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Problemas de calidad en inmunohistoquímica

en patología mamaria

Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz

Curso largo de diagnóstico de cáncer de mama

XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Madrid, 7 de febrero de 2014

Quimioterapia + anti-HER2

Hormonoterapia Quimioterapia +/- anti-angiogénesis

Quimioterapia +/- anti-angiogénesis

HER2+

RH+

RH- y HER2 -

“The public inquiry is charged with investigating events that led to a breakdown of estrogen receptor (ER) testing at a laboratory run by Eastern Health, the provincial

health care delivery system in Newfoundland and Labrador. Through the inquiry, the public learned that between 1997 and 2005 nearly 400 of about 1,000 breast cancer patients received incorrect test results of the ER status of their breast

tumors. “

HER

2 IH

Q

Programa de Garantía de Calidad de la SEAP Resultados de HER2 por inmunohistoquímica

Porc

enta

je d

e ce

ntr

os

27,3 26

16,1

11,1

31,1

22,8

16,4

25

30

24,7

20 20 18,2 16,518,5 17,2

22,2

15,613,7

38

32,1

19

43,1

37,2

56,7

42,2

32,929,9

34,130

20,5

36,8

29,332,2

35,2

44,3

59

36

51,8

69,9

25,8

40

26,9

32,837,1

45,4 45,950

61,3

46,7

52,2 50,6

42,640,1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

No participantes

44 56 56 64 60 73 68 77 71 79 86 92 94 95 96 94 92 98

Ronda

20/20 12/20 6/20 4/20

40

12 1215

6

1510

13 1520 22

36

59

6966

76 74

68

57

65,5

59,557

2429

19 19 18

11

22

30

19,5 20,5 21

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

<12

12-16

≥17

Inadecuado (puntuación <12)

Aceptable (puntuación 12-16)

Óptimo (puntuación >16)

Barlett, JM et al. Am J Clin Pathol 2009

NordiQC and UK-NEQAS HER2 IHC control results

45

57

94

75

84 79

91

74

57

80

65 70

74

66 68 74

80 82 77

68 68 65

75 70

88

68 72 72

65

85

0

20

40

60

80

100

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10

ER

PR

HER2

Sufficient results

% d

e c

entr

os

~ 20% of HER2 testing may be

inaccurate

Significant rates of discordance between local and central testing in NSABP B-31 and NCCTG 9831 trials

Study

No. of cases

retested

Method of

retesting Concordant cases, n (%)

Discordant cases, n (%)

Net change in cases, n

(%)

NSABP B-31 1040 IHC 838 (81) 202 (19)

74 (7.1) FISH 819 (79) 221 (21)

BCIRG-005 BCIRG-006

1190 IHC, FISH 877 (74) 313(26) 161 (13.5)

NCCTG 9831

1063 IHC, FISH 867 (81.6) 196 (18.4) 120 (11.2)

Perez, EA, et al. Breast Cancer Res Treat 2013 Perez, EA, et al. J Clin Oncol 2006 Paik S, et al. J Natl Cancer Inst. 2002 Roche PC, et al. J Natl Cancer Inst. 2002

~10% of HER2 classification

may be inaccurate

Consecuencias de un falso negativo (no usar trastuzumab)

1. Negación de una terapia que reduce el riesgo de recaída a la mitad

2. Negación de una terapia potencialmente curativa (y todo lo que conlleva una recaída y eventual fallecimiento)

3. Negación de una terapia que aumenta probabilidad de cirugía conservadora

4. Negación de una terapia que prolonga supervivencia en cáncer de mama metastásico

Simulación de los errores en HER2 en la clasificación de las pacientes con cáncer de mama

Consecuencias de un falso positivo (uso de trastuzumab)

1. Efectos secundarios 2. Cardiotoxicidad 3. Consumo de recursos hospitalarios 4. Consumo de recursos humanos

(paciente, trabajo) 5. Efectos psicológicos sobre la paciente y

familia 6. Coste económico directo 7. Manejo terapéutico en caso de recaída

Error 10%: repartido en FN y FP

100 pacientes 10 mal clasificadas; de éstas:

- 8 FN: pacientes HER2+ que no reciben trastuzumab

- 2 FP: pacientes HER2- que reciben trastuzumab

Calidad en inmunohistoquímica


Calidad de la muestra

Calidad de la técnica

Calidad de la interpretación

Allred, DC. Mod Pathol 2010

Sources of variability in molecular testing

• Goldstein NS, et al.: Recommendations for improved standardization of immunohistochemistry. Appl

Immunohistochem Mol Morphol 2007. “Tissue should be fixed in 10% neutral-buffered formalin.”

• Engel KB and Moore HM: Effects of preanalytical variables on the detection of proteins by IHC in FFPE tissue. Arch

Pathol Lab Med 2011. “… 15 preanalytical variables were capable of impacting IHC (including fixation delay; fixative type; time in fixation; reagents and conditions of dehydration, clearing, and paraffin impregnation; slide drying and conditions of storage.”

• Khoury T, et al.: Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers. Mod Pathol 2009. “We recommend not to delay formalin fixation for more than 1 hour and do not store specimens overnight at 4ºC.”

• Arber D: Effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical reactivity of breast markers. Appl

Immunohistochem Mol Morphol 2002. “The IHC reactivity of some breast prognostic markers is reduced, but only after extensive fixation that may not be clinically relevant.”

• Ibarra JA, Rogers LW: Fixation time does not affect expression of HER2/neu. Am J Clin Pathol 2010. “Fixation times between 3 and 120 hours in 10% buffered formalin do not appear to have an impact on the expression of HER2/neu by IHC analysis.”

• Xie R, et al.: Factors influencing the degradation of archival FFPE tissue sections. J Histochem Cytochem 2011. “… the presence of water, both endogenously and exogenously, plays a central role in antigenicity loss.”

Sources of variability in molecular testing

Khoury, T et al. Mod Pathol 2009 Yildiz-Aktas, IZ et al. Mod Pathol 2012

El retraso en la fijación (isquemia fría) modifica la expresión de biomarcadores en cáncer de mama

Lab A Lab B Lab C Lab D Lab E

Preservation of DNA in FFPE archieval tissue samples

Rojo, F. SPMM 2011

• Buffered 4% Formaldehyde / 10% Formalin – minimal prefixation time lag, 2 hours – duration of fixation (3 to 6 hours) – absolutely avoid low pH • No Bouin, No Acid Formaline, No B5, No AZF, No decalcified samples (bone biopsies)

DNA sequence alterations due to formalin fixation in archival specimens

Williams, C et al. Am J Pathol 1999

FFPE tissues exhibit a high frequency of nonreproducible sequence alteration because of formalin cross-linking cytosine nucleotides on DNA strands. Taq-DNA polymerase fails to recognize the cytosine and incorporates an adenine in the place of a guanosine, creating an artificial C-T or G-A mutation.

Calidad en inmunohistoquímica: Estandarización pre-analítica

• Reducir o minimizar el tiempo de isquemia fría: menos de 1h • No deshidratar las muestras • Fijar en solución tamponada de formol al 10%, en volumen suficiente • Preparar las muestras para garantizar una buena fijación, en especial las piezas quirúrgicas • Fijación 6-72 horas • Secciones de tejido 2-3mm • Procesadores automáticos con presión, sin aceleración por calor • Documentar los tiempos de isquemia fría, fijación y procesamiento

Calidad en inmunohistoquímica: Estandarización pre-analítica

Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes

Desenmascaramiento antigénico: temperatura,

enzima, pH, tiempo, presión

Sensibilidad anticuerpo

Especificidad anticuerpo

Sistema de detección

Tiempo de incubación

Temperatura y humedad

Sistema de revelado

Automatización

Competencia personal técnico

Concentración anticuerpo

Calidad de la técnica inmunohistoquímica

¡Más de 8000 condiciones experimentales diferentes!

Modificaciones del desenmascaramiento antigénico

Artefactos técnicos

Calidad de la técnica inmunohistoquímica

Anticuerpo

Precisión = reproducibilidad + repetibilidad Sensibilidad Especificidad

• Reproducibilidad: diferentes laboratorios diferentes instrumentos diferentes reactivos (anticuerpos) diferentes técnicos de laboratorio

• Repetibilidad: mismo laboratorio mismos instrumento mismo reactivo (anticuerpo) mismo técnico de laboratorio

• Sensibilidad diagnóstica Capacidad de determinar un VP vs FN: requiere comparación

• Sensibilidad inmunohistoquímica Capacidad de reconocer la diana por el ensayo

• Especificidad diagnóstica Capacidad de determinar un VN vs FP: requiere comparación

• Especificidad inmunohistoquímica Capacidad del anticuerpo a unirse exclusivamente a su diana, en ausencia de tinción de otras proteínas o tejidos

HER2 0 < 15-25,000

HER2 1+ ~ 80-100,000

HER2 2+ ~ 370-630,000

HER2 3+ ~ 2-10,000,000

Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas mujeres, en distintas localizaciones y variabilidad intratumoral

Chung, GC et al. Lab Invest 2007

ER h

eter

oge

nei

ty in

bre

ast

can

cer

ER DAPI

Heterogeneidad en cáncer de mama: variabilidad intratumoral

Falck, AK et al. BMC Cancer 2013 Martinez de Dueñas, E et al. Breast Cancer Res Treat 2013

Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas localizaciones

Tumor primario

Falk, AK. 2013 Metástasis ganglionar

Luminal A (%)

Luminal B (%)

HER2 (%) TN (%)

Luminal A 85 0 9 0

Luminal B 11 100 91 0

HER2 0 0 0 8

TN 4 0 0 92

Martinez de Dueñas, E.

2013 (ConvertHER)

Metástasis visceral

(lab. central)

Luminal 74 (90) 21 (0) 22 (18)

HER2 16 (3) 76 (100) 7 (6)

TN 10 (7) 3 (0) 71 (76)

Niikura, N. et al. J Clin Oncol 2012

Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas localizaciones

Recomendaciones

Precisión = reproducibilidad + repetibilidad Sensibilidad, Especificidad

• Determinación de ER, PR, HER2 (y Ki67) en todas las pacientes con cáncer de mama • Uso de la muestra más reciente en la historia de la enfermedad • Evitar las muestras artefactadas, con dudas en su fase pre-analítica, uso de secciones recientes • Estandarización de los procesos • Detectar fallos técnicos y descartar el ensayo • Mantenimiento de los equipos • Uso de controles positivos (y negativos) • Utilización de kits con aprobación FDA/EMEA (o anticuerpos recomendados por sociedades científicas) • Formación del personal técnico • Programas de control de calidad externo (semestrales) e interno • Validación del procedimiento (comparación con otro método y/o laboratorio de 25-100 muestras) sobre un 90% de concordancia de resultados • Acreditación/certificación de los laboratorios

Varga, Z et al. BMC Cancer 2013

Quality control study: overall positivy rate and accuracy in a single institution

101 hospitales

registrados

Centros Registrados: 101

Nº Casos incluidos: 8.455

Nº Casos HER2-positivos: 1.354

Tasa HER2+: 16,01%

(Operativa desde lanzamiento 20 de Mayo 2013)

Resultados a

31 de Diciembre de 2013

5135

3079

322

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Desconocido No metastásico Metastasicos

60%

36% 4%

Casos con información sobre el estadiaje

HER2+ 15,4%

HER2+ 20,2%

Resultados %HER2+ según estadiaje CM en nuestro entorno sobre casos reales

Información incluida en un 40% de los casos (3.401 casos)

29

163

130

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Desconocido Nuevo diagnóstico Recurrencia/recaida deun estadio nometastásico

13%

47%

40%

HER2+ 17,8%

HER2+ 22,3%

Casos metastásicos

Nú

mer

o d

e ca

sos

95 centros

Baja positividad HER2+( <13%) : 17 centros. Media: 63 centros. Alta positividad HER2+ (>21%) 15 centros

HER2 + media nacional: 16,01% Intervalo HER2 : 7,21% - 29%

Actividades Formativas

para patólogos y técnicos

Calidad en inmunohistoquímica: Estandarización analítica

Laboratorio A Laboratorio B Laboratorio C Laboratorio D

HER

2 3

+

HER

2 1

+

Criterios: Factor pronóstico en tumores ER+ En tumores homogéneos, evaluar 3 campos x400 500-1000 células Evaluar el bode infiltrativo del tumor Discrimina bien alta y baja proliferación Incluir los ‘hot-spots’

Problemas: No recomendado como biomarcador por ASCO Tumores heterogéneos Diferentes métodos de evaluación Baja concordancia interobservador (kappa 0.64 > 0.91) Diferentes anticuerpos No existe estándar: proliferación alta entre 10-25%

Dowsett, M et al. JNCI 2011 Polley, M et al. JNCI 2013 De Nielsen, TO et al. SABCS 2013

Calidad en inmunohistoquímica: interpretación de Ki67 en cáncer de mama

Ki67+

Ki67-

Dowsett, M et al. JNCI 2011 Polley, M et al. JNCI 2013 De Nielsen, TO et al. SABCS 2013

Calidad en inmunohistoquímica: interpretación de Ki67 en cáncer de mama

Ki67+

Ki67-

Criterios: Factor pronóstico en tumores ER+ En tumores homogéneos, evaluar 3 campos x400 500-1000 células Evaluar el bode infiltrativo del tumor Discrimina bien alta y baja proliferación Incluir los ‘hot-spots’

Problemas: No recomendado como biomarcador por ASCO Tumores heterogéneos Diferentes métodos de evaluación Baja concordancia interobservador (kappa 0.64 > 0.91) Diferentes anticuerpos No existe estándar: proliferación alta entre 10-25%

IHC assay to select therapy in HER2 breast tumors: interpretation

Interpretación de los resultados de Herceptest y Pathway (FDA)

HER2 3+ HER2 2+, equivocal HER2 1+ HER2 0

Original FDA Pack Insert

Intense membrane

>10%

Weak/intermediate

complete membrane

>10%

Weak complete

membrane >10%

Weak incomplete membrane

>10%

Any intensity

<10%

ASCO/CAP Guidelines 2007

Uniform intense

complete membrane

>30%

Intense 10-30% or weak/intermediate

complete membrane >10%

Weak incomplete membrane

>10%

Any intensity

<10%

ASCO/CAP Guidelines 2013

Uniform intense

complete membrane

>10%

Intense <10% or weak/intermediate membrane >10%

Faint membrane

>10%

Any intensity

<10%

Calidad en inmunohistoquímica en cáncer de mama

Mensajes finales

1. Estandarización: procesamiento, muestra, interpretación

2. Política de control de calidad 3. Formación

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