UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELAFACULTAD DE FARMACIA

MENCIÓN CIENCIA Y TECNOLOGÍADE LOS ALIMENTOS

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Br. Stephany Raquel Suarez RivasCI 19499259

Caracas, a los 22 días de marzo de 2013.

INFORME PRÁCTICA N° 2:

DETECCIÓN DE Salmonella A PARTIR DE PRODUCTOS CÁRNICOS.

1. Metodología1.1 Objetivos:1.1.1 Realizar una revisión bibliográfica de los microorganismos más

importantes de deterioro y/o patógenos, así como indicadores de inadecuadas prácticas higiénicas que pueden estar en carnes, pescados y productos derivados, interpretar su presencia (causa y significancia) y correlacionarla con el método de procesamiento aplicado a cada producto.

1.1.2 Realizar análisis microbiológico de las muestras de carne, a través del método convencional utilizando las técnicas de detección, aislamiento e identificación para Salmonella.

1.2 Metodología:Se utilizó el método establecido en la Norma Venezolana FONDONORMA 1291:2004 Aislamiento e identificación de Salmonella en alimentos.‘Para el aislamiento e identificación de Salmonella spp en alimentos se requieren etapas sucesivas debido a que el microorganismo se encuentra en bajo número, debilitado por los procesos tecnológicos o por la presencia de flora acompañante.’Se procedió como se indica a continuación:

1.2.1 Pre-enriquecimiento:Se pesó asépticamente 25g de una muestra de carne en una bolsa estéril y se le agregó 225mL de caldo lactosado, se mezcló en el Stomacher® durante 30 segundos y se incubó durante 24 horas a una temperatura de 35 ± 2°C.

1.2.2 Enriquecimiento:A partir del cultivo proveniente del pre-enriquecimiento se transfirió 1mL del cultivo a Caldo Tetrationato y 0,1mL del cultivo a Caldo Rappaport-Vassiliadis y se incubó ambos cultivos durante 24 horas a una temperatura entre 35-37°C.

1.2.3 Aislamiento:A partir de Caldo Tetrationato (serie 1) se aisló a:

Agar Bismuto-Sulfito denominándose ésta: placa 1A. Agar Hektoen-Entérico denominándose ésta: placa 1B. Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato denominándose ésta: placa

1C.A partir de Caldo Rappaport-Vassiliadis (serie 2) se aisló a:

Agar Bismuto-Sulfito denominándose ésta: placa 2A. Agar Hektoen-Entérico denominándose ésta: placa 2B. Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato denominándose ésta: placa

2C.

Todas estas placas se incubaron en posición invertida a una temperatura entre 35-37°C durante 24h.

A partir de las colonias que crecieron se inocularon en agar nutritivo y se incubó a 35 ± 2°C durante 24 horas y a partir de estas se realizaron las pruebas bioquímicas correspondientes a la identificación.

1.2.4 Identificación:A partir de los cultivos en agar nutritivo se realizaron las pruebas bioquímicas para la identificación de Salmonella las cuales constan de:Pruebas preliminares:

Cultivo en agar Triple-Azúcar-Hierro (TSI): Se transfirió un inóculo con filamento realizándose un estriado en el bisel y luego punción.

Cultivo en agar Lisina-Hierro (LIA): Se inoculó con punción del filamento en el agar.

Se incubaron ambos tubos a una temperatura entre 35-37°C durante 24h.

A partir de los tubos positivos se continuó con la batería de pruebas tinción de Gram, pruebas bioquímicas y pruebas serológicas.

Pruebas confirmatorias:

Cuando se obtiene por lo menos un resultado positivo (sospechoso de Salmonella) para alguna de las pruebas en agar TSI o en agar LIA se continúa con el resto de las pruebas.

Prueba morfológica:

Tinción de Gram: A partir de los cultivos positivos en agar TSI, se procedió a realizar la tinción de Gram.

Pruebas bioquímicas:

Ureasa: Se inoculó una asada del cultivo en agar TSI en caldo Urea. Se incubó a una temperatura entre 35-37°C por 24-48h y se revelaron los resultados.

Lisina-Descarboxilasa: Se inoculó una asada del cultivo en agar TSI en caldo Lisina-Descarboxilasa. Se incubó a una temperatura entre 35-37°C por 24-48h y se revelaron los resultados.

Caldo Dulcitol Rojo Fenol: Se inoculó una asada del cultivo en agar TSI en caldo Dulcitol Rojo Fenol. Se incubó a una temperatura entre 35-37°C por 24-48h y se revelaron los resultados

Caldo Triptonado: Se inoculó una asada del cultivo en agar TSI en caldo Triptonado. Se incubó a una temperatura entre 35-37°C por 24-48h y se revelaron los resultados con la adición de entre 0,2-0,3mL del Reactivo de Kovacs.

Caldo Malonato: A partir de los tubos positivos de caldo Triptonado se inoculó una asada en caldo Malonato. Se incubó a una temperatura entre 35-37°C por 24-48h y se revelaron los resultados.

Pruebas serológicas:

Prueba serológica polivalente somática (O):Se preparó una lámina portaobjeto con una asada del cultivo proveniente del agar TSI y una gota de solución fisiológica y se le añadió una gota de antisuero polivalente somático (O). Esta prueba se revela inmediatamente.

Pruebas bioquímicas/ serológicas

Resultado positivo Resultado negativo

Ureasa Coloración rosa pálida

Sin cambio de color

Lisina-Descarboxilasa Coloración morada (sin cambio de color)

Coloración amarilla

Dulcitol Rojo Fenol Coloración amarilla y/o gas

No gas, no se observa cambio de color

Indol Anillo color rojo Anillo color amarillo

Malonato Coloración azul No hay cambio de color

Antígeno somático (O)

Aglutinación No aglutinación

Tabla 1.1. Interpretación de los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas y serológicas.

2. Resultados y discusión

Generalmente, cuando hablamos de calidad de un alimento debemos considerar el aspecto microbiológico que resulta fundamental porque influye en la conservación y la vida útil del producto, pero además, porque los microorganismos pueden ser causantes de enfermedades conocidas como enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA´s) cuyas siglas en inglés es FBI (Foodborne illness).

De tal manera que, para garantizar inocuidad del alimento, se requiere la determinación de criterios para los microorganismos patógenos y/o toxinas y en algunos casos la utilización de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un patógeno). Por eso, su detección en los alimentos es de vital importancia.

Entonces, es necesario conocer las normas microbiológicas en materia de alimentos, quienes establecen la calidad microbiológica en términos de ciertos microorganismos que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de presencia de patógenos en alimentos. Estos microorganismos indicadores tienen la ventaja de que su detección puede resultar adecuada desde un enfoque de prevención de riesgos, indicando un manejo inadecuado o presencia de contaminación. También, su detección puede resultar más sencilla, rápida y económica, pudiendo brindar información de manera oportuna. Los microorganismos indicadores se pueden dividir en dos grupos:

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso que incluyen:

Mesófilos aerobios (o cuenta total) Hongos y levaduras Coliformes totales

Indicadores de contaminación fecal:

Coliformes fecales E. coli Enterococos Cl. perfringens (Andino, 2010)

A continuación se anexa una lista de microorganismos patógenos, modo de contaminación que se encuentran asociados a alimentos cárnicos y derivados.

Microorganismo

Modo de contaminación

Alimentos típicos

Bacillus cereus De la tierra o del polvo

Productos cárnicos, sopas, salsas, vegetales

Clostridium botulinum

Tipos A y B: de la tierra o del polvo; Tipo E: del agua y sedimentos

Tipos A y B: vegetales; frutas; productos cárnicos, avícola y de pescado; condimentos; Tipo E: pescado y productos de pescado

Campylobacter jejuni

Pollo, leche cruda (no pasteurizada)

Alimentos de origen animal, infectados

Vibrio cholera Heces humanas en el entorno marino

Mariscos crudos o mal cocinados

Clostridium perfringens

De la tierra , alimentos crudos

Pollo y carne de res cocidos

Escherichia coli Ganado infectado, contaminación fecal humana, directa o a través del agua

Carne de res cruda o mal cocida, leche cruda

Salmonella spp Alimentos de origen animal, infectados; heces humanas

Huevos crudos, mal cocinados: leche, carne y pollos crudos

Shigella spp Contaminación fecal humana, directa o a través del agua

Alimentos crudos

Staphylococcus aureus

Operarios con resfríos, dolor de garganta o cortadas que están infectadas, rebanadoras de carne

Jamón, productos cárnicos y avícola, pastelería rellena de crema, mantequilla batida, queso

Streptococcus Operarios con , Leche cruda,

pyogenes dolor de garganta y otro tipo de infecciones por estreptococos

huevos "endiablados"

Vibrio parahemolyticus

Entorno marino de la costa

Pescado y mariscos

Vibrio vulnificus Entorno marino de la costa

Ostiones y almejas crudas

Yersinia enterocolítica

Animales infectados, especialmente cerdos; aguas contaminadas

Carne de res y puerco cruda o mal cocida, tofu empacado en agua de manantial

Tabla 2.1. Principales microorganismos asociados a enfermedades de transmisión alimentaria de productos cárnicos y derivados. Tomado y modificado de Andino F., Castillo Y. Curso Microbiología de los alimentos. Universidad Nacional de Ingeniería. Estelí, 2010.

Caldo ResultadoCaldo Tetrationato CrecimientoCaldo Rappaport-Vassiliadis CrecimientoTabla 2.2. Resultados del crecimiento en los medio de enriquecimiento.

Medio de cultivo (Origen) Resultado obtenidoBismuto Sulfito (Tetrationato) 1-A Sin crecimiento microbianoHektoen entérico (Tetrationato)1-B

Crecimiento de colonias color naranja a salmón

XLD (Tetrationato) 1-C Crecimiento de 2 colonias una color amarillo y otra color crema

Bismuto sulfito (Rappaport) 2-A Sin crecimiento microbianoHektoen entérico (Rappaport) 2-B Crecimiento de colonias color verde

brillanteXLD (Rappaport) 2-C Crecimiento de 2 colonias una color

amarillo y otra color cremaTabla 2.3. Resultados del crecimiento en medios de cultivo diferenciales.

Imagen 2.1. Izquierda crecimiento en la placa 2-B, se evidencia crecimiento de colonias verdes. Derecha crecimiento en placa 2-C se evidencia crecimiento de colonias colores amarillo y crema.

Medios de Cultivo Características típicas de las colonia de Salmonella*

Agar Bismuto-Sulfito (BS) Colonias planas, marrones o grises a negro, con o sin brillo metálico

Agar Hektoen Entérico (HE) Colonias azul verdosas ó azules, con ó sin centro negro

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)

Colonias incoloras o ligeramente rosadas, con o sin centro negro

Agar Rambach Colonias rojas

Agar EF-18 Colonias verdes, azules o verdes azuladas.

Agar Xilosa-Lisina-Tergitol 4 Colonias negras o rojas con centro negro

* Las colonias atípicas mostraran diferentes características en los medios

diferenciales

Tabla 2.4. Características típicas de las colonias de Salmonella en medios de cultivo diferenciales. Tomado de: Sánchez, J. DETECCIÓN DE SALMONELLA A PARTIR DE PRODUCTOS CÁRNICOS. 2013.

A partir de las colonias color amarillo provenientes de la placa 2-B y 2-C se obtuvieron los siguientes resultados:

Pruebas bioquímica/morfológica/ serológica

Resultado obtenido para ambas colonias

Resultado típico de Salmonella

Agar TSI Agar completamente negro con evidencia de crecimiento microbiano. Positivo.

Bisel rojo, taco amarillo y con/sin formación de precipitado negro.

Agar LIA Positivo. Positivo.Tinción Gram Cocobacilos Gram

negativosCocobacilos Gram negativos

Ureasa Negativo NegativoLisina-Descarboxilasa Negativo PositivoDulcitol-Rojo Fenol Negativo PositivoIndol Positivo NegativoMalonato Positivo NegativoPSPS (O) Positivo Positivo

Tabla 2.5. Resultados de la pruebas bioquímicas obtenidas para la detección de Salmonella vs los resultados típicos.

Imagen 2.2.

Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas para detección de Salmonella a partir de la placa 2-C.

Imagen 2.3. Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas para la detección de Salmonella a partir de la placa 2-B.

Tras analizar los resultados obtenidos con lo establecido en las Normas FONDONORMA 1291:2004 se puede inferir que las colonias aisladas no pertenecen a Salmonella en la muestra de carne ya que los resultados, se hace evidente que todas estas pruebas no coinciden con este microorganismo. Sin embargo, estos resultados se pueden ajustar a la presencia de otro tipo de microorganismo como por ejemplo Escherichia coli ya que por lo reportado en la bibliografía este microorganismo puede crecer en agar Hektoen entérico produciendo colonias verdes, es un bacilo Gram negativo, es ureasa negativo, produce indol, es malonato positivo, pero no se puede confirmar que sea E. coli ya que sería necesario realizar las respectivas pruebas bioquímicas.

3. Conclusiones

Se consiguió información de los microorganismos más comunes causantes de contaminación en los alimentos cárnicos y derivados.

A pesar de que los resultados obtenidos indican ausencia de Salmonella, se cumplieron los objetivos de aislamiento e identificación de microorganismos de los que se sospechaba podían serlo. Sin embargo, no se puede aprobar el consumo de este alimento hasta tanto no se realicen más pruebas que descarten otros microorganismos patógenos como por ejemplo Escherichia coli ya que se ha reportado en la bibliografía que este microorganismo puede crecer en estos medios.

4. Bibliografía4.1 Andino F., Castillo Y. Curso Microbiología de los alimentos.

Universidad Nacional de Ingeniería. Estelí, 2010.4.2 Guía de interpretación de resultados microbiológicos de alimentos.

ANMAT. Disponible en: http://www.anmat.gov.ar/alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbiologicos.pdf

4.3 http://biotaetscientia.wordpress.com/2011/06/15/pruebas-microbiologicas-para-e-coli/

4.4 https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de- microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/ureasa

4.5 http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/ catedraMicro/lisina.pdf

4.6 Norma FONDONORMA 1291:2004. Aislamiento e identificación de Salmonella en alimentos. Disponible en: http://www.sencamer.gob.ve/

4.7 Sánchez, J. DETECCIÓN DE SALMONELLA A PARTIR DE PRODUCTOS CÁRNICOS. 2013.