informe crecimiento microbiano levadura

Fecha:PRÁCTICA DE LABORATORIO

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Nombre de la práctica: Preparación de medio de cultivo, identificación morfológica y cuantificación de microorganismo

Fundamentos de Biotecnología 3007815-1

DEPARTAMENTO DE PROCESOS Y ENERGÍA

FACULTAD DE MINAS

Laboratorio Bioprocesos y Flujos Reactivos. Ruiz-Colorado A. A.

PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO, IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMO

García Zambrano Mauricio Alejandro, Tutalcha Pame Harrison Alberto, De Vargas Bolaño Napoleón Alexander

Ingeniería química cuarto semestre, Ingeniería química cuarto semestre, Ingeniería química sexto semestre

[email protected] , [email protected], [email protected]

FUNDAMENTO

La caracterización de microorganismos sirve para identificar sus propiedades y sus capacidades a la hora de su cultivo en el laboratorio, para obtener mejores oportunidades de éxito de la misma en su propagación. Los medios de cultivo, estos nos ayudan a brindarles a los microorganismos que se están trabajando los requerimientos necesarios para que estos se adapten al medio de crecimiento, (ya que todos los microorganismos no necesitan las mismas condiciones). Según el interés que se tengan con ellos, dándoles lo que realmente necesitan para su reproducción, también se lo puede hacer selectivo el cultivo agregándole componentes con los cuales el microorganismo de interés se adapte al cambio y los demás contaminantes no (purificar), su utilización se puede dar en medio líquido, solido (agar) ,semisólido. Posteriormente a la preparación del medio de cultivo debemos realizar la siembra en nuestras cajas Petri debidamente esterilizadas. Los medios de cultivo tienen gran uso en la farmacología, en la industria de alimentos, fertilizantes, química, licorera.

La biomasa se refiere a los microorganismos presentes en un sistema, a la cantidad de los mismos que están presentes en una cierta cantidad de muestra, el objetivo de la biomasa es la reproducción del microorganismo que se está trabajando, la determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Es una variable clara para determinar las tazas de producción y consumo de nutrientes, Para la determinación de biomasa se hace uso del análisis espectrofotométrico y de peso seco; el análisis espectrofotómetro se basa en una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. El peso seco se mide con la cantidad total presente en una muestra, puede medirse en términos de peso seco

Laboratorio No. 4, Nombre de la práctica Preparación de medio de cultivo, identificación morfológica y cuantificación de microorganismo,

Universidad Nacional de Colombia Sede MedellínProfesor responsable: A. A. Ruiz-Colorado, [email protected]

mailto:[email protected]




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en unidades de volumen, las células se separan del líquido ya sea por centrifugación o por filtración.

La tinción de Gram es una prueba esencial y obligatoria a realizar en el laboratorio de microbiología. Es una etapa preliminar que se utiliza para diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas, según su composición en la pared celular.

OBJETIVOS (Pueden ser los descritos en la Guía)

General: Analizar e identificar la morfología, estructura, de la levadura Saccharomyces cerevisiae

además de determinar las condiciones de crecimiento y cuantificación de biomasa.

Específicos: Conocer cómo preparar y diferenciar los medios de cultivó para el S. cerevisiae. Conocer las técnicas de esterilización de los medios de cultivo para el S. cerevisiae. Hacer un análisis de los pasos realizados en la preparación, siembra y cuantificación del S.

cerevisiae, en el Laboratorio. Hacer análisis de la morfología de la levadura S. cerevisiae.




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METODOLOGÍA

Preparación de medio de cultivo sólido y líquido Saccharomyces cerevisiae:

Diagrama 1: preparación de medios de cultivosObservaciones:




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Tener cuidado con los medios de cultivos ya que estos se pueden contaminar con microorganismo presentes en el ambiente y producidos por el ser humano.Proceso para la tinción de Gram:




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Diagrama 2: Tinción de Gram

Procesos cuantificación de biomasa:




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Diagrama 3: pasos cuantificación de biomasa.RESULTADOS Y DISCUSIÓN



Tomar l ml de muestra en tubos ependorf

Centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos

Adicionar 1ml de solución salina al pellet

centrifugado y re suspender con ayuda de

un vortex.

Centrifugar a 7000 rpm por 5 minutos

Eliminar el sobrenadante

Adicionar l ml de solución salina al pellet centrifugado y re

suspender con ayuda de un vortex.

Diluir la solución de biomasa en solución salina isotónica

Medir absorbancia a la longitud de onda requerida según el

microorganismo (usando espectrometro)

Mediante interpolación con la curva de calibración se puede estimar la concentración en

peso seco dada una determinada absorbancia


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Medio de cultivo

Imagen 1.medio de cultivo.

Saccharomyces cerevisiae es una levadura cuya colonia es color crema o blanco, apariencia húmeda y brillante de bordes irregulares. La temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 30 °C. Puede producir ascosporas cuando hay requerimientos nutricionales adecuados. Sus dimensiones son: 2.5-10 micras de ancho y 4.5-21 micras de largo. Microscópicamente se observan redondas y ovoides, elipsoides a veces cilíndricas y filamentosas. Fermenta glucosa, galactosa, sacarosa y maltosa y no fermenta la lactosa.

Como se puede observar en la imagen 1, la inoculación hechas para las cajas de Petri A y C las colonias se encuentran muy aglomeradas, en cambio en la caja de Petri podemos notar que la colonias se encuentran aisladas, esto no permite seleccionar el microorganismo de un cultivo contaminado que se desea cultivar.

En el laboratorio se cultivó la levadura S cerevisiae, en medio líquido y en medio solido (agar), lo cual al inicio se lo inocula con una colonia madre de esa levadura, después de esto debemos darle unas condiciones óptimas para que el microorganismo prospere en el nuevo medio y así obtener los resultados que esperamos. Entre los factores que afectan el crecimiento y su velocidad de reproducción de la levadura está el PH el cual para levadura S cerevisiae debe estar en un rango 4-5, su temperatura debe ser optima no debe pasar de los 25C y 30 puesto que a esta temperatura o a superiores se produce su muerte, los nutrientes (carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y fósforo),satisfacen las necesidades del microorganismo ya que con estos la levadura se




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podrá alimentar durante la fase exponencial hasta llegar su tope máximo, la ausencia o presencia de oxigeno también es un factor importante la Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metabólica, por lo que en un proceso fermentativo en fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y en fase anaeróbica generalmente por la producción de etanol. La productividad se la midió como la producción de biomasa por unidad de volumen.

El etanol se lo puede obtener a partir de cualquier polisacárido o azúcar, la levadura que se cultivó en el laboratorio es la responsable de la fermentación alcohólica, la cual es una biorreaccion que permite degradar azucares en alcohol y dióxido de carbono.

Medio solido: este medio se encuentra con un color amarillo quemado (agar), en la parte superior de mismo donde se realizaron las siembras con una espátula previamente esterilizada en el mechero de alcohol con la cual se realizó el rayado, luego se generaron la colonias, que se las puede observar con unos puntos o aglomeraciones blancas, lo que nos da a entender que la siembra realizada tuvo éxito.

Medio líquido: en este medio se lo realizo con la inoculación de una cepa de levadura en el caldo de cultivo previamente preparada en el laboratorio, después de dos días de la inoculación el caldo de cultivo se observa de color amarillo cremoso y en su parte inferior una cantidad de materia blanca que es la biomasa que se espera obtener lo más pura posible.

Tinción de Gram:

Tabla 1.Prueba de tinción de Gram.Microorganismo Tinción de Gram

Saccharomyces cerevisiae POSITIVA

Imagen 2.microcopia del S. cerevisiae.




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Las principales características de que una bacteria sea Gram positiva son: Posee una triple capa constituida por peptidoglucano (50 % del peso seco), ácidos teicoicos y lípidos.

Como se puede observar en la imagen la S. cerevisiae es un microorganismo que posee una forma elipsoidales además es Gram positivo, esto se debe a que en el exoesqueleto está conformado por quitina, la quitina esta es un polisacárido compuesto de unidades de N-acetilglucosamina (exactamente, N-acetil-D-glucos-2-amina) formado enlaces β-1,4, esta composición hace parte de lo peptidoglucano pera la diferencia es que los peptidoglucano son copolímero formado por secuencias alterna.

Además la membrana está conformada por lípidos (triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres) que sirven como bloques para la membrana.

Cuantificación de biomasa

Con una absorbancia medida en el laboratorio procedemos hacer interpolación con la gráfica de cuantificación de biomasa.

Grafica 1.calibracion para la cuantificación de biomasa.




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Un método más rápido y útil para obtener una estimación del número de células o biomasa, consiste en la utilización de medidas de turbidez. Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de métodos rápidos, pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas.



Muestra Absorbancia (nm)1 0,4182 0,448

Promedio 0,433


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Concentración Biomasa (g/L)Biomasa 0,359

Biomasa* Factor de dilucion 10 (1000 microlitro/100 microlitro)

3,59

Los datos arrojados en la experimentación fueron 0,418 nm y de 0,448 nm, sacando un promedio de absorbancia quedaría en 0,433 nm, este dato lo procedemos a interpolar en la curva biomasa del S cerevisiae dándonos una concentración de biomasa en la muestra es de 0,359 (usando la regresión lineal). Ahora usamos el factor de dilución de 10 (1000 microlitro/100 microlitro) quedando la concentración en 3,59g/L, se multiplica por este factor de dilución ya que la muestra fue diluida, ya que la absorbancia que leímos, corresponde a una concentración baja de células, ya que la muestra fue disuelta. Lo mas indicado es multiplicar por ese factor de dilución de 10.

La absorbancia es afectada por el tamaño y la forma de las células; por lo tanto, la relación entre la absorbancia por lo cual es de crucial importancia mantener y saber el tamaño del medio del microorganismo a la hora de cultivar. Aunque experimentalmente no supimos el tamaño real de la levadura. Igualmente como se ve en la graficas del microscopio no hubo presencia de contaminantes.

DESARROLLO DE LA GUÍA1. Explicar la función para la célula, de cada uno de los componentes del medio.

D-Glucosa:

El S. cerevisiae crece anaeróbicamente con glucosa produciendo respectivamente 22 y 21 microorganismos de peso seco celular por micro mol de glucosa. Por ejemplo esta obtiene 2 ATP (moles) a partir de cada mol de glucosa fermentada.

Extracto de levadura:

Producto rico en vitaminas (complejo B especialmente)aminoácidos y otros factores de crecimiento. Buena fuente nutriente.

Peptona:

Son Polipeptidos formados durante la degradación enzimática de proteínas. Son la principal fuente de nitrógeno en el medio orgánico para e cultivo de bacterias. Contienen aminoácidos libres y cadenas cortas de péptidos, ciertas vitaminas y a veces carbohidratos




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Extracto de Malta:

Buena fuente de azúcar, por lo tanto de carbohidratos para el microorganismo. El extracto de malta suele ser utilizado también para activar la levadura.

2. ¿Por qué es necesario calentar el medio de cultivo con el agar? Explicar la Solubilización del agar.

El agar-agar es un hidrocoloide; los hidrocoloides son compuestos de alto peso molecular y constituido por grupos moléculas formando polímeros, el agar es conformado por cadenas repetidas de unidades alternadas β-1,3 D-galactosa y α-1,4 3,6-anhidro-L-galactosa:

La solubilidad en el frío no es posible, ya que mantiene los enlaces de hidrógeno formados durante la gelificación antes a su deshidratación, ya que su estabilidad depende e dos factores: hidratación y carga eléctrica, Al contacto con agua fría se hincha y puede aumentar hasta 30 veces su volumen. No aporta sabor ni aroma y carece de color.

3. ¿porque se esteriliza un medio de cultivo?

Porque pueden crecer microorganismos presentes en el medio ambiente o en algún ingrediente del medio, por lo que el microorganismo que crecerá no será el que sembraste, sino otro presente desde antes.

El método más utilizado para esterilizar casi cualquier medio de cultivo es por medio de alta temperatura y este es el método más utilizado por que la mayoría de los medio de cultivos requieren de alta temperatura para diluir algún componente del medio, por ejemplo el agar, que es




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el ingrediente que hace que los medios se vuelvan solidos

4. Justificar cada uno de los pasos de la coloración de Gram:

-añadir el cristal violeta, su fórmula molecular C24H28N3Cl, en una solución acusa se disocia en iones (CV+) e iones de cloruro (Cl-), estos iones penetran la pared y la membrana celular de la células gram positivas y negativas, interactúan con los iones de carga negativa presentes en la célula haciendo que tomen un color azul/purpura. Al enjuagar con agua ayuda quitar el exceso presente de cristal violeta en la célula

- añadir lugol, este compuesto está conformado por yodo en forma de iones negativos que al interactuar con los iones CV+, formando grandes compuesto de cristal violeta y yodo (CV-I) presente en la capa externa y interna de la célula, la cual atrampan el color producido por el cristal violeta.

-Agregar alcohol- acetona en un porción de 1:1, los efectos en las bacterias Gram positivas haciendo que aumente la permeabilidad de la pared y membrana celular haciendo que retenga el complejo CV-I y en las bacterias Gram negativas el alcohol-acetona extrae los lípidos de la paredes celulares, haciendo que los poros se agrande a su vez retiran el complejo CV-I, al añadir demasiado tiempo estos decolorante retirarían el complejo CV-I en las bacteria de Gram positivas.

-El principal uso en la tinción de Gram de la fucsina es como colorante secundario, que ayuda a dar contrasten a las bacterias Gram positiva y Gram negativas, pero en las Gram negativa la fucsina le da un color rojo.

5. ¿Porque se utiliza la longitud de onda para medida de absorbancia en la levadura?

La longitud de onda se utiliza en la absorbancia de la levadura, ya que con esta, Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra versus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (solución incógnita), también para la determinación del crecimiento del microorganismo.

CONCLUSIONES-La determinación de biomasa mediante peso seco y por análisis de espectrofotometría, es un método fácil, rápido versátil, y eficiente en costo. Pero que también es un método impreciso debido a diversos factores que se presentan en laboratorio.




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- Los posibles errores que se podría tener a la hora del cultivo como microorganismos contaminantes se pudo descartar con la observación en el microscopio, ya que estos desvían los valores de absorbancia

-La turbidez no es el único método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente de levaduras.

-Hay que ser minuciosos en la composición de los caldos nutritivos porque el incorrecto uso de ellos puede llevar al fracaso del cultivo del microorganismo

-Se logró una buena identificación de la morfología del S. cerevisiae.

-La tinción de Gram es una técnica muy utilizada para identificar la morfología celular, además En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano.

- Importancia de la calidad de la muestra biológica para el estudio.

BIBLIOGRAFÍA

-TORO R. (2005), Manual de Introducción al Laboratorio De Microbiología, editorial universidad de caldas, 2005

-VALENCIA, H (2001) Manual de prácticas de Microbiología Básica, Universidad Nacional de Colombia. 2001.

- Madigan, MT; Martinko J, Parker J; 2004; “BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS; 10ª Edición; EE.UU.; Williams & Wilkins publications; pags. 87-90.



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