de médula ósea se eliminan totalmente las células del sistema inmune del individuo que va a ser transplantado. Así, el individuo que recibe un transplante de médula ósea no va a tener ningún LT o LB propio, entonces, el que va a producir el daño va a ser el sistema inmune del donador. Las células del donador atacan al receptor. Para que se produzca el rechazo de un transplante se necesita primeramente un reconocimiento. El reconocimiento de las MHC extrañas puede ser un reconocimiento directo, donde los LT reconocen directamente las moléculas HLA del donador que van a estar en las células dendríticas del tejido a transplantar. �Los LT del receptor reconocen directamente las MHC en las células dendríticas del órgano donado. El otro mecanismo va a ser indirecto. En este son las propias células dendríticas del receptor las que van a presentar péptidos pertenecientes a las moléculas HLA del donador. �Las células dendríticas del receptor presentan péptidos que provienen de las HLA del donador. Estas células dendríticas que tenían MHC con péptidos cargados, pueden llegar a morir por apoptosis. Cuando las células dendríticas del donador mueren por apoptosis, quedan pedazos de las membranas de esas células que van a tener MHC. Estos pedazos de membrana con MHC van a ser captados por células dendríticas del receptor, las que las van a procesar como cualquier Ag extraño, y lo van a presentar a los LT en el contexto de las MHC-II. Otra forma de reconocimiento de un transplante es a través de los receptores Kir de las células NK. Las células NK son citotóxicas naturales. Estas moléculas reconocidas son muy inmunogénicas, pudiendo generar una respuesta humoral y celular. Los componentes celulares que participan en el rechazo son los LTCD4+. Los primeros que van a actuar son los LTh1 que producen las citoquinas inflamatorias. Después va a actuar los LTh2 que van a activar los LB. Van a poder actuar los LTCD8+ directamente produciendo citotoxicidad. Van a actuar también las células NK produciendo citotoxicidad Ac dependiente cuando ya haya Ac contra esas moléculas y además van a poder actuar por un mecanismo de citotoxicidad directa. Esta respuestas celulares son las más difíciles de investigar, pero las que más fácilmente responden a la inmunosupresión. Los componentes humorales que participan en el rechazo son los Ac, que pueden ser Ac preexistentes si el individuo había sido sensibilizado previamente, o pueden ser Ac que se formaron por todo el proceso de activación. Las respuestas humorales son las más fáciles de investigar, ya que es relativamente fácil saber si un individuo tiene o no Ac en un suero, pero son las más difíciles de manejar por inmunosupresión. RECHAZO DE TRANSPLANTES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO El rechazo hiperagudo es el que se puede producir aún en la mesa de operación. En este tipo de rechazo participan los Ac preexistentes, estos pueden ser del sistema ABO o

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aquellos que provienen de alguna sensibilización: embarazos, transfusiones o transplantes previos. Estos Ac se fijan al endotelio vascular y fijan complemento y toda la cascada de coagulación. Se forman pequeños trombos en el tejido transplantado, se va a alterar la permeabilidad capilar y se van a producir hemorragias. De esta manera el tejido es rechazado. Solo se puede prevenir haciendo una adecuada tipificación de las MHC y analizando bien si en el suero del paciente hay o no Ac. El rechazo agudo, que se produce de forma tardía, luego de algunas semanas, va a participar el reconocimiento directo que está mediado por células dendríticas del órgano que va a ser transplantado. Estas células dendríticas están activadas porque el órgano fue sometido a una tensión muy importante de estrés, cuando fue extraído. Estas cd al estar activadas van a presentar una buena cantidad de moléculas co-estimulatorias, y pueden, entonces, activar los LTCD4+ como los LTCD8+. Si se activan los CD8+ se va a producir la lisis de la célula, si se activan los LTCD4+ se van a activar todas las funciones de los LTh. En el reconocimiento indirecto, una cd del dador muere por apoptosis, deja pedazos de membrana con MHC, esto va a ser captado por cd del receptor, se procesan como cualquier Ag extraño y van a presentar esos Ag en el contexto de las MHC-II. Este rechazo agudo puede ser controlado por agentes inmunosupresores. El rechazo crónico es el que se produce muchos años después de realizado el transplante. Se puede producir después de los 10 años. Está fundamentalmente mediado por Ac. Los Ac van a pegarse a las células endoteliales, esa interacción favorece la llegada de macrófagos, de PMN neutrófilos, generando todo un estado de inflamación que provoca que se trate de regenerar el tejido inflamado. Al producirse esa regeneración se va obstruyendo el vaso sanguíneo y termina no permitiendo el paso de sangre. Por lo tanto, el daño en el rechazo crónico se produce por el mecanismo indirecto y por la presencia de Ac. Si bien un individuo puede saber si tiene Ac contra las MHC, no se puede saber si hay LB vírgenes que sean capaces de reconocer esas moléculas y que todavía no se hayan activado. INMUNOSUPRESIÓN Para evitar el rechazo debe someterse a los pacientes a eventos de inmunosupresión. La inmunosupresión puede ser farmacológica, usando fármacos que actúan a distintos niveles, como los corticoides, drogas citostáticas o citotóxicas que actúan a nivel de la regulación del DNA e impiden la replicación. Actúan sobre cualquier tipo celular, no solo LT, por eso son sumamente tóxicos para riñón e hígado. Hay otros productos que son de origen microbiano, son más selectivos. Uno de ellos es la ciclosporina, que es de un hongo, otro es el tacrimus, y estos productos afectan a los LT fundamentalmente. Puede inhibir la transmisión de señales de los LT, entonces se suprimen las respuestas T y no se ven afectadas el resto de las células. También se tratan de usar mecanismos de supresión mucho más específicos. Esta el GAT o ALG, que son sueros que se obtienen de animales contra timocitos o contra LT. Son sueros policlonales que se obtiene en oveja o en caballo. La desventaja de estos sueros policlonales es que están hechos en otras especies animales, entonces pueden ellos mismos inducir una respuesta y así disminuir su eficacia.

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También se pueden utilizar anticuerpos monoclonales contra distintos receptores del LT, por ejemplo contra la molécula CD3, pero tienen la desventaja de que están hechos en ratón y por la tanto pueden generar respuesta y disminuir su acción. Se está tratando de fabricar los Ac quiméricos, que tengan la mayor parte humana y una pequeña parte de ratón. Los Ac monoclonales se pueden conjugar a toxinas bacterianas, y también se pueden utilizar moléculas que inactiven el complemento. En cuanto a las exigencias de histocompatibilidad, los transplantes que necesitan exigencias más estrictas son las de riñón. Se ha visto que para los transplantes de hígado y corazón no es tan necesaria la histocompatibilidad HLA. En el de corazón lo que más dificulta es encontrar un órgano que pueda ser transplantado. Se ha visto que las tranfusiones de sangre previas pueden llegar a favorecer los transplantes porque se generan células T reguladoras, si la sangre tenía algún alelo de histocompatibilidad compartido entre donante y receptor. Es un mecanismo que no está claro, por un lado se produciría la sensibilización por la transfusión y por otro la generación de células T reguladoras que lo favorecían. PRUEBAS DE TIPIFICACIÓN DE LOS Ag DE HISTOCOMPATIBI LIDAD Por un lado hay que ver cuáles son los CMH que hay en el donador. Se extraen las células mononucleadas, donde van a estar los linfocitos. Se usa un gradiente de picol para extraer la capa de células mononucleadas, y esta se va a enfrentar con distintos sueros que ya están tipificados y que tienen un determinado Ac. Por ejemplo, un linfocito que tenga la MHC B7, se la enfrenta con un suero conocido. Se produce la reacción Ag-Ac y se fijará el complemento y se va a activar por la vía clásica, va a producir lesiones en la membrana y si después se agrega un colorante la célula se va a teñir. Si el Ac del suero no reconoce la MHC del linfocito, no se produce la interacción Ag-Ac, no se activa el complemento y por lo tanto al agregar el colorante la célula no se va a teñir porque la membrana está intacta. Esta técnica se denomina de microlinfocitotoxicidad , se realiza en policubetas y se utiliza complemento como componente de la reacción. Otra técnica es el cultivo mixto de linfocitos. Si los Ag de histocompatibilidad son diferentes hay proliferación celular, si son iguales los linfocitos se mantienen en reposo. Esta técnica tarda un par de días y necesita de donantes vivos, no puede realizarse con donantes cadavéricos. Esto es porque demora días y después de obtener el resultado recién se puede hacer el transplante. Las pruebas de cross-match se realizan con el suero del individuo que va a ser transplantado y el linfocito del presunto donador. También en este caso es necesario que sean donantes vivos. Esta prueba detecta si en el suero hay Ac contra los linfocitos del donador. Esta prueba también se hace con complemento. Se enfrentan las células del órgano que va a ser donado con el suero del paciente, si hay Ac se forma complejo Ag-Ac. Después se puede agregar una anti-γ-globulina. Se agrega el complemento, el cual se fija, y después se agrega el colorante. Si había Ac, el colorante va a penetrar en la

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célula y la va a teñir porque el complemento debilitó la membrana, y si no hay Ac la célula no se tiñe. Actualmente hay otras técnicas mucho más específicas y sofisticadas, que son las técnicas de biología molecular. En estos se detecta directamente la secuencia genética de cada alelo. Son mucho más costosas.

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REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD

Si se introduce un Ag extraño en el organismo, el organismo elabora una respuesta beneficiosa, porque ante una segunda entrada del microorganismo el organismo responderá neutralizando el agente. Esto es un efecto bueno. Existen casos en los cuales esta segunda entrada del Ag no ocasiona efectos beneficiosos, sino que puede producir daño. Este es el caso de las reacciones de hipersensibilidad. Entonces, una reacción de hipersensibilidad provoca daño en el organismo y se puede producir por alguna desregulación en el sistema inmune. Estas reacciones de hipersensibilidad fueron clasificadas por dos investigadores, que se llamaban Gell y Coombs, por lo que se las conoce también como “reacciones de Gell y Coombs”. Se las clasificó en cuatro tipos, y se necesita siempre una sensibilización previa o, en algunos casos, la presencia de autoantígenos que la desencadenen, como en las enfermedades autoinmunes. Se las clasifica de acuerdo a cual es el comportamiento inmunológico que las desencadena y cual es el mecanismo que ocurre: TIPO I: Está mediada por IgE, la cual tiene la característica de fijarse a células por el fragmento Fc. Se va a fijar a células que tengan el receptor para el Fc. Estas células son, por ejemplo, los mastocitos, eosinófilos y basófilos. Una primera entrada del Ag genera estos Ac tipo IgE. Estos Ac se fijan a las células: mastocitos, eosinófilos y basófilos, y cuando el Ag entre por segunda vez, se va a fijar a la IgE que está unida a la célula y va a desencadenar la liberación de mediadores químicos. El Ag debe ser soluble. La IgE puede estar hasta cuatro semanas fijada a las células y algunos ejemplos son la rinitis alérgica, el asma y la anafilaxia sistémica. TIPO II: Están mediadas por la IgG y también por la IgM. El Ag en este caso está unido a la célula o a la matriz extracelular. El mecanismo que actúa es la lisis por complemento, o la citotoxicidad por acción de las células NK, o la fagocitosis. Un Ag que produce este tipo de reacción es la penicilina. TIPO III: Están mediadas por IgG, el Ag es soluble y el mecanismo es el depósito de inmunocomplejos y la lisis a través del complemento. Como ejemplo, la enfermedad del suero y la reacción de Arthus. Estas tres son reacciones de hipersensibilidad inmediata, porque están mediadas por Ac. TIPO IV: Se conocen como reacciones de hipersensibilidad retardada y están mediadas por células: LTh1, LTh2 y LTc. En el caso del LTh1 y LTh2 el Ag es soluble. En el caso de los mediados por LTh1 el mecanismo es la activación de los macrófagos, porque los LTh1 producen IFN-γ que contribuye a la activación de los macrófagos. Un ejemplo típico es la reacción de la tuberculina. En el caso de los LTh2 el Ag es soluble y el mecanismo es la activación de los eosinófilos. Este fenómeno es lo que ocurre en el asma crónico, que se inicia como una reacción de hipersensibilidad tipo I.

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En los mediados por los LTc el Ag está asociado a células y se produce la lisis. El Ag es una molécula pequeña que es capaz de meterse adentro de la célula, asociarse a una proteína celular y después expresarse como una proteína extraña en el contexto de MHC-I. Los Ag o alergenos que pueden dar las reacciones de hipersensibilidad pueden encontrarse en muchos materiales. Por ejemplo, en el polen, en la caspa de los animales, en los excrementos de los ácaros, en materiales inyectables como drogas, medicamentos, vacunas, venenos de insectos, en los materiales ingeridos, en fármacos, en materiales que actúan por contacto, los detergentes, metales, etc. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Son las más comunes. Están mediadas por Ac que tienen la capacidad de fijarse a células. Se denominan CITOTROPICOS. Estas recciones se conocen también como REACCIONES DE ANAFILAXIA. Los Ac que producen estas reacciones de forma espontánea son de la clase IgE, pero las reacciones de anafilaxia también pueden llevarse a cabo de forma experimental, y en ese caso va a estar mediada por otro tipo de Ac que es la IgG. Estas reacciones fueron muy estudiadas en animales, y así se descifró el mecanismo que las desencadena. Anafilaxia Espontánea → IgE Anafilaxia Experimental → IgG La anafilaxia en animales se puede provocar de forma activa o pasiva: • En la anafilaxia activa se usa el mismo animal para generar la respuesta de Ac y para desencadenar la reacción. Entonces, se inyecta el Ag en un animal, este animal elabora los Ac, luego se inyecta nuevamente el Ag para desencadenar la reacción. La primera etapa, donde se inocula el Ag para que se generen los Ac, se denomina fase de sensibilización. El Ag se puede inocular por vía intradérmica o subcutánea. La etapa donde se inocula el Ag por segunda vez es la fase de desencadenamiento, y el Ag generalmente se inyecta de forma intravenosa. • La anafilaxia pasiva consiste en inyectar el Ag en un animal para que elabore Ac, se inyectan esos Ac en otro animal y después se inyecta el Ag desencadenante en el animal al que se le inyectaron los Ac. En un trabajo práctico se inmuniza un conejo con OA, por lo cual el conejo elabora Ac anti-OA. Se le extrae sangre, se separa el suero, el cual tendrá Ac IgG fundamentalmente. Este suero se lo inyecta a un ratón. Luego en el ratón se produce el desencadenamiento con la OA. Esta es una anafilaxia pasiva. En vez de ratón puede utilizarse otro conejo, es decir, el animal puede ser de la misma o de distinta especie. Si el animal es de la misma especie el Ac que se va a fijar es homocitotrópico, y si es de distinta especie se llama heterocitotrópico. La IgG se puede fijar a células de animales de la misma o de distinta especie.

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IgE→HOMOCITOTRÓPICA IgG→HETEROCITOTRÓPICA En el caso de la anafilaxia pasiva, es necesario esperar un tiempo para que los Ac se peguen a la célula, ese período se llama período de latencia. Luego de inyectar la dosis del Ag desencadenante, los fenómenos que se pueden observer son de dos maneras: puede producirse una anafilaxia generalizada o una anafilaxia local. En la anafilaxia generalizada están implicados muchos órganos, y en la anafilaxia local está implicado un solo tejido. En la generalizada, una vez que se produce el desencadenamiento por la liberación de todos los mediadores químicos, se puede llegar a producir el shock anafiláctico que lleva a la muerte del animal. Los síntomas que van a tener los animales van a depender de los mediadores químicos que liberen. No son iguales para las distintas especies. En el cobayo se libera histamina y en el ratón serotonina. Entonces, tanto la anafilaxia generalizada como la local pueden ser activa o pasiva. Las reacciones de anafilaxia local se pueden detectar por tres métodos: • Método de Schulz-Dale (mide la contracción muscular y utiliza quimiógrafos). • Degranulación de los mastocitos. • Anafilaxia cutánea. Estos métodos tienen una diferencia según la reacción sea activa o pasiva.

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ANAFILAXIA ACTIVA ANAFILAXIA PASIVA

Método de Schulz-Dale

Se trabaja con un pedazo de tejido de intestino o

útero de un animal sensibilizado. Se supone que en el tejido ya están

los Ac pegados a la célula. Se agrega el Ag

que se usó para sensibilizar y se mide la contracción muscular.

Se trabaja con un intestino o un útero de un

animal virgen. Se agregan los Ac obtenidos en otro animal, se espera el período de latencia, se agrega el Ag y se mide la

contracción muscular.

Técnica de la degranulación de

mastocitos

Se trabaja con serosa, una porción de mucosa de un animal sensibilizado que ya tiene los Ac pegados.

Se agrega el Ag, se produce la degranulación

de los mastocitos y después se colorea y se observa al microscopio.

Se trabaja son serosa de un animal virgen, se le

agregan los Ac, se espera el período de latencia y después se agrega el Ag. Se fija y se colorea para

mirar al microscopio

Anafilaxia cutánea

A un animal sensibilizado se le inocula el Ag por

vía intradérmica en forma local. Después por vía

intravenosa se le agrega el colorante de alto PM, que es el Azul de Evans.

Se llama TEST DE OVARY . A un animal se le inocula en la piel Ac

de otro animal. Se espera el período de latencia y

después por vía intravenosa se inyecta el Ag + el colorante de alto

PM.

El colorante de alto PM queda en circulación, pero en los puntos donde se produjo la degradación de los

mastocitos hay un aumento de la permeabilidad capilar y entonces el colorante sale y se observa una

mancha azul.

En una reacción de anafilaxia cutánea pasiva se inocula con un suero directo de conejo, que va a tener Ac heterocitotróficos porque provienen de otra especie animal, y es un suero de conejo que se inmunizo con OA. Se hace un control al cual se le inyecta solución fisiológica. En este tipo de práctico es muy importante tener cuidado al inocular al animal, ya que se pueden producir manchas azules por todas partes que van a ser inespecíficas.

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Luego se espera un tiempo que corresponde al período de latencia, y después se inyecta la dosis desencadenante por vía intravenosa. Esta inoculación se hace en el ojo, en el seno orbital, y se inyecta el Ag junto con el azul de Evans. El ratón se pone azul debido a la circulación del colorante por el organismo. Se sacrifica al ratón y se extrae la piel, para comprobar las manchas. Esta técnica sirve para determinar que Ac son capaces de fijarse a las células, para poder determinar la dosis sensibilizante, es decir, la cantidad de Ac que hay que agregar para que se produzca la reacción; y para estudiar los mecanismos que producen la reacción de anafilaxia. Las reacciones de hipersensibilidad tipo I en el hombre están mediadas por IgE. La IgE se encuentra en muy bajas concentraciones en sangre, está en el orden de los µg., y se encuentra fundamentalmente fijada a células. Tiene dos cadenas H y dos cadenas L, tiene cinco dominios de Ig, no tiene capacidad de fijar complemento ni tampoco de precipitar Ac, y si se calienta a 56ºC pierde la capacidad de unirse a los receptores. Para identificar IgE hay que utilizar técnicas muy sensibles porque está en muy baja concentración, entonces se usan métodos de interacción primaria con compuestos marcados con radioisótopos. Estos métodos son el PRIST y el RAST. El PRIST determina IgE total y el RAST determina IgE específica para un determinado Ag. Este tipo de reacción está mediada también por células. MASTOCITOS Los mastocitos se originan en la médula ósea. El nombre del mastocito viene del alemán mastzellen que significa célula obesa, ya que ese es su aspecto al microscopio. Son abundantes en todas las mucosas y los epitelios, y en los tejidos vascularizados, pero no están ni en retina ni en el sistema nervioso. Cuando se producen en médula ósea no son granulados, adquieren los gránulos a medida que maduran en el tejido. Los mastocitos humanos se pueden clasificar en dos tipos, de acuerdo a las enzimas que tengan: los mastocitos de mucosa producen triptasa y los mastocitos de tejidos producen quimiotriptasa. Estas células tienen receptores para el Fc de IgE, y se las llama FcER1. Estos receptores tienen una afinidad muy alta por la IgE, es de 1010 M-1, y en particular mucha afinidad por la IgE libre. Es decir que la IgE no necesita estar unida a ningún Ag para poder fijarse al FcER1. Los mastocitos expresan el FcER1 en forma constitutiva. A una misma célula se pueden unir moléculas de IgE de distinta especificidad, pero para que se desencadenen todos estos fenómenos se necesita el entrecruzamiento de receptores. Esto quiere decir que dos moléculas de IgE adyacentes se tienen que unir al mismo Ag. Para esto el Ag debe tener epitopes múltiples, repetitivos, o dos moléculas de distinta especificidad que estén muy cerca y un Ag que tenga dos epitopes distintos cercano uno del otro. Los gránulos de los mastocitos poseen mediadores químicos, los cuales se producen de forma constitutiva, estas son las enzimas histamina y el TFN-α que puede ser considrado como preformado. De las enzimas se sintetizan de forma constitutiva la triptasa, luego la histamina y el TNF-α. Es decir que el mastocito no necesita estar activado para producirlos. Una vez que se produce la activación sintetiza otros mediadores: IL-4, IL-13, leucotrienos, factor activador de plaquetas, y las prostaglandinas.

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Uno de los mediadores más importantes es la histamina, que deriva del aminoácido Hys y puede actuar por receptores celulares de tres tipos: H1, H2 y H3. De acuerdo a que interactúe con uno u otro va a ejercer una función diferente. La acción que va a ejercer en estas funciones va a estar mediada por su unión al receptor H1.

La histamina aumenta la permeabilidad capilar y produce la contracción del músculo liso. Como este es un fenómeno de tipo inflamatorio se favorece el pasaje de células desde el sitio de activación por el aumento de la permeabilidad capilar. El TFN-α actúa estimulando la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales, esto favorece el pasaje de células desde la circulación al tejido. La triptasa activa metaloproteasas que degradan la matriz extracelular. Estos fenómenos pueden llegar a ser beneficiosos en algunos momentos, como en algunas enfermedades parasitarias, pero en el caso de la alergia estos fenómenos producen daño. Dentro de los mediadores que se sintetizan después, los leucotrienos son los más importantes y tienen la misma acción que la histamina, con la diferencia de que son 100 veces más potentes, pero se liberan más tardíamente. Todos estos mediadores son responsables del shock anafiláctico que sufren los animales y que lleva a la muerte. EOSINÓFILOS Se encuentran en baja proporción en la circulación, son más abundantes en el tejido conectivo de los tractos respiratorio, gastrointestinal y urogenital. Tienen granulaciones con un contenido extremadamente tóxico para las células, es por eso que la producción de eosinófilos está muy bien controlada. Cuando se producen fenómenos inflamatorios se produce la IL-5 que favorece la producción de eosinófilos por la médula ósea. Esta interleuquina se genera en estados de inflamación . Los eosinófilos no expresan el FcER1 en forma constitutiva, pero sí lo hacen cuando está presente la IL-5. Para migrar a los sitios de inflamación los eosinófilos usan las quemoquinas. Las quemoquinas que participan son la CCL-5, CCL-9, CCL-11. La CCL-9 se conoce como eotaxina, es un factor que atrae a los eosinófilos. Los eosinófilos tienen un receptor para quemoquinas que es el CCR3. BASÓFILOS Los basófilos se parecen a los mastocitos pero tienen el mismo origen que los eosinófilos, el mismo precursor. Expresan el FcER1 solo cuando son estimulados y las citoquinas que favorecen la producción de basófilos son las IL-3 y el TGF-β. Parece ser que la producción de eosinófilos y basófilos se autorregula. Para que un LB produzca IgE debe experimentar el switch o cambio. Una citoquina muy importante en la producción del cambio de isotipo es la IL-4. Además, el LB debe interactuar con un LT a través de la molécula CD40 del LB con la molécula CD40L del LT, y la presencia de IL.4. Cuando los mastocitos se activan, por el entrecruzamiento de IgE unidas a la membrana por unión al Ag, comienzan a producir IL-4 y CD40L. Entonces, los mastocitos activados pueden contribuir a la producción de más IgE. Es una manera de incrementar la reacción de hipersensibilidad. Los Ag que inducen la producción de IgE son Ag proteicos, pequeños, de bajo PM; deben ser muy estables, ya que muchos de estos Ag se encuentran en el polvo, en los excrementos de los ácaros, por eso necesitan una alta resistencia. Además, necesitan

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tener una alta solubilidad. Cuando el polvo o el excremento de los ácaros se introducen por vía respiratoria, al estar en contacto con el moco se hidratan, por eso los alergenos deben ser solubles, para poder desprenderse de las partículas. Muchos tienen actividad proteasa, la que también favorece la salida del cúmulo de sustancias y la entrada a la mucosa. ATOPIA: Es la predisposición genética que tienen ciertos individuos de padecer estos fenómenos de alergia o hipersensibilidad. Se asocia a algunos genes, por ejemplo a los genes de ciertas citoquinas que están codificadas en el cromosoma 5 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-12), a los genes que están ubicados en el cromosoma 11, que son los que codifican para el receptor FcER1, y también se asocian a ciertos genes del CMH. Entonces, un alergeno que en un individuo normal no ocasionaría ningún problema, en ciertas familias de ciertos genotipos puede causar problemas. Si bien estas reacciones de hipersensibilidad son inmediatas, igual se pueden distinguir en ellas dos fases: una fase inmediata, que se produce cuando se liberan las histaminas, y una fase tardía, donde el edema y la inflamación son mayores, y es la que se produce cuando se liberan los leucotrienos. La fase temprana es la que se detecta cuando se hacen las pruebas cutáneas para saber si un individuo es alérgico. Se introduce el alergeno en la piel y a los pocos minutos aparece una zona rojiza debido al aumento del flujo sanguíneo y la alteración de la permeabilidad capilar. Si a un individuo le hacen esta prueba y resulta ser alérgico, y se quiere saber si el alergeno esta afectando también la capacidad respiratoria, deben hacerse pruebas midiendo la capacidad respiratoria antes y después de estar en contacto con el alergeno. Si resulta alérgico la capacidad respiratoria va a disminuir debido a los efectos de la histamina: contracción del músculo liso, se cierran los bronquios. �La célula principal que actúa en todo el mecanismo es el mastocito. La liberación de histamina produce la contracción del músculo liso y el aumento de la permeabilidad capilar. Si esto ocurre, por ejemplo, en el tracto gastrointestinal se favorece el aumento de las secreciones, aumenta el peristaltismo y va a producir diarrea y vómitos. Si ocurre en las vías aéreas va a disminuir el diámetro de los bronquiolos y le va a costar al individuo respirar (se va a producir tos, sibilancias). Depende también en cual sitio del tracto respiratorio está actuando. Si la liberación se produce en las fosas nasales va a haber estornudo, picazón. Si se produce a nivel de los vasos sanguíneos se produce un aumento de la extravasación de líquido, se produce edema y esto favorece que vayan más células a los ganglios o a las zonas cercanas al sitio de entrada. Las reacciones mediadas por la IgE pueden ser: • ANAFILAXIA SISTÉMICA: El Ag penetra por vía sanguínea. El individuo que fue previamente sensibilizado por el alergeno elaboró la IgE, y la segunda entrada del Ag se produce por vía sanguínea. Esto se da en el caso de las picaduras de avispa o abeja, cuyos venenos pueden producir este tipo de reacción. También la penicilina. El ingreso del alergeno puede inducir un shock anafiláctico que lleva a la muerte del individuo.

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Si actúa sobre el corazón y el sistema vascular va a producir un aumento de la permeabilidad capilar, va a disminuir la presión arterial, disminuye el O2, disminuye la frecuencia cardiaca hasta producir la muerte. En el tracto respiratorio se produce la contracción del músculo liso, se cierra la garganta, se puede producir edema de glotis. En el tracto gastrointestinal se producen cólicos, dolores, vómitos. A un individuo que padece toda esta sintomatología se le da epinefrina, para contrarrestar los efectos de la histamina. • RINITIS ALÉRGICA O FIEBRE DEL HENO: Es la más leve de todas las alergias. El alergeno entra por vía nasal y la degranulación de los mastocitos se produce en las fosas nasales. En estos casos hay picazón, estornudos, aumenta la secreción que puede estar muy poblada de eosinófilos, y aparece líquido en los senos paranasales debido a la extravasación de líquido que hay. Esto puede llegar a complicar también los oídos y favorece las infecciones por virus o bacterias. También puede afectar a los ojos, haber producción de lágrimas, etc. • ASMA ALÉRGICO: La liberación de los mediadores se produce en los bronquiolos: un alergeno entra por vía inhalatoria, se fija a los mastocitos que ya tienen la IgE y desencadenan la liberación de los mediadores químicos, lo cual altera la permeabilidad capilar y favorece la llegada de eosinófilos y LTh2. Este es un proceso agudo que luego se convierte en un proceso crónico, es decir, esta reacción de hipersensibilidad de tipo I pasa a ser una reacción de hipersensibilidad de tipo IV. En estas reacciones, si bien el Ag puede haber sido eliminado, se pueden favorecer en ambientes donde hay humo o algún otro componente que pueda estimular la reacción inflamatoria. • REACCIONES ALÉRGICAS CUTÁNEAS: La urticaria, que proviene del contacto con las ortigas (de ahí su nombre), es una reacción de liberación de mediadores químicos en la piel. Hay picazón, eritema, enrojecimiento. El edema angioneurótico es cuando la liberación de los mediadores se produce en el tejido subcutáneo. Estos dos casos se dan en alergias alimentarias, cuando el alergeno ingresa por vía oral y rápidamente por circulación llega a la piel. La dermatitis o exema atópico es parecida, pero las lesiones producidas tienen secreciones. Pican mucho, son eritematosas y con una cierta producción de líquido. Este exema se produce en muchas personas que tienen asma o rinitis alérgica. • ALERGIAS ALIMENTARIAS: Hay muchos componentes, proteínas animales o vegetales, que en individuos normales no ocasionan nada, pero en individuos que tienen cierta predisposición pueden causar estos fenómenos de alergia. El alergeno entra por vía oral y se difunde rápidamente por vía digestiva, por ello a veces puede producir urticaria. TRATAMIENTOS Un tratamiento es el preventivo, es decir, no estar en contacto con el alergeno. Otro es el farmacológico, por ejemplo, administrando los anti-histamínicos o los corticoides, atacando la sintomatología.

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Otro tratamiento es el inmunológico. Lo que más se usa desde el año 1911 es la desensibilización. Consiste en inyectar o administrar por vía oral, cantidades crecientes de alergeno para tratar de polarizar la respuesta inmune hacia los LTh1. Es decir, se desvía para que no haya tantos LTh2 y produzcan IgE. La respuesta se desvía hacia los LTh1 o se trata que se produzca más IgG. Estos métodos son específicos del Ag. Otras estrategias incluyen un Ac monoclonal anti-IgE que se llama ruMBA-E25 . Este Ac se une a la IgE que está libre, y así impide que se una a los mastocitos. Se los llama Ac inteligentes. Otra forma es tratar de estimular la respuesta de las células T reguladoras, que se puede hacer a través de algunos probióticos. Hay vacunas de ADN con pequeñas porciones de los alergenos. La idea general es tratar de modificar la respuesta para que no se produzca la IgE. Hay Ac que bloquean la IL-4, o al receptor de IL-4, así se evita que actúe sobre los LB y produzcan IgE. PRUEBAS DE ALERGIAS CUTÁNEAS Se inoculan los alergenos conocidos y se observan las reacciones que se producen en la piel. Hay que tener cuidado con estas pruebas porque se pueden producir algunas reacciones no deseadas, por eso primero se hace una técnica de PRICK que consiste en cubrir la piel con una solución de alergeno, y luego se pincha la piel. Si no hay reacción se administra la inyección más grande. RACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Estas reacciones están medidas por Ac que pueden ser del tipo IgG o IgM. En estas reacciones el Ag está unido a una célula. El mecanismo por el cual se van a producir estas reacciones puede ser por activación del complemento o por un mecanismo de citotoxicidad dependiente de Ac, como lo pueden efectuar las células NK; y también puede ser a través de la fagocitosis mediada por los receptores para el fragmento Fc de la IgG, el FcγR. Este tipo de reacciones la pueden producir algunos tipos de fármacos que se unen a las células y las alteran, como por ejemplo la penicilina, la metildopa y la quinidina. La metildopa es para la presión sanguínea y la quinidina es para la arritmia. Algunos ejemplos son la anemia hemolítica que se puede producir por la incompatibilidad ABO y la eritroblastosis fetal. ANEMIA HEMOLÍTICA En la incompatibilidad ABO, tambien puede producirse en el rechazo de ingertos. Los individuos con GR A tienen en la membrana el Ag A y el Ac anti-B, los que tienen GR B tienen en su membrana el Ag B y el Ac anti A, los del grupo O tienen ambos Ac y los del grupo AB no tienen ningún Ac. Las isoaglutininas anti-A y anti-B son del tipo IgM y son los llamados Ac naturales. Parece que se originan por ciertos componentes que tienen en su membrana las bacterias comensales, que reaccionan en forma cruzada con los Ag de membrana. Si un individuo del grupo A recibe sangre que es del grupo B, las aglutininas del individuo van a destruir los GR B, y el mecanismo por el cual los destruye es por activación del sistema complemento.

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ERITROBLASTOSIS FETAL Se produce por incompatibilidad Rh. Se llama eritroblastosis porque para compenzar la destrucción hay un aumento en la producción de los GR, y aparecen muchas formas inmaduras. El grupo Rh se asocia a los Ag de membrana D. Los Ac anti-Rh no son naturales, se obtienen por sensibilización durante el embarazo, o por alguna transfusión incorrecta. Una madre Rh(-) no tiene Ag D ni Ac anti-D. Si tiene un hijo Rh(+), el cual sí tiene Ag D, en el momento del parto, cuando se ponen en contacto la sangre fetal con la sangre materna, se puede producir la sensibilización de la madre. Esto quiere decir que esta mujer va a empezar a fabricar Ac anti-D. En un embarazo posterior, esos Ac anti-D pueden pasar al feto a través de la placenta, ocacionando la anemia hemolítica en el bebé. Algunos autores dicen que el mecanismo de destrucción de los GR del bebé es a través de la fagocitosis: se forman complejos Ag-Ac, que luego son captados por los macrófagos y de esa manera son destruidos. En este caso no se activa el complemento porque estos Ac son incompletos, o porque no hay una densidad adecuada de Ag D en la membrana del GR. Las mujeres Rh(-) que tuvieron un hijo Rh(+) tienen que recibir un tratamiento para evitar la producción de estos Ac. Se les administra una vacuna llamada ROGHAM que consiste en inyectar Ac anti-D. El mecanismo por el cual actúan estos Ac no está muy claro. Algunos proponen que estos Ac están inactivando los LB vírgenes que sean capaces de reconocer al Ag D. PENICILINA La penicilina tiene la particularidad de poder unirse a ciertas proteínas del hospedador y son capaces de poder unirse al GR. Si al mismo tiempo se liga la fracción C3d del complemento, porque como el individuo estuvo infectado se activó todo el sistema complemento generando las distintas fracciones, estos eritrocitos pueden ser fagocitados por los macrófagos y los macrófagos pueden presentar en su membrana péptidos de todo el gran complejo que fagocitaron. Pueden así activar a los LT, que van a activar a su vez a los LB que reconozcan a la penicilina. Se van a generar así Ac anti-penicilina. Estos Ac van a poder actuar sobre los GR que habían sido modificados por la penicilina y los van a poder destruir por activación del sistema complemento. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Estas reacciones están mediadas por complejos inmunes Ag-Ac. Los Ac pueden ser del tipo IgG y también IgM, y el Ag debe ser soluble. Siempre que ingrese un Ag soluble que genera Ac, se formaran complejos Ag-Ac. Es un fenómeno normal que ocurre en todas las respuestas inmunes. En los primeros estadíos de la respuesta, es decir, cuando recién entra el Ag, se va a tener mucha cantidad de Ag y poco Ac. Los complejos inmunes Ag-Ac no tienen la conformación suficiente como para fijar el complemento, por lo tanto no pueden ser eliminados. Cuando se está en la fase intermedia de la respuesta inmune, hay cantidades comparables de Ag y Ac, y los complejos inmunes que se forman pueden fijar complemento y así ser eliminados. En la fase final de la respuesta inmune, cuando hay más Ac que Ag, los complejos que se forman también pueden fijar complemento y ser eliminados.

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Entonces, los complejos inmunes de los primeros estadíos pueden llegar a depositarse en algunos órganos, por ejemplo, en el glomérulo renal, en las articulaciones, y una vez que se depositan sí pueden fijar el complemento, lo activan y se produce la liberación de C3a y C5a, que estimulan respuestas inflamatorias. Dentro de estas reacciones mediadas por inmunocomplejos, hay algunas de tipo local, que se conocen como FENÓMENO DE ARTHUS . En un individuo que generó Ac IgG contra un Ag soluble, le inoculamos por vía intradérmica o subcutánea el Ag. Estos Ac tipo IgG que se habían producido van a fijarse al Ag, y los complejos inmunes formados van a activar a mastocitos que tienen el FcγR, se va a producir la liberación de los mediadores químicos y se va a producir una reacción de tipo inflamatoria. Se va a caracterizar en la piel por enrojecimiento y formación de edema. En este caso no se activa el complemento, pero se está produciendo un fenómeno inflamatorio. La activación del mastocito no es por el entrecruzamiento de receptores, es el complejo inmune el que lo activa. Hay otra reacción tipo III que es sistémica y se la llama ENFERMEDAD DEL SUERO. Hacia fines del siglo XIX, en algunas enfermedades infecciosas, como la escarlatina o el tétanos, se trataba a los individuos con una inyección de suero de caballo que había sido inmunizado con toxina de estas bacterias. Así se introducía una gran cantidad de proteínas en el individuo, por lo que al cabo de 7 a 10 días experimentaba una reacción de hipersensibilidad: fiebre, escalofríos, artritis, trastornos renales; esto se debía a la formación de inmunocomplejos. Entonces, en este caso se produce por la introducción de una gran cantidad de Ag soluble proteico en un individuo (Ac antitoxina de caballo). Esta es una enfermedad que se autolimita, ya que los Ac van a ser finalmente eliminados por activación del complemento y de respuestas secretoras mediadas por células fagocíticas y mastocitos. Aparece entre los 7 y 10 días porque es el tiempo que se necesita para que se formen Ac contra estas proteínas (Ac anti-antitoxina de caballo). Después los complejos se van eliminando. En la actualidad prácticamente no se usan estos sueros. Se pueden dar en el caso de los sueros antiofídicos, que aun se preparan en animales, y en el caso de los transplantes, a veces para disminuir la respuesta inmune se les da a los individuos sueros antilinfocíticos que fueron preparados en ovejas. La penicilina también puede causar este tipo de patología. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV: HIPERSENSI BILIDAD RETARDADA Son reacciones mediadas por células. Las células que van a participar son los LTh y los LTc. Una de estas puede ser la reacción de tuberculina, y otras las reacciones de hipersensibilidad de contacto, como la dermatitis por contacto. En este caso se necesitan entre 100 y 1000 veces más Ag que para las otras reacciones de hipersensibilidad. REACCIÓN DE TUBERCULINA La reacción consiste en introducir intradérmicamente un Ag que va a estar constituído por proteína y otros componentes del Micobacterium tuberculosis. Los Ag van a ser procesados por los macrófagos y van a impactar a LTh1 que ya habían sido previamente sensibilizados; son LT efectores. Los linfocitos van a liberar citoquinas inflamatorias, estas citoquinas van a alterar la permeabilidad capilar, van a llegar al sitio PMN y se va a producir al cabo de unas 72 hs la típica reacción de eritema, enrojecimiento y edema.

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Esta prueba se usa en países desarrollados antes de vacunar contra la tuberculosis. En Argentina se vacuna directamente con BCG. Esta prueba nos dice si el individuo estuvo en contacto con el M. tuberculosis, por lo cual ya generó la suficiente cantidad de células de memoria como para poder defenderse. Entonces en este caso el Ag que participa es un Ag soluble. Los LTh1 pueden liberar: quemoquinas, para ayudar a la llegada de las otras células inflamatorias; el IFN-γ, que activa a los macrófagos y aumenta la fagocitosis; el TNF-α y el TNF-β, que producen lesiones titulares y favorecen la producción de moléculas de adhesión; y pueden producir citoquinas que van a actuar sobre médula ósea estimulando la produción tisular. DERMATITIS POR CONTACTO: La pueden provocar Ag solubles o Ag unidos a células. Un ejemplo típico es la reacción de un componente del veneno de la hiedra venenosa, que es un hapteno: pentadecacatecol. Puede unirse a proteínas extracelulares pero como también tiene características lipídicas puede penetrar dentro de las células y unirse a proteínas propias de esta. Entonces puede ser presentado en el contexto de la MHC-II y también MHC-I. En este caso la acción va a estar mediada por LTh1 cuando se une a proteínas extracelulares, o por LTc, cuando son intracelulares, respectivamente. El primer contacto de un individuo con este hapteno no ocasiona grandes problemas. Aparecen reacciones imperceptibles. Pero el individuo se sensibiliza de tal manera que ante la segunda entrada se producen lesiones muy importantes en la piel, con un exudado característico. Cada vez que se ponga en contacto este individuo con el Ag la reacción será más fuerte y más importante. Entonces, una célula de Langerhans puede captar una molécula extraña y se la puede presentar a los linfocitos que ya habían sido previamente sensibilizados. Estos linfocitos secretan INF-γ, se activan los queratinocitos y esto es perjudicial para el organismo: se altera la permeabilidad capilar por las citoquinas producidas por los queratinocitos y se favorece la llegada de más células que incrementan la inflamación. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO V: Estas reacciones están mediadas por Ac contra receptores hormonales. Lo que hacen es ejercer un efecto estimulatorio. Algunos colocan a la enfermedad de Graves en este contexto.

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INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Son enfermedades poco frecuentes que afectan distintos componentes del sistema inmune. Pueden afectar al sistema B, que sería todo el sistema humoral, el sistema T o celular, el sistema de los fagocitos y el sistema del complemento. La incidencia es muy baja y la distribución es: 65% deficiencias humorales, 5% a la inmunidad celular, un 10% para las células fagocíticas y 5% para el complemento. Son enfermedades hereditarias que dan manifestaciones clínicas ya en la infancia temprana. Las infecciones son las manifestaciones clínicas más frecuentes, es decir, estas personas tendrán una mayor susceptibilidad a los procesos infecciosos. Muchas de estas patologías son ligadas al cromosoma X, por lo que los más afectados van a ser los varones. Entre los procesos infecciosos que se ven en estas personas pueden estar: otitis a repetición, sinusitis que puede llegar a tener complicaciones pulmonares, neumonías, deficiencias respiratorias. Hay infecciones en la piel, en el tejido gastrointestinal, etc. Las clasificamos de acuerdo a cuales son las alteraciones que se presentan en cada una de ellas. Estos trastornos que estudiaremos son inmunodeficiencias primarias. Las inmunodeficiencias secundarias pueden deberse a trastornos metabólicos, degradación, etc. Se hace una clasificación de la deficiencia de la respuesta inmune adaptativa o de la respuesta inmune innata. DEFICIENCIAS DE LA RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA En la respuesta inmune adaptativa están las inmunodeficiencias que tengan que ver con los Ac, y está comprometido el linaje B. Las inmunodeficiencias combinadas tienen deficiencia humoral y celular. En la parte celular están comprometidos los LT, y por lo tanto también puede haber deficiencia de Ac debido a la colaboración T-B. Con las técnicas de biología molecular se han podido detectar las alteraciones cromosómicas. Se hacen estudios prenatales para saber si hay alguna anormalidad en los cromosomas. Se hacen en los primeros meses con muestras de las vellosidades coriónicas y cuando está aproximadamente en la semana 20 de gestación, ya se puede hacer con sangre del cordón. Esto brinda un diagnóstico prenatal. Esto es bueno para determinar el estado de portador, se pueden detectar mutaciones a nivel del cromosoma X que corresponderían a mujeres portadoras. Los varones portadores corresponderían a aquellos cuyas mutaciones están en cromosomas somáticos. Esta información permite tomar algún recaudo, sobre todo en los progenitores de personas que tienen inmunodeficiencias. Entre las inmunodeficiencias que tienen que ver con los Ac está la AGAMAGLOBULINEMIA LIGADA AL SEXO , que también se llama Enfermedad de Bruton. En esta hay une mutación en un gen llamado tirosinquinasa de Bruton. Tiene que ver con la diferenciación de las células pre-B, es decir, hay un freno en la maduración de las células B, en el paso de pre-B a LB maduro. No hay señales para que el LB madure y queda en el estadío pre-B. A nivel de la médula ósea no va a haber desarrollo de folículos linfoides, ni centros germinativos, y por supuesto va a haber

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deficiencias en todas las Igs; de ahí el nombre “agamaglobulinemia”. El patrón de herencia es ligado al sexo y se advierte entre los 6 y 12 meses de vida: los recién nacidos tienen la protección de las IgG maternas, cerca de los 6 meses esas IgG fueron metabolizadas y comienza a manifestarse la inmunodeficiencia propia del bebé. Van a predominar infecciones debido a gérmenes como los pyógenes, y todos aquellos patógenos que deben ser eliminados por Ac. Es necesario hacer un diagnóstico precoz para instaurar un tratamiento preventivo rápido. El tratamiento es mediante dosis de γ-globulinas intravenosa, y es de por vida. Entonces, está disminuída toda la respuesta Ac-dependiente. Hay una forma de agamaglobulinemia que es autosómica recesiva, que puede presentar un defecto en la cadena µ o en la cadena λ. Queda frenado el pasaje a pre-B, queda en el estadío pro-B. El fenotipo es el mismo que el anterior; están disminuídas las γ-globulinas. Puede existir también déficit de algunas de las Ig. Serían trastornos en la diferenciación final del LB. Puede haber déficit de IgA y déficit de algunas de las subclases de IgG. En el caso de la IgA es una de las más frecuentes, y la parte más comprometida es la parte pulmonar y la parte intestinal. En este caso hay niveles normales de IgM e IgG. También se han visto déficit en algunas subclases de IgG. La IgG1 es la más abundante, por lo que un nivel bajo de IgG1 afecta mucho el nivel de IgG total. Está también la inmunodeficiencia con exceso de IgM. En este caso el problema se da en el cambio de isotipo. Para que se produzca el switch debe haber una cooperación T-B. El CD40L del LT debe interactuar con el CD40 del LB, pero en este caso hay un defecto con el CD40L. No existen entonces colaboración T-B y entonces no hay cambio de isotipo. Están anuladas entonces las respuestas a Ag-T dependientes y el tratamiento es con γ-globulinas endovenosas. La activación de los macrófagos por la células T también depende de la interacción CD40-CD40L, entonces la activación de los macrófagos también va a estar alterada, por lo tanto va a haber deterioro en la respuesta inflamatoria, en la movilización de leucocitos, va a haber neutropenia. La forma de revertir esta neutropenia es suministrar factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos por vía endovenosa. Estos factores son los que produce normalmente el macrófago activado. La HIPOGAMAGLOBULINEMIA TRANSITORIA DE LA INFANCIA se debe a que, en un principio el lactante va a estar cubierto por la IgG que pasa a través de la placenta. Esa IgG va a ir decayendo, y a partir de los tres meses comienza la síntesis propia de Ig, primero la IgM, luego la IgG, luego la IgA. Puede ocurrir que haya un retraso en la producción de IgG propia hasta 36 meses. Se piensa que las células LB no reciben la ayuda necesaria de las LT para producir los Ac. Sería como una inmadurez en la colaboración T; las LB van a ser normales. Esta patología revierte. Las INMUNODEFICIENCIAS COMBINADAS poseen alteraciones tanto a nivel de la inmunidad humoral como de la inmunidad celular. Acá los defectos son a nivel de los LT. Las células B van a ser normales, pero como su normal funcionamiento depende de la colaboración T, se ve afectada la respuesta celular y humoral. Estas son patologías más severas, y la única forma de revertirla es con un transplante de médula ósea. Una forma de poder clasificarla es de acuerdo al fenotipo que se presenta: están las Inmunodeficiencias Combinadas Severas T(-) B(+) y las Inmunodeficiencias Combinadas Severas T(-) B(-).

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La respuesta inmune adaptativa está totalmente ausente, son las más graves y si no hay transplante de médula ósea el paciente muere. En el primer caso de inmunodeficiencia combinada severa T(-) B(+), se describen dos entidades con alteraciones moleculares específicas, si bien desde el punto de vista clínico e inmunológico van a se iguales. Una es ligada al cromosoma X, y la deficiencia es la cadena γ común a un grupo de receptores de Ig. Otra es la autonómica recesiva, cuya alteración es a nivel de JAK3. En las inmunodeficiencias ligadas al cromosoma X el efecto es en la γ común que está presente en los receptores de todas las interleuquinas: IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, IL-21R. La IL-2 tiene que ver con la homeostasis de los linfocitos, también hay afección de las células NK, ya que está afectado el IL-15R. Todo esto va a afectar el normal desarrollo de las LT y las células NK. La cadena γ se asocia a la JAK3 que es una proteinquinasa que se necesita para transmitir señales de activación hacia el interior de las células. Si bien los LB no se ven disminuídos, funcionalmente van a ser anormales porque no se va a ver un cambio en el isotipo de las Ig porque se necesita la colaboración T. Estos pacientes que tienen inmunodeficiencia combinada severa tendrán ausencia de LT, células NK, presencia de LB con una respuesta proliferativa deficiente. La inmunodeficiencia combinada severa T(-) B(-) puede deberse a la deficiencia en RAG1 y RAG2. Esto se debe a que no hay una actividad endonucleasa en la formación del receptor BCR y TCR, es decir, la recombinación VDJ necesaria para crear estos receptores específicos está alterada. También hay deficiencias en la enzima adenosindesaminasa o la purín nucleosido fosforilasa. Estas enzimas intervienen en el metabolismo de las purinas. Si hay deficiencia de la adenosindeaminasa o de la purín nucleosido fosforilasa va a haber acumulación de ATP y GTP, que inhiben una ribonucleótido reductasa y eso inhibe la síntesis de ADN y por lo tanto la replicación celular. También puede haber una deficiencia en la ZAP 70, que tiene que ver con la deleción + y – en la maduración tímica sobre todo aquellos timocitos que van a ser CD8+. Entonces va a haber una ausencia de LTCD8+. También está la deficiencia en la expresión de MHC tipo II y tipo I. Si hay deficiencia en las moléculas tipo II va a estar afectada la población LThCD4+. Esto acarrea déficit de Ac. El defecto molecular no se encuentra en los genes que codifican a estas moléculas, sino en los genes que codifican para las proteínas promotoras, que regulan la transcripción de esos genes. No hay respuesta proliferativa a aquellos Ag que necesitan ser procesados y presentados por MHC-II. También puede existir deficiencia de TAP1 y TAP2, que serían defectos en los genes que codifican al transportador de péptidos Fas. Esto impide la captación de péptidos por parte de los MHC-I. Va a haber menos concentración de éstas moléculas en la superficie de las células. Va a estar afectada la parte citotóxica. Puede haber una deficiencia en la cadena α del IL-7R, entonces va a haber también una deficiencia de tipo T(-) B(+). Puede haber deficiencias en el CD3, entonces el complejo CD3-TCR va a estar defectuoso. Se han descrito otros síndromes con deficiencias bien definidas. En el síndrome de Di George hay defectos en la embriogénesis del timo, es decir, que directamente no hay timo. Durante la embriogénesis, el timo surge a partir de los arcos faríngeos IV y V.

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Cuando hay defectos también en el arco VI puede haber cardiopatías. A nivel del I y II hay defectos faciales. En estas personas sin timo no hay respuesta adaptativa. DEFICIENCIAS EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA Hay deficiencias del complemento y deficiencias en los fagocitos. Se han descrito deficiencias para todos los componentes del complemento, y se pueden agrupar de acuerdo a cual está afectado. Si hay deficiencias en la activación de C3 hay mayor susceptibilidad a aquellas infecciones donde se necesita el C3 como opsonina para promover la fagocitosis. Esto también se da cuando hay deficiencias en el factor I y el factor M. Cuando hay deficiencias en los componentes del complejo de ataque a las membranas, hay mayor susceptibilidad a infecciones por Neisseria, porque la forma de defensa contra esta bacteria es la lisis por complemento. Cuando hay deficiencia en los primeros dos componentes hay acumulación de inmunocomplejos. Cuando hay deficiencia del inhibidor de C1 hay una activación descontrolada de la vía clásica, hay una entidad que se llama angioedema hereditario. Esto se debe a que hay una producción excesiva de un fragmento que es vasoactivo, entonces produce edema por acumulación de líquido, y si se produce en la epiglotis es edema lleva a la muerte. Puede haber deficiencias cuantitativas, o sea, en el número o función de fagocitos. Cuantitativas se refiere a los casos de neutropenia. Las primarias son excepcionales y se pueden deber a una deficiencia de producción en la médula ósea. La neutropenia secundaria puede ser a causa de una infección en la médula ósea, que produce un freno y lleva a una neutropenia, o alguna enfermedad glucoproliferativa que disminuye la cantidad de fagocitos. Cuando son funcionales las alteraciones pueden estar en la movilidad o en la adherencia de los fagocitos, o bien a la capacidad de los fagocitos de poder ingerir los microorganismos. Puede haber deficiencia en la adhesión leucocitaria. Hay una alteración en el gen que codifica para el CD18, es decir, las integrinas leucocitarias. Estas moléculas son necesarias para que el fagocito abandone el torrente circulatorio y vaya a los tejidos. Está afectada la adherencia a las células fagocíticas. Algunas de las integrinas son CR3, CR4, LFA1 (antígeno funcional leucocitario). En cuanto a la funcionalidad pueden ser defectos en la capacidad de poder destruir a los microorganismo. Una enfermedad típica es la Enfermedad Granulomatosa Crónica, también puede haber deficiencias en la peroxidasa, o en gránulos secundarios, en la glucosa-6-fosfatasa, deshidrogenasas, que tienen que ver con la formación de componentes que tienen actividad microbicida. La NADPH oxidasa es un complejo enzimático formado por cuatro subunidades, dos de ellas son componente de la membana y dos son componentes citosólicos. Los componentes de membrana son la gp91 y la p22. Los componentes citosólicos están formados por la p40-47 y la 67. Cuando se produce la fagocitosis esta provoca la translocación de las subunidades citosólicas hacia la membrana. Se forma el complejo que es la NADPH oxidasa, que produce la transferencia de un e- a la molécula de O2 formando el anión superóxido O2

- que es inestable y puede transformarse por la superóxido dismutasa (SOD) a H2O2, que por la mieloperoxidasa (MPO) puede

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transformarse en HClO. Son sustancias oxidantes que van a ayudar a destruír al microorganismo. En el caso de la enfermedad granulomatosa el defecto está en el gen que codifica para la cadena gp91. La unión de la cadena gp91 con la p22 forma el citocromo B558. Este defecto está en el cromosoma X. Las formas recesivas tienen los defectos en las otras cadenas. Los microorganismos en el interior de la célula no van a ser destruídos y van a dar lugar a la formación de los granulomas. Está también el Defecto Microbactericida de los Leucocitos, donde hay deficiencias a nivel del receptor para el INF-γ y para la IL-12. Entonces se han descrito que micobacterias que generalmente son no patógenas pueden llevar a una infección sistémica. Un estudio clásico para poner en evidencia si está afectada la parte del estallido respiratorio es el estudio de la reducción de un colorante que se llama nitoazul de tetrazolio. Este colorante es transparente y amarillo, y va a ser fagocitado junto con las partículas. Se va a reducir como consecuencia de la oxidación del NADPH y va a dar lugar a un precipitado de color violeta oscuro. Esto en los pacientes con la enfermedad granulomatosa crónica no ocurre. TRATAMIENTOS Son todos tratamientos sustitutivos: • γ-globulinas en aquellas que son deficiencias predominantemente de Ac, • transplante de médula ósea para aquellas combinadas y algunas también en el caso de deficiencias severas en los fagocitos. En el caso de las Igs, existen preparados para vía intramuscular como endovenosa pero los más usados son por vía endovenosa. Los preparados contienen predominantemente IgG1 e IgG2. En el caso de transplantes de médula ósea se debe disponer de un donante compatible. En cuanto a la terapia enzimática, para los casos de deficiencias de adenosindeaminasa, está en vía de desarrollo. Se está buscando en el ambito de la terapia génica. Los laboratorios se agrupan en niveles de acuerdo al grado de complejidad. NIVEL I son los menos complejos, NIVEL II son ya de alta complejidad.

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INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS Las inmunodeficiencias primarias se deben a alguna causa genética, por la alteración a nivel de algún componente del sistema inmune, ya sea alguna molécula que no se expresa, alguna enzima, etc. De acuerdo a cual sea la deficiencia va a estar afectada una u otra rama de la respuesta inmune. En las inmunodeficiencias secundarias veremos el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida , y es secundaria porque se produce como consecuencia de otra causa. El hecho que provoca el SIDA es la infección por un virus llamado virus del HIV (Human Inmunodeficiency Virus). EL VIRUS DEL SIDA: HIV El SIDA se descubrió por primera vez en el año 1980 y se caracteriza porque hay una marcada disminución en el número de LTCD4+. Esto conduce a que el individuo tenga una mayor susceptibilidad a infectarse con microorganismos que normalmente no producen enfermedad, tienen tendencia a sufrir formas muy graves del Sarcoma de Kaposi, y también tienen una mayor predisposición a padecer linfomas de células B. ESTRUCTURA DEL HIV El agente que produce esta enfermedad es el HIV. Es un retrovirus, posee ARN como material genético. El genoma del HIV está formado por dos moléculas de ARN. Posee una cápside que va a encerrar al ARN y a la transcriptasa reversa, que es la enzima necesaria para pasar el ARN a ADNc, tiene una envoltura lipídica que proviene de la envoltura del hospedador, y tiene proteínas de envoltura que son propias del virus: una es la gp120 y otra la gp41. Existen dos clases de HIV: el HIV-1 y el HIV-2 . EL HIV-1 fue el primero que se descubrió, en el año 1983, y fue descubierto casi simultáneamente por dos investigadores, GAGE y MONTANGIE. En el año 1986 se descubrió el HIV-2 en África. La diferencia está en la proteína gp41, que en el HIV-2 está reemplazada por la gp36. Además el HIV-2 es menos virulento y la enfermedad progresa más lentamente. GENOMA DEL HIV Tiene dos secuencias que se denominan LTR: Long Terminal Repeat. Estas secuencias sirven para poder insertarse en el genoma de la célula. Después hay genes que codifican para las proteínas de la envoltura, los env, que codifican para la gp120 y la gp41. Hay otros genes que codifican para la polimerasa, los pol, y codifican para la transcriptasa reversa. Después están los genes reguladores, como los nef, que es un regulatodor negativo que hace que se exprese menos MHC en las células infectadas y también reduce la replicación viral, y el otro gen regulador es el tat, que es un regulador positivo de la transcripción. Si bien hay pocos genes, alcanzan para que el individuo sintetice todas las proteínas y enzimas que necesita. Esto es, porque se puede leer en tres marcos de lectura diferentes. TRANSCRIPTASA REVERSA DEL HIV No tiene capacidad de corregir los errores. Esta es una herramienta que el virus utiliza para poder evadir la respuesta inmune. Esto es, porque al irse modificando la cadena que se está expresando puede hacer que el sistema inmune no lo reconozca.

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CÉLULAS QUE PUEDE INFECTAR EL HIV El HIV va a infectar a células que tengan en su membrana el marcador CD4: los LTCD4+, los macrófagos y las células dendríticas. La simple presencia del CD4 no es condición para que el HIV pueda infectar, necesita de co-receptores. Estos son el CCR5, el CXCR4, y recientemente se ha descrito uno más que es el DC-SING de las células dendríticas. El CCR5 y el CXCR4 son receptores de quemoquinas, son receptores normales utilizados por el sistema inmune para montar una respuesta adecuada. �es necesario la presencia de la molécula CD4 y de dos tipos de receptores: CCR5 y CXCR4. Se ha visto in vitro que los HIV pueden interactuar con distintos receptores, y de acuerdo a cual de esos dos receptores está involucrado, el HIV puede clasificarse en MACROFAGOTRÓPICO , que tiene predilección por el CCR5 de los macrófagos, y el otro HIV se denomina LINFOTRÓPICO , que tiene predilección por los CXCR4 de los LTh. Se cree que in vivo también existen estos dos tipos de HIV, los macrofagotrópicos predominan en las etapas tempranas de la infección, y los linfotrópicos actúan en las etapas tardías, cuando se disminuye más el número de LT. Como se ve el HIV afecta tanto lo innato como lo adaptativo. El HIV tiene una característica particular que cuando afecta a los macrófagos, no los destruye. El efecto del HIV sobre el macrófago no es citopático. El macrófago infectado actúa como reservorio viral. Los LT que pueden ser infectados pueden ser LT vírgenes o LT activados. En el caso de que el HIV infecte un LT0, no se integra inmediatamente en el genoma. A partir del ARN se produce ADNc y queda latente, pudiendo ser degradado por la maquinaria celular. Sin embargo, si ese LTh0 se activa antes de que el ADNc sea degradado, se va a insertar en el genoma y el virus se va a empezar a replicar. Estos LTh0 también estarán constituyendo reservorios virales. INFECCIÓN Primero se produce la interacción gp120-CD4. Además hay interacción con los co-receptores. Esto produce cambios conformacionales y la proteína gp41 es la encargada de la fusión con la membrana de la célula huésped. Después de la fusión se produce la entrada de todo el genoma viral, se produce la acción de la transcriptasa reversa para pasar el ARN a ADN. El ADNc se integra al genoma, y cuando la célula lo activa y empieza a proliferar, comienza a actuar el factor de transcripción NFKβ. Al replicarse la célula se replica el genoma viral, y se forman nuevos virus que van a emerger de la célula infectada. La célula infectada va a poder expresar en su membrana glicoproteínas del virus. VÍAS DE DISEMINACIÓN Se pueden encontrar virus que estén en líquidos corporales: semen, líquido cefaloraquideo y sangre, y virus que estén dentro de las células: linfocitos y macrófagos. Las vías de diseminación más comunes son: a través de las relaciones sexuales, la administración intravenosa de drogas con agujas contaminadas, la lactancia materna, ya que la mayoría de los casos pediátricos se producen por transmisión vertical, que es de

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la madre infectada al bebé y se puede producir durante el embarazo, en el momento del parto (20 a 50 % de los casos) o durante la lactancia. Las transfusiones con derivados de sangre contaminada ya prácticamente no existiría. PROGRESIÓN DE LA INFECCIÓN Cuando se produce la entrada del virus en el organismo, se va a producir un incremento en la replicación viral. El individuo tendrá un conteo de LT normales. En ese período de la infección la sintomatología puede ser una simple gripe o que el individuo esté asintomático. Alrededor de al menos un mes se empiezan a producir los Ac contra los distintos componentes virales. En ese momento está actuando la respuesta inmune para tratar de controlar la infección. Se van a producir Ac contra componentes virales y ese momento en que aparecen los Ac se denomina Seroconversión. La seroconversión se refiere entonces a la aparición de Ac anti-HIV en sangre. Luego hay un período de latencia que es asintomático que puede durar de 2 a 10 años, en los cuales el individuo no experimenta ninguna sintomatología. Este es un momento donde hay una gran lucha entre el sistema inmune y el HIV. El número de LTCD4+ había caído bastante cuando el virus se estaba replicando, luego sube un poco, aunque no alcanza los valores normales, pero se mantiene. Por último, empieza a descender. Cuando el número de LTCD4+ es menor a 500/µL el individuo comienza a padecer cierta sintomatología como ciertas infecciones oportunistas. Dependiendo de cuales sean los componentes más afectados va a predominar un tipo de germen u otro. Cuando el número de LTCD4+ llega a ser menor de 200/µL se comienza a hablar de SIDA. El progreso dentro de la enfermedad puede deberse a todos los reservorios de células que pueden presentar el virus en forma latente sin que se esté replicando. Existen individuos llamados no progresores, es decir, que están infectados pero que no van a desarrollar la enfermedad, y se ha visto que en estos individuos hay una marcada respuesta de los LTCD8+. Los LTCD8+ son muy importantes para controlar las infecciones virales. También hay otro grupo de individuos que si bien están expuestos no desarrollan la enfermedad, y que tienen mutaciones en los genes que codifican para los co-receptores. Como se vio, en las primeras semanas se tiene una gran replicación viral, a medida que empieza a actuar la respuesta inmune, la viremia va disminuyendo. En la etapa asintomática o de latencia la curva se mantiene baja, y al final aumenta cuando se instaura el SIDA. Como se genera una respuesta inmune contra ese agente, se va a tener producción de Ac contra proteínas de envoltura y contra una proteína del core que es la p24. Esta proteína p24 es muy importante para el diagnóstico. También está la acción de los LTc que es muy importante al principio de la infección, luego disminuye lentamente pero se mantiene para decaer hacia la fase final. Esos Ac que se producen durante la infección no son del todo beneficiosos para el organismo. Los primeros que se producen no tienen capacidad de neutralización. Parecería ser que se generan contra epitopes de la gp120 que se encuentran hacia el interior del virus, es decir, epitopes ocultos. Además estos Ac contribuyen a que la enfermedad se disemine. Si por ejemplo, se tiene un Ac contra la gp120, que se unió a un virus, aparece un macrófago que tiene un receptor para el Fc de ese Ac, y si ese macrófago no está infectado se puede infectar con esa unión.

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También, la gp120 es fácilmente liberada de la membrana viral, por lo que va a haber mucha gp120 suelta en el plasma. Los Ac pueden unirse a esa gp120 suelta y no estar disponibles para unirse a la gp120 en el virión. � Lo fundamental en la respuesta inmune contra el HIV son los LTCD8+ que van a eliminar a las células infectadas. INMUNOSUPRESIÓN PRODUCIDA POR EL HIV Altera la función de los macrófagos, incrementando la quimiotaxis cuando las proteínas virales están actuando, o los inhiben. Puede incrementar la producción de las citoquinas inflamatorias, fenómeno muy importante en la demencia por HIV. Las células del SNC más afectadas por el HIV son la microglia, que son macrófagos del SN que controlan las infecciones que llegan a este tejido. La presencia de HIV activa continuamente a la microglia y producen estas citoquinas. La presencia del virus inhibe la fagocitosis y por lo tanto también la presentación antigénica. Se inhibe la fusión fagosoma-lisosoma. Se inhiben todos los mecanismos internos que son necesarios para destruir el agente agresor una vez que es fagocitado. También disminuye la producción del receptor para Fc de las Igs. Los neutrófilos también son afectados. Si bien no tienen la molécula CD4 en su membrana tienen el CXCR4 en abundancia. Entonces, por interacción directa entre el HIV y la membrana del neutrófilo lo pueden llegar a lesionar o destruir. También en los neutrófilos está aumentada la apoptosis por la presencia de las moléculas Fas. En cuanto a las alteraciones a nivel de los LT pueden ser fallas en las citoquinas que produzcan estos linfocitos, o disminución en el número. Por ejemplo, si hay disminución en la producción de IL-2 va a estar afectada también la acción de los LB, y también la de los LTCD8+. En las alteraciones cuantitativas a nivel de los LT, hay una disminución en el número que pude deberse a una acción citotóxica directa del virus, por formación de sincitios, que son células multinucleadas gigantes, y son producidas por las cepas linfotrópicas. Se produce una interacción entre el CD4 de una célula no infectada y la glicoproteína gp120 que está expresando una molécula infectada. También se pueden infectar las células del timo. Se ha visto que la involución del timo se ve alterada en los individuos que son HIV +. También se favorece la apoptosis de los LT, y a su vez los LT pueden actuar como reservorios virales, en el caso de los LT vírgenes y de memoria. A nivel de los LB se produce una activación policlonal. Se va a generar una gran cantidad de Ac que no son específicos para el virus, y pueden producir fenómenos de autoinmunidad. El número de las células NK es normal, pero no son funcionales. Esto estaría relacionado con las citoquinas: no hay citoquinas adecuadas para su activación. Entre los mecanismos de escape a la respuesta inmune está la variación antigénica, que está producida por la incapacidad que tiene la transcriptasa reversa para poder corregir la inserción de nucleótidos erróneos. Regula la expresión de las MHC, disminuyéndola, por lo cual hay menos presentación antigénica. Además, el HIV se ubica en sitios inmunológicamente privilegiados: ojos, SNC o testículos, que son lugares de difícil acceso para los Ac.

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TRATAMIENTO Se podría atacar a nivel de cuatro puntos. Un punto sería evitar la fusión entre el HIV y la célula a infectar: inhibidores de la fusión. No existen muchas drogas que puedan atacar este punto, hasta ahora hay una sola que se llama Fuzeon. Se intentaron utilizar Ac que bloqueaban a la CD4, pero no produjeron efectos positivos. Otro punto sería atacar a la transcriptsa reversa: inhibidores de transcriptasa inversa análogos o no análogos de los nucleósidos. Se puede hacer de dos formas, inhibiendo directamente a la enzima, o mediante nucleósidos análogos a los nucleósidos verdaderos, ese medicamento es el AZT , que es análogo a la timina. Otra forma sería utilizar inhibidores de proteasas para evitar que se produzca el ensamblaje del virus. El problema es que el virus adquiere resistencia contra ellos. Lo ideal es hacer un tratamiento combinado. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO: Se pueden buscar Ac anti-HIV o directamente al HIV. Para diagnóstico se utilizan TÉCNICAS DE TAMIZAJE que deben ser confirmadas. Se utiliza el ELISA de amplificación indirecto para detectar Ac, y también técnicas de aglutinación que son más baratas, en las cuales partículas de latex se recubren con Ag virales, que pueden ser proteínas recombinantes o lisados virales. Para CONFIRMAR se hace Western blot, IFI, ensayo lineal (Doble blot), o RIPA: En el Western blot se hace correr un lisado viral en un gel de poliacrilamida, se traspasa a nitrocelulosa, se lo enfrenta con el suero del paciente y se observa cuantas bandas reconoce el suero. Existen distintos criterios de positividad, en la Argentina se considera positivo un suero cuando tiene la presencia de dos bandas pertenecientes a gp120, gp160, gp24 y gp41. Si aparecen dos de estas, entonces se considera al paciente HIV positivo. Si aparecen otras bandas pero no estas se lo considera indeterminado, y se le practica de nuevo la determinación. Para IFI se trabaja con improntas de células infectadas. El inmunoensayo lineal es parecido al Western blot pero no se hace la corrida electroforética, sino directamente, en una membrana de nitrocelulosa se siembran las distintas proteínas virales, después se procede como en el Western blot, se enfrenta con el suero. La técnica RIPA utiliza nucleótidos radiactivos. Se hacen cultivos del virus con nucleótidos radiactivos, se obtienen los HIV de los sobrenadantes de esos cultivos, y eso se lo enfrenta con el suero del paciente. Se forma un inmunocomplejo entre el Ac del paciente y el HIV que tiene un componente radiactivo, y después se agrega una proteína A que se une al Fc del Ac unido al HIV marcado. Después se hace una corrida electroforética y se aprecia la marca por autorradiografía. La detección del virus es importante antes de la seroconversión para poder suministrar los anti-retrovirales y de esa manera ayudar al sistema inmune que está actuando para que pueda controlar la infección. En este período los ensayos para detectar Ac van a dar negativo pero el individuo está infectado. La detección de Ag se puede hacer de distintas formas. Se puede detectar el Ag gp24 por ELISA cuantitativo. Se utilizan cultivos de células mononucleares separadas por Ficall-Hypaque de un donador sano. Se hacen co-cultivos. Se cultivan las células mononucleares de un paciente que tiene una determinada MHC y se las enfrenta con células mononucleares de un donador sano, que tiene otro alelo del HLA diferente. Se va a producir la

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proliferación celular y se va a replicar el virus, y en el sobrenadante de esos cultivos se va a obtener el HIV. Después se lo identifica con algún tipo de Ac. Otra forma es por técnicas de biología molecular, que detectan el ARN viral. Esto es muy importante en las primeras etapas de la infección, cuando se puede detectar el p24 y el ARN viral. En las mujeres embarazadas el HIV se puede transmitir durante el embarazo, en el parto o durante la lactancia. En una mujer con serología positiva para el HIV y una carga viral mayor a 1000 copias de ARN, se aconseja que esa mujer no tenga parto normal, sino que se haga una cesárea. También es aconsejable que no amamante. Si el bebé tiene menos de 18 meses, se investiga HIV por PCR, p24 y detección de ARN. Si da positivo es una presunta infección, y se pide una segunda muestra. Si da negativo se repite después de dos a cuatro meses, si vuelve a dar negativo entonces no está infectado. Es importante que la muestra de sangre no provenga del cordón. Si el bebé es mayor a 18 meses, se busca Ac a través de la serología. Si es negativo el bebé es HIV negativo, si es positivo se debe confirmar. MARCADORES SUBROGANTES: controladores de la enfermedad Son marcadores que sirven para controlar la enfermedad y la acción de los medicamentos. Uno es el número de LTCD4+, y da una idea de cómo va progresando la enfermedad. En las últimas etapas se tiene menos de 200/µL y se declara el SIDA. Se utiliza IFI, citometría de flujo, etc. Es un método subjetivo, varía entre los distintos laboratorios, pero sirve para tener una idea de cómo evoluciona el deterioro en el paciente. Otro marcador importante es la carga viral, que mide la cantidad de virus que hay en la sangre. Se mide por ARN. Hay otros marcadores que no son muy utilizados.