estudio químico computacional sobre la formación del intermediario l th dp en el ciclo catalítico...

Universidad de Concepción Facultad de Ciencias Químicas

Departamento de Físico Química Grupo de Química Biológica y Computacional

Estudio químico computacional sobre la formación del intermediario LThDP en el

ciclo catalítico de la enzima acetohidroxi sintasa

Tesis para optar al grado académico de Licenciado en Química y al título profesional de Químico

Omar Blas Alvarado Carripán

Concepción, Octubre del 2012

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción i i

Resumen

El ácido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina dependiente que

cataliza los primeros pasos de la ruta biosintética de los aminoácidos de cadena

ramificada valina, leucina e isoleucina. Esta enzima se encuentra en plantas, hongos

y bacterias por lo que es el principal blanco de acción de herbicidas, fungicidas y

agentes antimicrobianos. El ciclo catalítico de la AHAS está constituido por cuatro

pasos principales. En el primer paso el intermediario iluro realiza un ataque

nucleofílico sobre una molécula de piruvato para dar paso a la formación del

intermediario (2S)2LactilThDP (LThDP). La formación de este intermediario

necesita además la presencia de un hidrógeno el cual en la AHAS es de

procedencia desconocida, debido a la inexistencia de grupos ionizables cercanos a

las zonas del sitio activo de la enzima. Por este motivo en la presente tesis se

estudió el mecanismo de reacción para la formación del LThDP, postulando que

el grupo encargado de promover la transferencia protónica es el grupo amino del

anillo de pirimidina cuando este se encuentra bajo la forma APH⁺. Para ello se

realizó una exploración de la superficie de energía potencial (SEP) de la reacción

considerando a los sustratos aislados en fase gas. Además se realizaron cálculos de

las funciones de Fukui para el sustrato piruvato, para el estado de transición y para

el intermediario iluro bajo las formas AP y APH⁺ con el fin de contrastar la

reactividad de ambas formas tautomericas. Por último se realizaron cálculos

termodinámicos utilizando medios de distintas constante dieléctrica, con el

propósito de verificar la estabilidad de formación del intermediario iluro bajo la

forma APH⁺ debido a la protonación del anillo pirimidínico por parte del

aminoácido glutamato. Los cálculos computacionales se realizaron con el paquete

computacional GAUSSIAN 03, empleando la teoría de los funcionales de densidad

(DFT) a nivel B3LYP/631++G(d,p) para la exploración de la SEP y B3LYP(C

PCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) para los cálculos termodinámicos, en

tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete computacional Jaguar

7.7, empleando B3LYP/631++G(d,p). Los resultados obtenidos indicaron que la

formación del LThDP ocurre de manera concertada, mostrando una barrera de

activación de aproximadamente 21 Kcal/mol. Además se observó que es el iluro

bajo la forma AP quien realiza el ataque nucleofílico sobre la molécula de piruvato.

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción ii ii

Abstract

Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiaminedependent enzyme that catalyzes

the first steps in the biosynthetic pathway of branched chain amino acids valine,

leucine and isoleucine. This enzyme is found in plants, fungi and bacteria making it

the main target of action of herbicides, fungicides and antimicrobial agents. The

catalytic cycle of AHAS consists of four main steps. In the first step the

intermediate ylide performs a nucleophilic attack on a molecule of pyruvate to

make way for the formation of the intermediate (2S)2lactylThDP (LThDP). The

formation of this intermediate also needs the presence of a hydrogen which is of

unknown origin in the AHAS, due to the absence of ionizable groups in the active

site of the enzyme. For this reason in this thesis studied the reaction mechanism for

the formation of LThDP, postulating that the group responsible for the

protonation is the amino group of the pyrimidine ring when the form is APH⁺. In

order to validate this hypothesis, the potential energy surface (PES) was explored

considering the reaction between isolated substrates in gaseous phase. Furthermore,

Fukui function calculations were performed for the substrate pyruvate, for the

transition state and for the intermediate ylide under the forms and AP and APH⁺ in

order to compare the reactivity of both tautomeric forms. Finally thermodynamic

calculations were performed using different dielectric media, in order to verify the

stability of the intermediate ylide formation under the form APH⁺ owing to

protonation of the pyrimidine ring by the amino acid glutamate. The computations

were performed using the GAUSSIAN 03 software package, using the density

functional theory (DFT) at B3LYP/631++G(d,p) for the exploration of the SEP

and B3LYP(CPCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) for thermodynamic

calculations, while reactivity studies were performed using the software package

Jaguar 7.7 employing B3LYP/631++G(d,p). The results obtained indicated that the

formation of LThDP occurs in a concerted way, showing an activation barrier of

approximately 21 Kcal / mol. Also was observed that the ylide in the AP form is

responsible for the nucleophilic attack on the molecule of pyruvate.

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción iii iii

Índice general

CAPITULO 1: Introducción………………………………………………………….……………….1

1.2 Propuestas de investigación................................................................................... 6

1.3 Propuestas de investigación................................................................................. 11

1.4 Hipótesis y objetivos del trabajo de tesis ............................................................ 13

1.4.1 Hipótesis .............................................................................................. 13

1.4.2 Objetivos .............................................................................................. 13

CAPITULO 2: Metodología..................................................................................... 14

2.1 Construcción de la SEP con los sustratos aislados ............................................ 15

2.2 Cálculos de reactividad ....................................................................................... 17

2.3 Cálculos termodinámicos ................................................................................... 18

2.3.1 Cálculos en fase gas ............................................................................. 18

2.3.2 Cálculos en solución ............................................................................ 19

CAPITULO 3: Resultados y discusión .................................................................... 20

3.1 Exploración de la SEP con los sustratos aislados .............................................. 21

3.1.1 SEP a nivel semiempirico ................................................................... 21

3.1.2 Corrección DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................ 28

3.1.3 Optimización de los puntos críticos de SEP DFT al nivel B3LYP/6 31++G(d,p) .................................................................................................... 30

3.2 Estudio de reactividad ........................................................................................ 36

3.3 Análisis termodinámico ...................................................................................... 39

CAPITULO 4: Conclusiones y proyecciones ......................................................... 41

4.1 Conclusiones ....................................................................................................... 42

4.2 Proyecciones ....................................................................................................... 43

Bibliografía ................................................................................................................ 44

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción iv iv

Índice de figuras

Figura 1: síntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato................... 6

Figura 2: estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros Φp y ΦT .................. 7

Figura 3: mecanismo de protonación del cofactor ThDP correspondiente a las

etapas de activación del cofactor para formación del intermediario Iluro ................ 8

Figura 4: estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y

el grupo difosfato ......................................................................................................... 9

Figura 5: ciclo catalítico de la enzima AHAS reportado en literatura ..................... 10

Figura 6: mecanismo de formación del intermediario LThDP en literatura ......... 12

Figura 7: mecanismo postulado para la formación del intermediario LThDP ............... 12

Figura 8: coordenadas de reacción para exploración de SEP en la formación del

intermediario LThDP............................................................................................... 15

Figura 9: equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=

CH2CH2OH. ............................................................................................................. 18

Figura 10: ciclo termodinámico para calculo de ΔG° del equilibrio en solución.... 19

Figura 11: representación 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3....................... 22

Figura 12: representación bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3..... 22

Figura 13: estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en

fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET1, (C) intermediario I, (D)

estado de transición ET2, (E) producto LThDP .................................................... 23

Figura 14: estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario

I................................................................................................................................... 24

Figura 15: mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario

LThDP mediante cálculos a nivel PM3................................................................... 27

Figura 16: diagrama de energía para SEP a nivel semiempírico PM3..................... 27

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción v v

Figura 17: representación 3D de la superficie de energía potencial a nivel DFT ... 28

Figura 18: representación 2D de la superficie de energía potencial a nivel DFT. .. 29

Figura 19: estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel DFT optimizados en

fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET, (C) producto LThDP......... 30

Figura 20: estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT ..................... 31

Figura 21: estructura del estado de transición ET con el stretching simultáneo de las

coordenadas de reacción C2C2α y H4’O2α .......................................................... 32

Figura 22: esquema de los cálculos IRC aplicados al estado de transición ET....... 32

Figura 23: estabilización por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de

protonación del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R¹ igual a 5(2

[hidroxidifosfato]etil)4metil1,3tiazol3io.............................................................. 33

Figura 24: mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario

LThDP mediante cálculos a nivel B3LYP/631++G(d,p)....................................... 35

Figura 25: diagrama de energía para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p) .............. 35

Figura 26: funciones de Fukui para el (A) APH⁺Iluro, (B) APIluro, (C) estado

de transición ET y (D) piruvato. Función de Fukui para (E) piruvato ............... 36

Figura 27: índices atómicos de Fukui para APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=

CH2CH2OH .............................................................................................................. 37

Figura 28: índices atómicos de Fukui (A) y (B) para la molécula de piruvato

.................................................................................................................................... 37

Figura 29: índices atómicos de Fukui y , en paréntesis, para el estado de

transición ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.......................................... 38

Figura 30: equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=

CH2CH2OH .............................................................................................................. 39

f −

f +

f −

f − f +

f − f +

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción vi vi

Índice de tablas

Tabla I: valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp

y ΦT para los puntos críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel

semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3......................................................... 23

Tabla II: valores de longitudes y ángulos de enlace para los puntos críticos de la

SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3

.................................................................................................................................... 24

Tabla III: valores de cargas atómicas tras MPA para los puntos críticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel PM3........................................................................ 24

Tabla IV: valores de longitudes de enlace del anillo pirimidínico para los puntos

críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el

hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26

Tabla V: ordenes de enlace de Mulliken del anillo pirimidínico para los puntos

críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el

hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26

Tabla VI: valores de cargas atómicas tras MPA para el anillo pirimidínico del

cofactor ThDP en el mecanismo de reacción obtenido a nivel PM3..................... 26

Tabla VII: valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y los ángulos diedros Φp

y ΦT para los puntos críticos de la SEP en fase gas a con el método DFT a nivel 6

31++G(d,p). ................................................................................................................ 30

Tabla VIII: valores de longitudes de enlace de los puntos críticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31

Tabla IX: valores de ángulos de enlace para los puntos críticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP/631++G(d,p) ............................................ 31

Tabla X: valores de ordenes de enlace para los puntos críticos de la SEP

optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción vii vii

Tabla XI: valores de cargas atómicas tras análisis NBO para los puntos de críticos

de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................................................................... 33

Tabla XII: valores de longitudes de enlace para el anillo pirimidínico de los puntos

críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............... 34

Tabla XIII: valores de ordenes de enlace NBO para el anillo pirimidínico de los

puntos críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ... 34

Tabla XIV: valores de cargas atómicas del tipo NBO para el anillo pirimidínico del

cofactor ThDP en el mecanismo de reacción a nivel B3LYP/631++G(d,p) ...... 34

Tabla XV: valores de ΔG° para la reacción acido base entre el residuo altamente

conservado Glu139, simulado con una molécula de acido acético y APIluro....... 39

Capitulo 1: Introducción

Licenciatura en QuímicaQuímico Universidad de Concepción 1 1

Capítulo 1

Introducción

n este capítulo se dará una breve descripción de lo que son las enzimas y

sus propiedades. Posteriormente, se expondrán aspectos generales de la

enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra, las

reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo catalítico que hasta el

momento se le ha postulado en literatura. Esto permitirá revelar las interrogantes

asociadas a la enzima y así dar paso a la propuesta de trabajo en que está enfocada

esta tesis.

E



1.1 Enzimas.

Las enzimas son proteínas globulares, de gran tamaño y que funcionan como

catalizadores biológicos. Están formadas por largas cadenas de aminoácidos unidos

a través de enlaces peptídicos¹. Estas cadenas de residuos de aminoácidos

presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades específicas que

posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar diferentes

estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a la secuencia de

aminoácidos de la cual está constituida la enzima y es lo que se considera como la

estructura primaria. El siguiente nivel de organización abarca a las hélices alfa y a la

conformación beta plegada, estas dos formas están determinadas por el tipo de

interacción entre las cadenas laterales de aminoácidos de distintos polipeptidos

dentro de la enzima y son las que componen las estructuras secundarias. La

estructura terciaria corresponde a la disposición tridimensional de todos los átomos

que componen la proteína. Por último se encuentra la estructura cuaternaria, la

cual se compone de complejos de más de una cadena polipeptídica². Estos tipos de

plegamientos están regidos por las interacciones entre los enlaces no covalentes

presentes en el ambiente enzimático. Estas interacciones corresponden a enlaces de

hidrógeno, enlaces iónicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales ayudan a

mantener la forma de las enzimas³. Es así como la distribución de los

aminoácidos polares y no polares orientan la forma en que se pliegan las enzimas.

Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el interior de la enzima,

mientras que las cadenas laterales polares, tienden por sí mismas a disponerse cerca

del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal forma que su

estructura adopte la menor energía libre posible⁴. Las diferencias de plegamientos y

formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas enzimas corresponden a

enzimas que difieren en su secuencia de aminoácidos y por ende en su

ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan principalmente por catalizar

la misma reacción química que otras enzimas, pero mostrando diferentes

parámetros cinéticos⁵’⁶.



Cada enzima actúa sobre un sustrato específico y generalmente cataliza

exclusivamente una sola reacción, aunque esto varía dependiendo de la cantidad de

cofactores que presente cada enzima en su composición. La región en que las

enzimas llevan a cabo la reacción con los sustratos se denomina sitio activo. Las

enzimas en su sitio activo requieren además de la presencia de moléculas no

proteicas para ejercer su actividad catalítica que se denominan cofactores, estas

pueden ser metales divalentes o moléculas orgánicas que reciben el nombre de

coenzimas.

En un principio se pensaba que esta interacción enzimasustrato ocurría bajo el

modelo de “llave cerradura”, pero sin embargo este modelo falla al intentar explicar

la estabilización de los estados de transición. Por este motivo Daniel Koshland⁷

sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en donde se

establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con lo que el sitio activo

podría cambiar su conformación estructural debido a la interacción con el sustrato.

Como resultado, las cadenas aminoacídicas que componen el sitio activo

interactúan específicamente con los distintos cofactores y sustratos, permitiendo a la

enzima llevar a cabo su función catalítica. Existe un tercer modelo, llamado tensión

sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland⁸. En este modelo el

sustrato es tensionado hacia la formación del producto como resultado de una

transición conformacional inducida por la enzima, la cual deforma los ángulos de

enlace y activa al sustrato.

Una manera de cuantificar la interacción enzimasustrato es a partir de la constante

de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuación de MichaelisMenten. Esta

constante tiene una gran importancia práctica debido a que es independiente de la

concentración de la enzima, permite el cálculo de la concentración de sustrato que

conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad máxima de reacción

y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el sustrato. Dentro de este

ámbito existen además otros factores que influyen en la interacción enzimasustrato

y que están directamente relacionados con la actividad enzimática. Entre ellos se

encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta también lo hace la velocidad

enzimática, pero si esta aumenta demasiado se produce la desnaturalización del

ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimática. Otro factor es el

pH, el cual es específico para la actividad máxima en cada enzima y basta un



pequeño cambio para provocar la desnaturalización de esta, que en otras palabras

se refiere a la modificación de todas las estructuras de la enzima, excepto la

estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el efecto de la concentración

de sustrato y de los productos finales, la existencia de isoenzimas, además de

modificaciones alostéricas y covalentes en la estructura proteica de las enzimas,

también provocan variaciones de la actividad enzimática. Uno de los factores más

importantes que influyen en la actividad enzimática y que generan un gran interés

debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos pueden clasificarse

según la forma en que interactúan con las enzimas, la cual puede ser de forma

reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima

para producir una proteína que no tiene actividad enzimática y a partir de la cual es

imposible regenerar la enzima original. En cambio los reversibles se unen

covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser liberado, por lo que se

habla de una unión temporal. Dentro de esta última clasificación estos pueden

subdividirse según la manera en que intervienen en la reacción, de forma

competitiva y no competitiva con respecto al sustrato⁹.

En la actualidad se conoce un gran número de enzimas, las cuales catalizan una

amplia gama de reacciones en los más diversos organismos. Por este motivo la

Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una

nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los denominados números

EC (Enzyme Commission), donde la clasificación comienza con las letras EC,

seguidas por cuatro números los cuales están separados por puntos. El primer

número indica la clase principal de la enzima y los siguientes son especificaciones

progresivas. Las clases principales se dividen en: 1. Oxidoreductasas: que catalizan

reacciones de oxidorreducción; 2. Transferasas: que transfieren grupos activos a

otras unidades receptoras, pero no transfieren moléculas de agua; 3. Hidrolasas: las

cuales catalizan reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de

monómeros a partir de polímeros; 4. Liasas: que catalizan reacciones en las que se

adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a través de la

eliminación de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que transfieren grupos

dentro de la misma molécula para formar isómeros; 6. Ligasas: que catalizan la

degradación o síntesis de los enlaces CC, CS, CO y CN mediante el

acoplamiento de moléculas de alto valor energético.



Dentro de la clasificación de las transferasas se encuentra una de las enzimas más

importantes para la vida de organismos tales como bacterias, hongos y plantas. La

enzima acetohidroxi sintasa, conocida comúnmente como AHAS o acetolactato

sintasa se denomina con el número EC 2.2.1.6. El primer número se debe a que la

AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosintética de los aminoácidos de

cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus productos son

transferidos a otras enzimas de la ruta biosintética, (transferasa). El segundo

número, el 2, se debe a que las moléculas transferidas poseen al menos un grupo

cetónico en su estructura. En tanto el tercer número, el 1, denota que la enzima

corresponde a una transcetolasa (transfiere moléculas formadas por la

condensación de dos átomos de carbono). Por último el numero 6 corresponde

solo a un número arbitrario de clasificación para las transferasas¹⁰.

La producción de los aminoácidos de cadena ramificada en la que está involucrada

la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento de los organismos

antes mencionados. La inhibición de esta enzima y por ende de la producción de

estos aminoácidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta característica la

AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores, entre los que se

encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los herbicidas se

utilizan en las plantaciones para la eliminación de malezas, las cuales son dañinas ya

que compiten directamente con los cultivos por el acceso al agua, al sol y a los

nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han desarrollado para la

eliminación de bacterias responsables de enfermedades tales como la

tuberculosis¹¹.



1.2 AHAS.

El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima que se encuentra

en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencionó anteriormente. Su

función es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta biosintética de

los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Las reacciones

que cataliza la AHAS consisten en la condensación de dos moléculas de αceto

ácidos, figura 1. En primera instancia cataliza la descarboxilacion, de forma

irreversible y no oxidativa, de una molécula de piruvato.

Figura 1. Síntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato. Los átomos de carbono en negro, los de oxigeno en rojo y los de hidrógenos en blanco.

Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de

cuál sea el segundo αceto ácido en reaccionar. Si este corresponde a una segunda

molécula de piruvato, se produce la formación de (2S)2acetolactato (AL), el cual

es el precursor de los aminoácidos de cadena ramificada valina y leucina. Pero si el

segundo sustrato corresponde a una molécula de 2cetobutirato (2CB) se produce

la formación de (2S)2aceto2hidroxibutirato (AHB) el cual es el precursor del

aminoácido de cadena ramificada isoleucina¹¹⁻¹³.



N

N

CH2

N +

S NH 2 C H 3

CH 3

CH2 CH2

O P

O

O

O

P OH

O

O

H

Mg 2+

1`

1 2

3

4

5

2` 3`

4`

5`

6` 6

7

7` P Φ

T Φ

La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina dependiente, ya que para su

actividad catalítica requiere del cofactor tiamina difosfato (ThDP). Pero además, la

AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El primero corresponde al

metal divalente Mg²⁺ y el segundo corresponde al cofactor flavina adenina

dinucleotido (FAD)¹⁴.

El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al interior de la enzima es el

cofactor 3[(4’amino2’metilpirimidina5’il)metil]5(2[hidroxidifosfato]etil)4

metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido

comúnmente como ThDP. Este cofactor está formado por un anillo tiazolio y por

un anillo pirimidínico. El anillo pirimidínico se encuentra sustituido en la posición

2’ por un grupo metilo y en la posición 4’ por un grupo amino. Ambos anillos están

enlazados a través de un carbono puente con el cual forman los ángulos diedros ΦP

= N3C7’C5’C4’ y ΦT = C2N3C7’C5’ tal como se muestra en la figura 2. Las

tres conformaciones básicas que puede adoptar el ThDP debido a la torsión de

estos diedros son: la conformación tipo F (± 90°, 0°), la conformación tipo S (±

150°, ±100°) y la conformación tipo V (± 70°, ±95°)¹⁵, en donde el primer valor

corresponde al diedro Φp y el segundo al diedro ΦT, respectivamente.

Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros Φp y ΦT.

La conformación tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la

cercanía existente entre el grupo imino del anillo pirimidínico y el hidrógeno

enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales existe una distancia

promedio de 3.0 Å. Esta cercanía permite la abstracción del hidrógeno enlazado al

carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera la formación

de la especie activa conocida como iluro¹⁴’¹⁵, figura 3. Estas etapas de activación

consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la protonación del

nitrógeno N1’ por parte del aminoácido altamente conservado acido glutámico

(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa de la forma 4’



aminopirimidina (AP) a la forma 4’aminopirimidinio (APH⁺). Luego, el grupo

amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en la forma 1’,4’

iminopirimidina (IP). Por último, el grupo imino del anillo de pirimidina en la

forma IP extrae el átomo de hidrógeno enlazado al carbono C2 formando la

especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas etapas de activación son

comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual que los dos

primeros pasos del ciclo catalítico de la AHAS ¹¹’¹⁶⁻¹⁸.

Figura 3. Mecanismo de protonación del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de activación del cofactor (verde) para formación del intermediario iluro (azul).

Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, éste además de estar unido al

carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un grupo

etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal divalente Mg²⁺. Este metal

cumple la función de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al interactuar con

dos aminoácidos del ambiente enzimático, los cuales corresponden específicamente

a un ácido aspártico y a una asparraguina¹⁷.

El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con sustratos debido a

que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxidoreducción, es el cofactor flavina

adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor está compuesto por una unidad de

riboflavina (vitamina B2), que está unida a un grupo pirofosfato, el cual que está

enlazado a una ribosa, la que a su vez está unida a una adenina, figura 4. Se ha

postulado que el FAD confiere dos propiedades fundaméntales a la AHAS, una de

ellas consiste en el aumento de la actividad catalítica de la enzima cuando este



N

N

N N

O

N H 2

O

OH O H

O P

O

O O H

P

O

OH

OH

O H

OH

N

NH N

O

O

CH 3 C H 3

cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la AHAS a adoptar la

conformación de tetrámero, confiriendo al FAD un rol estructural dentro de la

enzima¹³’¹⁹.

Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y el grupo difosfato se muestran con los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.

El ciclo catalítico de la AHAS postulado hasta el momento²⁰⁻²² se muestra en la

figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de estos pasos se compone

de un ataque nucleofílico por parte del carbono C2 del intermediario iluro sobre el

carbono carbonílico de una molécula de piruvato, generando al intermediario (2S)

2[(1carboxi1hidroxi)etil]tiaminadifosfato también conocido como 2lactil

tiaminadifosfato (LThDP). En el segundo paso el LThDP sufre una

descarboxilación dando origen al segundo intermediario del ciclo catalítico: el 2(1

hidroxietil)tiaminadifosfato (HEThDP). Una característica importante de este

intermediario es que sus dos estructuras resonantes correspondientes a la forma de

enamina y la forma activa C2αcarbanión poseen diferente reactividad, siendo más

estable la forma de enamina. En tanto la forma C2αcarbanión es la que continúa

con el ciclo catalítico de la AHAS, dando origen al tercer paso del ciclo. En este

tercer paso el HEThDP, en su forma aniónica, reacciona con el segundo αceto

ácido, el cual puede ser una molécula de piruvato o una molécula de 2cetobutirato.

En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleofílico sobre el carbono

carbonílico de la segunda molécula de sustrato en cuestión, formando el

intermediario (1S,2S)2[(2carboxi1,2dihidoxi1,2dimetil)etil]tiaminadifosfato,

comúnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP), cuando

reacciona con una molécula de piruvato, como también el intermediario (1S,2S)2

[(2carboxi1,2dihidoxi2etil1metil)etil]tiaminadifosfato que comúnmente recibe



el nombre de 2acetohidroxibutiratotiaminadifosfato (AHBThDP) cuando

reacciona con la molécula de 2cetobutirato, respectivamente.

Figura 5. Ciclo catalítico de la enzima AHAS reportado en literatura.

De acuerdo a lo postulado en bibliografía, un punto a destacar en este tercer paso

es que al igual que en el paso número uno del ciclo, aquí también es necesaria la

presencia de algún residuo cercano al cofactor que posea un grupo ionizable capaz

de protonar al oxígeno carbonílico del segundo αceto ácido. Por último, en el paso

número cuatro del ciclo catalítico el producto es liberado tras el rompimiento del

enlace C2C2α y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de iluro el cual se

reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, además en este cuarto paso, nuevamente es

necesaria la presencia de algún residuo cercano al cofactor que posea un grupo

ionizable, el cual ahora debe promover la extracción del hidrógeno ubicado en el

primer hidroxilo formado de los intermediarios ALThDP o AHBThDP, según

sea el caso, con el fin de formar los productos (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2

hidroxibutirato, respectivamente¹¹’²⁰⁻²². Sin embargo, a raíz de los análisis de la

estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los aminoácidos

cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos que se encuentran



próximos al grupo amino del anillo pirimidínico y al carbono C2 del anillo tiazolio,

no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones¹¹. Debido a estas

interrogantes, se ha postulado para los pasos número 3 y 4 del ciclo, la posibilidad

de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia de grupos

ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio activo²³.

1.3 Propuesta de investigación.

En los últimos 30 años se han publicado una gran cantidad de artículos

relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su totalidad los

mecanismos de activación e inhibición. Entre los aspectos más relevantes que se

han publicado se encuentran por ejemplo la obtención de la estructura cristalina de

la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a diversas bacterias, clases

de hongos y tipos de plantas. Además se han realizado estudios enfocados tanto en

su actividad catalítica, como también en la detección de los intermediarios

presentes en el ciclo catalítico, para los cuales además se han determinado las

constantes de velocidad de formación¹¹’¹⁴’²¹⁻²³. Sin embargo, a pesar de esta gran

cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes relacionadas con esta

enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos relacionados directamente

con su ciclo catalítico, referentes a la forma en que ocurren los mecanismos de

reacción que dan paso la formación de los intermediarios en los distintos pasos del

ciclo catalítico, además de la ausencia de grupos ionizables cercanos al sitio activo

capaces de promover transferencias protónicas para la formación de estos

intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de los pasos del ciclo

catalítico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la falta de estos grupos

ionizables y del cual además se desconoce la forma en que ocurre su mecanismo de

reacción, es el paso número 1 del ciclo catalítico, correspondiente a la formación

del LThDP. Tal como se describió en la sección anterior, este paso consta de un

ataque nucleofílico por parte del cofactor tiamina difosfato (ThDP) hacia el primer

sustrato incorporado en el ciclo catalítico de la AHAS correspondiente a una

molécula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la forma de iluro,

figura 6.



Figura 6. Mecanismo de formación del intermediario LThDP en literatura.

Además, en este paso se requiere de la protonación del oxígeno carbonílico de la

molécula de piruvato, para la formación del intermediario LThDP²⁴. Pero, debido

a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de algún ácido o de un

grupo de similares características¹¹’²³, el origen del protón requerido en esta etapa

del ciclo catalítico es desconocido.

Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente tesis se ha propuesto

un mecanismo para la formación del intermediario LThDP, el cual no requiere de

la presencia de un grupo con carácter ácido aledaño al sitio activo de la enzima.

Con esto se postula que el origen del hidrógeno requerido en esta etapa del ciclo

catalítico proviene del mismo cofactor ThDP, específicamente del grupo imino

cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se encuentra en la

forma de APH⁺, figura 7.

Figura 7. Mecanismo postulado para la formación del intermediario LThDP.



1.4 Hipótesis y objetivos del trabajo de tesis.

1.4.1 Hipótesis.

La protonación del oxígeno carbonílico de la molécula de piruvato en la

formación del intermediario LThDP, se lleva a cabo por el grupo 4’imino

del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo pirimidínico

bajo la forma de APH⁺.

1.4.2 Objetivos.

• Objetivo general: modelar teóricamente mediante métodos mecánico

cuánticos el mecanismo de reacción postulado para la formación del

intermediario LThDP desde el punto de vista de la cinética, reactividad y

termodinámica.

• Objetivos específicos:

1. Cinética: explorar el mecanismo de reacción y determinar la barrera

de activación para la formación del LThDP, considerando los

sustratos aislados en fase gas, mediante la construcción de una

superficie de energía potencial (SEP) con el anillo pirimidínico en la

forma de APH⁺ al momento de realizar la trasferencia protónica.

2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los índices atómicos

de Fukui para los reactantes y estado de transición.

3. Termodinámica: calcular los ∆G° en fase gas y en solución para la

reacción acido base entre el residuo altamente conservado GLU139

y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH⁺, utilizando

solventes con distintos valores de constante dieléctrica.

Capitulo 2: Metodología


Capitulo 2

Metodología

n este capítulo se presenta la metodología empleada para la construcción

de las SEP con los sustratos aislados en fase gas a nivel semiempírico y las

posteriores correcciones energéticas para las estructuras obtenidas

empleando la teoría de los funcionales de densidad (DFT), además se indica la

metodología utilizada para los cálculos termodinámicos tanto en fase gas como en

solución. También se presenta la metodología empleada para el cálculo de las

funciones de Fukui a las distintas moléculas de interés.

E



N

N N + S C

C H 3 CH 2

N +

H

H

H CH 2

OH

C H 3

CH 3 COO

CO 2

CH 3 O R2 R1

C2α

C1

O2α

C2 H4`

.

..

.

2.1 Construcción de la SEP con los sustratos aislados.

Para la construcción y exploración de la superficie de energía potencial (SEP) en

fase gas y con los sustratos aislados, se consideraron dos coordenadas de reacción

tal como se observa en la figura 8. Una de las coordenadas corresponde al ataque

nucleofílico entre el carbono C2 y el carbono carbonilico C2α (R1) y la otra

corresponde a la transferencia protónica de uno de los hidrogeno enlazados al

grupo 4’amino cuaternario hacia el oxígeno carbonilico del piruvato (R2).

Figura 8. Coordenadas de reacción para exploración de SEP en la formación del intermediario LThDP.

Con el propósito de considerar de una manera simple el ambiente apoenzimatico

en la construcción de la SEP se realizaron tres aproximaciones. En primer lugar, en

todos los cálculos se consideró al cofactor ThDP en la conformación tipo V con

valores para ΦP de 66° y ΦT de +96°, obtenidos de la estructura cristalina de la

AHAS¹⁴. En segundo lugar, en todos los cálculos realizados al intermediario L

ThDP, este siempre se consideró con la estructura del enantiómero S. Por último,

en todas las estructuras se incluyó al residuo altamente conservado glutamato,

debido a la importante interacción que posee con el átomo N1’ del anillo

pirimidínico¹⁷. Este aminoácido fue reemplazado por una molécula de acido

acético, con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxílato del acido

glutámico²⁵’²⁶. Lo mismo se hizo con el grupo hidróxidifosfato, el cual se

reemplazo con un grupo hidroxilo debido a que su rol solo consta en anclar el

ThDP al sitio activo, por lo que no tiene ninguna contribución en la actividad

catalítica del cofactor²³’²⁴’²⁷. Además, en ninguno de los cálculos se incluye el

metal divalente Mg²⁺ ya que su rol es coordinar el grupo difosfato del ThDP y

además no tiene participación directa en la catálisis¹⁴’¹⁷.



Posteriormente esta estructura se optimizó utilizando el hamiltoniano PM3

(Parameterized Model number 3) con el programa MOPAC 2009²⁸⁻³⁰. Una vez

optimizada la molécula se restringió la longitud de enlace C1C2α a una distancia

de 1.55 Å y se optimizó nuevamente. A continuación, con este resultado se

generaron 73 estructuras diferentes, las cuales se obtuvieron al cambiar la distancia

de la coordenada de reacción R1 desde 1.40 Å hasta 5.00 Å con intervalos de 0.05

Å. En cada una de estas estructuras se restringieron longitudes de enlaces, ángulos

de enlaces y ángulos diedros con la finalidad de resaltar solo lo cambios de energía

producidos únicamente por las coordenadas de reacción en estudio y además para

reproducir de cierta forma la rigidez del cofactor en el sitio activo de la enzima.

Luego, en cada una de estas estructuras la coordenada R2 fue variada entre 3.70 Å

y 0.9 Å con intervalos de 0.034 Å, asegurando de esta manera que ambas

coordenadas de reacción, tanto R1 como R2, tuviesen un total de 72 pasos cada

una. A continuación la energía de cada una de las 5300 estructuras se graficó en

función de la coordenadas R1 y R2 con el programa SigmaPlot 10.0³¹,

construyendo de esta manera la SEP a nivel semiempírico utilizando el

hamiltoniano PM3. Para encontrar los estados de transición en esta superficie se

seleccionaron estructuras representativas correspondientes a la región de los puntos

de silla de la superficie y se procedió a su optimización y posteriores cálculos de

frecuencia con el programa MOPAC 2009³².

Sin embargo, debido a las conocidas limitaciones que presenta el método

PM3³³’³⁴, la SEP PM3 fue corregida utilizando “Density Functional Theory”

(DFT)³⁵ a nivel B3LYP/631++g(d,p)³⁶’³⁷. Para esto con el software GAUSSIAN

03³⁸ se realizaron cálculos single points de las estructuras optimizadas a nivel PM3.

Posteriormente estas energías corregidas se graficaron versus las coordenadas de

reacción R1 y R2 para obtener la SEP corregida a nivel DFT. A las estructuras

optimizadas al nivel B3LYP/631++g(d,p) de los posibles estados de transición de la

SEP se les realizó un cálculo IRC³⁹ (Intrinsic Reaction Coordinate) al mismo nivel

de teoría, con la finalidad de confirmar el estado de transición correspondiente a la

reacción de interés. Este cálculo condujo hacia reactantes y producto, y sus

resultados fueron comparados con las estructuras optimizadas a nivel B3LYP/6

31++g(d,p) del sistema reactantes y del producto obtenidas a partir de la SEP DFT.



2.2 Cálculos de reactividad.

Para los estudios de reactividad se calcularon las funciones de Fukui y los índices

atómicos de Fukui y ⁴⁰⁻⁴². Estas funciones e índices atómicos permitieron

visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las distintas especies

involucradas en la reacción de formación del LThDP. La función (r) refleja la

reactividad global de la molécula respecto a un centro electrofílico. En tanto la

función (r) refleja la reactividad hacia un eventual ataque nucleofílico³³. Estas

funciones están definidas por las ecuaciones 1 y 2.

( ( ) ( )) / N N f r r δ ρ ρ δ + + = − (1)

( ( ) ( )) / N N f r r δ ρ ρ δ − − = − (2)

Con estas ecuaciones las funciones de Fukui fueron calculadas mediante una

aproximación de diferencias finitas, donde N es el número de electrones, ρ es la

densidad electrónica de cierto átomo (r) y δ es una fracción de un electrón, donde

el valor utilizado fue de 0.01. En tanto para el análisis de los índices atómicos de

Fukui³³’⁴¹’⁴², estos se calcularon simultáneamente con los de las funciones de

Fukui mediante la metodología implementada en el paquete computacional Jaguar

7.7⁴³’⁴⁴ y con la ayuda de la interfaz grafica Maestro 9.1⁴⁵.

Los resultados de las funciones de Fukui fueron entregados y visualizados como

isosuperficies, mientras las funciones atómicas de Fukui, también conocidas como

las funciones condesadas de Fukui³³, se obtuvieron por el cálculo descrito en las

ecuaciones 1 y 2, correspondientes al cambio de densidad electrónica entre las

moléculas neutras y sus especies radicales, donde se registró la población

electrónica sobre los átomos de las moléculas analizadas⁴⁰’⁴²’⁴⁶. Para la obtención

de las poblaciones atómicas se realizaron cálculos del tipo MPA (Mulliken

Population Analysis)⁴⁷, análisis implementado en la metodología de Jaguar 7.7 para

el cálculo de funciones de Fukui²⁷’⁴⁸.

f + f −

f −

f +



2.3 Cálculos termodinámicos.

2.3.1 Cálculos en fase gas.

Las estructuras que se muestran en la figura 9, fueron optimizadas en fase gas con

el software GAUSSIAN 03 y utilizando la teoría de los funcionales de densidad al

nivel B3LYP/631++G(d,p). Posteriormente sobre las estructuras optimizadas se

realizaron cálculos de frecuencia al nivel de teoría a B3LYP/6311G³³’³⁸.

Figura 9. Equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1= CH2CH2OH.

Los resultados de las funciones termodinámicas entregadas por los cálculos de

frecuencia fueron obtenidos de acuerdo a las ecuaciones 3, 4 y 5. Donde ESCF es la

energía potencial (SelfConsistent Field Energy), ZPE es la energía del punto cero

(Zero Point Energy), kB es la constante de boltzmann, T la temperatura y EInt es la

suma de las energías trasnacional, rotacional, vibracional⁴⁹. Con el valor de la

energía libre de las moléculas de la figura 9 se calculó el valor del ∆G° para

reacción acido base entre en residuo y los tautómeros APIluro y APH⁺Iluro.

tot SCF Int E E ZPE E = + + (3)

corr tot B H E k T = + (4)

corr corr tot G H TS = − (5)



2.3.2 Cálculos en solución.

Las estructuras de la figura 9 fueron optimizadas en fase gas. Los efectos de

solvatación implícita fueron modelados de acuerdo al modelo CPCM (Conductor

Polarizable Continuum Model)⁵⁰’⁵¹, tal como está implementado en Gaussian 03.

Las constantes dieléctricas de los medios considerados fueron 2.01 y 32.63³⁸’⁵²,

como paradigmas de medios apolares y polares respectivamente, con el fin de

resaltar el efecto del ambiente enzimático, tratando de simular en primer lugar las

estabilizaciones producidas por las fuerzas de Van der Waals que otorgan los

residuos cercanos al sitio activo y que generan un ambiente hidrofóbico de una

constante dieléctrica con valores entre 2 y 4¹⁸. Para el segundo caso se intento

simular el ambiente enzimático en el interior de la enzima, pero ahora

considerando las estabilizaciones de carácter electrostático por parte de

aminoácidos que presentan grupos ionizados²³’⁵³. Además todos los cálculos

fueron hechos considerando al residuo altamente conservado glutamato

interactuando con el átomo N1’ como una forma simple de considerar el ambiente

apoenzimatico. Este residuo fue reemplazado por una molécula de acido acético,

con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxílato del acido glutámico.

Las energías libres en solución fueron calculadas a nivel B3LYP(CPCM)/6

311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p), mediante el empleo del ciclo termodinámico,

que se muestra en la figura 10, tomando la diferencia entre el ΔG° del equilibrio en

fase gas y los valores de ΔG° de solvatación obtenidos de los cálculos single points

en solución de las moléculas involucradas (ecuación 6).

Figura 10. Ciclo termodinámico para calculo de ΔG° del equilibrio en solución.

0 0 0 0 solucion gas solvB solvA G G G G ∆ = ∆ + ∆ − ∆ (6)

Capitulo 3: resultados y discusión


Capitulo 3

Resultados y discusión

n este capítulo se presenta la SEP con los sustratos aislados en fase gas

realizada a nivel semiempírico PM3 y su posterior refinamiento con el

método DFT a nivel 631++G(d,p). También se presenta el resultado de

los índices de reactividades correspondientes a las funciones de Fukui para el iluro

con el anillo pirimidínico en la forma AP y APH⁺, para la molécula de piruvato y

para el estado de transición. Además, se presentan los valores del cambio de la

energía libre en condiciones estándar obtenido del análisis termodinámico

realizado para la reacción acido base entre el residuo altamente conservado

GLU139 y APIluro.

E



3.1 Exploración de la SEP con los sustratos aislados.

3.1.1 SEP a nivel semiempírico PM3.

La exploración de la SEP a nivel semiempírico con el hamiltoniano PM3, figuras

11 y 12, muestran que el mecanismo de reacción para la formación del LThDP

presenta la formación de un intermediario y la presencia de dos estados de

transición. La primera etapa del mecanismo consiste en el desplazamiento de la

molécula de piruvato hacia el cofactor ThDP, promoviendo el ataque nucleofílico

por parte del carbono C2 hacia el carbono carbonílico C2α de la molécula de

piruvato, alcanzando de esta forma el primer estado de transición ET1. Este estado

de transición está caracterizado con solo una frecuencia imaginaria de –407 cm⁻¹ y

que corresponde al stretching de la coordenada C2C2α. La barrera de activación

observada, calculada a nivel PM3, es aproximadamente de 29 Kcal/mol. Durante

esta etapa no se observa transferencia protónica. A continuación, el ataque

nucleofílico se completa formando el intermediario I, con una longitud de enlace

C2C2α de aproximadamente 1.55 Å, que corresponde a la longitud promedio de

un enlace simple carbonocarbono. Luego, una vez formado este intermediario, se

produce la transferencia protónica desde el grupo 4’NH2 al oxígeno carbonilico

O2α, formando finalmente el producto LThDP, vía el estado de transición ET2.

Este estado de transición también esta caracterizado con una sola frecuencia

imaginaria igual a –2004 cm⁻¹, correspondiente al stretching H4’O2α. La barrera

de activación observada, calculada a nivel PM3, para esta última etapa es

aproximadamente de 5 Kcal/mol.

Cabe destacar que estas barreras de activación se obtuvieron a partir de las

estructuras de los puntos críticos de la reacción que fueron optimizadas en fase gas

sin restricciones, una vez construida la SEP. Ya que no corresponden a las

estructuras con las que se construyo la superficie, las cuales fueron restringidas en

algunas variables tales como longitudes de enlaces, ángulos de enlaces y ángulos

diedros. Estas nuevas optimizaciones se realizaron utilizando el hamiltoniano PM3

en MOPAC 2009.



Figura 11. Representación 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3.

Figura 12. Representación bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3.

Los valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp y

ΦT para los diferentes puntos críticos de la SEP optimizados sin restricción de

variables se presentan en la tabla I. Para la región de los reactantes, del

intermediario y del producto se tomaron las estructuras de menor energía

encontradas en la SEP. Mientras que para los estados de transición se tomaron las

estructuras encontradas en las zonas de puntos de silla de la superficie.



En la figura 13 se muestran los resultados de las estructuras optimizadas en fase gas

de los puntos críticos de esta SEP. Además, para resaltar los cambios estructurales

ocurridos durante el transcurso de la reacción, en la tabla II se presentan los valores

de algunas longitudes y ángulos de enlace, pertenecientes principalmente a la

molécula de piruvato y al grupo imino del anillo pirimidínico. Por otro lado en la

tabla III, se presentan las cargas atómicas obtenidas del análisis poblacional de

Mulliken (MPA)³³’⁵⁵ para los átomos más relevantes involucrados en el ataque

nucleofílico y en la transferencia protónica. En esta última tabla y con el fin de

comparar la variación de la carga sobre los nitrógenos N4’, figura 14, también se

presentan las cargas atómicas del nitrógeno N3.

Figura 13. Estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET1, (C) intermediario I, (D) estado de transición

ET2, (E) producto LThDP.



Figura 14. Estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario I.

En el sistema de reactantes la molécula de piruvato presenta una geometría trigonal

plana, con valores de algunos de enlaces cercanos a los 120°. En esta región de la

SEP, el piruvato se encuentra a una distancia de 4.05 Å del intermediario iluro,

orientando su grupo carbonilo hacia el grupo imino cuaternario del anillo

pirimidínico. Por su parte el nitrógeno N4’ en esta región registra la mayor

densidad de carga positiva, en comparación a los demás puntos críticos de la SEP,

ya que a medida que avanza la reacción la carga atómica del nitrógeno N4’ adopta

valores negativos, específicamente en el segundo estado de transición y en el

producto. Además, el enlace N4’C4’ muestra una longitud de enlace de 1.33 Å, la

cual es menor que el valor de longitud de enlace promedio para un enlace doble

carbononitrógeno, correspondiente a 1.38 Å⁵⁴. Así, el anillo pirimidínico se

encuentra bajo la forma de APH⁺, acorde a lo postulado en literatura²⁷ para otras

enzimas ThDP dependientes.



A medida que la reacción avanza y se sitúa en la región del primer estado de

transición ET1, los valores de los ángulos de enlaces de la molécula de piruvato

comienzan a sufrir modificaciones. Claro ejemplo de esto es la disminución del

valor del ángulo de enlace C1C2αO2α desde 122° a 114°. Esto da cuenta del

cambio de geometría que sufre el piruvato, pasando de una geometría trigonal plana

a una geometría tetraédrica, producto del ataque nucleofílico realizado por el

carbono C2. Además como consecuencia de lo ocurrido en esta etapa de la

reacción, la densidad de carga negativa sobre el carbono C2α disminuye,

produciendo una variación en la carga atómica de 0.220 a 0.359 desde los

reactantes hasta el intermediario I. En tanto la longitud del enlace C2αO2α

aumenta de 1.21 Å a 1.34 Å, aumentando también la carga negativa sobre el

oxígeno O2α.

Una vez en la región del intermediario I, la molécula de piruvato se encuentra

enlazada al cofactor ThDP, adoptando una geometría tetraédrica con ángulos de

enlace cercanos a los 109°. Sin embrago la orientación del oxígeno carbonilico O2α

de la molécula de piruvato no ha sufrido modificaciones con respecto a la que

presentaba en el sistema de reactantes. Esto se debe principalmente a que el

cofactor ThDP no ha perdido su conformación tipo V, la cual se mantiene durante

todo el transcurso de la reacción, al igual que el ángulo de enlace H4’N4’C4’.

Como consecuencia, la transferencia protónica desde el grupo imino cuaternario

del anillo pirimidínico hacia el oxígeno carbonilico O2α se encuentra favorecida,

quedando el oxígeno O2α a una distancia de 1.68 Å con respecto al hidrógeno

H4’. Finalmente, el aumento de la densidad de carga negativa sobre el nitrógeno

N4’ al atravesar la zona del segundo estado de transición ET2 y posteriormente al

llegar a la formación del intermediario LThDP, indica que el anillo pirimidínico

queda bajo la forma de IP, acorde a los postulado en bibliografía para otras

enzimas ThDP dependientes²⁰’²¹. Con un valor de 1.31 Å para la longitud del

enlace N4’C4’ y una carga atómica sobre el nitrógeno N4’ de 0.276.

En lo que respecta al anillo pirimidínico, tanto los valores de las longitudes de

enlace, tabla IV, como los valores de los órdenes de enlace, tabla V, ambos

obtenidos por MPA, muestran que desde el sistema de reactantes y hasta la zona

del intermediario I, los enlace π del anillo se encuentran deslocalizados.



A medida que la reacción avanza y pasa desde el intermediario I hasta la formación

del producto LThDP, las longitudes de los enlaces C4’C5’ y C4’N3’ aumentan,

disminuyendo sus ordenes de enlace y formando enlaces simple carbonocarbono y

carbononitrógeno, respectivamente. Esto provoca que la densidad de carga

negativa sobre el carbono C4’ disminuya, tabla VI. Lo mismo ocurre con los

enlaces C6’N1’ y N1’C2’, los cuales también sufren un aumento en sus longitudes

de enlaces en estas etapas de la reacción, disminuyendo sus ordenes de enlace y

provocando un aumento en la densidad de carga negativa sobre el nitrógeno N1’

(tabla III). A pesar de esto, el nitrógeno N1’ se mantiene con una carga parcial

positiva durante toda la reacción. En cuanto a los enlaces C5’C6’ y C2’N3’, estos

mantienen sus ordenes de enlaces constantes durante toda la reacción, con valores

correspondientes a órdenes de enlaces intermedios entre un enlace simple y un

enlace doble.



De acuerdo a los resultados obtenidos de la exploración de la SEP utilizando el

hamiltoniano PM3, se propone el siguiente mecanismo para la formación de

intermediario LThDP, figura 15.

Figura 15. Mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario LThDP mediante cálculos a nivel PM3.

Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energía que se muestra

en la figura 16. La barrera de activación, en términos de energía electrónica, para

este mecanismo de reacción es de 32.65 Kcal/mol, considerando la barrera

energética del estado de transición ET2 con respecto al sistema de reactantes,

debido a que la etapa limitante de la reacción corresponde a la segunda etapa del

mecanismo⁵⁶.

Figura 16. Diagrama de energía para SEP a nivel semiempírico PM3.



3.1.2 Corrección DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p).

La corrección DFT de la SEP fue necesaria debido a las conocidas limitaciones del

método PM3, a causa de las simplificaciones en la descripción electrónica de este

método, como por ejemplo considerar solo a los electrones de valencia y la

utilización de un mínimo de funciones bases. Estas simplificaciones traen como

consecuencia valores erróneos de las cargas sobre los átomos de nitrógeno y una

sobre estimación de las barreras de activación²⁹’³³’³⁴. Sin embargo, los métodos

semiempíricos siguen siendo una buena alternativa para una exploración preliminar

de la superficie de energía potencial para un posterior refinamiento a nivel DFT ⁴⁰.

Figura 17. Representación 3D de la superficie de energía potencial a nivel DFT.

La corrección de la SEP se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita en la

sección 2.1. Los resultados de esta corrección se muestran en las figuras 17 y 18.

Esta nueva superficie de energía potencial muestra diferencias importantes en su

topología con respecto a aquella obtenida a nivel PM3. La zona correspondiente al

intermediario I, ya no presenta la estabilidad energética descrita por el método

PM3. Como consecuencia, las zonas de los puntos de silla correspondientes a los

estados de transición ET1 y ET2 han desaparecido. Ahora en esta nueva SEP, es

posible observar que la reacción ocurre mediante un mecanismo concertado, vía un

estado de transición asíncrono⁵⁷, donde la coordenada de reacción R1,

correspondiente al ataque nucleofílico del carbono C2 sobre el carbono carbonilico



C2α, se adelanta a la coordenada de reacción R2. De esta manera, se observa que a

medida que se acerca la molécula de piruvato hacia el cofactor ThDP, se comienza

a producir el ataque nucleofílico. Mientras esto ocurre, la distancia entre el oxígeno

O2α y el hidrógeno H4’ disminuye paulatinamente. Ya en la zona del estado de

transición ET y hasta la formación del producto LThDP, se lleva a cabo la

transferencia protónica, rompiéndose el enlace entre el hidrógeno H4’ y el

nitrógeno N4’ y formándose el enlace O2αH4’, mientras el ataque nucleofílico se

completa.

Figura 18. Representación 2D de la superficie de energía potencial a nivel DFT.

Debido a que la metodología implementada para corregir la SEP a nivel DFT solo

consistió en realizar cálculos single points sobre estructuras optimizadas a nivel

PM3, fue necesario realizar optimizaciones al nivel B3LYP/631++G(d,p) para los

puntos críticos de la SEP DFT. Para las regiones correspondientes al sistema de

reactantes y al producto LThDP, se tomaron las estructuras de menor energía

encontradas en la superficie. En tanto, para la identificación del estado de

transición ET se tomaron varias estructuras aproximadas, pertenecientes a la región

de punto de silla de la SEP. A todas las estructuras optimizadas se les realizaron

cálculos de frecuencia, para cuantificar la barrera energética del mecanismo en

términos del cambio de energía libre.



3.1.3 Optimización de los puntos críticos de SEP DFT al nivel

B3LYP/631++G(d,p).

Los valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp y

ΦT para los diferentes puntos críticos de la SEP DFT, optimizados al nivel

B3LYP/631++G(d,p), se presentan en la tabla VII. Además, en la figura 19 se

muestran los resultados de las estructuras optimizadas de los puntos críticos de la

SEP.

Figura 19. Estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel DFT optimizados en fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET, (C) producto LThDP.



En las tablas VIII y IX, se presentan los valores de algunas longitudes y ángulos de

enlace de los puntos críticos, pertenecientes principalmente a las moléculas de

piruvato, acido acético y al grupo imino del anillo pirimidínico, figura 20. En tanto,

en la tabla X se muestran algunos órdenes de enlace, obtenidos del cálculo NBO

(Natural Bond Orbital). Cálculo que realiza un análisis de los órdenes de enlaces y

de las hibridaciones basado en la población electrónica obtenida del análisis NPA

(Natural Population Analysis), análisis incorporado en el cálculo NBO⁵⁸’⁵⁹.

Figura 20. Estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT.



La optimización y caracterización del estado de transición calculado al nivel

B3LYP/631++G(d,p) mostró como resultado una única frecuencia imaginaria de

222 cm⁻¹, correspondiente al stretching simultaneo de las coordenadas de reacción

C2C2α yH4’O2α, como se muestra en la figura 21.

Figura 21. Estructura del estado de transición ET con el stretching simultáneo de las coordenadas de reacción C2C2α y H4’O2α.

Con la finalidad de corroborar que el estado de transición encontrado corresponde

a la reacción de interés, se llevó a cabo un cálculo IRC. El resultado condujo al

producto y al sistema de los reactantes previamente optimizados, tal como se

muestra en la figura 22.

Figura 22. Esquema de los cálculos IRC aplicados al estado de transición ET.



C H 3

O O H

N

N R 1

NH 2 C H 3

C H 3

O O H

N

N R 1

NH 2 +

C H 3

1.57 Å

:

.. ..

:

1.33 Å

..

De acuerdo a los resultados, se observa que en la zona de los reactantes el piruvato

se encuentra a 4.96 Å de distancia de la molécula iluro y a 3.51 Å de distancia con

respecto a la coordenada de reacción R2, orientando su grupo carboxílato hacia el

grupo 4’NH2. A medida que la molécula de piruvato se acerca al carbono C2 del

iluro, ésta cambia su orientación y es el oxigeno O2α quien queda más próximo al

grupo 4’NH2, otorgando la configuración tipo S presente en el LThDP. Una vez

que la reacción cruza la zona del estado de transición y hasta la formación del L

ThDP, la longitud de enlace entre el carbono C4’ del anillo pirimidínico y el

nitrógeno N4’ del grupo imino disminuye, debido a la transferencia protónica

desde el grupo 4’NH2 hacia el oxigeno O2α. Como consecuencia, la densidad de

carga negativa sobre el N4’ aumenta en la formación del LThDP, tabla XI. De

igual forma, la distancia del enlace de hidrógeno formado entre el residuo y el

nitrógeno N1’, disminuye desde 1.57 Å a 1.43 Å, sin producirse transferencia

protónica, quedando el anillo de pirimidínico en la forma de 4’iminopirimidina.

Además, estructuralmente se observa que durante toda la reacción el sitio

preferencial de protonación del anillo de pirimidina, correspondiente al nitrógeno

N1’, se encuentra desprotonado, figura 23, al igual que en la estructura cristalina de

la AHAS⁶⁰. Mostrando que el grupo imino cuaternario puede formarse debido a la

estabilización de la carga negativa sobre el nitrógeno N1’ por parte del enlace de

hidrógeno formado con el residuo, el cual esta a una distancia de 1.57 Å del

nitrógeno N1’ en la zona de los reactantes y en el estado de transición ET.

Figura 23. Estabilización por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de protonación del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R¹ igual a 5(2[hidroxidifosfato]etil)4metil

1,3tiazol3io.



Adicionalmente, el anillo pirimidínico durante la reacción se encuentra con sus

enlace π deslocalizados, según las longitudes y órdenes de enlace que muestra el

anillo, tablas XII y XIII, respectivamente. En tanto, las cargas parciales para los

átomos de anillo pirimidínico, obtenidas del análisis NBO, se presentan en la XIV.

Así, las principales diferencias que ha otorgado el refinamiento de la SEP a nivel

B3LYP/631++G(d,p) en comparación a la construida con el método PM3, recaen

principalmente en que el mecanismo de reacción ocurre de manera concertada y

no por etapas y que para la formación del grupo imino del anillo pirimidínico no

necesaria la protonación del nitrógeno N1’. De esta manera, según los resultados

obtenidos es posible que el anillo pirimidínico no se encuentre bajo la forma de

APH⁺ al momento de realizar tanto el ataque nucleofílico sobre el carbono

carbonílico C2α, como la transferencia protónica hacia el oxigeno carbonilico O2α.



En virtud de los resultados obtenidos de la SEP corregida a nivel DFT, se propone

el siguiente mecanismo, figura 24, para la formación del intermediario LThDP.

Figura 24. Mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario LThDP mediante cálculos a nivel B3LYP/631++G(d,p).

Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energía que se muestra

en la figura 25. La barrera de activación observada para la formación del

intermediario LThDP es de aproximadamente 21 Kcal/mol. El valor de esta

barrera de activación está por debajo de la barrera de activación teórica informada

en otros estudios, la cual tiene un valor de 35.83 Kcal/mol según cálculos realizados

en fase gas y con los sustratos aislados a nivel DFT²⁴. La barrera de activación

experimental es de 16.21 Kcal/mol ²².

Figura 25. Diagrama de energía para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p).



3.2 Estudio de reactividad.

Con el fin de complementar los resultados anteriores se realizó un estudio de

reactividad en términos de las funciones de Fukui y de las diferentes especies

participantes en la reacción. Las funciones y se calcularon de acuerdo a la

metodología implementada en Jaguar 7.7⁴⁴’⁴⁵ y los resultados se muestran en la

figura 26, en la cual las funciones se visualizan como isosuperficies. Para las

moléculas de APIluro, APH⁺Iluro y para el estado de transición ET obtenido de

la SEP DFT se calculó la función . En tanto, para la molécula de piruvato se

calcularon las funciones y . Las zonas azules de la función corresponden a

regiones que pierden densidad electrónica, cuando la molécula se somete a un

ataque electrofílico o cuando la molécula actúa como un nucleófilo. Por otro lado,

las zonas rojas de la función corresponden a regiones que ganan densidad

electrónica cuando la molécula sufre un ataque nucleofílico o cuando la molécula

actúa como un electrófilo⁴².

Figura 26. Funciones de Fukui para el (A) APH⁺Iluro, (B) APIluro, (C) estado de transición ET y (D) piruvato. Función de Fukui para (E) piruvato.

f + f −

f + f −

f −

f +

f −

f − f −

f +

f +



Los átomos que no poseen regiones coloreadas no presentan reactividad. En este

sentido, en la estructura del iluro en la forma APH⁺ se puede apreciar que los

centros nucleofílicos más importantes corresponden a los oxígenos carboxílicos del

residuo, en cambio el carácter nucleofílico del carbono C2 del anillo de tiazolio es

muy bajo. Sin embargo, en el caso del iluro bajo la forma AP se observa que el

átomo con mayor carácter nucleofílico corresponde al carbono C2, como es de

esperar para que se produzca el ataque nucleofílico a la molécula de piruvato. Por

otro lado, los índices atómicos de Fukui ⁴⁷’⁴⁸ calculados sobre el carbono C2,

resultan ser 0.34 y 0.00 para las formas AP y APH⁺, respectivamente, figura 27.

Estos resultados sugieren que el ataque nucleofílico del iluro sobre el piruvato

requiere al iluro en su forma AP (APIluro).

Figura 27. Índices atómicos de Fukui para APIluro y APH⁺Iluro. Con R1= CH2CH2OH.

En lo que respecta al sustrato, la molécula de piruvato, muestra un importante

carácter nucleofílico sobre todos los átomos de oxígenos y el carbono C2α muestra

características de electrófilo. Los índices de Fukui atómicos para el carbono C2α y

el oxigeno carbonilico son = 0.51 y el oo = 0.24, figura 28. Estas características

complementarias entre APIluro y el piruvato sugieren que la reacción de

formación del LThDP ocurra mediante el mecanismo postulado a nivel DFT.

Figura 28. Índices atómicos de Fukui (A) y (B) para la molécula de piruvato.

2 C f −

2 C f α +

2 O f α −

f −

f − f +



En el estado de transición ET se puede observar que las funciones de Fukui antes

mencionadas se mantienen y los lóbulos están dirigidos en la orientación correcta.

Es decir el lóbulo del átomo C2 está orientado hacia el carbono C2α y el lóbulo del

oxigeno carbonilico está orientado hacia el hidrógeno del grupo 4’NH2. En este

estado de transición postulado, el índice local de Fukui sobre el oxigeno carbonilico

de la molécula de piruvato alcanza el valor máximo de 0.27, figura 29, que

comparado con su respectivo valor en la molécula de piruvato aislada de 0.24,

indica el aumento en el carácter nucleofílico de este oxigeno como consecuencia

del ataque del iluro sobre el carbono C2α.

Figura 29. Índices atómicos de Fukui y , en paréntesis, para el estado de transición

ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.

En la figura 29, la función condensada de Fukui se muestra entre paréntesis.

Aquí se observa que otra de las variaciones presentes en el estado de transición ET,

es la disminución de los índices de Fukui para los nitrógenos N1’, N4’ y para el

carbono C2. La función condensada de Fukui para el carbono C2α también

disminuye en esta etapa de la reacción.

En definitiva, estos resultados complementan el mecanismo de reacción postulado

a nivel DFT. La nula reactividad del carbanion C2 cuando el anillo pirimidínico se

encuentra bajo la forma del APH⁺ deja en evidencia que al momento del ataque

nucleofílico el anillo pirimidínico se encuentra con la forma de AP.

f − f +

f −

f +

f +



3.3 Análisis termodinámico.

Los resultados de la exploración de la SEP y de la optimización del estado de

transición a nivel DFT sugieren que durante el ataque nucleofílico del iluro, a la

molécula de piruvato, el anillo pirimidínico se encuentra con el nitrógeno N1’

desprotonado y el nitrógeno N4’ en su forma imino. Además, los cálculos IRC

indican que el producto LThDP se encuentra también con el nitrógeno N1’

desprotonado y el nitrógeno N4’ se encuentra en su forma imino, a diferencia de lo

reportado para enzimas ThDP dependientes²⁰’²⁷.

Con la finalidad de corroborar estos resultados y determinar el estado de

protonación del nitrógeno N1’ del anillo pirimidínico durante la reacción, desde el

punto de vista termodinámico se ha estudiado el equilibrio acido base entre el

residuo altamente conservado GLU139, simulado con una molécula de acido

acético y las formas AP y APH⁺ del iluro, figura 30, considerando medios de

diferente constante dieléctrica. En la tabla XV, se presentan los valores de los ΔG°

para cada uno de los medios y en la figura 30 se muestran algunas longitudes de

enlace (Å) y cargas parciales del tipo NBO para algunos de los átomos más

relevantes de la reacción.

Figura 30. Equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1= CH2CH2OH.



En este sentido, el equilibrio involucra directamente la estabilidad de las bases

conjugadas formadas, contrastando la factibilidad de la protonación del nitrógeno

N1’ del anillo pirimidínico por parte del residuo GLU139. Los resultados que se

muestran en la tabla XV indican que en los tres medios considerados la especie

termodinámicamente favorecida es el iluro con el nitrógeno N1’ desprotonado, la

forma APIluro. Este resultado está en concordancia con los resultados descritos en

las secciones anteriores, es decir, durante el ataque nucleofílico el anillo

pirimidínico se encuentra con el nitrógeno N1’ desprotonado al igual que el

producto LThDP formado. Una mayor estabilización de la base conjugada de la

forma APH⁺ debido a la deslocalización de la carga negativa del nitrógeno N1’ en

el anillo pirimidínico, permite que la forma AP sea energéticamente más estable.

En comparación, la base conjugada del acido acético posee una menor cantidad de

estructuras resonantes capaces de estabilizar la carga negativa sobre el oxigeno O1’.

Estos resultados además, presentan una concordancia con el estado de protonación

del residuo GLU139 encontrado en las diferentes estructuras cristalinas obtenidas

de la AHAS¹⁴’¹⁷’⁶⁰ y con los cálculos de los pKa experimentales del nitrógeno N1’

y del grupo carboxílato del residuo GLU139, que tiene valores de 7.0 y 9.1,

respectivamente, donde el rango de pH de mayor actividad catalítica que presenta

la AHAS es de 7.5, aproximadamente²¹. Sin embargo, también se observa una

fuerte dependencia del valor de ∆G° con el medio, lo que sugiere la posibilidad que

en el sitio activo de la enzima la forma APH⁺ pueda existir debido a

estabilizaciones producidas por los residuos aminoacídicos y que por ende es

posible que la forma APH⁺ pueda participar en otras etapas del ciclo catalítico de la

AHAS.

Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones

Licenciatura en QuímicaQuímico Universidad de Concepción 41

Capitulo 4

Conclusiones y proyecciones

n este capítulo se presentan las conclusiones referentes a los resultados

obtenidos en la presente tesis. Entre ellas se encuentran la determinación

del mecanismo de reacción para la formación del intermediario LThDP,

la limitación del análisis energético de la reacción al trabajar en fase gas y con los

sustratos asilados y la disyuntiva existente entre cual es la forma del anillo de

pirimidina en el intermediario iluro a la hora de llevar a cabo el primer paso del

ciclo catalítico. Además se presentan las posibles proyecciones necesarias para

complementar las hipótesis investigadas.

E



4.1 Conclusiones

Los resultados de la presente tesis permiten concluir lo siguiente:

1. La reacción de formación del intermediario LThDP ocurre vía un

mecanismo concertado, es decir la carboligacion C2–C2α y la transferencia

protónica desde el grupo 4’NH2 hacia el oxigeno carbonilico O2α de la

molécula de piruvato ocurren de forma simultánea.

2. Durante la reacción el átomo N1’ del anillo pirimidínico esta desprotonado.

3. En todo momento el cofactor ThDP se encuentra estabilizado a través de

un fuerte enlace de hidrogeno formado entre el anillo pirimidínico y el

grupo carboxílico del residuo acido glutámico, a 1.57 Å, estabilizando la

eventual carga negativa sobre el átomo N1’.

4. La estructura optimizada del estado de transición muestra valores máximos

de los índices atómicos de Fukui sobre el oxigeno carbonilico de 0.27

comparado con el valor de 0.24 del piruvato aislado, indicando el aumento

de su carácter nucleofílico como consecuencia del ataque del átomo C2 del

iluro sobre el carbono C2α de la molécula de piruvato. También se observa

que la función de Fukui ⁻ sobre el átomo C2 está orientada hacia el átomo

C2α del piruvato evidenciando el ataque nucleofílico en curso.

5. La barrera de activación observada es de 21.87 Kcal/mol en

correspondencia al valor reportado en literatura de 16.21 Kcal/mol.

6. La estructura optimizada del producto LThDP muestra que el átomo N4’

está en su forma imino mientras que el nitrógeno N1’ esta desprotonado.

7. Los resultados además indican que en los tres medios considerados la

especie termodinámicamente favorecida es el iluro con el nitrógeno N1’

desprotonado.

8. La participación del anillo pirimidínico en la forma APH⁺ durante la

reacción entre el piruvato y el iluro no está avalada por los cálculos

químicos cuánticos de esta tesis.



4.2 Proyecciones

Con el fin de corroborar el mecanismo de reacción obtenido, cuantificar la

estabilización otorgada por el ambiente enzimático en la reacción y

principalmente para determinar cuál de las dos formas tautomericas del anillo

de pirimidina es la involucrada en la formación del intermediario LThDP, para

el presente trabajo de tesis se proponen como proyecciones:

• Realizar simulaciones de dinámica molecular, para encontrar una

estructura representativa del sitio activo de la enzima. Con los resultados

de las simulaciones determinar aquellos aminoácidos que aporten

mayor estabilidad al cofactor y a la molécula de piruvato, mediante

cálculos de energías de interacción²³.

• Con el resultado de la simulación de dinámica molecular realizar la

exploración de la superficie de energía potencial, mediante cálculos

híbridos QM/MM, con la finalidad de incorporar el ambiente

enzimático en la formación del LThDP y cuantificar su efecto sobre el

mecanismo de reacción propuesto.

Bibliografía


Bibliografía

[1] Fersht, A. Estructura y mecanismo de las enzimas. Barcelona: editorial Reventé S.A. 1980. p 35. [2] Peña, Arroyo, Gómez, Tapia. Bioquímica. México D.F: editorial Limusa. 2004. p 8389. [3] Dzyaloshinskii, I. E.; Lifshitz, E. M.; Pitaevskii, L. P. Soviet Physics Uspekhi. 1961. 4 (2): 153–176. [4] Alberts, Bray, Hopkins, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Introducción a la biología celular. Madrid: editorial medica panamericana S.A. 2006. p 119157. [5] Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Lusick. Biología molecular del gen, sexta edición. Madrid: editorial medica panamericana. 2008. p 80. [6] Peretó, J.; Sendia, R.; Pamblanco, M.; Baño, C. Fundamentos de bioquímica. Madrid: editorial Universidad de Valencia. 2007. p 5960. [7] Koshland, D. E. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1958. 44: 98104. [8] Bender, M. J; Brubacher, L. J. Catálisis y acción enzimática. Barcelona: editorial Reventé S.A. 1997. p 1930. [9] Devlin, T. M. Bioquímica, cuarta edición. Barcelona: editorial Reventé S.A. 2004. p 414450. [10] Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NCIUBMB). EC2 Transferase Nomenclature. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC2/. [11] McCourt, J. A.; Duggleby, R. G. Amino Acids. 2006. 31:173210. [12] Chipman, D. M.; Barak, Z.; Scholss J. V. Biochimica et Biophysica Acta. 1998. 1385: 401419. [13] Chipman, D. M.; Duggleby, R. G.; Tittman, K. Current Opinion in Chemical Biology. 2005. 9: 475481. [14] Pang, S. S; Duggleby, R. G.; Guddat, L. W. Journal of Molecular Biology. 2002. 317: 249262. [15] Friedemann, R.; Naumann, S. Journal of Molecular Structure: Theochem. 2003. 630: 275281. [16] Lie, M. A.; Schiott, B. Journal of Computational Chemistry. 2007. 29, 7: 10371047. [17] BarIlan, A.; Balan, V.; Tittman, K.; Golbik, R.; Vyazmensky, M.; Hubner, G.; Barak, Z.; Chipman, D.M. Biochemistry. 2001. 40: 11946 11954. [18] Delgado, E. J.; Alderete, J. B.; Jaña. G. A. Journal Molecular Modeling. 2011. 11: 27359. [19] Singh, B. K; Schmitt, G.K. FEBS Letters. 1989. 258, 1:113115. [20] Nemeria, N.; Baykal, A.; Joseph, E.; Zhang, S.; Yan, Y.; Furey, W.; Jordan, F. Biochemistry. 2004. 43: 65656575. [21] Nemeria, N.; Chakraborty, S.; Balakrishnan, A.; Jordan, F. Journal FEBS. 2009. 276: 24322446. [22] Tittmann, K.; Golbik, R.; Uhlemann, K.; Khailova, L.; Schneider, G.; Patel, M.; Jordan, F.; Chipman, D. M.; Duggleby, R. G.; Hubner, G. Biochemistry. 2003. 42: 78857891. [23] Jaña, G.; Jiménez, V.; VillàFreixa, J.; PratResina, X.; Delgado, E.; Alderete, J. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2010. 78: 17741788.

Bibliografía


[24] Xiong, Y.; Liu, J.; Yang, G. F.; Zhan, C. G. Journal of Computational Chemistry 2010. 31: 15921602. [25] Berg, J. M.; Stryer, L.; Tymoczko, J.L. Bioquímica. España: editorial Reventé S.A. 2007. p 17. [26] Ege, S. Química orgánica: estructura y reactividad. Volumen 2. Barcelona: editorial Reventé S.A. 2000. p 1202. [27] Paramasivam, S.; Barakrishnan, A.; Dmitrenko, O.; Godert, A.; Begley, T. P.; Jordan, F.; Polenova, T. Journal of Physical Chemistry B. 2011. 115: 730736. [28] Stewart. J. J. P. Journal of Computational Chemistry. 1989. 10 (2): 209220. [29] Stewart. J. J. P. Journal of Computational Chemistry. 1989. 10 (2): 221264. [30] Stewart. J. J. P. Frank. J. Q. C. P. E. Program. MOPAC: A General Molecular Orbital Package. Colorado Spring. Colorado. 1987. [31] Jandel Scientific Corporation. SigmaPlot. 2000. [32] Anders, E.; Koch, R.; Freunscht, P. Journal of Computational Chemistry. 1993 14:13011312. [33] Cuevas, G.; Cortés, F. Introducción a la química computacional. México D.F: Progreso, S.A. 2003. P 5969, 103126, 140169. [34] Levine, I. N. Mecánica Cuántica. Madrid: Editorial Pearson, educación S.A.; 5ª Edición. 2001. p 467679. [35] Parr, R. G.; Yang W. Densityfunctional Theory of Atoms and Molecules. Oxford University Press. Nueva York. 1989. p 7084 [36] Becke, A. D. Physical Review A. 1988. 38(6): 30984000. [37] Lee, C.; Yang, W.; Parr, R. G. Physical Review B. 1988. 37(2): 785789. [38] M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Rob, J. R. Cheeseman, J. A. Montgomery Jr., T. Vreven, K. N. Kudin, J. C. Burant, J. M. Millam, S. S. Iyengar, J. Tomasi, V. Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scalmani, N. Rega, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, M. Klene, X. Li, J. E. Knox, H. P. Hratchian, J. B. Cross, V. Bakken, C. Adamo, J. Jaramillo, R. Gomperts, R. E. Stratmann, O. Yazyev, A. J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J. W. Ochterski, P. Y. Ayala, K. Morokuma, G. A. Voth, P. Salvador, J. J. Dannenberg, V. G. Zakrzewski, S. Dapprich, A. D. Daniels, M. C. Strain, O. Farkas, D. K. Malick, A. D. Rabuck, K. Raghavachari, J. B. Foresman, J. V. Ortiz, Q. Cui, A. G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B. B. Stefanov, G. Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I. Komaromi, R. L. Martin, D. J. Fox, T. Keith, M. A. Al Laham, C. Y. Peng, A. Nanayakkara, M. Challacombe, P. M. W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M. W. Wong, C. Gonzalez, and J. A. Pople, Gaussian, Inc., Wallingford, CT, 2003. [39] Fukui, K. Accounts of Chemical Research. 1981. 14 (12): p 363–368. [40] Lewars , E. G. Computational chemistry: Introduction to the theory and applications of molecular and quantum mechanics. 2ª Edition. London: Springer. 2011. p 497509. [41] Parr, R. G.; Yang W. Journal American Chemical Society. 1984. 106: 4049 4150. [42] Contreras, R. R.; Fuentealba, P.; Galván, M.; Pérez, P. Chemical Physical Letters. 1999. 304: 405413. [43] Jaguar 7.7, Schrodinger L.L.C. New York N.Y. 2010. [44] Jaguar 3.0, Schrodinger, Inc., 121 SW Morrison suite 1212, Portland, OR 97204, USA, 1997. [45] Maestro, version 9.1, Schrödinger, LLC, New York, NY. 2010.

Bibliografía


[46] De Proft, F.; Van Alsenoy, C.; Peeters, A.; Langenaeker, W.; Geerlings, P. Journal of Computational Chemistry. 2002, 23, 1198. [47] Mulliken, R. S. The journal of Chemical Physics. 1955. 23(10): 18331840. [48] Aurell, M. J.; Domingo, L. R.; Pérez, P.; Contreras, R. Journal Chemical Physics. 2005. 60 (50): 1150311509. [49] Ochterski, J. thermochemistry in Gaussian. The official Gaussian Website. April 19. 2000. http://www.gaussian.com/g_whitepap/thermo.htm [50] Barone, V.; Cossi, M. The Journal of Physical Chemistry A. 1998. 102: 19952001. [51] Cossi, M.; Rega, N.; Scalmani, G.; Barone, V. Journal of Computational Chemistry. 2003. 24: 669681. [52] Gutierrez, E. Química. Barcelona: editorial Reventé S.A. 1985. p 189. [53] Kamerlin, S. C. L.; Chu, Z. T.; Warshel, A. The Journal of Organic Chemistry. 2010. 75: 63916401. [54] Brown, T. L.; Lemay, E.; Bursten, B. E.; Burdge, J. R. Química: la ciencia central. Mexico D.F: Pearson educación. 2004. p 305. [55] Fraga, S. Química Teórica: estructura, interacciones y reactividad. Madrid: consejo superior de investigaciones científicas. 1987. p 216220. [56] Murdoch, J. R.; Journal of Chemical Education. 1981. 58(1): 3236. [57] Kirby, A.J.; Hollflder, F. From enzyme models model enzymes. London: Royal Society of Chemistry; 1st Edition. 2011. p 181. [58] Reed, A. E.; Curtiss, L. A.; Weinhold, F. Chem. Rev.1988. 88: 899926. [59] NBO 5.0. E. D. Glendening, J. K. Badenhoop, A. E. Reed, J. E. Carpenter, J. A. Bohmann, C. M. Morales, and F. Weinhold Theoretical Chemistry Institute, University of Wisconsin, Madison, WI, 2001. [60] Pang, S.S.; Guddat, L. W.; Duggleby, R.G. The Journal of Biological Chemistry. 2003. 28: 76397644.