INMUNODIFUSION EN GEL DE AGAR INTRODUCCION Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antgeno correspondiente, se forman complejos antgeno-anticuerpo que se insolubilizan en su mayor parte, dando lugar a una reaccin de precipitacin. Empleando soportes adecuados es posible que los antgenos y anticuerpos migren con diferentes velocidades, de modo que al encontrarse interreaccionen y precipiten. Los geles utilizados como soporte tienen como base pectina, alginatos, poliacrilamida e incluso pueden utilizarse tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visualizan como bandas, que permanecern estables mientras un mayor flujo de molculas de alguno de los reactivos empleados no provoque su redisolucin. Se utiliza normalmente el mtodo de Oucherlony o de doble difusin. Consiste en enfrentar en pequeas perforaciones efectuadas en el agar, las soluciones de antgeno y anticuerpo. Al difundir y ponerse en contacto, producirn una banda de precipitacin slo si se encuentran en concentraciones ptimas. Si sta concentracin es la que corresponde a la zona de equivalencia de la banda de precipitacin estar situada aproximadamente en la distancia media que separa los reservorios. Cuando hay exceso de antgeno o anticuerpo, la banda estar ms prxima al pocillo del anticuerpo o del antgeno, respectivamente. (Fig. 1) Este sistema permite identificar las bandas de precipitacin mediante el empleo simultneo de antgenos y anticuerpos conocidos. Se pueden observar tres tipos de reacciones a. Reaccin de identidad: los dos sistemas difunden en una nica banda de precipitacin. b. Reaccin de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitacin que se cruzan. c. Reaccin de identidad parcial: Se produce cuando uno de los antgenos tiene menos de un componente y es capaz de dar una reaccin cruzada con un anticuerpo elaborado contra un antgeno ms simple. En este caso las bandas de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln. Esto indica que en este antgeno hay componentes antignicos no compartidos. Este mtodo, que debido a su sencillez, se puede realizar en cualquier laboratorio, ha sido utilizado prcticamente en todas las virosis,. Como mtodo de diagnstico serolgico. Debido a su limitante, la baja sensibilidad, ha sido desplazada por otras tcnicas. En virologa veterinaria se lo utiliza en la actualidad para identificar reactores para las siguientes infecciones: Fiebre aftosa, Leucosis Bovina Enzotica, Lengua Azul, Anemia Infecciosa Equina, Enfermedad de Gumboro, Bronquitis Infecciosa.

RT-PCR (reaccin encadena de polimerasa-transcripcin inversa)

Se utiliza para la deteccin y amplificacin de ARN. Permite estudiar la expresin de determinados genes (su traduccin a protenas). En primer lugar se extrae el ARNtotal de las clulas en estudio y se separa la fraccin correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que acta como transcritasa inversa y como ADN polimerasa simultneamente). A partir de aqu se aplica la tcnica de PCR lo que permite una deteccin de la expresin de ARNm mucho ms sensible que con Northern blot o con hibridacin in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciacin automtica de ADN. Existen diversos kits comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-PCR,50,80