inmovilizacion de enzimas (1)
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Instituto Tecnológico deMorelia
Alumno: Osmar Wilebaldo Solís Morales
Profesor: Juan Carlos González Hernández
Materia: Cinética Química Biológica
Unidad: IV
Trabajo: Inmovilización de enzimas
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Índice
Introducción
Contenido1.-) Aspectos generales sobre la inmovilización de enzimas.
2.-) Ventajas e inconvenientes.
3.-) Métodos de inmovilización.
4.-) Soportes de inmovilización.
5.-) Adsorción.
5.1.-) adsorción por interacción hidrofòbicas.
5.2.-) adsorción por interacciones iónicas.
5.3.-) adsorción por afinidad.
5.4.-) adsorción por coordinación a un metal.
6.-) Atrapamiento.
7.-) Unión covalente.
7.1.-) Formación de enlaces diazo.
7.2.-) Formación de enlaces tipo peptídico.
7.3.-) Formación de enlaces de Schiff.
7.4.-) método de alquilación o arilación.
7.5.-) Reacciones de intercambio tio-disulfuro.
8.-) Entrecruzamiento o Reticulado.
9.-) Comparación entre los métodos de inmovilización.
10.-) Elección del método.
11.-) Propiedades de las enzimas inmovilizadas.
12.-) Actividad catalítica.
13.-) Especificidad por el sustrato.14.-) Constantes cinéticas.
14.1.-) Constante de Michaelis (K m ).
14.2.-) Velocidad máxima (V max ).
15.-) Temperatura y pH.
16.-) Estabilidad. 17.-) Aplicación de las enzimas inmovilizadas.
Referencias
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Introducción
Las enzimas son biomoléculas
especializadas en la catálisis de las
reacciones quimias que tiene lugar
la célula. Son muy eficaces como
catalizadores ya que son capaces
de aumentar la velocidad de las
reacciones químicas mucho más
que cualquier catalizador artificial
conocido, y además son altamente
específicos ya que cada uno de
ellos induce la transformación de
un solo tipo de sustancia y no de
otras que se pueden encontrar enel medio de reacción.
La estabilidad estructural de las
enzimas durante las reacciones
bioquímicas son algunos de los
desafío principales en el estudio de
los biocatalizadores. Se han
desarrollado diferentes técnicas
con el fin de inmovilizar las
enzimas que contengan uneficiencia funcional y mayor
reproducibilidad.
De esta manera la inmovilización
de enzimas se refiere al hecho de
limitar o retardar el movimiento.
La enzima inmovilizada es aquella
que esta confinada en un espacio
definido, que retiene su actividad
catalítica y puede ser reutilizadade forma continua.
La inmovilización se remonta al
estudio de las biopelículas, las
cuales son una superficie de
conexiones de comunidades
microbianas que consisten en
múltiples capas de célula
incrustada en matrices hidratadas.
En 1985 se llevó a cabo la
inmovilización de múltiples
enzimas para su uso, por ejemplo
en la producción de L-aminoácidos
a partir de ceto-ácidos a partir de
reactores de membrana.
Los componentes principales de un
sistema de inmovilización
enzimático son la enzima, la
matriz o soporte y el método
de fijación. Alguna de sus
propiedades como la actividad
catalítica o la estabilidad térmica
llegan a ser alteradas, sin
embargo puede conservar su
funcionalidad durante varios ciclos.
Debe tener en cuenta el
conocimiento de las propiedades
de los materiales del soporte y los
procesos de inmovilización.
1.-) Aspectos generales sobre
la inmovilización de enzimas.
Según IUPAC la inmovilización es
una “técnica utilizadas para
conseguir la fijación física o
química de células, orgánulos,
enzimas u otras proteínas en un
soporte sólido, una matriz solida o
mediante retención de una
membrana, con el fin de aumentar
su estabilidad y hacer posible su
uso repetido o continuado”
Figura 1. Componentes de un sistema de
inmovilización: enzima, soporte y técnica de
inmovilización.
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Concretamente las enzimas
inmovilizadas pueden ser definidas
como “enzimas físicamente
confinadas o localizadas en una
cierta región definida del espacio
con retención de su actividad
catalítica y que puede ser usadas
repetidamente y de modo
continuo” (Chibata, 1978)
2.-) Ventajas e inconvenientes
Como ventajas del empleo de
enzimas inmovilizadas podemos
destacar:
El aumento de la estabilidad
de la enzima.
La posible reutilización del
derivado, por lo que
disminuye los costes del
proceso.
La posibilidad de diseñar un
reactor enzimático de fácil
manejo y control, adaptado
a la aplicación de la enzimainmovilizada.
Como inconvenientes del
proceso de inmovilización:
La alteración de la
conformación de la enzima
respecto de su estado
nativo.
La gran heterogeneidad delsistema enzima-soporte
donde pueden existir
distintas fracciones de
proteínas inmovilizadas con
un diferente número de
uniones.
Siempre suele haber una
pérdida de inactividad de la
enzima durante la
inmovilización.
El biocatalizador es más
caro que la enzima nativa.
Tabla 1. Ventajas e inconvenientes del
sistema de inmovilización de enzimas.
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3.-) Métodos de inmovilización.
Los numerosos métodos
empleados para llevar a cabo la
inmovilización de enzimas se han
clasificado atendiendo a diversoscriterios, como por ejemplo, la
naturaleza física o química de la
inmovilización (arroyo, 1998) o su
carácter reversible o irreversible
(brena y batista-viera, 2006).
Algunos grupos funcionales de la
enzima pueden dar lugar a fuertes
enlaces covalentes que la unan a
un soporte o a otras moléculas dela enzima, la inmovilización
también puede ocurrir por
adsorción de la enzima a un
soporte. Las enzimas pueden ser
inmovilizadas por atrapamiento,
donde la enzima no da lugar a
ningún tipo de enlace si no que
esta retenida físicamente. Todos
estos métodos se detallaran a
continuación.
Existen cinco métodos principales
para inmovilización de enzimas o
células: adsorción, unión
covalente, entrecruzamiento,encapsulamiento y
atrapamiento.
Los métodos más utilizados de
inmovilización son:
Adsorción
Atrapamiento
Figura 2. Método de
adsorción.
Figura 3. Método de
Atrapamiento
Tabla 2. Clasificación de los distintos métodos de
inmovilización de enzimas.
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Unión covalente
El proceso de inmovilización ideal
para una enzima es aquel que le
permite conservar una alta
actividad catalítica en el paso del
tiempo para ser utilizada
continuamente.
Dependiendo de la estructura de la
proteína y del material, así comode las condiciones de reacción
será el método de inmovilización a
utilizar.
4.-) Soportes de
inmovilización.
La naturaleza de los soportes de
inmovilización y el tipo de unión
de la enzima con estos afecta de
modo determinante al
comportamiento de la enzima
inmovilizada. Algunas de las
características ideales de las que
debería constar un buen soporte
de inmovilización son:
Buena estabilidad mecánica.
Adecuado tamaño de
partícula y porosidad.
Buena resistencia tanto al
pH como a la presión.
Buena disponibilidad.
Bajo coste.
Dependiendo de las característicasfísicas del soporte:
Diámetro de partícula
Resistencia mecánica.
Compresión.
También conociendo el tipo de
reactor:
Tanque agitado.
Lecho empaquetado.
Tanque continuo o
descontinuo.
Los soportes de inmovilización se
pueden clasificar en dos grupos:
soportes orgánicos y soportes
inorgánicos. Los soportes de
inmovilización inorgánicos
presentan una alta estabilidad
mecánica, química y frente a los
ataques bacterianos. Mientras que
los soportes orgánicos son mas
versátiles, pueden ser diseñados y
sintetizados en el laboratorio para
provocar el tipo de interacción
enzima-soporte deseado, la
mayoría de los soportes de
inmovilización empleados en
aplicaciones industriales son deeste tipo “orgánicos”.
Figura 4. Método de unión
covalente.
Tabla 3. Clasificación de los distintos soportes
de inmovilización.
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5.-) Adsorción.
Es el método más simple de
inmovilización, se basa en enlaces
débiles aunque tiene cierta eficacia
en los procesos. Intervienen lasfuerzas de Van der Waals,
interacciones iónicas, y puentes de
hidrogeno.
Esta técnica es de bajo costo, fácil
preparación, el soporte se puede
recargar, pero uno de los
inconvenientes es que el enlace es
reversible y solo se puede
monitorear la reacción en periodoscortos.
Otros de los inconvenientes por
mencionar son: hay fuga del
biocatalizador, enlace inestable, no
es posible controlar lo anterior y
por lo tanto tiene un índice de
reproducibilidad bajo.
Los soportes más utilizados seencuentran la
carboximetilcelulosa, el
almidón, el colágeno, sepharosa
modificada, resinas de
intercambio iónico, silica gel,
oxido de aluminio, titanio, tierra
de diatomeas, cerámica,
hidroxiapatita, cerámica, etc.
Todos los soportes dan bajas
cantidades de proteínas (1
mg/g de soporte).
5.1.-) adsorción por
interacción hidrofòbicas.
La adsorción mediante
interacciones hidrofòbicas tiene
lugar debido a la afinidad quepresenta entre si los grupos no
polares presentes en la enzima
y el soporte. La fortaleza de la
adsorción será mayor cuanto
mayor sea el carácter
hidrofóbico de ambos, elsoporte y la enzima.
5.2.-) adsorción por
interacciones iónicas.
La adsorción de una enzima a
un soporte mediante
interacción iónica está basada
en los principios que rigen las
interacciones de naturalezaelectrostática. Las cargas de la
enzima interacción con aquellas
de signo opuesto del soporte,
dando lugar así a la
inmovilización de la enzima.
Cuando los soportes empleados
poseen un gran número de
cargas y los sustratos yproductos de la reacción
enzimática también están
cargados, la cinética enzimática
suele verse distorsionada y
pueden ocurrir problemas
difusionales.
5.3.-) adsorción por
afinidad.El principio de afinidad entre
biomoléculas complementarias
se ha aplicado también a la
inmovilización de enzimas
(Brena y batista-viera, 2006).
La mayor ventaja de este
método se encuentra en el alto
grado de selectividad de la
interacción ligando-enzima. Sin
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embargo se requiere la unión
covalente al soporte o matriz de
un ligando de afinidad que
suele ser caro. Este ligando
unido al soporte es selectivo yse une por afinidad a la enzima,
quedando esta inmovilizada.
5.4.-) adsorción por
coordinación a un metal.
Al depositar sobre un soporte
solido ciertas sales o hidróxidos
de metales de transición como
mercurio, cobre, níquel, titanioo zirconio, se puede producir la
coordinación del metal a
determinados grupos
nucleofilicos del soporte y
posteriormente a la enzima, a
este tipo de inmovilización se le
conoce como inmovilización por
unión a un metal.
La precipitación de estas sales
o hidróxidos de metales al
soporte (celulosa, quitina, ácido
algínico, silicatos) suele llevar a
cabo mediante calentamiento o
neutralización.
El método es bastante simple y
la actividad específica de lasenzimas inmovilizadas por este
método es bastante alta.
Además, se trata de un método
reversible, pues la elución de
las proteínas inmovilizadas se
pueden conseguir fácilmente
por competición con ligando
solubles o disminuyendo el pH.
Sin embargo, la estabilidadoperacional alcanzada es
variable y los resultados no son
fácilmente reproducibles.
6.-) Atrapamiento
Esta técnica consiste en lainclusión de la enzima por
unión covalente o no, dentro de
geles, fibras, matrices solidas
porosas constituidas por
prepolimeros
fotoentrucruzables o polímeros
del tipo poliacrilamida,
colágeno, alginato, carraginato
o resinas de poliuretano.
Además minimiza la lixiviación
de la enzima y mejora su
estabilidad, pero con frecuencia
resulta en limitaciones de
transporte de sustrato/analito
al sitio activo de la enzima.
Esta técnica permite la
posibilidad de adaptar el
material de encapsulación para
proporcionar el microambiente
óptimo para la enzima.
La encapsulación eficiente se
ha realizado empleando
alginato de calcio, que previene
la perdida de la enzima y
aumenta la estabilidadmecánica.
El proceso de inmovilización se
lleva a cabo mediante la
suspensión de la enzima en una
solución monómera,
seguidamente se inicia la
polimerización por un cambio
de temperatura o mediante laadición de reactivo químico. El
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atrapamiento puede ser en
geles o en fibras, que suelen
ser más resistentes que los
geles. En el primer caso, la
enzima queda atrapada en elinterior de un gel, mientras que
en el segundo caso la enzima
se encuentra ocluida dentro de
las microcavidades de una fibra
sintética.
Como ventaja adicional, la
enzima no sufre ninguna
alteración en su estructura.
Pero requiere de un control
riguroso de las condiciones de
polimerización, así como la
comprobación de que la
naturaleza del proceso no altera
los grupos reactivos de la
proteína.
El atrapamiento por medio de
nano materiales ha
revolucionado el área de
inmovilización de enzimas y ha
ampliado el rango de aplicación
en el campo de la química fina,
biomedicina, biocombustibles,
biosensores y medicina.
6.-1) Atrapamientos en gel o
fibras.
Uno de los métodos más
utilizados para lograr la
inmovilización de una enzima
es su atrapamiento en n gel
polimérico. Los geles
empleados mayoritariamente
son geles de carragenos,
alginato, agarosa ypoliacrilamida. En todos los
casos, la enzima queda
retenida en los huecos
intersticiales del soporte
polimérico. La técnica consiste
generalmente en disolver estospolímeros en agua, añadir la
enzima desea en disolución y
posteriormente enfriar la
mezcla.
En caso de los polímeros de
acrilamida, la polimerización gel
puede iniciarse a partir de un
reactivo químico, directamente
en presencia de la enzima.
También se puede llevar a cabo
en el atrapamiento de la
enzima en geles de sílice
obtenidos mediante procesos
sol-gel, que consisten en la
hidrolisis en agua de un
alcoxido de silicio y un proceso
posterior de policondensación(Gupta y Chaudhury, 2007;
Brady y Jordan, 2009).
6.-2) micro encapsulación.
La micro encapsulación consiste
en rodear la enzima con una
membrana semipermeable que
permite el paso de moléculas
de sustrato y de producto, perono de la propia enzima (Arroyo,
1998). Estas membranas
semipermeables pueden ser
permeables o no permeables.
7.-) Unión covalente
La inmovilización por unión
covalente, se basa en el
entrecruzamiento de la enzima
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y el material del soporte
produciendo un enlace fuerte y
estable. Este enlace covalente
es formado entre el grupo
funcional de la matriz delsoporte y la superficie de la
enzima que contiene residuos
de aminoácidos.
Los residuos de aminoácidos
que intervienen en la formación
del enlace, son los grupos
amino (NH2) de la lisina o
arginina, el grupo carboxilo
(COOH) del ácido aspártico o
acido glutámico, los grupos
sulfhidrilos de cisteína, los
grupos hidroxilos (OH) de la
serina o treonina.
De entre los 20 aminoácidos
diferentes que se encuentran
en la estructura de las enzimas,
los más empleados para la
formación de enlaces con el
soporte son principalmente la
lisina, la arginina, la
cisteína, la tirosina y la
histidina, y en menor medida
la metionina, el triptófano, la
arginina y el ácido aspártico
y glutámico. El resto de
aminoácidos, debido a su
carácter hidrófobo, no se
encuentran expuestos hacia el
exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir
en la unión covalente.
Los materiales utilizados en
esta técnica incluyen la
poliacrilamida, agarosa y silica,los polímeros de polisacáridos,
estos últimos son muy
populares para la inmovilización
de enzimas. La unión covalente
requiere de dos pasos: la
activación del material desoporte que se lleva a cabo por
la adición de un compuesto
reactivo y el segundo es la
modificación del esqueleto del
polímero para activar la matriz.
Hay que prestar especial
atención a que estos enlaces
covalentes que se forman
entre enzima y el soporte no
afecten al centro activo de la
enzima, pues en caso de
hacerlo podría perder su
actividad catalítica. La
presencia de inhibidores u otros
compuestos en el medio de
reacción puede ayudar a evitar
la pérdida de actividad, tambiénson cruciales en el proceso de
inmovilización parámetros
como el tiempo de reacción, la
temperatura, el pH o tampón
utilizado.
La inmovilización de enzimas
mediante unión covalente a un
soporte puede tener lugar
mediante enlaces de distinta
naturaleza (tipo diazo,
peptídico, base Schiff,
alquilación, arilacion o
disulfuro) y la con la
intervención de diversos
reactivos, tal y como se
muestra en la siguiente tabla 4.
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7.1.-) Formación de enlaces
diazo.
Este método consiste en la
funcionalización del soporte con
grupos diazonio capaces de
enlazarse con restos amino,
tirosil o histidil de la enzima. El
soporte debe contener gruposamino aromático, que pueden
ser introducidos mediante un
espaciador, de modo que estos
grupos amino se diazotan con
ácido nitroso como paso precio
a la inmovilización.
Alguno de los soportes que se
han empleado para llevar a
cabo este tipo de inmovilización
han sido los derivados de
polisacáridos como p-aminobencil celulosa, m-
aminoanisol celulosa, m-
aminobencil-oximetil celulosa.
7.2.-) Formación de enlaces
tipo peptídico.
Este método de inmovilización
está basado en la formación de
enlaces peptídicos o denaturaleza similar entre el
soporte de inmovilización y la
enzima. Se trata de unir la
enzima al soporte, mediante el
mismo tipo de enlace que
existe entre los distintos
aminoácidos que forman a la
proteína.
Para ello, es necesario llevar a
cabo la activación del soporte
de inmovilización, mediante el
uso de reactivos como:
bromuro de cianógeno, carbonil
dimidazol y cloroformiato en el
caso de que le soporte
contenga grupos hidroxilo, o
reactivos tipo carbodimida si elsoporte contiene grupos
carboxilo.
Existen otros reactivos, no tan
empleados debido a su
toxicidad o inestabilidad de los
derivados generados, que
también permiten la activación
de determinados soportes quecontienen grupos carboxilos o
Tabla 4. Clasificación de los distintos tipos de
unión covalente a un soporte
Figura 5. Acoplamiento diazo entre el soporte
de inmovilización y la enzima
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amino para dar lugar a la
formación de enlaces peptídicos
con la enzima.
Figura 6. Diversos métodos de inmovilización enzimática mediante la
formación de enlaces tipo peptídicos.
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7.3.-) Formación de enlaces
de Schiff.
Este método de inmovilización
está basado en la formación de
bases de Schiff y posterior
reducción de los mismos. Para
ellos es necesario activar el
soporte de inmovilización de
modo que se obtengan grupos
carbonilo capaces de reaccionar
con los grupos amino
presentes en la estructura de la
enzima.
La activación del soporte se
puede conseguir mediante
oxidación con peryodato, en el
caso de determinados
polisacáridos o soportesactivados previamente con
glicidol. Otro método muy
empleado consiste en utilizar
un dialdehído, cuando se desea
lograr la inmovilización de la
enzima en soportes que
contienen grupos amino
Figura 7. Diversos métodos deinmovilización enzimática mediante la
formación de bases de Schiff y posterior
reducción. (E= enzima)
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7.4.-) método de alquilación
o arilación.
Este método se basa en la
inmovilización de una enzima
mediante la alquilación o
arilación de sus grupos amino,
fenol o sulfhidrilos utilizando
para ello reactivos espaciadores
que se unen al soporte y a la
enzima. Estos reactivos pueden
ser oxiranos, divinilsulfona,
haluros de sulfonio y triazina tal
y como se detalla en la
siguiente figura.
Figura 8. Diversos métodos de inmovilización enzimática mediante el método de
alquilación o arilación. (E= enzima)
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7.5.-) Reacciones de
intercambio tio-disulfuro.
El intercambio tio-disulfuro se
produce entre grupos tiol
presentes en la enzima y los
residuos disulfuro mixtos del
soporte. En primer lugar, se
hace reaccionar un soporte que
contiene grupos tiol con 2,2,-
dipiridildisulfuro obteniendo asi
un derivado con enlaces
disulfuro.
Posteriormente, la enzima seenlasa por medio de sus grupos
tiol y ocurre la liberación de 2-
tiopiridona. La característica
principal de este enlace es su
reversibilidad, pues a pesar de
su carácter covalente, existen
reactivos como ditiotreitol
(DTT) que en condiciones
suaves pueden romper esos
puentes disulfuro establecidos
entre la enzima y el soporte
(Brena y Batista-Viera, 2006).
En este método aporta la
ventaja como la posibilidad de
reutilizar el soporte, una vez
que la actividad enzimática
haya caído, eliminando laenzima agotada y
sustituyéndola por enzima
nueva.
Como soportes de
inmovilización ha sido
empleados la agarosa-
glutation-2-piridil disulfuro
(llamada sefarosa tíol-activada), agaraso-
mercaptohidroxipropieter-2-
pirdil disulfuro y agarosa-ácido
adípico hidracina-N-acetil-
homocisteina-2piridil disulfuro.
Entre enzimas inmovilizadas
por enlaces disulfuro podemos
encontrar: anhidrasa
Carbonica, β-galactosidasa,
penicilina G-acilasa y lipasa.
8.-) Entrecruzamiento o
Reticulado.
La inmovilización por
entrecruzamiento o reticulado
ocurre en ausencia de un
soporte sólido y consiste en la
formación de enlaces
intermoleculares entre
diferentes moléculas de enzima
por medio de reactivos bi-omultifuncionales. Estos
reactivos pueden ser
glutaraldheido,
bisdiazobenzidina, entre otros
que dan lugar a
entrecruzamiento mediante
formación de bases de Schiff,
acoplamientos diazo, alquilación
o enlaces peptídicosrespectivamente. De todos ellos
Figura 9. Inmovilización enzimática mediante
reacciones de intercambio tiol-disulfuro. (E=
enzima)
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el más usado es el
entrecruzamiento mediante
glutaraldheído.
Entre las ventajas de este
método se encuentran su
simplicidad, y la disponibilidad
de controlar el tamaño de
partícula y las propiedades del
producto final. Como
inconvenientes podemos citar
que las reacciones se realizan
en condiciones relativamente
severas, con lo que la
conformación del centro activo
de la enzima puede verse
afectada, provocando una
importante pérdida de
actividad.
9.-) Comparación entre los
métodos de inmovilización.
Todos los métodos de
inmovilización presentan
ventajas e inconvenientes con
respecto al resto. No existe un
método ideal y general para la
inmovilización de cualquier
enzima (Arroyo, 1998). Por lo
tanto, la elección del método y
condiciones de inmovilización
deberá realizarse en base a la
enzima concreta a inmovilizar
y a la aplicación posterior que
se le va a dar a la preparación
final obtenida.
Otros factores como la
naturaleza del sustrato,
producto o tipo de reactor a
emplear también son
determinantes en la elección
del método de inmovilizacion.
En la siguiente tabla se muestra
un resumen de lascaracterísticas generales de
cada método de inmovilización
(fortaleza del enlace, dificultad,
regeneración del soporte,
validez del método y coste del
proceso), así como de las
propiedades generales de las
enzimas inmovilizadas por
dicho método (actividad
enzimática y estabilidad).
No obstante pueden existir
excepciones a estas tendencias
generales debido a que un
determinado tipo de enzima con
un determinado tipo de soporte
puede originar la aparición de
características especialesdistintas a las esperadas.
Figura 10. Inmovilización enzimática por
entrecruzamiento con glutaraldehído.
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10.-) Elección del método.
La elección a detener en cuenta
las condiciones de la reacción
biocatalizada, el tipo de reactor
que se vaya a utilizar, el tipo de
sustrato que se tenga que ser
procesado y otros factores.
En general, los métodos de
preparación difícil y de mayor
coste proporcionan
biocatalizadores más estables y
duraderos; en cambio aquellos
métodos más sencillos como el
atrapamiento o la adsorción,donde la unión de la enzima
con el soporte es débil, origina
derivados inmovilizados que
presentan perdidas de actividad
y que deben ser repuestos
continuamente. Una vez elegido
el método más conveniente, los
derivados que preparemos
deben estar caracterizadossegún las indicaciones
establecida por el Working onImmobilized Biocatalysis:
11.-) Propiedades de lasenzimas inmovilizadas.
Cuando se inmoviliza una
enzima se producen cambios en
algunas de sus propiedades
como pueden ser la actividad
catalítica o estabilidad térmica
(Brena y Batista-Viera, 2006).
Estas modificaciones puedenser debidas a varios factores. Al
Tabla 5. Comparación entre los distintos
métodos de inmovilización.
Tabla 6. Caracterización de un derivado
inmovilizado.
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interaccionar la enzima con el
soporte de inmovilización
pueden producirse cambios
conformacionales en la
estructura tridimensional de laproteína que afectan a su
centro activo.
Además, las interacciones que
surgen entre el soporte y el
sustrato, ya sean de naturaleza
electrostática, hidrofòbicas o
impedimentos estéricos,
contribuyen a que la interacción
entre la enzima inmovilizada y
el sustrato tengan lugar en un
microentorno diferente al de la
solución.
Todos estos factores actúan
conjuntamente, dando lugar a
la modificación de las
propiedades de la enzima
inmovilizada, y resulta difícil
determinar que factor provoca
un determinada cambio.
12.-) Actividad catalítica.
La actividad catalítica de las
enzimas generalmente se ve
afectada tras el proceso de
inmovilización (García-Gálan etal, 20011). Para que un método
de inmovilización sea útil la
enzima debe mantener su
actividad catalítica tras la
inmovilización, aunque a
menudo esta disminuye.
En algunas ocasiones puede
llegar a perderse
completamente la actividad
enzimática debido a factores
como que: la enzima al
inmovilizarse lo haga de tal
forma que quede impedido el
paso del sustrato al centroactivo, algún grupo del soporte
reaccione con el aminoácido del
centro activo esencial para la
actividad catalítica, ocurra un
cambio conformacional durante
la inmovilización que da lugar a
una forma inactiva o las
condiciones del proceso
ocasiones la desnaturalizaciónde la enzima (Arroyo, 1998).
Cuando la enzima mantiene su
actividad después de la
inmovilización, los cambios
(disminución o aumento de la
actividad enzimática) se deberá
principalmente a efectos
difusionales, electrostáticos,estéricos y/o del microentorno.
13.-) Especificidad por el
sustrato.
Cuando se lleva a cabo la
inmovilización de una enzima la
especificidad por su sustrato
puede cambiar. En general, al
inmovilizar una enzima sobreun soporte polimérico, su
actividad hacia sustratos de
elevado peso molecular
disminuye debido a
impedimentos estéricos,
especialmente en el caso de
inmovilización por
atrapamientos; mientras que si
el sustrato es de bajo pesomolecular no suele observarse
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cambios en la actividad
enzimática tras la
inmovilización .
Una solución para minimizar
estos impedimentos estéricos
es la introducción de un brazo
espaciador o cadena alquílica
de dos a ocho átomos de
carbono entre soporte y
enzima. No obstante, se ha
observado en algunos caso que
la acción de determinas
enzimas inmovilizadas frente a
sustratos de levado peso
molecular esta favorecida
respecto a sustratos de bajo
peso molecular, probablemente
debido a fuerzas atractivas
entre sustrato y soporte de
inmovilización.
14.-) Constantes cinéticas.
Por lo general, las constantes
cinéticas se ven alteras cuando
esta es inmovilizada. El estudio
cinético de la enzima tras la
inmovilización resulta de vital
importancia para comprender
como le ha afectado dicho
proceso y cuáles son sus
características finales.
Hay que tener en cuenta que
las constantes cinéticas
medidas con enzimas
inmovilizadas no son verdades
constantes cinéticas
equivalentes a las obtenidas en
un medio de reacción
homogéneo con enzimas endisolución, sino que se trata de
valores aparentes debido a
efectos de difusión y otros
factores físicos que tiene lugar.
14.1.-) Constante de
Michaelis (K m ).
En muchos casos, el valor de la
constantes de Michaelis, Km,
aumenta tras la inmovilización,
lo que significa que disminuye
la afinidad aparente de la
enzima inmovilizada por el
sustrato. En otras ocasiones, el
cambio producido en el valor deKm debido a la inmovilización es
pequeño o nulo, o incluso
puede llegar a disminuir
ocurriendo aparentemente un
aumento de la afinidad de la
enzima por su sustrato.
Algunas explicaciones dadas a
la modificación de los valoresde Km hace referencia a
cambios conformacionales de la
enzima, interacciones
electroestáticas entre soporte y
el sustrato, adsorción del
sustrato al soporte y
limitaciones en la difusión del
sustrato y/o producto,
especialmente en el caso deinmovilización por
atrapamiento.
14.2.-) Velocidad máxima
(V max ).
Dependiendo al método de
inmovilización escogido y de la
naturaleza del soporte, la
cantidad de enzima
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inmovilizada y su conformación
puede variar afectando así la
velocidad máxima aparente,
Vmax, que muestra dicha
enzima al actuar sobre susustrato. Existen casos en los
que se ha descrito una mejor
de Vmax tras la inmovilización y
en otros muchos se ha descrito
una disminución.
Este parámetro nos da una
información limitada, pues
cuando ocurre un aumento de
Vmax no se puede saber si se
debe a una mayor cantidad de
enzima inmovilizada o a un
aumento de su actividad, por lo
que es difícil establecer
comparaciones entre distintos
métodos de inmovilización o
diferentes soportes.
15.-) Temperatura y pH.
Cuando se lleva a cabo la
inmovilización de una enzima,
estos valores óptimos de
temperatura y pH pueden verse
alterados. Un buen método de
inmovilización será aquel que
permita a la enzima actuar con
una actividad catalítica máximadurante un mayor rango de
temperaturas y pH.
16.-) Estabilidad.
En muchos casos se observa un
incremento en la estabilidad de
las enzimas después de su
inmovilización. Este fenómeno
puede ser debido a una
estabilización conformacional
de la enzima (ocasionada por
una mayor rigidez de su
estructura y prevención de la
disociación de sussubunidades), a la protección
que ejerce el soporte frente a
proteasas del medio, a una
disminución de los problemas
de agregación intermolecular o
a la creación artificial de un
microentorno favorable para la
enzima como resultado de la
inmovilización. Hay diferentesestabilidades dependiendo a la
interacción de algunos factores:
Estabilidad hacia
reactivos.
Estabilidad hacia enzimas
proteolíticas.
Estabilidad Térmica.
Estabilidad operacional. Estabilidad durante el
almacenamiento.
Estabilidad frente al pH
17.-) Aplicación de las
enzimas inmovilizadas.
La inmovilización de enzimas ha
dado lugar principalmente a
aplicación en los campos delanálisis, la medicina, la
industria y el medioambiente.
Entre algunas aplicaciones se
encuentran:
biosensores.
Tratamientos con enzimas
inmovilizadas.
Biocatalizadores
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Referencias:
http://www.bionova.org.es/biocast /documentos/tema14.pdf
https://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&sqi=2& ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.researchgate.net%2Fprofile%2FMiguel_Arroyo%2Fpublication%2F237564145_Inmovilizacin _de_enzimas._Fundamentos_mtodos_y_aplicaciones%2Flinks%2F00
b7d524d21ceec982000000.pdf&ei=fyk8VbOUD8yoNtvygYgC&usg=AFQjCNEPSChoeJQ8yJP4phr_XJnV8Xbyqg&sig2=1NjGbOHfbrpfM9usAd2S7Q&bvm=bv.91665533,d.eXY
http://iqtma.cps.unizar.es//components/com_docman/dl2.php?archive=0&file=SU5NT1ZJTElaQUNJX05fREVfRU5aSU1BUy5wZGY=http://sgpwe.izt.uam.mx/files/use
rs/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzimas.pdf