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INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

,/NOMBRE ASESORES:

Sánchez Pérez .\linema

9033710 I

Ingenieria Bioquimica Industrial ünidnd lztapalapa

/División: Ciencias Biológicas y de la Salud

TELEFONO PARTICULAR: 796 11 79

T R I M E S T R E LECTIVO: 96-0

HORAS SEMANA: 20 horas.

Y T í T U L O DEL TRABAJO: EFICIENCIA BIOLOGICA Y P R O D U C C I ~ N

DE CELULASAS DE: Pleurofus osfreatus

CULTIVADO EN PAJA DE AMARANTO.

M. en B. Rnfnel G. Campos Montiel Profr. Titular Depto. Biotecnología

Profr. Titular "A" Depto. Biotecnologia.

Químico José María Barba C h f v a .

LUGAR REALIZACIÓN:

FECHA DE INICIO:

Lnborntorios R-109 y I 1 1, IIAM-I.

03 de hlnyo de 1996.

/FECHA DE TERMINACIÓN: 18 de hovirmbre de 1996 1 C I A V E :

I " . 31.B. Rafael G. Campos hl.

A I u m n n A s e s o r ' A s e s o r

DESARROLLO DEL TRABAJO

EFICIENCIA BIOL~GICA Y PRODUCCI~N DE CELULASAS DE: Pleurutus ustreatus CULTIVADO EN

PAJA DE AMARANTO I

GENERALIDADES D E LA S ENZIMAS

Las enzimas son catahizndores biológicos de naturaleza protidica que intervienen en todas las reacciones metabólicns energéticamente posibles, que ellas aceleran por activación específica. Permiten alcanzar rápidamente el estado de equilibrio de la reacción sin modificarlo. Son las llaves útiles de Is biotecnología y la bioindustria. Son ellas las que en In ingeniería microbiológica, entalizan las reacciones metab6licas puestas en juego y aseguran su regulación. Son ellas igualmente las que conducen la ingenieria genética para r u l b r las modificaciones del equipamiento enzimático de ciertos microorgrnismos con vista a hacerlos aptos para la biosíntesis de metabolitos interesantes.

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L a s celulasas pertenecen a la clase de las Bidrolasas, actúan sobre la celulosa, que w un complejo polisrdrido, parecido al almidón, pero constituído por unidades de Dglucosa a travb de un enlace acetal (enlace glueosídico p-1-4); su hidrólisis es también gradual hasta el término del disacándo eelobiosa, el cual finalmente se resuelve en glucosa por influencia de Is P-glucosidasa.

L a celulosa existe en las plantas superiores, en lar algas, en muchos tipos de hongos y en los quistes de algunos protozoanos. El polisadrido está localizado en la pared celular donde se encuentra no como cadenas simples sino como unidades submicroscópicas en forma alargada conocidas como micelas. A su vez, estas niicelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas. En la pared celular, la celulosa probablemente está organizada en unidades discretas separadas por un espacio, el cual, en el tejido maduro de Ins plantaa está comúnmente lleno de ligninn.

La utilhci6n biológica de la celulosa puede Ilevane a cabo d e d e temperaturas cercanas al punto de congelaci6n. hasta alrededor de los 65 OC.

En vista de que la celulosa es poco aprovechable como tal. las poblaciohes se desarrollan lentamente; por esto la desaparición de la celulosa purificada no es rapida.

La celulasa se encuentra en las plantas (semillas de cerenles. Aspergillus O w e , etc.) y tambitn en ciertos animales (jugo intestinal de caracoles, orugas)

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L a celulasa es un complejo enzimático de por lo menos dos enzimas Ci y Cx, es la enzima que reduce las uniones entre las cadenas de celulosa abriendo la estructura cristalina convirtiéndola en amorfa y/o reactiva. Cx (endo y exo glucanasas) hidrolizan la celulosa más reactiva eliminando las unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores (ero) y por rompimiento aleatorio de cadenas largas (endo). Cx actua en la celulosa cristalina generando extremos libres susceptibles al ataque enzimático. Ci es una enzima que hidroliza los extremos reactivos producidos por la acción de Cx, este tipo de enzima se encuentra ampliamente distribuida entre hongos, bacterias y actinomicetos.

Se considera a la solución de la enzima como de un solo componente y las distintas actividades catalíticas aparecen cuando la celulosa es absorbida en diferentes porciones de la matriz celulosa, se dice que la enzima que rompe las uniones cristalinas tiene una forma compleja de Cl + Cx y Cl ó Cx actúan en el paso de la Iiidrólisis para la produccih de azúcares reductores.

MED~CIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Como la celulasa es un complejo de enzimns, muestran varios tipos de actividades, la celulosa incluye formas cristalinas de altn resistencia tales como el algodón, varios tipos de celulosa micr,ocristalina tales como Avicel, hidroccluloru, pulpas de soltito como solka floc, así como papel filtro y fibras de algodón.

Muchos sustratos susceptibles incluyen celulosas reprecipitadas y celofán. L a mayoría son derivados solubles tales como: carboximetilcelulosa y sulfato de celulosa. Existen muchos métodos de ensaye para detectar o medir la actividad de las celulasas, todos tienen diferente sensibilidad en IR deteccibn de componentes de celulasa dependiendo del sustrato empleado, el efecto medido, In duración y las condiciones de ensayo.

Los principales métodos incluyen los pasos siguientes:

a) Reducción en viscosidad de unn solución derivada de celulasa. Este método mide la acción de la P-glucanasa, independiente de la acción de Ci.

b) La producción de azúcares reductores, de derivados solubles de celulosas. Este método también mide la acción de la P-glucanasa, independiente de Ci.

e) Producción de azúcares reductores o ptrdida de residuos de alto peso de la celulosn sólida; este método mide la acción combinada de Ci y O-glucanasa. Usualmente el algodón se considera que tiene más sustrato resistente y el mejor indicndor de la acción de Ci.

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d) Reducción de la Densidad Óptica (absorbancia) de una solución de celulosa o suspensión. Con hidrocelulosa como sustrato este método se usa para medir Ci. Es probable que la B-glucanasa sea también requerida para este efecto.

e) Medición de la disminución de la actividad claramente definida por la reducción en los rompimientos de las fibras de hibo tela, estambre de algodón, maceración de papel filtro y microfragmentación de micelas de celulosa.

Todos los métodos mencionados son basados en una hidrólisis con periodos relativamente cortos y con reacción limitada por la enzima o por una porción accesible del sustrato de celuljsa.

L a enzima puede estar muy diluida, esto dificulta la exploración de valores obtenidos para predecir la degradación. Para papel filtro en una hora a 50°C y pH 4.8. El tiempo es corto, el pH y temperatura son Óptimos y el papel filtro como sustrato, tan susceptible como la pulpa de sulfito de celulosa. El algodón tambien es resistente y el carhoximetilcelulosa también es susceptible a esta medición de la actividad. El papel puede str cortado en tiras eliminando el trabajo de cortar moléculas de alto Peso Molecular. El contacto de las tiras de papel con la enzima en un tubo sin agitación es bueno, no es necesario remover el papel cuando el azúcar se está determinando. Aunque el papel filtro es más susceptible que el algodón, una pequeña preparación de enzimas puede producir niveles significativos de azúcar reductor en una hora. Estos azúcares reductores se pueden cuantihcar posteriormente con el método del Acido dinitrosalicilico (DNS).

CWÉTICA ENZIMÁTICA

Por ser las enzimas los catalizndores empleados por los seres vivos en una mayoría de reacciones, es de gran importancia conocer cuáles son las leyes que rigen la cinética de estos biocatalilzadores y quC variables afectan In velocidad de reacción, p u u cae conocimiento permitirá disefiar y operar procesos enzimáticos. Cuando una molécula de sustrato se ha difundido huta la vecidad de la enzima, Csta es detenida y itraida por diferentes grupos4 Las cadenas salientes de aminoácidos la atraen al mismo tiempo que otros grupos pueden atraer otra porción de esa misma molécula, lo que puede causar Ir ruptura de alguna unión u otros cambios en la molécula. A lo anterior lo conocemos como reacción enzimática, ya que los sitios activos de una enzima pueden catalimr una reacción química convirtiendo una molécula en otra. La cinética de una reaccián puede indicar la forma en la que la actividad de In enzima se regula in vivo. Dada la compleja naturalari de la enzima y del fenómeno enzimático en sí, no es de extrañar que muchos parámetros afecten la velocidad de reacción. Entre los más importantes están: temperatura, pH, tiempo y sustrato.

EFECTO D E LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Generalmente al aumentar la temperatura aumenta también la velocidad de reacción química. El coeficiente de temperatura de una reacción, expresado por el valor Qio. es el cociente entre la velocidad a una temperatura t + lo", y la relativa a la temperatura to. Qlo tiene valores comprendidos en la región de 2. Las reacciones enzimáticas difieren del resto de las reacciones químicas en que el incremento de velocidad debido a la temperatbra ceso al llegar a los 45 Ó 50 debido a la destrucción o desnaturalización de las proteínas enzimáticas por efecto del calor. En consecuencia el valor de Qio para una enzima al llegar a los 40-50 O suele ser generalmente mucho menor que 2.

Un aumento de la temperatura puede producir un aumento en la velocidad total de una reacción enzimdtica de varias formas. Por ejemplo, la velocidad de combinación del enzima con su substrato, se puede favorecer, o sea aumenta k+i, o la velocidad de desdoblamiento del complejo substrato-enzima en los productos de reacción se puede estimular, o sea aumenta k+% L a afinidad de la enzima para un coenzima o activador se puedk aumentar debiendo tener la temperatura un efecto sobre la ionización y las funciones de pH de alguno o de todos los componentes de la reacción. A pesar de la aparente complejidad de los efectos de la temperatura, están sujetos, no obstante, el análisis experimental si se eligen condiciones adecuadas. Arrhenius, en 1899, propuso la relación siguiente entre la velocidad de reacción y la temperatura:

- d l n k = E dt R V

en donde: k = constante de velocidad R = constante de los gases T = temperatura absoluta E = constante llamada Energía de Activación.

L a Energía de Activación para sustratos está en el rango de 4,000 a 2,000 caümol, y de 40,000 a 160,000 caümol para las enzimas.

Integrando la expresión:

In k =-E + Cte. RT

En la gráfica se muestra que a medida que aumenta la temperatura aumenta la velocidad de reacción y la estabilidad de la enzima disminuye por inactivación tCrmica, como ya se mencionó anteriormente.

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El término "temperatura Óptima'' es inadecuado y puede ocasionar errores, a menos que se interprete como la temperatura Óptima para un conjunto particular de parámetros.

EFECTO D E L pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZlMATICA

El grado de ionización de los residuos de aminoácidos en la superfície de la enzima está en función del pH del medio, por lo que de nuevo se obtiene una curva de tipo campana al graficrr la velocidad de reacción contra el pH, aunque las condiciones de reacción infiuyen en ella mucho menos que en el caso anterior. El factor que más influye en la titulación de los grupos ionizables que mantienen la carga en la superficie, actúan en el sitio activo o estabilizan la enzima; cualquier modificación del o debida al pH altera estas condiciones; se puede decir, pues, que existe un pH Óptimo para la enzima. Las ionuaciones del sustrato o del producto deben considerarse también, p¿es pueden afectar la velocidad de reacción. El efecto del pH puede proporcionar una información valiosa respecto a la naturaleza de la enzima y al sitio activo en particular, lo que constituye información sobre el mecanismo de reacción.

GENERALIDADES DE LA PLANTA Amaranthus

El amaranto pertenece a la familia Amnranthacene, es una planta que posee caracteristicas agron6mico-alimentarías altamente prometedoras, además de ser muy versátil ya que se puede usar como grano, verdura o forraje.

El amaranto es una planta de crecimiento rápido y es una de lu pocas upeeies que sin ser pasto utiliza la ruta C4 para la fijación del carbono. Es una planta que soporta condiciones climáticas muy fuertes: Se adapta ratifactorinmente a altitudes elevadas. Puede crecer en climas calientes y templados donde el suministro de agua escasea y es altamente tolerante a condiciones hidas y suelos pobres, condiciones bajo las cuales los cereales tienen poca opción de desarrollarse.

GENERALIDADES DE LOS HONGOS

Los hongos son plantas criptógamas (del griego kripfus, oculto, y genios, matrimonio) pertenecientes al tipo de las talofitas, y que se diferencían de las algas por carecer de clorofila. Esta característica, impide a los hongos el poder formar hidratos de carbono a partir del C02 atmosférico (igual que sucede a los animales), por lo que han de tomarlo de las complejas combinaciones orgánicas, sean vegetales o animales. vivos o muertos. Cuando los hongos toman las sustancias orgánicas que necesitan de un ser vivo, se les llama parhitos, y si el sustrato carece de vida, se lu llama sapr6fitos; al no realizar la función clorofílica, pueden vivir en ausencia de la luz.

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El papel de los hongos en la naturaleza es de la mayor importancia, y en SU desarrollo pueden utilizar como alimento cualquier resto orginico sin valor que desintegran hasta reducirlo a productos inorgánicos.

Otra caracteristica de los honaos Y común a todas las talofitas. es la de estar - - formados por un conjunto de células semejantes e indeferenciadas y ser incapaces de formar teiidos, lo oue nos lleva a la conclusión de considerarlos como una masa celular " o falso tejido, que se denomina nriceliu.

Las talofitas carecen de raiz, hojas y flor; el talo o micelio es el encargado de realizar todas las funciones, y está constituído por un conjunto de filamentos (hifas) unicelulares o pluricelulares, que penetran en el sustrato para tomar los alimentos.

AI hablar de hongos o de setas debemos distinguir que hongo es toda la planta, y seta la parte que suele comerse (portadora de los Órganos de reproducción), y que recibe los nombres de cuerpo fructífero, carpóforo o aparato esporifero; entre hongo y seta existe la misma diferencia comparativa entre árbol y fruto.

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Como ya se mencionó, I4 seta dejada en el terreno, una vez alcanzada su plena madurez, emite un polvillo constituido por pequerías células, Ins esporas (semillas). Las esporas tienen carácter masculino y otras femeninas. A veces las esporas maduran en el ápice de los soportes llamados basidios, otras dentro de unos saquitos llamados ascos. Basidio significa base, soporte; y asco significa odre. Los hongos provistos de basidio se reúnen en la clase de los Basidiomicetos, y los provistos de ascos, Ascomicetos.

El hongo Pleurofus usfreafus es un basidiomiceto del orden Agaricales, recibe el nombre de oreja u oreja de cazshuate en MCxico debido a su formación (estructural) en forma de una oreja. Puede ser cultivado en un medio preparado con materiales celulósicos, como fragmentos de papel, aserrin de pino o de encino, o coa paja de gramineas y harina de frijol; también es cultivado en troncos de árboles muertos y en una variedad de desperdicios agricolas lignocelulósicos, los cuales contienen aproximadamente 60 a 70% de celulosa y 15% de lignina sin que su necesario efectuar una fermentación previa y otro tipo complicado de preparación química o biológica. El P/eurofus no puede crecer en sustratos preformador (como el caso del cultivo de Agaricus) por su alto contenido de nitrógeno. El Pleurofus tiene la peculiaridad de crecer en sustratos bajos en contenido de nitrógeno y desarrollar cuerpos fructiferos con alto contenido de nitrógeno.

O B J E T I V O S

DeterminarJa factibilidad de uso de la paja de amaranto como sustrato para la produccion del basidiomiceto celulolitico Pleurufus osfreafus.

M E T O D O LOG í A U T I L I Z A D A

J Propagación del microorganismo

El microorganismo se produjo por el hongo Pleurotus osfreatus en paja de amaranto. L a cepa utilizada fue Pleurotus osfreatus UAM-I(I), de la colección de cepas del Departamento de Biotecnoiogia de la Universidad Autónoma Metropolitana.

J Obtención del extracto enzimático

Conforme el hongo creció, se tomaron muestras, desde la formación de primordios a la formrición de los cuerpos fructíferos. Cada muestra se secó inmediatamente a temperatura ambiente y se molió. Posteriormente se colocó 1 g. en un vaso de precipitados con 50 ml. de agua desionizada y se homogeneizó durante 5 minutos. Se filtró sobre algodón y el filtrado se usó como extracto crudo enzimático.

Estimación de Is actividad enzimática I

Las actividades enzimaticas se caracterizaron del extracto crudo enzimatico, preparado en el paso anterior. Una Unidad Internacional (UI) se define como la cantidad de enzima (Endoglucanasa 6 Exoglucanasn) que catalizn la formación de 1 p o ü m i n de producto en condiciones determinadas.

Se determin6 el efecto del pH, Temperatura y Sustrato en la Actividad Enzimática.

* Determinación de la Endoglucanasa (con CarboxiMetilCelulosa como sustrato)

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO

CarboxiMetilCelulosa al IVo, disolviendo 0.5 g. en 50 ml. de buffer; también se

Buffer de fosfatos p H 4, disolviendo 5.04 g de HNnzP04 y 3.01 g. de H2KPO4

Bufler de aeetatos p H 5, disolviendo 3 ml. de Pcido acético y 8.7 g. de acetato

Buffer de fosfatos pH 6, disolviendo 2 g. de HK2P04 y 8 g. de H2KP04 en 1

Buffer de fosfatos p H 7, disolviendo SO0 mg. de HNaPO4 y 301 mg. de

Buffer de fosfatos pH 8, disolviendo 16.73 de HK2PO4 y 0.523 g. de ii2KPO4

Buffer pH 9, disolviendo 1.24 g. de ácido bónco y 180 ml. de agua, se aiiadió

Se preparó:

prepararon diluciones 0.0005,0.005,0.05,0.5 y 5%.

en 1 litro de agua desioniznda.

de sodio en 1 litro de agua desioniznda.

litro de agua desionkda.

H2KP04 en 1 litro de agua desioniznda.

en 1 litro de agua desionizada.

NaOH 1 M. hasta pH 9 y se diluyó con agua desioniznda hasta 200 ml.

... .

EFECTO D E L pH

Para determinar el pH Óptimo, se colocó 1 ml. del extracto enzimático en un tubo de ensayo, se añadió 1 ml. del sustrato (CMC) disuelto en cada una de las soluciones buffer correspondiente y se incubó en un baño de temperatura controlada a 50 "C durante 30 min.

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Para determinar la Temperatura Óptima, se colocó 1 mi. del extracto enzimático en un tubo de ensayo, se añadió 1 ml. del sustrato (CMC) disuelto en el buffer donde se encontró mayor actividad enzimática (del ensayo anterior) y se incubó en un baño de temperatura controlada a diferentes temperaturas (30, 40, 50, 60 y 70 "C) durante 30 min.

Los ensayos se hacieron por triplicado, corriendo paralelamente en cada caso dos testigos que contienen 1 ml. del sustrato correspondiente y 1 ml. de agua desionizada.

* Determinación de la Exoglucanasa (con Papel Filtro como sustrato)

EFECTO DE LA C O N C E N T R A C l O N DE SUSTRATO

Se preparó: El papel filtro se cortó en rectángulos, para obtener pesos de 0.0005, 0.005.

Se usaron las mismas soluciones buffer preparadas en el ensayo anterior.

EFECTO D E L pH

Para determinar el pH óptimo, se colocó 1 ml. del extracto enzimático en un tubo de ensayo, se aiiadió 1 ml. de cnda una de las solucione buffer correspondiente se añadió un rectángulo de Papel Filtro y se incubó en un baño de temperatura controlada a 50 "C durante 90 min.

0.05 y 0.1 g. .

EFECTO D E LA TEMPERATURA

Para determinar la Tempernturn Óptima, se colocó 1 ml. del extracto enzimático en un tubo de ensayo, se añadió 1 ml. de buíier donde se encontró mayor actividad enzimática (del ensayo anterior), se añadió un rectángulo de Papel Filtro y se incubó en un baño de temperatura controlida a diferentes temperaturas (30,40,50, 60 y 70 "C) durante 90 min.

Los ensayos se hacieron por triplicado, corriendo paralelamente en cada caso dos testigos que contienen 1 ml. del buíier correspondiente con su Papel Filtro y 1 ml. de agua desionizada.

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En ambos análisis (Endo y Exo) se estimron las actividades por la liberación de azúcares reductores por el método de DNS.

Método de Cuantificación de Azúcares Reductores IDNS)

Fundamento: En presencia de calor, el ácido 3,5-dinitrosalicílico se reduce a acido 3-amino-5-nitrosalicílico por los azúcares reductores presentes, desarrollándose color amarillo-café. L a Densidad Óptica se lee en el espectrofotómetro a una X =575 nm. Y se conoce la concentración de azúcares reductores presentes interpolando en una Curva Patrón de Glucosa, graficando Absorbancia contra Concentración, expresando rl final la actividad en Uylitro.

Altas concentraciones de proteínas interfieren en la determinación. El color final desarrollado es estable durante 24 hrs., además es un método sencillo y rapido. L o s reaciivos: 3,5-dinitrosalicílico y fenol son costosos.

Interferencias, Ventajas y Desventajas:

Metodología:

Preparación de reactivos:

Disolver 2.5 g. de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), 2.5 g. de NaOH, 0.125 g. de NazSOi, anhidro y 0.5 8. de fenol en 100 ml. de agua destilada. Aforar a 250 ml. (Guardar en frasco color ámbar).

Soluci6n pátron:

concentración de lg/l.

Preparación de la curva patrón (por duplicado):

T U B O SOLUCION PATRON A G U A DESIONIZADA CONCENTRACION

Disolver 0.25 g. de glucosa en 250 ml. de agua deaionhda, para tener una

(mi.) (mi.) (m%i)

0.0 2.0 0.0 0.5 1.5 62.5 1 .O 1.0 125.0 1.5 0.5 187.5 2.0 0.0 250.0

- AdicionPr a cada uno de estos tubos 4.5 ml. del Resctivo del DNS.

LLevar a un baño de agua en ebullición durante 5 minutos exactamente. Agitar en vórlex.

* Enfriar en hielo. ,I Leer la absorbancia a 575 nm. ajustando a cero con el tubo No. 1 (blanco). * Tratar a las muestras problema de igual manera que la curva patrón.

Nota: Si las lecturas en el espectrofotómetro son mayores de 0.6 de absorbancia, repetir la determinación diluyendo la muestra.

Los resultados se expresaron en Unidades internacionales por Litro (VIA).

J Análisis Químico.

Este estudio consistió en análisis de: Proteína (Nitrógeno por el método de Kjeldhal), Fibra, Cenizas y Humedad.

Método de Cuaiitificación de Proteína

L a determinación de proteína por el método de Kjeldahl está fundamentada en el hecho de que el macronutriente es el que contiene nitrógeno en mayor cantidad, de tal manera que la determinación de nitrógeno orgánico total es muchas veces un estimador del contenido total de proteína (en la que se incluyen polipéptidos y aminoríeidos). El método se basa en la completa conversión de todas las formas de nitrógeno a una sal inorgánica de amonio. De tal manera que el punto final del an$lisis involucra la determinación de este producto.

Metodoiogía:

3 Digestión. Se colocó en un matraz Kjeldahl de 100 ml., 0.3 g. de In muestra (previamente envuelto en papel arroz libre de Nitrógeno). Se añadieron 5 ml. de ácido sulfúrico concentrado, 2.6 ml. de sulfato de sodio, 0.1 g. de sulfato cúprico y 6 perlas de Sdenio. Posteriormente en una campana de extracción se colocó el matraz en un digestor Kjeldahl en donde se digiere la muestra aproximadamente 3 boras hasta que el líquido del matraz quede transparente. Se movieron los matraces para que el calentamiento sea homogéneo, usando guantes pues las temperaturas alcanzadas son muy elevadas. Precaución: los vapores liberados son muy tóxicos.

3 Destilación. El contenido del matraz Kjeldahl se vació al destilador, se agregaron 15 ml. de una solución de Hidróxido de Sodio 10 N, y se puso a funcionar el aparato. Se colocó el tubo terminal del refrigerante del aparato destilador dentro de un vaso de precipitados de 50 mL con 10 ml. de solución boratada al 4% y 3 gotas de indicador (rojo de metilo-azul de metileno). Se colectaron aproximadamente 30 ml. d e destilado.

=> Titulación. El destilado se tituló con una solución de ácido clorhidrico 0.02 N (previamente valorado) con carbonato de sodio 0.02 N (patrón primario) y usando verde de bromocresol como indicador.

El experimento se hizo por triplicado, corriendo paralelamente un testigo sin

El contenido de Nitrógeno total en la muestra se calculó: muestra, sólo con el papel arroz..

YO Nz = iml. HCI) 1N HCI) 11.4) I muestra (9) I

donde:ml. HCI = ( ml. muestra - ml. testigo) de ácido clorhidrico usados en la titulación

N HCI = normalidad del ácido clorhidrico (0.02 N, o el ajustado al valorar con el patrón primario)

1.4 = Factor de corrección

El contenido de proteina se calcula:

'YO Proteína = 'YO Nz 6.25

Método de Cuantifiutción de Fibra

El mttodo del detergente neutro para constituyentes de paredes celulares u un método rilpido para In determinación de la fibra total en alimentos de origen vegetal. Parece dividir la materia seca de los alimentos muy cerca al punto que separa los constituyentes solubles y nutricionalmente disponibles (98Y0) de aquellos que son aprovechables de manera incompleta y dependen de Ir fermentaci6n microbiann.

Se preparó lo siguiente:

0 Solución Detergente Neutro:

a) Agua destilada 1 I. b) Lauril sulfato de sodio U.S.P. 30.00 g. e) E.D.T.A. C.R 18.61 d) Fosfato ácido disódico anhidro, 4.56

e) Tetraborato de sodio decnhidratado 6.81

f) Etilen glicol monoetil, éter, 10 ml.

G.R

C.R

G. purificado.

Í ,

Se preparó poniendo el EDTA y el NazB407.10 €I20 juntos en un vaso de precipitados de 2 litros, añadió algo del agua destilada, calentando hasta disolución, homogeneizando con un agitador magnético; se agregó a esta solución el lauril sulfato de sodio y el etilen glicol monoetil éter. En otro vaso de precipitados, se colocó el fosfato ácido disódico, agregando algo de agua destilada y calentando hasta disolverlo; se añadió esta segunda solución a la primera. Se comprobó que el p H final de esta solución esté entre 6.9 y 7.1.

Metodología:

Se pesaron 0.5 g. de muestra seca y molida en un matraz de bola de 250 ml., se aiiadieron 15 ml. de la solución detergente neutro a temperatura ambiente, 2 ml. de decahidronaftleno.

Se acondicionó el matraz con un refrigerante (reflujo), y se calentó usando un reóstato hasta que el hervor, inmediatamente después se disminuye la temperatura para evitar la formación de espuma. Se ajusta el hervido y se cuida que la muestra no se pegue en el matraz o se queme. Una v a que comenzó a hervir se mantuvo por 1 hora.

El contenido del matraz se filtró en un embudo Buchner usando 250 ml. agua desionizada caliente para recoger los residuos del matraz. Se usó Papel Filtro No. 541 (previamente puesto a peso constante a 70 OC durante 24 horas).

Se dobló el papel cuidadosamente y se secó en estufa a 100 OC durante 24 horas. Se enfriaron en un desecador por 30 minutos y se pesaron.

L o s rendimientos de la fibra detergente neutro recuperada se reportaron como el porcentaje de constituyentes de la pared celular:

?'O Fibra - 100 - { muedtra inicial In) - mu- fi nal (nl* 100) muestra final (9)

Método de Cuaiitificación de Cenizas

El contenido de cenizas corresponde al residuo inorghnico obtenido por incineración de la muestra a altas temperaturas y, se puede decir que estas cenizas contienen todos los minerales de la muestra.

La determinaci6n se realizó de la siguiente manera: Se puso a peso constante un crisol a 100 "C en una estufa, durante 24 horas. Se dejó enfriar en un desecador durante 30 min. y se pesó. DespuCs se colocaron 3 g. de la muestra y se colocó en la mufla a 550 "C durante 24 horas. Se dejó enfriar en el desecador y se pesó. Posteriormente el contenido de cenizas (residuo inorghnico presente en la muestra) se calculó de la siguiente manera:

YO M. O. = Deso crisol chuestra - Deso crisol dcenizas * 100 peso de la muestra

?/O Cenizas = 100 - ( YO Materia Orgánica )

L a cuantificación se hizo por triplicado.

Método de Cuantificación de Humedad

L a humedad de una muestra es perdida por volatilización a causa del calor aplicado. L a determinación de humedad es una de ins medidas analíticas más importantes y más ampliamente usadas; y frecuentemente es indice de estabilidad y calidad.

Se utilizó la determinación por secado en mufla; poniendo a peso constante un crisol a 100 "C en una estufa, durante 24 horas. Se dejó enfriar en un desecador durante 30 min. y se pesó. Despu& se colocaron 3 g. de la muestra y se colocÓ en la mufla a 100 "C por 24 horas. Se dejó enfriar en el desecador y se pesó. El contenido de humedad al final se calculó por diferencia en el peso de la muestra reportándose en porcentaje.

YO Humedad = PCrdidr de DWO (g) 100 ' muestra (g)

L a cuantificación se hizo por triplicado.

A C T I V I D A D E S R E A L I Z A D A S

% Anteproyecto y asesorías. % Conocimiento de TCcnicas, métodos y equipos. % Propagación del microorganismo. % Obtención del extracto enzimátim. % Estimación de actividad enzimática

endoglucanasas exoglucanasas

% Análisis quimico Proteina Fibra Cenizas Humedad

% Análisis de resultados, e interpretación. % Elaboración del Informe Final. 'J+ Presentación en un Congreso Nacional.

O B J E T I V O S Y M E T A S A L C A N Z A D O S

Se cumplió el objetivo de analizar el rastrojo de amaranto para utilizarlo como sustrato para el crecimiento de P. ostreatus, para producción de enzimas (celulasas).

R E S U L T A D O S Y C O N C L U S I O N E S

ANÁLISIS ENZIMÁTICO

10 95.48 21.16 20 29 41

97.12 893.38 67.12 492.86 123.26 342.84

ANALISIS QUíMlCO

O 16.86 83.14 0.041 10 76.77 20 16.81 83.18 77.19 29 6.38 93.6 1 82.98 41 7.07 92.93 92.93

10 O. 158 0.991 20 80.44 0.929 5.808 29 96.83 5.159 32.242 41 97.14 3.999 24.925

E I -

ANALISIS QU¡MiCO

100

80

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O 20 29 41

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O 10 20 29 41

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ANALISIS ENZIMATICO

- 10 20 29 41

Tlempo (dlar)

-X-PAF€LFLTRO Exogúcanara -CMC ádoglucanara - __

AIUAUSJS QLdMlCO

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ANALISIS auhico

I O M 29 41

TIempo (dhr)

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La eficiencia biológica, es decir, la masa de hongos frescos por masa de sustrato seco, fue de 194%. Esta es una de las mas altas reportadas hasta ahora para cultivos de P. ostreutus, comparable con la obtenida (196%) cuando se cultiva en pulpa de café fermentada.

Los resultados obtenidos en la producción de enzimas, muestran que la mayor producción de la actividad de la celulasa Endoglucanasa (ensayada con C.M.C.) fue durante la formación de primordios de fructificación con 893 U1 I L., mientras que la actividad de la celulasa Exoglucanasa (ensayada con Papel Filtro) fue cuando está formado el cuerpo fructífero con 123 U1 / L. .

En el creciniicnto en este sustrato, los analisis quimicos demostraron que el hongo utiliza principalmente el extracto libre de nitrógeno, ya que la fibra detergente neutro permanece casi constante. Se observa que el hongo utiliza mas del 37% de las cenizas del sustrato transformándola en materia organica.

! '

B I B L I O C R A F I A

ALEXANDER, IntroducciOn a la microbiologia del suelo, p.p.163-175

AOAC, (1980), Qnicial methods of analysis of the Association of Analytical chemistry, Published by the Association of Analytical Chemistry, Washington, D.C.

ARORA, D. (1991), Handbook o í Applied Mycology, (Soil & Plants) Vol 1, Ed. Marcel Dekker, Inc., USA.

AUBERT, J., dewadation, Ed. Academic Press.

P. Beguin, J. Millet. (1988), Biochemistrv and genetics o í cellulose

FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS, (1994), México

CALINDO, E., E. Barnazn, Biotecno Iopia. -dea v a menuas, Ciencia y Desarrollo, (1988) 80:21-40.

MART INEZCARRERA , D. (1988). El cultivo de 10s hOñEOS CO mcstibla Ciencia, 39:217-221.

i&on of . . . . MLLLER, G. (1959). ysC of Dinilrorrlievliffor Determ Pcduc inn Su= r, Analytical Chemistry, 31:426-428.

QUINTERO, R (1988). lnpenieria Bioouimica me0 ria Y a D liuciones),Ed. Alhambra pp. 186-188.

SCRlBAN, R (1985). Biotccnoloeia, Ed. El M8nunl Moderno, pp. 242-243.

SEGEL, (19 ), CÍlculos de Bioauiniica, Ed. Acribia, Zaragoza, p.p. 283,356-363

VALMASEDA, M., M. Martinez, A. Martinez, Kinetics of wheat straw solid-state fermentation with Trnntetes versicolor & Pleurotus ostrealus lienin & 00 lvsnccha rid€ Biteration & I> roduetion of related enzvmatic activitieg, Appl Microbio¡ Biotechnol, (1991) 35:817-823

ZOIiAR, K. Lienocellulose Deeradation during Solid-state Fermentation: P/eurolus ustreutus versus Phaneroclraele clirvsos~oriuni, Applied & Environmental Microbiology, Apr.(1992) 1121-1127.

'INIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA & IVlSlON DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE U SALUD DtPAñIAMENTV Dt BlOiECNOlOGlA

México, D. F., a I8 de Noviembre de 1996.

DR. JOSE LUIS ARREDONDO FICUEROA DIRECTOR DE LA DIVISION DE C.B.S.

P R E S E N T E

Nos permitimos dirigimos a Uaed, para hacer de su conocimiento que una vez revisado el seMcio social titulado "EFICIENCIA BIOLOCICA Y PRODUCCION DE CELULASAS DE Pleurofus ostreafus CULTIVADO EN PAJA DE AMARANTO", realizado por la a l m a SANCHEZ PEREZ MMERVA con mtricula 90337101 de la Licenciatura ingenieria Bioquím¡ca industrial. El informe de este trabajo cumple con los requisitos del reglamento de Servicio Social a nivel Licenciatura y se ACEPTA, dado que cubre con dichos requisitos.

Sin otro particular por el momento. reciba un cordial saludo

A T E N T A M E N T E "Casa Abierta al Tiempo"

Quim. + o e a. Barba Chávez

Prof. Titular "A" T.C. Prof. Titular M.T.

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! Casa abiet-ia ai liempo i

1 UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DMSION DE CIENCIAS BlOLOGlcAS Y DE LA SALUD SERWCIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

0 Por medio de la presente se hace constar que el (la): Q. JOSE MARIA BARBA CHAVEZ

del Departamenti de:BIOTECNOLOGIA de la DMsi6n de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO. CULTIVADO EN PAJA DE AMARANTO

EFICIENCIA BIOLdGICA Y PRODUCCIÓN DE CELUUSAS DE: Pleumlus osfreatus

. + . - ALUMNO: SANCHEZ PEREZ MINERVA

_ . . . LICENCIATURA: iNGENlERlA BIOQUIMICA INDUSTRIAL

PERIODO: 3 DE MAYO DE 1996 - 18 DE NOVIEMBRE DE 1990

Se extlende la presente para los nnes que al Interesado convengan. en la Ciudad de México, O.F. a los '0 ' tres dlas,del mes de Diciembre de mil novecientos noventa y seis.

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3 - Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo' I . ,4 . .

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Secretarlo Acadbmlco Dlv. CBS

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UNIDAD IZTAPALAPA r 1 - c v c-", IC, n1'>.eri I "d.lr.Bl"85 , . . 1- TTmET-ni,m. ,

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