Hiperhomocisteinemia en la fertilidad de las hembras carentes de la enzima

cistationina beta sintasa.

I Jornadas Científicas IIS AragónZaragoza, 8 de noviembre de 2010

Mª Ángeles Navarro FerrandoCP08/00043

La homocisteína es un aminoácido no esencial cuya elevación sanguínea se asocia con el desarrollo de enfermedades de tipo vascular, neurológico y reproductivo

HiperhomocisteinemiaEn el campo de la reproducción humana se ha visto que la hiperhomocisteinemia (Hhcy) es un factor de riesgo asociado a problemas placentarios como la preclampsia, abrupción, infarto placentario o aborto espontáneo.

Metilación de fosfolípidos, proteínas, DNA …

Proteínas

Metionina

Homocisteína

BHMT

Betaína

Remetilación

THF

MTHFR

Metilén THF

Metil THF

MS

Vit B12

Cistationina

Cisteína

Glutation

SerinaVit B6CBS

Vit B6

Transulfuración

S-adenosil metionina

S-adenosil homocisteína

ATPMAT

Dimetilglicina

Taurina Sulfato + CO2

α - cetoglutarato + NH4

SAH

SMMT

STHM

CGL

SH2

SH2

Metabolismo de la homocisteína

Deficiencia de la enzima cistationina beta sintasa (CBS) en la población

El defecto se transmite de forma autosómica recesiva

Incidencia homocigosis 1:58000 y 1:1.000.000heterocigosis 1:100

Valores de homocisteína en homocigosis pueden llegar hasta 400 micromolar

Modelo animal de hiperhomocisteinemia

Ratones carentes de CBS

1. Los homocigotos presentan una hiperhomocisteinemia muy severa y logran completar el desarrollo embrionario normalmente

Parámetro μM Cbs +/+ Cbs -/-

Homocisteina 25,4 ± 4,8 353 ± 81a

Metionina 144 ± 12 2545 ± 241a

Animales de 2 semanas estirpe C57Bl/6J media ±SD a, p<0.001 t Student

(Akahoshi et al ,2008)

Ratones carentes de CBS

2. Presentan bajo peso al nacer, retardo de apertura del ojo, anormalidades esqueléticas tales como cara, cola y extremidades muy alargadas y delgadas. El pelo en el lomo es menos denso y con menor diámetro

WT (cbs +/+) KO (cbs -/-)

(Watanabe y cols., 1995)

Ratones carentes de CBS

3. El 80% de estos animales mueren antes de cumplir los 21 días

(Watanabe y cols., 1995)

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30

día

% s

uper

vive

ncia

cbs -/-cbs +/+

Ratones carentes de CBS

4. Los hepatocitos de estos animales son de mayor tamaño con inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas

(Watanabe y cols., 1995)

WT (cbs +/+) KO (cbs -/-)

Ratones carentes de CBS

5. Los machos que sobreviven son fértiles mientras que las hembras no lo fueron

(Watanabe y cols., 1995)

Matingfemale x male

Number of

mating

Number of plugs

Number of pregnacies

Number of pups Litters size

Number of surviving

pups

cbs +/+ x cbs +/+ 6 6 6 49 8 ± 2a 46

cbs +/- x cbs +/- 6 6 6 39 6 ± 2a 24

cbs +/- x cbs -/- 10 9 7 39 6 ± 1a 23

cbs -/- x cbs -/- 10 10 1 2 0.4 ± 1 0

Animales de 6 meses a, p<0.001 vs cbs -/- x cbs -/- anova.

Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras en función del genotipo

( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)

Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras trasplantadas

MatingTransplanted female x male

Number of pups

Liter size

Number of surviving pups

cbs -/- ovary → cbs +/+ x cbs -/- 7 3 ± 1 7

cbs -/- ovary → cbs +/- x cbs -/- 12 3 ± 1 12

cbs -/- ovary → cbs +/- x cbs +/+ 3 2 ± 1 3

cbs +/+ ovary → cbs +/- x cbs +/+ 11 3 ± 1 11

( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)

Determinación del momento del desarrollo del embrión en el que se

produce la muerte.

Objetivo 1

Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los

úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.

Objetivo 2

Determinación del momento del desarrollo del embrión en el que se

produce la muerte.

Objetivo 1

• Grupo Control : WT (edad 12 semanas)♀ Cbs +/+ X ♂ Cbs +/+n=24

• Grupo Homocigoto: Cbs KO (edad 12 semanas)♀ Cbs -/- X ♂ Cbs -/-n=24

Grupos experimentales

♀ gestantes sacrificadas a día 4, 8, 12 y 16 de gestación (n=6)

Eutanasia con CO2

Ayuno

HomocisteínaCisteína Lípidos

Plasma

Análisis de expresión

Tejidos

Análisis proteómico

Análisis histológico

Toma de muestras

Diseño experimentalgestación

Registro de pesos y nº de sitios de implantación

día 4,8,12,16

(Ovario, útero, embriones, placenta)

Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los

úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.

Objetivo 2

Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestaciónGrupos experimentales

Útero hembras cbs +/+

Útero hembras cbs -/-

con

sin

Sitios de implantación

Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación

• Extracción y limpieza de RNA

•Análisis de expresión (Affimetrix gene chip).

•Identificación de los genes sobreexpresados y reprimidos en las diferentes condiciones experimentales con respecto al grupo control

•Confirmación a nivel individual por real time PCR

Procedimiento experimental

3.Recuperación del fenotipo de fertilidad femenina por ingeniería genética y terapia celular.

4.Inducción del fenotipo de infertilidad en ausencia de expresión de cbs utilizando siRNA.

5.Ratificación de los mecanismos propuestos en el objetivo 2 al verse corregidos en la recuperación del fenotipo.

Objetivos Futuros

Agradecimientos

Dr. Jesús OsadaMario NuñoDr. Mario Alberto GuzmánDr. José Manuel LouDr. Alfonso SarriáDra. Natalia GuillénDr. Sergio AcínRoberto MartínezDr. Joaquín SurraCristina BarranqueroSara SanchoClara GabásAdela Ramirez