inmovilizacion en polimeros de celulas vegetativas
TRANSCRIPT
1
INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBETH ORTEGA SIERRA TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2012
2
INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBTEH ORTEGA SIERRA
APROBADO
________________________ ________________________ Ingrid Schuler PhD. Janeth Arias MSc, MEd. Decana Académica Directora de Carrera
3
INMOVILIZACION EN POLIMEROS DE CELULAS VEGETATIVAS, MADURAS Y QUISTES DE
Azotobacter chroococcum C26
ORIANA LISBTEH ORTEGA SIERRA
APROBADO
________________________ ___________________________ Ruth Bonilla Buitrago PhD. Daniel Fernando Rojas, MSc. Directora Codirector ___________________________ Adriana Matiz Jurado
4
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a la
moral Católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
5
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION………………………………………………………………… 6
2. JUSTIFICACION Y PLNTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………… …… 9
3.MARCO TEORICO, REFRENTES CONCEPTUALES………………… …… 10
3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal……………………… …… 11
3.2 El género Azotobacter………………………………………………… …… 11
3.3 Conservación en polímeros…………………….................................. …… 12
4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………… …….. 13
4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS…………………………………………………. 13
5. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………… 13
5.1 Microorganismo y condiciones de cultivo…………………………… ……... 13
5.2 Preparación de célula de Azotobacter………………………………… ……. 14
5.3 Evaluación de la influencia del estado fisiológico, el polímero y la temperatura sobre la viabilidad de Azotobacter chroococcum C26………………………………………………………………………………….. 14
5.4 Estimación bacteriana……………………………………………………. ……. 14
5.5 estimación bacteriana……………………………………………………….. 14
5.6 Análisis estadístico…………………………………………………………… 15
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………… 15
6.1Evaluacion de la viabilidad de Azotobacter chroococcum C26…… ……. 15
6.2 Interpretación de la degradación celular mediante el modelo termodinámico de Arrhenius……………………………………………………………………….……. 21
7. CONCLUSIONES……………………………………………………………….…… 28
8. REFERENCIAS…………………………………………………………………. 30
6
RESUMEN
La preservación de microorganismos con potencial biotecnológico reviste de gran
importancia ya que estos son ingrediente activo para la generación de bioproductos. A
pesar de que muchas técnicas han sido desarrolladas, la mayoría implican el uso de
equipos e infraestructura especializada, de aquí que el desarrollo de métodos alternos
es relevante. El objetivo de este trabajo fue evaluar el rol de diferentes polímeros y
temperaturas sobre la supervivencia de Azotobacter chroococcum C26 a lo largo del
tiempo en tres estadios fisiológicos. Los resultados mostraron que la conservación
dependió del tipo de polímero, estado fisiológico y temperatura (P<0.05). El mejor
tratamiento fue cuando se emplearon células vegetativas y carragenina, con pérdidas
de viabilidad menores a una unidad logarítmica. Aún más, la interpretación
termodinámica de los resultados basada en el modelo de Arrhenius permitió establecer
que éste tratamiento tuvo la mayor energía de activación (Ea = 24,12 kcal/mol). Los
resultados obtenidos en el presente estudio representan las bases para más
investigación en el desarrollo de tecnologías para la preservación de microorganismos
en polímeros biológicos y sintéticos, y da una luz acerca de las condiciones que
optimizan el mantenimiento de microorganismos de interés agrícola pertenecientes al
género Azotobacter.
Palabras clave: Azotobacter chroococcum, polímeros, estados fisiológicos.
1. INTRODUCCIÓN
Algunos microorganismos pueden desempeñar un rol fundamental en el desarrollo de
las plantas ya sea perjudicial o benéfico. En particular, el efecto benéfico puede estar
mediado por un incremento en la disponibilidad de nutrientes o por la influencia
generada por la síntesis de algunos compuestos que pueden alterar el desarrollo
vegetal. El efecto de estos microorganismos puede ser evidenciado no solo por un
7
aumento en el tamaño de la planta, sino también por una disminución en el impacto de
estreses de tipo abiótico y biótico sobre el desarrollo de la misma (Richardson et al
2009). Este efecto estimulador y protector para el crecimiento de las plantas puede
tener repercusiones económicas importantes, ya que la productividad de cultivos de
interés agrícola y pecuario puede ser significativamente mejorada. Además, el uso de
esta conjunto de herramientas tecnológicas, usualmente llamadas como bioinsumos
biofertilizantes y/o biocontroladores, tienen gran importancia puesto que están en
congruencia con las nuevas políticas de manejo sostenible del medio ambiente.
Este grupo de bacterias capaces de promover el crecimiento de las plantas, son
llamadas en conjunto bacterias promotoras de crecimiento vegetal o PGPBs por sus
siglas en inglés (Plant Growth-Promoting Bacteria) (Compant et al, 2005). Las PGPBs
pueden clasificarse de acuerdo a su grado de relación con la planta, de aquí se
distinguen tres grupos importantes: simbióticas, asociativas y de vida libre. Otra
clasificación es basada en la capacidad fisiológica particular que les permita estimular
el crecimiento de las plantas, por ejemplo fijando nitrógeno molecular (diazótrofos)
(Verma et al, 2009), solubilizando y/o mineralizando fuentes de fósforo no disponibles,
produciendo fitohormonas (auxinas, giberelinas, o citoquininas), o mediante actividad
ACC deaminasa, etc. La influencia de los microorganismos sobre el crecimiento de las
plantas puede llegar a ser significativo, esto en términos de adquisición de nutrientes y
características estructurales y funcionales (Richardson et al 2009), y finalmente sobre
el crecimiento y desarrollo de las plantas.
Los microorganismos asociativos y de vida libre pueden contribuir a la nutrición de las
plantas, esto a través de diferentes mecanismos, no obstante el grado de interacción
entre el huésped y el hospedero juega un rol importante. Estas bacterias a pesar de
que pueden interactuar a diferentes grados de asociación con la planta, por ejemplo en
la rizosfera o en la región tisular, no son capaces de formar estructuras especializadas
(nódulos). Los mecanismos más reportados son aquellos relacionados con el aumento
en la disponibilidad de nutrientes ya sea por fijación como en el caso del nitrógeno, o
por solubilización en el caso de fósforo, potasio o boro. Otros mecanismos son
8
enfocados hacia la promoción del crecimiento mediante la síntesis de metabolitos los
cuales pueden regular el crecimiento vegetal tal como las fitohormonas. Mientras que
otros tienen como diana la protección de los tejidos por competencia por espacio o
nutrientes (Spadaro y Lodovika, 2003)
Las bacterias del género Azotobacter han sido estudiadas por largo tiempo debido a su
capacidad para actuar como biofertilizantes, por su capacidad de diferenciación celular
y por la presencia de hasta tres complejos de fijación biológica de nitrógeno los cuales
están codificadas por las familias de genes nif, vnf y anf. Este género comprende
bacterias de característica Gram-negativa, fijadoras de vida libre aeróbicas; y en
adición, son quimiorganotroficas y son capaces de metabolizar diferentes azucares,
alcoholes y ácidos orgánicos, aún más se ha mostrado su rol metabolizando
hidrocarburos de naturaleza alifática y aromática.
Azotobacter posee tres estados fisiológicos marcados: células jóvenes, células
maduras y células enquistadas. Cada uno de esos estados fisiológicos está
acompañado por cambios a nivel de la composición en su membrana, además de
cambios en el metabolismo en general. Los fosfolipidos son los principales
componentes de la membrana. En el estado vegetativo, los lípidos de la membrana
son fosfolipidos con una cabeza polar, y cuando las células pasan a un estado de
quiste, los fosfolipidos en la membrana son reemplazados por una familia de lípidos
fenolicos que se acumulan en la exina 5-n-alkylresorcinoles y 6-n-alkylpirenos (Reusch
y Sadoff, 1979; Reusch y Sadoff, 1983; Funa et al, 2005). La formación de quistes se
puede inducir con diferentes compuestos como el β-hidroxibutirato o n-butanol (Lin y
Sadoff 1968). Los diferentes estados fisiológicos exhiben difererentes grados de
tolerancia a condiciones extremas, de aquí que sea importante evaluar el efecto
fisiológico de la bacteria sobre el desarrollo de una técnica de conservación biológica.
En la actualidad, ha revisto de gran relevancia la conservación de cultivos de
microorganismos debido a su uso en diferentes áreas como microbiología industrial,
biotecnología, o ciencias de alimentos, etc. (Sorokulova et al, 2012). Hasta la fecha, un
9
amplio número de métodos de conservación han sido experimentados y
estandarizados (liofilización, crioconservación, secado en líquido, etc.), sin embargo la
mayoría de ellos implican el uso de equipos especializados o condiciones astringentes
de almacenamiento. Bajo ciertas condiciones, sin embargo, mantener cultivos
bacterianos bajo temperaturas de ultracongelacion es imposible, de aquí que el
desarrollo de una técnica que no requiera condiciones muy exigentes de temperatura
es retador y reviste de gran importancia. Aún más, poca literatura es disponible acerca
de la estandarización de métodos de conservación para baterías del género
Azotobacter.
De aquí, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto sobre la viabilidad celular de la
conservación de células de Azotobacter chroococcum C26 empleando diferentes
polímeros, diferentes estados fisiológicos y tres temperaturas.
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La explosión demográfica que se ha presentado en el mundo en los últimos 100 años,
ha dejado como consecuencia un creciente aumento por la demanda de alimentos lo
cual ha conllevado a la implementación de estrategias capitalistas que buscan obtener
el máximo beneficio del recurso suelo sin pensar en el manejo sostenible que se le
debe dar a este. Por otra parte, la falta de capacitación en algunos agricultores
productores ha llevado a que la aplicación de los insumos químicos se haya realizado
de manera inadecuada. Ambos factores, solos o combinados, han provocado daños
en ocasiones irreversibles a los ecosistemas. De aquí, el desarrollo de tecnologías
limpias que permitan disminuir el impacto causado por la aplicación indiscriminada de
agroquímicos es de alta necesidad. Dentro de estas estrategias que se han
desarrollado esta el uso de fertilizantes biológicos, los cuales se definen como la
aplicación formulada de microorganismos los cuales pueden mediar sobre el
crecimiento de las plantas a través de diversos mecanismos los cuales implican un
aumento en la biodisponibilidad de nutrientes en suelo o la regulación del crecimiento
por la síntesis de ciertos metabolitos. Actualmente, muchos estudios de bioprospección
10
son realizados con el objetivo de recuperar la mayor parte de la diversidad cultivable
de microorganismos del suelo los cuales pueda servir como base para la generación
de insumos biológicos, no obstante una vez recuperados estos deben ser conservados
bajo condiciones que permitan no solo mantener la viabilidad de estos sino también su
estabilidad. En particular, las bacterias del género Azotobacter han sido ampliamente
trabajadas en CORPOICA y han demostrado ser eficientes para la promoción del
crecimiento vegetal sobre diferentes tipos de cultivos incluyendo algodón, pimentón y
pastos. En adición, las técnicas de conservación actuales, las cuales están reportadas
para este género, implican el uso de procesos costosos de alto mantenimiento o el uso
de equipos sofisticados como ultracongelacion o liofilización. De aquí, el objetivo de
este trabajo fue evaluar la conservación de células de Azotobacter en polímeros,
donde se ensayaron diferentes estados fisiológicos de Azotobacter y diferentes
temperaturas, con el objetivo de estandarizar una técnica que permita mantener la
viabilidad de las colecciones de bacterias de este género asociadas a cultivos de
importancia agronómica.
3. MARCO TEÓRICO, REFERENTES CONCEPTUALES
3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal
El medio ambiente y la agricultura son sistemas que pueden recibir un impacto fuerte
debido al uso indiscriminado y en altas cantidades de fertilizantes de tipo químico o
mineral, sin embargo el uso de estas sustancias es fundamental para el desarrollo y
sostenimiento de las plantas (Adesemoye, et al 2009). En consecuencia, ha sido de
gran importancia la búsqueda de alternativas biológicas que permitan la obtención de
nutrientes y demás procesos requeridos por las plantas. En este sentido se muestran
las bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB), las cuales pueden afectar
significativamente el crecimiento de las plantas mediante el ciclaje de nutrientes, la
supresión de patógenos mediante la producción de antibióticos y sideróforos o
sustancias antagonistas de bacterias y hongos y/o por producir sustancias
11
biológicamente activas tales como auxinas y otras hormonas vegetales, adicional a
esto generan mecanismos específicos como: la fijación de nitrógeno no simbiótica,
solubilización de fosfatos minerales y otro nutrientes, la capacidad de producir o
cambiar la concentración de reguladores del crecimiento vegetal como el ácido
indolacético, ácido giberélico, citoquininas y etileno, etc. (Ahmad et al. 2008)
Una amplia gama de bacterias incluyendo especies de Pseudomonas, Azospirillum,
Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, y Serratia han demostrado promover el
crecimiento de plantas (Khalid, et al 2004). Durante los últimos tiempos la aplicación de
PGPB ha ido incrementando debido a los resultados favorables que presentan al ser
inoculadas en diferentes cultivos. Su capacidad promotora de crecimiento ha sido
altamente reportada y ha demostrado que la capacidad promotora de crecimiento
puede llegar a ser muy específica (Chen et al. 1994; Amara y Dahdoh 1997; Biswas et
al. 2000; Hilali et al. 2001; Asghar et al. 2002).
3.2 El género Azotobacter
Es un grupo de microorganismos que está altamente relacionado con la habilidad de
fijar nitrógeno de forma bilógica, como también de pertenecer al grupo de las bacterias
promotoras de crecimiento en plantas (PGPB) (Lenart, 2012).
El género Azotobacter esta conformado por microorganismos que habitan el suelo y
comprenden bacilos Gram negativos que pueden ser capaces de fijar por lo menos 10
mg de N por gramo de hidrato de carbono consumido (Tejera et al. 2005), además de
poder metabolizar una gran variedad de compuestos como fuente de carbono entre los
cuales se reportan: ácidos orgánicos, azucares o derivados alcohólicos como el
manitol y otras como la glucosa, fructosa, sucrosa, acetato, fumarato piruvato,
succinato. Este género tiene la particularidad de ser catalasa positiva. El rango de pH
en el que puede crecer en presencia de nitrógeno combinado es 4.8-8.5, no obstante
el pH óptimo para crecer cuando fija nitrógeno es 7.0-7.5 (Holt, 2000). Esta bacteria
posee una pared celular compleja que consiste de una membrana externa y una capa
interna de peptidoglicano que contiene ácido murámico y mureína. Azotobacter se
12
distingue de otros géneros por la capacidad de sus miembros para formar quistes
metabólicamente inactivos después de un crecimiento exponencial o la inducción de
células vegetativas con reactivos específicos como el butanol o el β hidroxibutirato
(Sadoff, 1975). Los quistes tienen un distintivo morfológico, apareciendo como células
esféricas con citoplasma contraído y un doble contorno pared gruesa. Durante la
germinación de una célula en estado vegetativo emerge la estructura de quiste
dejando tras de sí una porción residual de la capa de quiste (Socolofsky y Wiss 1961).
Una de las especies de Azotobacter con mayor potencial para la producción de
biofertilizantes es Azotobacter chroococcum. El crecimiento de A. chroococcum es
afectado por la temperatura, la cual debe estar en el intervalo de 28 a 32 °C, mientras
que el pH debe mantenerse entre 7,0 y 7,5 (Vessey, 2003).
3.3 Conservación en polímeros
La conservación y el mantenimiento de microorganismos por medio de técnicas como
la inmovilización van cobrando más relevancia actualmente, debido a la gran
importancia de preservar la viabilidad y las estructuras morfológicas y genéticas de las
células, esto por medio de técnicas fácilmente reproducibles y que manejen equipos
básicos. En la actualidad se ha reportado el uso de polímeros de tipo natural o sintético
para la conservación de dichas bacterias (Sorokulova et al. 2008). Los polímeros más
ampliamente utilizados son polisacáridos de algas tales como alginato, carragenina y
agarosa. Las propiedades químicas y físicas, tales como la composición monomérica,
grado de sustitución, cinética de formación de gel, el gel fuerza y la contracción de las
matrices producidos con tales polisacáridos, puede llegar a influir sobre la viabilidad
celular (Murano 1998).
El mantenimiento de los cultivos microbianos es un problema importante para muchas
áreas como la microbiología industrial, la biotecnología y la producción de
bioinoculantes. Los métodos más eficientes reportados son la liofilización y
ultracongelacion, sin embargo estos métodos requieren de equipos sofisticados y
condiciones de almacenamiento controladas (Thorne et al., 1994). Recientemente,
13
investigadores de la Universidad de Auburn en USA, implementaron una nueva técnica
para la conservación de bacterias no costosa y fácil de reproducir, en donde son
implementados polímeros de tipo: pululano y goma acacia para la conservación de
microorganismos como: Escherichia coli y Bacillus subtlis (Krumnow et al, 2009;
Sorokulova et al, 2008); esto, como una alternativa para la conservación de los
microorganismos bajo condiciones menos astringentes y de una forma más
económica.
4. OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de diferentes polímeros y diferentes estados fisiológicos sobre la
inmovilización y viabilidad de Azotobacter chroococcum C26.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar el efecto de diferentes polímeros sobre la viabilidad de Azotobacter
chroococcum C26 a través del tiempo.
2. Determinar la influencia del estado fisiológico sobre la viabilidad de Azotobacter
chroococcum C26 bajo preservación.
3. Estudiar termodinámicamente la relación entre la técnica de conservación
(temperatura y estado fisiológico) y la viabilidad celular.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Microorganismo y condiciones de cultivo
El microorganismo empleado para el estudio fue A. chroococcum C26, el cual fue
provisto por el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Potencial
Biofertilizante (Corpoica - Tibaitatá). Las células fueron crecidas en medio liquido
14
Burk’s, sin fuente de nitrógeno (Lin, 1969) a 30 °C (Su et al. 1979). Cuando agitación
fue necesaria se emplearon 150 rpm.
5.2 Preparación de células de Azotobacter
Tres estados fisiológicos de Azotobacter fueron evaluados: células vegetativas, células
en fase estacionaria tardía y quistes. Para preparar las células en cada uno de los
estados fisiológicos se empleó la metodología descrita por Su et al. (1979). En breve,
las células vegetativas fueron preparadas por incubación durante dos días en medio
Burk’s, las células maduras por incubación durante siete días y las células de A.
chroococcum fueron enquistadas mediante la aplicación de 0.3 % de n-butanol en el
medio Burk’s tal como reportó. ( Segura et al. 2009 y Vela, 1971).
5.3 Evaluación de la influencia del estado fisiológico, el polímero, y la
temperatura sobre la viabilidad de Azotobacter chroococcum C26
Se estableció un diseño factorial completo multinivel con un total de 36 tratamientos.
Los factores de evaluación fueron: tipo de polímero, estado fisiológico y temperatura de
almacenamiento. Se utilizaron tres polímeros (alginato de sodio, carragenina,
hidroxipropilmetilcelulolosa) y Buffer Phosphate Saline (BPS) como control, en tres
estados fisiológicos (vegetativa, madura, quiste) y tres temperaturas (4 ºC, 22 ºC, 30
ºC) para el ensayo de estabilidad. En breve, cada una de las suspensiones celulares
en los diferentes estados fisiológicos (como se describió previamente en 2.2), fueron
centrifugadas y re suspendidas en las siguientes concentraciones del polímero: 1.5%
carragenina, alginato de sodio 0.3% e hidroxipropilmetilcelulolosa (HPMC) 0.5 %, o
BPS. Los polímeros fueron dispersos utilizando agua como solvente. Todas las
dispersiones con los polímeros fueron refrigeradas a 4 ºC previo a su utilización.
Inmediatamente, 200 µl de cada tratamiento fueron puestos en un microtubo de 1.5
mL, tapado con un algodón, y secado a 30ºC durante 48 h. Para verificar el estado del
secado, algunos tubos fueron tomados al azar y se pesaron previa y posteriormente al
tiempo de secado. Los microtubos fueron almacenados bajo las temperaturas
reportadas previamente. Cada tratamiento se realizó por triplicado. El experimento fue
monitoreado a los 0, 8, 15 y 30 días.
15
5.4 Estimación de la viabilidad bacteriana
Se realizaron diluciones seriadas desde 103 a 106 de cada uno de los viales para
estimar la concentración inicial de A. chroococcum C26 en contacto con los polímeros.
Para la estimación de viabilidad de cada tiempo y temperatura se tomaron los viales,
se resuspendieron en 200 µL de agua estéril y se incubaron a temperatura ambiente
por 30 min. La viabilidad bacteriana fue estimada por preparación de diluciones
seriadas, sembrando 20 µl de cada dilución por triplicado en medio LG (Safari, 2004).
Los resultados fueron expresados como log(UFC/ml).
5.5 Valoración, estimación o evaluación de la degradación térmica mediante la
ecuación de Arrhenius
La degradación térmica de las bacterias fue analizada mediante el uso de la ecuación
de Arrhenius como fue reportado previamente por Sorokulova et al. (2008).
5.6 Análisis estadístico
Se empleó un ANOVA univariante de multivías para la evaluación del diseño factorial
completo, y el test HSD-Tukey para pruebas post hoc. Los análisis fueron realizados
en el paquete estadístico SPSS 17.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Evaluación de la viabilidad de Azotobacter chroococcum C26
Se evaluó el efecto del estado fisiológico y la temperatura de almacenamiento sobre la
viabilidad de las células de Azotobacter chroococcum C26 cuando se inmovilizan en
diferentes polímeros. El objetivo fue determinar las condiciones de almacenamiento
16
que optimizan la conservación de células de Azotobacter a lo largo del tiempo. Se
monitoreó la viabilidad celular durante 30 días. Con base en los resultados, fue posible
inferir que dentro de los parámetros evaluados, existen diversos factores que pueden
influir sobre la viabilidad de las células de Azotobacter. En particular, fue evidente que
el tipo de polímero, el estado fisiológico y la temperatura influyeron significativamente
sobre la viabilidad celular (P<0.05) y que la degradación siguió cinéticas de orden uno;
aún más, se observó que existió interacción entre las variables de estudio (Tabla S1).
Cuando se evaluó el efecto del estado fisiológico sobre la preservación en los
diferentes polímeros, nosotros observamos que el estado fisiológico que más presentó
resistencia a los factores medio ambientales fueron las células maduras (Fig. 2),
seguidas de las vegetativas (Fig. 1) y los quistes (Fig. 3). En general, es bien sabido
que la composición de la membrana de Azotobacter depende del estado fisiológico en
el que se encuentre el microorganismo (Funa et al. 2006). A diferencia de cuando se
encuentra en estado vegetativo, las células maduras de Azotobacter presentan la
acumulación de ciertos ácidos grasos como el C17Δ el cual ha mostrado estar
involucrado en la mediación de la resistencia a factores ambientales adversos en
Pseudomonas putida KT2440 (Muñoz-Rojas et al. 2006), mientras que los quistes
acumulan ácidos grasos de tipo alquilresorcinoles y alquilpirenos (Funa et al. 2006).
Los resultados mostraron que después de 30 días las células en estado vegetativo
fueron afectadas en baja proporción cuando se almacenaron a 4°C y 22°C, esto sin
importar el polímero empleado (P<0.05). Cuando se conservaron a 30 °C se dio una
reducción significativa en la viabilidad en todos los tratamientos. Esto sugiere que el
factor temperatura presentó un efecto significativo sobre la supervivencia de los
microorganismos (P<0.05). Las consideraciones termodinámicas de este evento serán
discutidas más adelante. El tratamiento donde se dio la menor pérdida de viabilidad fue
bajo conservación en carragenina y temperaturas inferiores a 30 °C. De manera
general el polímero no fue el factor principal que influyó sobre la pérdida de viabilidad
(Fig. 1).
17
Fig. 1 Viabilidad de Azotobacter chrococcum C26 durante el estado de células vegetativas. Este grafico muestra
células viables de A. chrococcum recuperadas después de proceso de conservación y secado en carragenina (A),
alginato de sodio (B), HPMC (C) y como prueba control BPS (D).
En el caso de las células maduras, la única temperatura que permitió mantener la
viabilidad fue 4 °C. En particular, cuando la temperatura de almacenamiento fue 22 °C
y 30 °C la disminución de la BSR fue cercana al 75%, implicando que hubo una
reducción de casi seis unidades logarítmicas en el recuento de células viables (Fig. 2).
Las células preservadas en carragenina mantuvieron una alta viabilidad sin importar la
temperatura aplicada, en este caso la reducción en la BSR fue menor a 15% (Fig. 2A).
18
Fig. 2 Viabilidad de Azotobacter chrococcum C26 durante el estado de células maduras. Este grafico muestra
células viables de A. chrococcum recuperadas después de proceso de conservación y secado en carragenina (A),
alginato de sodio (B), HPMC (C) y como prueba control BPS (D).
Interesantemente, los resultados mostraron que la cepa C26 de A. chroococcum en los
estados fisiológicos vegetativas y maduras, fueron mejor preservadas en carragenina
en comparación con los demás polímeros, lo cual fue evidenciado por una escasa
disminución en la viabilidad (Fig. 1A y 2A). Denkova et al. (2004) reportó que este
polímero puede proporcionar un efecto protector sobre las células bacterianas, y más
interesante aún, que produce atrapamiento en el gel lo cual genera una masa seca
que puede actuar como un receptor para proteger las células de choque osmótico en
el momento de realizar la rehidratación durante la recuperación de las células
conservadas. Además, este polímero presenta una alta viscosidad, dependiente de la
temperatura, la cual le permite un mejor recubrimiento de las células (Rokka 2010,
Hemar et al 2002).
19
Cuando se conservaron las células enquistadas a 4°C y 22 °C, la BSR (en general fue
disminuida menos de 15% después de 30 días. Los mejores resultados fueron
observados bajo conservación en carragenina donde la pérdida de viabilidad fue casi
nula. La temperatura presentó un efecto significativo sobre la viabilidad, a pesar de que
las células enquistadas de Azotobacter chroococcum usualmente exiben propiedades
excepcionales de resistencia a factores adversos (Lin y Sadoff, 1969). Los resultados
mostraron que a 30 °C la viabilidad es severamente afectada sin importar el tipo de
polímero empleado (Fig. 3). Un quiste maduro consiste de una célula contraída
conocida como cuerpo central el cual es rodeado por una cápsula conformada por una
capa externa laminada delgada llamada exina y una gruesa denominada intina
(Segura et al. 2009). A diferencia de las células no enquistadas, la membrana está
compuesta por ácidos grasos de tipo alquilresorcinol y alquilpireno, los cuales estan
codificados por los genes arsABCD (Funa et al. 2006). A pesar de que se creyó por un
largo tiempo que estos ácidos eran los encargados de mediar la tolerancia a
desecasión (Sadoff et al. 1971; Funa et al. 2006), estudios posteriores contradijeron
esta hipótesis (Segura et al. 2006). Moreno et al. (1986) mostraron que Azotobacter
puede ser mantenido bajo condiciones de desecasión por un tiempo superior a 20
años a temperatura ambiente. Esto sugiere que la temperatura podría cumplir un papel
crucial sobre la viabilidad de los quistes a través del tiempo, esto se soporta por el
hecho de que cuando la temperatura de 22 °C fue impuesta la pérdida en la viabilidad
fue mucho menor. En general, la viabilidad de las células enquistadas después de 30
días fue más afectada que las células en los otros estados fisiológicos. Otra hipótesis
se plantea para explicar los bajos índices de supervivencia en las células enquistadas,
muchos autores argumentan que el n-butanol induce el proceso de enquistamiento, sin
embargo puede resultar tóxico para las células (Brotonegoro, 1974). La acumulación
intracelular de este compuesto derivado del proceso de enquistamiento y una alta
temperatura podrían dar lugar a la generación de una mayor toxicidad en las células lo
cual podría estar asociado a la pérdida de viabilidad, no obstante más investigación es
requerida para comprobar esta hipótesis.
20
Fig. 3 Viabilidad de Azotobacter chrococcum C26 durante el estado de células enquistadas. Este grafico muestra
células viables de A. chrococcum recuperadas después de proceso de conservación y secado en carragenina (A),
alginato de sodio (B), HPMC (C) y como prueba control BPS (D)
Previos reportes han mostrado la eficiencia de los métodos de conservación para
bacterias basados en el uso de polímeros. Krumnow et al. (2009) reportó el uso de
goma acacia y pulano para la preservación de células no relacionadas
filogenéticamente: Escherichia coli y Bacilus subtilis. Ellos emplearon cuatro
temperaturas entre 5 y 40 °C para la evaluación de la viabilidad a través del tiempo.
Los resultados mostraron una influencia significativa del tipo de polímero y la
temperatura sobre la viabilidad celular. Nosotros observamos el mismo patrón puesto
que la viabilidad fue principalmente influenciada por estos dos parámetros. De manera
interesante, el estado fisiológico que se esperaba presentara la mayor tolerancia a
altas temperaturas (30 C), fue de hecho el que menos toleró. Con base en los
resultados es posoble concluir que la técnica de conservación en polímeros representa
21
una buena alternativa al uso de equipos especializados. Cuando se emplearon los
polímeros y la temperatura de almacenamiento fue de 22 °C o menos, la viabilidad
celular fue mantenida. Los mejores resultados fueron presentados con carragenina
como conservante, sugiriendo más estudios para evaluar su eficacia a través del
tiempo.
6.2 Interpretación de la degradación celular mediante el modelo termodinámico
de Arrhenius
Para la evaluación termodinámica de la degradación se utilizó el modelo de Arrhenius
reportado por Sorokulova et al. (2008) para el estudio de conservación de esporas de
Bacillus subtilis. El modelo de Arrhenius (Ecuación 1) describe la dependencia entre la
tasa constante k de las reacciones químicas sobre la temperatura T (Fig. 4, 5 y 6) y la
energía de activación Ea, tal y como se describe a continuación:
k = AeEa
RT
(1)
La variable A representa el factor pre-exponencial de Arrhenius, y suele llamarse el
factor de frecuencia o colisión. La energía de activación Ea representa la cantidad de
energía que es requerida para que se dé un proceso, R representa la constante de los
gases ideales y T la temperatura en escala absoluta. El valor de k se describe como la
tasa constante a la cual un proceso ocurre o se da una reacción química, y es
calculada con base en la cuantificación de los reactantes y productos en una reacción
química. En es caso de este estudio (Ecuación 2), el valor de k fue estimado
empleando una relación entre el recuento inicial de células y el final a través del
tiempo, lo cual se describe mediante la siguiente ecuación diferencial:
dN
dt= -kN
(2)
22
Esta ecuación se explica como: “la velocidad o la variación en el conteo de células es
directamente proporcional al número de células en el tiempo”. Solucionando el sistema
se genera (Ecuación 3):
logN
No
æ
èçö
ø÷= -2,303kt (3)
Fig. 4 Grafico de Arrhenius, temperatura de degradación para células vegetativas de A. chrococcum C26 para los
polímeros: carragenina (A), alginato de sodio (B), HPMC (C) y como prueba control BPS (D)
23
Fig. 5 Grafico de Arrhenius, temperatura de degradación para células maduras de A. chrococcum C26 para los
polímeros: alginato de sodio (A), HPMC (B) y como prueba control BPS (C)
Fig. 6 Grafico de Arrhenius, temperatura de degradación para células enquistadas de A. chrococcum C26 para los
polímeros: carragenina (A), alginato de sodio (B), HPMC (C) y como prueba control BPS (D)
24
El valor de k se obtiene a partir de la graficación de los resultados obtenidos en un
plano cartesiando con eje vertical log(N/No) y horizontal t, la pendiente de la curva es
igual a -2,303k, de donde se despeja k.
De la misma manera se empleó la ecuación de Eyring la cual involucran parámetros de
energía libre de Gibbs (ΔG), entropía estándar de activación (ΔS), entalpia estándar de
activación (ΔH), constante de Boltzmann Kb, h es la constante de Planck y la
temperatura absoluta. La ecuación de Erying (Ecuación 4) se describe a continuación:
k =kbT
he
DG
RT =kbT
he
DS
RTe-DH
RT
(4)
Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que la mejor formulación para la
conservación de Azotobacter fue en la cual se emplearon células vegetativas y el
polímero carragenina. Esto fue evidente por la alta energía de activación (véase tabla
1), es decir, la cantidad de energía que se requiere para iniciar el proceso, lo cual en el
contexto del trabajo representa la degradación celular (véase ecuación 2). El segundo
mejor formulado fue células vegetativas y alginato sódico con un valor de Ea cercano a
20 kcal/mol. Sorokulova et al. (2008) reportaron valores de Ea similares para esporas
de Bacillus subtilis conservadas bajo diferentes formulaciones, esto indicaría teniendo
en cuenta los valores de Ea para las formulaciones, que el polímero cumple un papel
fundamental en la protección de las células vegetativas. No obstante, los resultados no
indicaron lo mismo en los otros estadío fisiológicos, confirmando la relación existente
entre el estado fisiológico y el polímero empleado (véase Fig. S1).
25
Tabla 1. Parámetros termodinámicos derivados de las ecuaciones de Arrhenius y Eyring.
Tratamiento
Ea (kcal/mol)
A (1/dia)
ΔS [cal/(mol K)]
ΔH (kcal/mol)
ΔG-4ºC (kcal/mol)
ΔG-22ºC (kcal/mol)
ΔG-30ºC (kcal/mol)
Vegetativas + Carragenina 24.12 7.76E+15 -10.322 23.549 26.41 26.59 26.68
Vegetativas + Alginato de Na 19.84 2.40E+13 -21.801 19.263 25.30 25.69 25.87
Vegetativas + HPMC 13.81 1.02E+09 -41.819 13.236 24.82 25.57 25.91
Vegetativas + BPS 8.10 6.43E+04 -61.032 7.528 24.43 25.53 26.02
Maduras + Carragenina ND ND ND ND ND ND ND
Maduras + Alginato de Na 12.74 2.17E+08 -44.893 12.170 24.61 25.41 25.77
Maduras + HPMC 17.10 4.57E+11 -29.658 16.519 24.73 25.27 25.51
Maduras + BPS 13.18 4.40E+08 -43.488 12.609 24.66 25.44 25.79
Enquistadas + Carragenina 10.12 2.95E+06 -53.427 9.545 24.34 25.31 25.73
Enquistadas + Alginato de Na 17.33 1.32E+12 78.221 46.462 24.79 23.39 22.76
Enquistadas + HPMC 10.49 2.57E+06 -53.706 9.911 24.79 25.75 26.18
Enquistadas + BPS 10.78 8.28E+06 -51.382 10.203 24.44 25.36 25.77
Ea: energía de activación, A: factor pre- exponencial de Arrhenius; ΔS: la entropía estándar de activación; ΔH: entalpía
estándar de activación; ΔG: energía libre de Gibbs.
Cuando las células vegetativas fueron conservadas se encontró que el polímero ejerce
una actividad protectiva sobre las celulas disminuyendo la energía de activación
necesaria para que se inicie el proceso de degradación. Cuando las células
vegetativas fueron conservadas en carragenina, alginato y HPMC la energía de
activación se incrementó en 197%, 144% y 70%, respectivamente, comparado con el
control. En el caso de las células maduras la energía de activación fue incrementada
30% cuando las células se conservaron en HPMC con respecto al control de BPS, sin
embargo no se observaron diferencias cuando se conservaron las células en alginato.
Finalmente, las células enquistadas solo presentaron un aumento en la energía de
activación cuando se conservaron en alginato. Estos resultados sugieren que el estado
fisiológico presenta preferencias particulares sobre el tipo de polímero empleado.
Cuando comparamos entre los tres estados fisiológicos conservados en BPS, los
resultados mostraron que la energía de activación fue mayor cuando las células se
encontraban en estado maduras y quistes que en estado fisiológico vegetativas. Este
26
resultado muestra que las células de Azotobacter per se son más resistentes a medida
que se hace más viejas o se diferencian en células denominadas quistes. El valor de la
energía deactivación se incrementó en 62,7% y 33,1% para maduras y quistes, con
respecto a las células vegetativas. Es interesante resaltar, que las células maduras
presentaron una energía de activación mayor que las células enquistadas las cuales,
como se mencionó previamente, son más tolerantes a las condiciones ambientales
adversas, en particular a la desecación. Este resultado soporta las observaciones
previamente descritas donde se mencionaba que las células enquistadas tuvieron una
acelerada muerte celular en la mayor temperatura. Esto da lugar a la generación de
tres hipótesis: 1) los quistes de Azotobacter C26 no son resistentes a la desecación, 2)
no llegaron a la madurez necesaria, o 3) el agente inductivo residual ejerció toxicidad
sobre las células conservadas. Pero como ya se mencionó, se requiere de mayor
investigación para evaluar estas hipótesis.
De modo general, y soportando los resultados presentados en la Tabla S1, en
promedio las células vegetativas tuvieron una mejor interacción con los polímeros lo
cual fue evidente por un mayor aumento en la energía de activación comparado con
los otros estadios fisiológicos. Aún más, la energía libre Giggs la cual discutiremos a
continuación fue mayor, es decir se requiere de una mayor inversión de trabajo por
parte del entorno para que se dé a cabo la reacción, esto es la degradación térmica de
las células. También fue posible inferir que de manera general las células en estado
vegetativo fueron más tolerantes a las condiciones impuestas, lo cual fue evidente por
mayores energías de activación (Tabla 1).
La energía libre de Gibbs relaciona la entropía y la entalpia de un sistema,
entendiéndose entropía como el grado de desorden o aleatoriedad y la entalpia como
la energía interna no invertible en trabajo. Cuando el ΔG = 0 se dice que el sistema
está en equilibrio, cuando ΔG < 0 quiere decir que el proceso se da espontáneamente,
mientras que cuando el ΔG > 0 el proceso requiere de energía para realizarse. Los
resultados obtenidos ilustran esta relación, para que la degradación de las células se
dé se require que el entorno proporcione energía al sistema. En el caso de los
microtubos donde se conservó, la energía es aportada en forma de calor el cual
27
proviene del ambiente en el cual se conservaron los tratamientos. En el caso de la
temperatura de 30 °C la energía que invierte el entorno en el tratamiento es mayor que
en las otras temperaturas (Tabla 2), de modo que se invierte una mayor energía para
que la reacción se dé, cuando se supera la energía de activación las células empiezan
a degradarse y en consecuencia el recuento disminuye. Krumnow et al. (2009)
reportan que el único factor que se asocia con la degradación térmica no es la
temperatura a la cual se preservan los tubos sino también el tiempo de exposición el
cual se relaciona con la cantidad neta de entrada de calor al sistema.
Fig. 7 Correlación termodinámica de los tratamientos en A. chroococcum C26 Compensación entalpia-entropía para
degradación de estados fisiológicos: células vegetativas (A), células maduras (B) y células enquistadas(C) en
diferentes tratamientos.
Como se revela en el estudio la energía asociada con el cambio de la entropía se
correlaciona con el cambio de entalpia en un fenómeno conocido como entalpia-
entropía que se refiere esencialmente a la relación específica lineal encontrado que
existe entre el cambio en entalpía y la variación de entropía en muchos procesos
biológicos (Dunitz, 1995). Este proceso de compensación se caracteriza por generar
un grafico lineal de ΔH frente al ΔS (Fig. 7). En nuestro estudio experimental esta
relación se ve evidenciada para cada estado fisiológico de A. chroococcum,
observándose un comportamiento de cambio de entalpia positivo, indicando que la
degradación de cada tipo de célula está asociado a la absorción de calor como ha sido
reportado en otros estudios (Sorokulova et al. 2008). El valor de ΔH para los
28
tratamientos vegetativas-carragenina, vegetativas-alginato y enquistadas-alginato
fueron altos si se les compara con los tratamientos conservados con BPS y otros
estudios como los realizados por Sorokulova et al. (2008) donde se presenta el ΔH de
formulaciones de esporas de Bacillus subtilis con energías de activación en el rango
entre 10-20 kcal/mol.
Nuestras investigaciones han mostrado que la conservación de células de Azotobacter
chroococcum C26 con los ciertos polímeros puede incrementar considerablemente la
tolerancia de las células a condiciones extremas, además fue posible evidenciar que el
estados fisiológico expone un papel clave en esta tolerancia. Estos hallazgos son muy
importantes especialmente puesto que permiten el desarrollo de nuevas técnicas de
conservación que no requiere sofisticación. La interpretación termodinámica de los
resultados proporcionó una visión más holística que permite identificar de forma más
directa cómo las variables del entorno pueden afectar un tipo de sistema abierto como
el trabajado en este estudio.
7. CONCLUSIONES
Los resultados de este estudio permitieron evidenciar que tanto el estado fisiológico, el
tipo de polímero y la temperatura de almacenamiento juegan un papel clave sobre la
viabilidad de Azotobacter a lo largo del tiempo. El experimento fue interpretado en
términos de la viabilidad celular a lo largo del tiempo, y en términos termodinámicos lo
cual permitió establecer una relación entre la energía que el sistema recibe y la
degradación celular. Con base en los resultados se estableció que el mejor método
para la conservación fue aquel que implicó el uso de células vegetativas y carragenina.
En términos de viabilidad se observó que el recuento no disminuyó significativamente a
través del tiempo y en términos termodinámicos se demostró que la energía de
activación es superior a la de los otros tratamientos. Adicionalmente, fue posible
observar que la viabilidad fue similar cuando se conservaron las células a 4 y 22 C, por
lo cual es posible desarrollar un método de conservación con polímeros a temperatura
29
ambiente. El desarrollo de este tipo de tecnologías es importante pues permite
mantener la viabilidad de las células a lo largo del tiempo sin la necesidad emplear
equipos especializados o condiciones astringentes de conservación. En consecuencia,
la estabilidad de las células es posible mantenerla a través del tiempo con un poca
inversión económica y de infraestructura.
30
8. REFERENCIAS
Adesemoye AO, Torbert HA, Kloepper J W. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Allow Reduced Application Rates of Chemical Fertilizers. Microbial ecology. 2009; 58: 921- 929. Ahmad F, Ahmad I, Khan M.S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 2008; 163: 173—181 Amara, M.A.T. and Dahdoh, M.S.A. Effect of inoculation with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield and uptake of nutrients by wheat grown on sandy soil. Egyptian Journal of Soil Science. 1997; 37: 467–484. Arrhenlus, S. Uber die Reaktionsgeschwindigkeitbei der Inversion von Rohrzucker durch Sauren. Z. Physical Chemical 1889; 4: 226-248. Asgha H.N, Zahir Z.A, Arshad, M. and Khaliq A. Relationship between in vitro production of auxins by rhizobacteria and their growth promoting activities in Brassica juncea. L. Biology and Fertility of Soils 2002; 35: 231–237. Bernd H, ertesvag H, Valla S. A New Azotobacter vinelandii Mannuronan C-5-Epimerase Gene (algG) Is Part of an alg Gene Cluster Physically Organized in a Manner Similar to That in Pseudomonas aeruginosa. Journal of bacteriology. 1996; 178 (20):5884-5889. Biswas J.C, Ladha J.K. and Dazzo F.B. Rhizobia inoculation improves nutrient uptake and growth of lowland rice. Soil Science Society of America Journal. 2000; 64:1644–1650. Biswas J.C, Ladha J.K, Dazzo F.B, Yanni Y.G. and Rolfe B.G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice. Agronomy Journal. 2000; 92: 880–886. Bonartseva G.A, Myshkina V.L, Nikolaeva D.A, Kevbrina M.V, Kallistova A.Y, Gerasin V.A, Iordanskii A.L and Nozhevnikova A.N. Aerobic and anaerobic microbial degradation of Poly-β-Hydroxybutyrate produced by Azotobacter chroococcum. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2003; 109:285-301 Brotonegroro S. Nitrogen fixation and nitrogenase activity of Azotobacter chroococcum. Veenman and
Zonen. Wageningen. 1974, 76 p
Chung-Jey S, Reusch R and Sadoff L. Fatty acids in phospholipids of cells, cysts, and germinating cysts of Azotobacter vinelandii. Journal of bacteriology.1979; 137 (3): 1434-1436 Chen Y, Mei R, Lu S, Liu, L, Kloepper, J.W. 1994.The use of yield increasing bacteria as plant growth promoting rhizobacteria in Chinese agriculture. In Management of Soil Born Diseases ed. Gupta, V.K. and Utkhede, R. pp. 1–13 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C, Ait E. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Applied and environmental microbiology. 2005; 71 (9): 4951–4959. Damir O, Mladen P, Božidar S, Sr_an N. Cultivation of the bacterium Azotobacter chroococcum for preparation of biofertilizers. African Journal of Biotechnology. 2011; 10(16): 3104-3111
31
Denkova Z, Krastanov A, Murgov I. Immobilized lactic acid bacteria for application as dairy starters and probiotic preparations. The Journal of General and Applied Microbiology 2004; 50 (2): 107-14 Doyle M, Beuchat L, Montville T. Microbiología de los alimentos fundamentos y fronteras. Acribia. España.
2000, 326 p.
Dunitz J. Win some, lose some: enthalpy-entropy compensation in weak intermolecular interactions. Chemistry & Biology. 1995; 2:709-712
Gama S, Nuñez C, Segura D, Moreno S, Guzman J and Espin G. Azotobacter vinelandii Aldehyde
Dehydrogenase Regulated by 54: Role in Alcohol Catabolism and Encystment. Journal of bacteriology. 2001; 183 (21): 6169–6174 Hilali A, Przrost D, Broughton W.J, Antoun A. Effects the inoculationof souches de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii sur la croissance du bl’e dans deux sols du Marco. Canadian Journal of Microbiology. 2001; 47: 590–593.
Jackson LE, Burger M, Cavagnaro TR. Roots, nitrogen transformations and ecosystem services. Annual Review of Plant Biology 2008 ; 59:341–363
Funa N, Ozawa H, Hirata A, Horinonouchi S. Phenolic lipid synthesis by type III polyketide synthases is essential for cyst formation Azotobacter vinelandii. PNAS. 2006; 103 (16): 6356-6361.
Hemar Y, Hall C.E, Munro P.A, Singh H. Small and large deformation rheology and microstructure of k-carrageenan gels containing commercial milkprotein products. International Dairy Journal. 2002; 12: 371–381
Holt J.2000. Bergey´s manual to determinative bacteriology. Novena edicion. Baltimore. Maryland. Ed. Williams & Wilikins. USA. Pp 77, 105.
Kailasaphaty K. Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications. Current Issues in Intestinal Microbiology 2002; 3: 39-48.
Khalid A, Arshad M, Zahir Z. A. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. Journal of Applied Microbiology. 2004; 96: 473–480.
Krumnow A, Sorokulova I, Olsen E, Globa L, Barbaree J, Vodyanoy V. preservation of bacteria in natural polymers. Journal of Microbiological Methods 2009; 78: 18-194.
Murano E. Use of natural polysaccharides in the microencapsulation techniques. Journal of Applied Ichthyology. 1998; 14: 245-249.
Muñoz J, Bernal P, Duque E; Godoy P, Segura A, ramos J. Involvement of cyclopropane fatty acids in KT2440 to freeze-drying the response of Pseudomonas putida. Aplied and environmental microbiology. 2006; 72 (1): 472-477.
Lenart A. Ocurrence, characteristics and genetic diversity of Azotobacter chroococcum in various soils of Southern Poland. Polish Journal of Environmental Studies. 2012; 21 (2): 415-424.
Lin, L. P, Sadoff H L. Encystment and polymer production by Azotobacter vinelandii in the presence of b-hydroxybutyrate. Journal Bacteriology 1968; 98:1335-1341
32
Reusch R N, Sadoff H L. Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane. Nature
1983; 302: 268 - 270
Reusch R N and Sadoff H L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization. Journal Bacteriology. 1979; 139: 448-453.
Richardson A, Barea J, Mcneill A, Prigent C. Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms. Plant soil. 2009; 321: 305- 339.
Rokka S, Rantamaki P. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications. European Food Research and Technology. 2010; 231: 1-12
Sadoff H. L, Berke E, Loperfido B. Physiological Studies of Encystment in Azotobacter vinelandii. Journal of bacteriology. 1971; 105 (1): 185 189 Sadoff H. Encystment and Germination in Azotobacter vinelandii. Bacteriological reviews. 1975; 39 (4): 516-539 Safari AA, Sharifi Z. Land use Effect on the occurrence and distribution of Azotobacter in Hamadan soils, Iran. Proceedings of The Fourth International Iran & Russia Conference. 2004; 614-618
Segura D, Vite O, Romero Y, Moreno S, Castañeda M, Espin G. Isolation and characterizacion of Azotobacter vinelandii mutants impaired in alkylresorcinol synthesis: alkyilresorcinols are not essential for cyst desiccation resistance. Journal of bacteriology. 2009; 191 (9): 3142-3148.
Socolofsky MD, Wiss O. Cysts of Azotobacter. Journal Bacteriology. 1961; 81: 946-954.
Sorokulova I, Krumnow A, Pathirana S. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnology Progress. 2008; 24: 1147-1153
Sorokulova I, Watt J, Olsen E, Globa L, Moore T. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. Journal of Microbiological Methods 2012; 88: 140-146.
Stevenson LH, Socolofsky MD. Cyst formation and poly-β-hydroxybutyric acid accumulation in Azotobacter. Journal Bacteriology. 1966; 91: 304–310 Tejera N, Lluch C, Martinez M V, Gonzalez J. Isolation and characterization of Azotobacter and Azospirillum strains from the sugarcane rhizosphere. Plant and Soil. 2005; 270: 223–232 Thorne, P.S., Lange, J.L., Bloebaum, P., Kullman, G.J., 1994. Bioaerosol sampling in-field studies—can samples be express mailed? Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 55, 1072–1079 Verma S, Ladha J, Tripathi A. Evaluation of plant growth promoting and colonizationability of endophytic diazotrophs from deep water rice. Journal of Biotechnology 2001; 91: 127–141
Vessey J. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil. 2003; 255: 571–586.
Wyss O, Smith DD, Pope LM, Sokolofsky KE. Endogenous encystment of Azotobacter vinelandii. Journal Bacteriology.1969; 100: 475–479
33
ANEXOS
Tabla S1. Análisis estadístico de las variables de estudio.
Origen Suma de
cuadrados tipo III
gl Media cuadrática F Sig.
Modelo corregido 172201,502a 35 4920,043 875,413 ,000
Intersección 426856,726 1 426856,726 75949,703 ,000
Estado fisiológico 5103,826 2 2551,913 454,056 ,000
Temperatura 131995,887 2 65997,944 11742,873 ,000
Polímero 16194,097 3 5398,032 960,460 ,000
Estado x Temperatura 807,604 4 201,901 35,924 ,000
Estado x Polímero 2424,493 6 404,082 71,897 ,000
Temperatura x Polímero 7106,773 6 1184,462 210,749 ,000
Estado x Temperatura x Polímero 8568,821 12 714,068 127,053 ,000
Error 404,658 72 5,620
Total 599462,886 108
Total corregida 172606,161 107 a. R cuadrado = ,998 (R cuadrado corregida = ,997);
bvariable dependiente: BSR (Bacterial Survival Rate).