heterogeneidad celular en tumores de mama humanos
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Heterogeneidad celular en tumoresHeterogeneidad celular en tumoresde mama humanos :de mama humanos :
modificaciones del crecimiento ymodificaciones del crecimiento ydiferenciación por hormonas ydiferenciación por hormonas y
factores de crecimientofactores de crecimiento
Resnicoff, Mariana
1989
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Resnicoff, Mariana. (1989). Heterogeneidad celular en tumores de mama humanos :modificaciones del crecimiento y diferenciación por hormonas y factores de crecimiento.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2198_Resnicoff.pdf
Cita tipo Chicago:Resnicoff, Mariana. "Heterogeneidad celular en tumores de mama humanos : modificaciones delcrecimiento y diferenciación por hormonas y factores de crecimiento". Tesis de Doctor. Facultadde Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1989.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2198_Resnicoff.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
"HETEROGENEIDAD CELULAR EN TUMORES DE MAMA HUMANOS: MODIFICACIONES
DEL CRECIMIENTO l DIFERENCIACION POR HORMONASl FACTORES DE
CRECIMIENTO"
Autor: Mariana Resnicoff
Director: Estela E. Medrano
Lugar gg trabajo: Instituto de Investigaciones Bioquímicas
“Fundación Campomar"
Tesis para optar a1 tituio de Doctor en Ciencias Quimicas
Añ01989¿(y-,2.
“A mis padres“
AGRADECIMIENTOS
Muchas han sido las personas e instituciones que de uno u otro
modo colaboraron en la realización de este trabajo de tesis.
Quiero expresar aqui mi especial agradecimiento:
- a la Dra. Estela E. Medrano, directora de esta tesis, por su
entusiasmo, por el aporte de ideas y proyectos siempre
fructiferos, por escuchar atentamente mis propuestas y por
haberme permitido libertad de acción en el trabajo.
- a la "Fundación Campomar", en la persona de los miembros de la
Comisión Directiva, por haber permitido la realización del pre
sente trabajo en el Instituto de Investigaciones Bioquímicas.
- a la Fundación “Maria Calderón de la Barca" por haberme otorgado
la beca que posibilitó este trabajo de investigación y por haber
confiado en mi durante estos años.
- a Eduardo Cafferata por sus prácticas enseñanzas en las técnicas
de cultivo de células y por su eficiente y responsable colabora
ción técnica durante todos estos años.
- a mis compañeros de laboratorio -Eduardo Cafferata, Marcela
Ferraro, Silvia González y Ariel Nilner- y a Tony Coira, por los
momentos tan agradables y divertidos que compartimos en nuestro
lugar de trabajo y por haber permitido, gracias a su amistad y
afecto, que todo resultara más fácil y placentero.
- a Fernando Larcher, Silvana Ragone, Beatriz Molinari, Irene
Larripa, Irma Slavutsky, Inés Bravo y Osvaldo Podhajcer por Su
colaboración en la realización de algunos experimentos.
- a Hiïda Gasparolí por su constante dedicación, apoyo y colabora
ción proporcionados durante estos años.
- a Irene Cangiano por su disposición y dedicación en 1a trans
cripción y procesamiento de textos de esta tesis.
- a Fernando Massironi y a la Sra. Beiïe Hoïf por haberme simpli
ficado los trámites administrativos.
Finaïmente quiero agradecer muy especiaïmente a mis padres por
su constante apoyo, incïusive económico.
Parte de los resuitados descriptos en el presente trabajo de tesis
ha sido publicada en ios siguientes articuios:
“13-cis-retina1 stimuïates proiiferation and induces intra
nucïear protein accumuiation in the human mammarytumor ce11s
MCF-7“.
M. Resnicoff and E.E. Medrano.
(1987) Biochem. and Biophys. Res. Commun.1432309-315.
“Subpopulations of MCF-7 ceiis separated by Percoil gradient
centrifugation: a mode] to anaiyze the heterogeneity of human
breast cancer".
M. Resnicoff, E.E. Medrano, O.L. Podhajcer, A.I. Bravo, L. Bover
and J. Mordoh.
(1987) Proc. Nati. Acad; Sci. USA84:7295-7299.
"Effect of estradio] and tamoxifen on the anchorage-independent
growth of the subpopuiations derived from MCF-7breast carcinoma
ceiis. Cytogenetic anaiysis of the stem ceii subpopuiation“.
O.L. Podhajcer, M. Resnicoff, L. Bover, E.E. Medrano, I.
Sïavutsky, I. Larripa and J. Mordoh.
(1988) Expt]. Ceïl Res. l79:58-64.
“Céiulas epiteiioides de tumor de mamahumano: un modelo para e]
estudio de factores de crecimiento Iiberados durante e] proceso
de 1a coaguïación".
E.E. Medrano, M. Resnicoff, F. Larcher, E.G.A. Cafferata y M.
Vizcargüénaga.
(1988) Fisiopatologïa y cïïnica de ias hormonas de crecimiento,
editada por 1a Sociedad Argentina de Endocrinología, p. 25-38.
l'Growth factors and hormones which affect surviva], growth and
differentiation of the MCF-7stem cells and their descendants".
M. Resnicoff and E.E. Medrano.
(1989) Exptï. Cel] Res. (en prensa).
“Reïevant aspects of MCF-7human breast tumor cel] growth which
are expressed onïy in the absence of serum“.
E.E. Medrano, M. Resnicoff, E.G.A. Cafferata, F. Larcher, 0.L.
Podhajcer, L. Bover and B. M01inari.
(1989) Expt]. Ce11 Res. (en prensa).
ABREVIATURAS
ADN:
AMPC:
ARN:
ARNm:
BSA:
But:
CEA:
Ci:
cpm:
DMSO:
E2:
EDTA:
EGF:
FBS:
GTP:
Ig:
IGF:
kDa:
mM:
MQD:
ng:
PBS:
PDGF:
ácido desoxirribonucieicoadenosina 5' monofosfato cïciico
ácido ribonucieico
ácido rib0nucieico mensajero
seroaibümína bovina
butirato de sodio
antïgeno carcinoembrionarioCurie
cuentas por minuto
dimetiisuifóxido
17 FJ—estradioiácido etiiendiamino tetraacético
factor de crecimiento epidérmicosuero feta] bovino
guanosina 5' trifosfato
inmunogiobuiina
factor de crecimiento semejante a insuiinakilodaitons
moiar
medio condicionado
metionina
miiimoïar
medio químicamente definido
nanogramo
soïución saiina de buffer fosfato
factor de crecimiento derivado de pïaquetas
Pg:
PMSF:
RE:
rpm:
SDS:
SGF:
TCA:
TGF:
Thr:
TLI:
Tris:
ug:
prostaglandinafenil meti] sulfonil fluoruro
l3-cis-retina1
receptores estrogénicos
revoluciones por minuto
sodio dodecil suifato
factor de crecimiento de sarcoma
ácido tricioroacéticofactor de crecimiento transformante
trombina
indice de marcación con timidina
2-amino-2-hidroximeti1-1,3-propanodiolunidades
microgramo
INDICE
Página NQ
.00...lo...0...0.00000000IOOIIOOCCOOOOOO0.0|... 1
INTRODUCCION
1. Heterogeneidadtumoral............................. 92. Reguïaciónde] crecimientocelular ................. 103. Crecimiento autócrino en céïuias transformadas ..... 16
4. Cultivo de Iïneas celuiares tumorales humanas ...... 19
5. Factoresdecrecimiento............................ 215.1. Factorestipo I: PDGF............................ 235.2. Factores tipo II: somatomedinas.................. 265.3. FactorestipoIII ................................ 285.3.1.EGF............................................ 295.3.2.Trombina....................................... 315.3.3. I0.0.0.0.00-¡000.000.000.0006. Efectores o moduiadores de] crecimiento ceiular .... 35
6.1. .0.0.00000000QOOOOOOIQOOIOO0.0.006.2. OOOOOODQOOOIOODOOOOIOOOO00......
6.3. Compuestos retinoideos: derivados de 1a Vitamina A 38
o...ooooooooclooooolc0000.00.00
MATERIALES Y METODOS
1.Células............................................2. Mediosdecultivo..................................3. Mediosde cultivo libres de metionina ..............4. Factoresdecrecimiento............................5. Moduladoresde la diferenciación celular ...........6. Cultivocelular....................................7. Curvasde crecimientocelular ......................8. Marcaciónde proteinas con (355)-metionina .........
8.1. Determinación de las proteinas marcadas con
(355)-metionina secretadas al medio de cultivo ...
8.2.1. Determinación de las proteinas intracelulares
marcadascon(355)-metionina...................8.2.2. Determinación de las proteínas intracelulares
(nucleares y citoplasmáticas) marcadas con(355)-metionina................................
9. Determinaciónde proteinas.........................10. Medicióndetransporte............................11. Determinación de queratinas11.1. Análisisde Westernblot ........................11.2. Técnicainmunocitoquïmica.......................12. Marcación de proteinas con (32P)-ortofosfato ......
13. Separación de las células MCF-7en subpoblaciones
14. Ensayosclonogénicos en agar blando ...............15. Determinación del efecto de factores de crecimiento
sobrecélulasquiescentes.........................
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20.
21.
22.
23.
Determinación de] “TLI”: porcentaje de nücieos mitó
ticos marcadoscon metii-(3H)-timidina ............
Determinación de receptores estrogénicos (RE) por
1a técnica inmunocitoquïmica......................Determinación de antïgeno carcinoembrionario (CEA)
por 1a técnica inmunocitoquimica..................Determinación de 1a proteina p21, codificada por el
gen ras, utiiizando 1a técnica inmunocitoquïmica ..
Tinción de iïpidos con “oii red 0" ................Obtenciónde Ios medioscondicionados .............
una...ooo-ooo-oo-ooooooo-o.o.ol.OIOOOIOICOOOOOOOOOODOIOO
RESULTADOS
A. Anáiisis de heterogeneidad ce1u1ar
A.1. Distribución de 1as céiuïas en gradientes de densl
A.2. Anáiisis de Ias distintas subpobiaciones
A.2.1. Capacidad de generar otras subpobiaciones
oba000......oonoooocoooootooo'oolsoooooooloooo
A.2.2.Capacidadproiiferativa........................A.2.3. Crecimiento independiente de] anciaje ..........A0204.
A.2.4.1.
A.2.4.2. Determinación de]
A.2.4.3.
Expresión de distintos marcadores ceiuiares ....
Expresión de la proteina p21, codificada por
e] oncogenras ...............................contenido de receptor estro
000000.0.00.00000000000.0000000000Expresión de antïgeno carcinoembrionario (CEA)
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60
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68
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71
A.2.4o4o en...¡co-oooosooonoooooo.A.2.5. Respuesta a distintos factores de crecimientoA.2.5.1. Efecto de diversos factores de crecimiento so
bre ias subpobiacionesquiescentes ...........A.2.5.1.1.Efectodeinsuiina.........................A.2.5.1.2.Efectode trombina.........................A.2.5.1.3.EfectodePgF2c¿...........................A.2.5.1.4.Efectodeestradio]........................A.2.5.1.5. Efecto de PDGF, EGF y una combinación de
ambos.......................................A.2.5.2. Efecto de diversos factores de crecimiento so
bre 1as subpobiaciones en activa pro1iferaci6nA.2.5.2.1.Efectodetrombina.........................A.2.5.2.2.EfectodePgF2c4...........................A.2.5.2.3.EfectodeEGF..............................A.2.5.2.4. Efecto de la combinación PDGF/EGF..........
A.2.5.3. Efecto de factores de crecimiento sobre 1a su
pervivencia de 1as sobpoblaciones Cultivadasen un mediolibre de suero ...................
A.2.5.3.1. Rescatecontrombina.......................A.2.5.3.2. RescateconPgF2°<.........................A.2.5.3.3.Rescateconestradio] ......................A.2.6. Fosforiïación de las proteinas presentes en 1as
subpobïaciones cultivadas en presencia o ausenciadesuero...................................
A.3. Análisis citogenético de 1a subpobiación E y de la
0......0.0000000IODIOOOOOO0.0.0....
72
72
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78
81
81
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83
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88
A.4. Interacciones entre ias subpobiaciones
A.4.1. Contribución de 1a Subpobiación E a1 crecimiento
de 1a iinea ce1u1arMCE-7......................A.4.2. Efecto de ios medios condicionados
A.4.2.1. Efecto de ios medios condicionados sobre 1a
proiiferación ceiuiarA.4.2.1.1. Efecto de 10s medios condicionados sobre 1a
proiiferación de 1a subpobiaciónE .........A.4.2.1.2. Efecto de ios medios condicionados sobre 1a
proiiferación de 1a subpobiaciónF .........A.4.2.2. Efecto de ios medios condicionados sobre e]
crecimiento independiente de] anciaje
A.4.2.2.1. Efecto de] medio condicionado por 1a subpo
b1aci6n F sobre e] crecimiento independiente
de] anciaje de 1a subpobiación E ...........
A.4.2.2.2. Efecto de] medio condicionado por 1a subpo
biación E sobre e] crecimiento independiente
de] anclaje de 1a SubpoblaciónF ...........B. Crecimiento de ias céiuias MCE-7en e] medio iibre
de suero
B.1. Requerimientode factores de crecimiento .........
B.1.1. Requerimiento de factores de crecimiento manifes
tado a1 piaquear ias cé1u1as a baja densidad ...
B.1.2. Requerimiento de factores de crecimiento manifes
tado a1 piaquear 1as céiuias a aita densidad
B.2. Ultraestructura de 1as céluïas MCE-7cuitivadas en
e] medioquimicamentedefinido ...................
89
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93
95
98
98
100
102
B.2.1. Microscopía electrónica de las células MCF-7cul
tivadas en presencia o ausencia de suero 104
8.2.2. Determinaciónde queratinas .................... 104
8.3. Análisis de las proteinas marcadas con (35S)-metignina............................................. 106
8.3.1. Análisis de las proteinas celulares ............ 1068.3.2. Análisis de las proteinas liberadas al medio de
cultivo........................................ 109B.4. Análisis de los medios condicionados obtenidos a
partir de las células cultivadas en presencia de
suero o en el medio quïmicamente definido ........ 109
B.5. Crecimiento independiente del anclaje ............ 112
B.6. Distribución de las células en gradientes de denslO...O.IIO..OOOIOOOUOOOOOIOOOOICOIOO
B.7. Expresiónde marcadorescelulares ................ 117
8.7.1. Expresión de antígeno carcinoembrionario (CEA) 117
8.7.2. Expresión de la proteina p21, codificada por el
oncogenras .................................... 1198.7.3. Expresión de receptores estrogénicos (RE) ...... 119C. Efecto de los moduladores de la diferenciación
C.1. 13-cis retinal
C.1.1. Efecto del 13-cis retinal sobre la proliferacióncelular........................................ 124
C.1.2. Efecto del 13-cis retinal sobre la sintesis de
proteinas celulares y liberadas al medio de cultivo........................................... 126
C.1.3. Efecto del 13-cis retinal sobre el crecimiento
independientede] anciaje......................C.1.4. Efecto de] 13-cis retina] sobre 1a distribución
de ias céiulas en gradientes de densidad .......
C.1.5. Efecto de] 13-cis retina] sobre ias subpobiacionesaisladas...................................
G.2.Dimetilsuifóxido.................................C.2.1. Efecto de] dimetiisuifóxido sobre 1a proiifera
ciónceiuiar...................................C.2.2. Efecto de] DMSOsobre 1a diferenciación ce1u1ar
C.3. Butirato de sodio
C.3.1. Efecto de] butirato de sodio sobre 1a proliferaciónce1u1ar...................................
C.3.2. Efecto de] butirato de sodio sobre la diferenciaciónceiuiar...................................
G.4. Combinación de moduiadores de 1a diferenciación
C.4.1. Efecto sobre 1a proiiferación ceiuiar ..........D. Crecimiento de 1a Iïnea ceiular en suspensión
0.1. Obtención de 1a iïnea ceiular en suspensión ......D.2. Anáiisis de las céiuiasD.2.1. Curvasde crecimientoceiuiar ..................
0.2.2. Distribución de las células en gradientes de densidad..........................................
0.2.3. Crecimientoindependiente de] anclaje ..........0.2.4. Contenidode receptores estrogénicos ...........0.2.5. Respuestaa factores de crecimiento ............0.2.6. Efecto de moduiadores de 1a diferenciación ceiu
1ar
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147
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0.2.6.1.
0.2.6.2.
DISCUSION
Efecto de] 13-cis retina]
Efecto de] butirato de sodio
lo o.o.ooo...tooooooonoccooooooo2. Crecimiento de ias céiuias en e] medio iibre de sue
F0
2.1.
2.2.Requerimiento de factores de crecimientoU1traestructura de 1as céiuias
3. Moduiadores de la diferenciación ceiular
3.1.
3.2.
DMSOy butirato de sodio
3.3.
CONCLUSIONES GENERALES
Efectos del
Efectos de agentes
Efectos de] estradio]
IOOÜOOOUOOOOCOOOOOOOIOO
inductores de 1a diferenciación
BIBLIOGRAFIA
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177
LISTA _É FIGURAS
INTRODUCCION
1.1. Esquema de 1a jerarquía ceiular, producto de 1a
diferenciación de 1a céluia "stem"...............
1.2. Diagrama de Ios mecanismos de secreción endócrino
(I), paracrino(II) y autócrino(III).............Cicio ceiuiar reguiado
RESULTADOS
1.
N o
LA.) o
Distribución de ias células MCF-7y T-47D (inserto)
en gradientes de densidad de Percoii
Distinta capacidad de ias subpoblaciones E y A para
dar origen a todas 1as subpobiaciones que componen
1a iïnea parenta]
Curvas de crecimiento de ias distintas subpobiacio
I.0.0.0000IOOOOOOOO0.0...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOI.
Indice de marcación con timidina (TLI) y expresión
de diversos marcadores: proteina p21, producto de]
gen ras (p21ra5), receptores estrogénicos (RE) y an
tïgeno carcinoembrionario (CEA)en las distintas sug
pobiaciones, medidas a1 cabo de 1 3 dias dey cul
tivoDeterminación de] indice de marcación con timidina
(I)ycodificada por e] gen ras (II), receptores estrogéni
expresión de diversos marcadores: proteina p21
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\l o
10.
15.
cos (III) y antígeno carcinoembrionario (IV) en Ias
subpobiaciones aisladas
Tinción de Iipidos con "oii red 0" en las subpobiacionesaisiadas....................................Efecto de diversos factores de crecimiento (trombina,
EGFy PDGF)sobre las subpobiaciones ais1adas ......
Efecto de PgF2d\sobre e] crecimiento de 1as subpobigcionesB,Cy D....................................Distribución de las céluïas de 1a Subpobïación C tra
tadas con PgF2c4 y de 1a subpobiación D tratadas con
densidadtrombina durante 5 dias, en gradientes dedePercoil.........................................
Curvas de crecimiento de ias céluias MCF-7parenta
ies, “MCF-7reconstituidas“ y “MCF-7(-E)" ........
Efecto de ios medios condicionados por 1as distin
tas subpobïaciones sobre e] crecimiento de 1a sub
0.0.0.0...OO0..OOOOOOCIOOOOOOOOOOOOOOOO
Efecto de ios medios condicionados por las distin
tas subpoblaciones sobre e] crecimiento de 1a sub
pobiaciónF.......................................Efecto de] medio condicionado por 1a subpobiación E
sobre e] crecimiento independiente de] anciaje de
de1asubpobiaciónF ..............................Curvas de crecimiento de 1as células MEF-7cuitiva
das en presencia de suero o en e] medio químicamen
te definido
Morfología de las céiuias MCF-7cuitivadas en pre
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23.
24.
25.
26.
senciao ausenciade suero........................
Microscopía eiectrónica de ias céiuias MCF-7......
Citoqueratinas reveiadas por 1a técnica de 1a inmu
noperoxidasa c0n anticuerpos de conejo dirigidos
000.00.00.00.00IIIOOIOOOOElectroforesis en ge1es bidimensionales de protei
nas ceïuiares marcadas con (355)-metionina ........
Autorradiografïa de] ge] monodimensionai de protei
nas secretadas a1 medio de cuitivo marcadas con
(35S)-metionina...................................Diferenciación de ias céluias CHEF/18 mediada por
e] medio condicionado de ias céïuias MCP-7cultiva
das en presencia de suero
Crecimiento independiente del anciaje de las céiu
0.00.0...OOÜOOOOOCOCOIOOCOOO-00.00.0000..
Expresión de antígeno carcinoembrionario, reveiado
por 1a técnica inmunocitoquïmica
Determinación de 1a proteina p21, codificada por e]
gen ras (A y B) y receptores estrogénicos (C y D)
en céluias MCP-7
Efecto de] 13-cis retina] sobre e] crecimiento de
las céïuias MCF-7
Incorporación de (355)-metionina a1 materiaï soïu
bie en presencia de TCAen céiulas MCF-7 controies
y crónicamente tratadas con 13-cis retina]
Crecimiento independiente de] anciaje de ias céiulas MCP-7crónicamente tratadas con 13-cis retina]
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27.
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33
Efecto de] 13-cis retina] sobre 1as Subpobiaciones
A, B y E
Efecto de] DMSOsobre e] crecimiento de 1as céiuias
MCP-7
Efecto de] butirato de sodio sobre e] crecimiento
de las céluïas MCF-7
Efecto de] butirato de sodio sobre 1a distribución
de ias céiulas MCP-7en gradientes de densidad de
Percoi]
Efecto dei 13-cis retina] y de] butirato de sodio
(agregados por separado o en combinación) sobre e]
crecimiento de ias células MCF-7adheridas a1 sus
trato, en presencia o ausencia de suero, y en sus
pensión...........................................Morfoiogïa que presenta 1a subpobiación B de ias cg
1u1as MCF-7Iuego de] tratamiento con estradio] oDMSO..............................................Curvas de crecimiento de las céiuias MCE-7 en sus
pensióny en presenciade suero ...................
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146
148
LISTA DE TABLAS
Página Hg
I. Crecimiento independiente de] anclaje de ias subpo0.0..0...OUOOOOIIOIOOOOOCOOOOO...
II. Crecimiento independiente del anciaje de 1a Subpo
blación E: infiuencia de] suero y de] aporte hormona]............................................... 69
III. Incorporación de (3H)-timidina en las subpobiacio
nes quiescentes: efecto de distintos factores decrecimiento...................................... 76
IV. Fosforiiación de ias subpobiaciones cuitivadas en
presenciao ausenciade suero..................... 87V. Requerimiento de factores de crecimiento de ias cé
luias MCP-7cuando se plaquean a baja densidad ceiuiar................................................ 99
VI. Sintesis de proteinas en 1as células MCF-7cuitiva
das en presencia de suero o en e] medio quimicamen
te definidodurante3 dïas ........................ 110VII. Efecto de ios medios condicionados de ias céiuias
MCF-7cuitivadas en presencia o ausencia de suero
sobre e] crecimiento de 1a linea ceiuiar CHEF/18 113
VIII. Crecimiento independiente dei anciaje de ias c5]!1as MCF-7cultivadas en ei medio iibre de Suero 115
IX. Distribución de ias céiuias MCF-7en gradientes de
densidaddePercoii............................... 118X. Expresión de receptores estrogénicos en céiuias
MCP-7cultivadas en presencia o ausencia de suero
x1. Efecto de] l3-cis retina] sobre 1a síntesis y acumg
Iación de proteínas en céïulas MCP-7..............XII. Efecto de] 13-cis retina] sobre la distribución de
densidad de1as células HCF-7 en gradientes de
000......00.00.0000....OOOIOOOOOOOOOOOOOOO
XIII. Efecto del dimetílsuïfóxido sobre la diferenciaOOCOOOOOIOOOOOOOOÓOOCOC
123
127
133
138
RESUMEN
E] presente trabajo de tesis estuvo dedicado a1 estudio de 1a
linea ceiuiar de tumor de mama humano MCF-7 considerando su
heterogeneidad ceiular, sus caracteristicas de crecimiento en un
medio químicamente definido y su respuesta a diversos factores de
crecimiento, hormonas y agentes moduiadores de 1a diferenciación.
A. Heterogeneidad ceiuiar
La linea celular MCF-7en crecimiento exponencia] se separó,
utiiizando gradientes de densidad de Percoli, en 6 subpoblaciones
distintas (A a F). Estas subpobiaciones se subcuitivaron y carac
terizaron en base a distintas propiedades: capacidad de generar
todas ias subpoblaciones, veiocidad de crecimiento, capacidad de
sintesis de ADN,eficiencia cionogénica, y expresión de diversos
marcadores: proteina p21, producto de] gen ras, receptores
estrogénicos, antïgeno carcinoembrionario y iïpidos teñidos con eicoiorante "oii red 0“.
La Subpobiación E constituyó e] 5% de 1a población totai; fue
1a ünica subpobiación capaz de generar todas ias subpobiaciones y
ninguna otra subpobiación 1a originó; fue 1a de mayor capacidad
proiiferativa, determinada a través de curvas de crecimiento y de
sintesis de ADN, y fue 1a de mayor eficiencia cionogénica
(6,62¿1,18)%. E1 anáiisis cariotïpico de 1a subpobiación E reveió
1a presencia de Ios mismos marcadores descriptos para 1a iïnea
ceiuiar parentai MCF-7.Este resuitado permitió descartar 1a posi
biiidad de que dicha subpobiación correspondiera a un cion obte
nido en forma aislada, a 1a vez que sugirió que su mayor velocidad
de crecimiento se debe a que está enriquecida en céiulas "stem".
Dicha subpobiación resuïtó imprescindibïe para mantener e] creci
miento de 1a iïnea celuiar dado que en Su ausencia, e] crecimiento
observado a las 48 horas correspondió a] 60% de] contro] y fue de
apenas e] 20% a1 cabo de 6 dias de cultivo. E1 crecimiento se
recuperó a] agregar medio condicionado por 1a subpobiación E
diiuido con medio fresto (1:1).
La Subpoblación F resuitó ser 1a más densa y 1a de mayor
grado de diferenciación dado que fue 1a de menor capacidad proïi
ferativa, constituyó e] estadïo termina] o "punto finai" de 1as
demás subpobiaciones y presentó e] mayor porcentaje de céluias
cuyos ïïpidos se tiñeron con e] coiorante “oiï red 0“.
En base a Ios resuitados presentados en este trabajo se pudo
deducir 1a siguiente secuencia de aparición de ias subpobiaciones:
E-9 A-> B-+ C-+ 0-9 F.
Las subpoblaciones también se caracterizaron en base a 1a
expresión de receptores estrogénicos, siendo 1as subpobiaciones C
y F las de mayor contenido.
La subpobiación C resuitó ser 1a de mayor expresión de 1a
proteïna p21, producto de] gen ras.
La expresión de antïgeno carcinoembrionario no varió signifi
cativamente en ias distintas subpobiaciones cu1tivadas durante 24
horas.
Se ana1izó 1a respuesta de ias subpobiaciones aisladas a
diversos factores de crecimiento, taies como insuiina, PDGF,EGF,
trombina y PgF2<X. E1 agregado de insuiina, PDGF, EGF o trombina
estimuió e] crecimiento de las subpobiaciones con mayor grado de
diferenciación (D y F). La PgF2(x tuvo efecto mitogénico sobre las
subpobiaciones C y D e inhibió e] crecimiento de 1a Subpobia
ción B.
E1 tratamiento de 1a subpobiación D con trombina permitió
además 1a supervivencia de ias células en un medio iibre de suero,
mientras que 10s controies cuitivados en ausencia de trombina no
sobrevivieron en e] medio quïmicamente definido por más de 8-10
dias. La supervivencia de 1a subpobiación C en un medio Iibre de
suero fue posibie por tratamiento de ias células con PgF2cK.También se estudiaron ias interacciones entre ias distintas
subpobiaciones, para lo cua] se ensayó el efecto de los medios
condicionados por 1as distintas subpobiaciones sobre ei creci
miento de ias subpobiaciones E y F.
E1 crecimiento de la subpobiación E resultó inhibido por e]
agregado de ios medios condicionados por ias distintas sub
pobiaciones, siendo e] de 1a subpobiación F ei de mayor efecto
inhibitorio.
E1 crecimiento de 1a subpobiación F resuitó estimuiado por e]
agregado de los medios condicionados de ias subpobiaciones A y E
mientras que ios correspondientes a ias subpobiaciones B, C y D no
indujeron cambios significativos. E1 medio condicionado por 1a
subpobiación E fue capaz de inducir e] crecimiento en agar biando
de 1a subpobiación F, con una eficiencia cionogénica de] 1%y con
colonias cuyo tamaño promedio fue de 800 células/colonia.
Similares resuitados se obtuvieron por tratamiento de ias céiuias
con EGF, 10 que indujo a pensar en 1a posibiiidad de 1a presencia
de TGF-<x en dicho medio condicionado.
B. Crecimiento en gl medio químicamente definido
Se estudió e] comportamiento de 1a 1ínea ceiular en un medio de
cuitivo iibre de suero, anaiizando sus cambios morfoïógicos,
requerimiento de factores de crecimiento, eficiencia cionogénica y
expresión de proteínas taïes como citoqueratinas, antígeno car
cinoembrionario, proteína p21, producto de] gen ras y receptores
estrogénicos.
En ausencia de suero y a baja densidad ceiular (62.500
céïuïas/cmz), 1as céïuias requirieron e] aporte exógeno de insu
1ina, EGFy trombina. Cuando 1as céiuïas aicanzaron una densidad
de 12.000 - 13.000 céluias/cmz, 5610 requirieron insuiina para su
óptimo crecimiento. En este medio de cuitivo (medio químicamente
definido) se modificó 1a morfología hacia un fenotipo ceiuiar
menos diferenciado. Estos cambios morfológicos se acompañaron de
cambios en 1a distribución topoïógica de varias proteínas, como
1as queratinas y e] antígeno carcinoembrionario.
Observadas a1 microscopio eïectrónico, las céïuïas cuitivadas
en e] medio químicamente definido presentaron un aparato de Goigi
voiuminoso y muy desarroiiado; se observaron también modifica
ciones en 1a membrana piasmática ("coated pits" y vesícuias
recubiertas), probablemente reïacionadas con 1a actividad secretora de estas céluïas.
Las células cuitivadas en presencia de suero, por e] contrario,
no presentaron un compïejo de Goigi desarroiiado y 1as modifica
ciones en 1a membrana piasmática fueron poco frecuentes.
En ambas condiciones de cuitivo se evidenció 1a presencia de
uniones estrechas, desmosomasy tonofiiamentos.
En e] medio químicamente definido se verificó una mayor iibera
ción de proteinas a1 medio de cuitivo y se comprobó 1a aparición
de una proteina de 56.000 daitons. Estos cambios cuaii y cuan
titativos podrian correlacionarse con 1a mayor eficiencia c10
nogénica que presentaron las céiulas cultivadas en un medio iibre
de suero y podrian refiejar también 1as diferencias observadas
luego de] tratamiento de ias céiulas CHEF/18 con ios medios con
dicionados por ias céluias MCF-7cuitivadas en presencia o ausen
cia de suero. 5610 e] medio condicionado por 1as céiuias MCF-7
cuitivadas en presencia de suero fue capaz de inducir 1a diferen
ciación de ias céiuias CHEF/18a adipocitos.
Las céluias cuitivadas en ausencia de suero presentaron un
enriquecimiento en ias subpobiaciones de mayor capacidad proii
ferativa a expensas de una disminución en ias subpobiaciones con
mayor grado de diferenciación.
La expresión de ia proteina p21, producto de] gen ras, fue más
intensa en presencia de suero y más difusa en e] medio quimica
mente definido.
E1 contenido de receptores estrogénicos sufrió un incremento
transiente a los 10 dias de cuitivo de 1as céiuias en ei medio
químicamente definido y dicho incremento se correlacionó con ei
requerimiento hormona] que manifestaron ias céluias en ese
momento.
6
C. Efecto gg hormonasl agentes moduiadores gg la diferenciación
C.1. Estrógenos
E1 agregado de estradioi a las subpobiaciones quiescentes
incrementó la incorporación de timidina tritiada en 1a sub
población C pero inhibió dicha incorporación en 1a subpobiación F.
E1 agregado de estrógenos a ias subpobiaciones aisiadas
cultivadas en e] medio químicamente definido tuvo distintos
efectos: sobre ias subpobiaciones A, B, C, D y F, e1 estradioi
ejerció un rápido y notabïe efecto diferenciante. Sobre 1a sub
población E, por e] contrario, indujo a 1as céiulas a despegarse
de las p1acas de cuitivo y permitió el crecimiento bajo 1a forma
de agregados multiceluiares en suspensión. Dicha iïnea ce1u1ar
lleva más de 2 años de cuitivo.
G.2. DimetiISuifóxido
A partir de concentraciones de 0,5% de DMSOse inhibió e]
crecimiento ceiuiar. Dicho efecto se manifestó a las 24 horas de
tratamiento y estuvo acompañado por cambios morfoiógicos irrever
sibies. E1 efecto inductor de 1a diferenciación del DMSOse veri
ficó a1 anaiizar 1a distribución de ias céiuias en gradientes de
densidad de Percoii; se comprobó que e] DMSOinduce un enriqueci
miento en las subpobiaciones con mayor grado de diferenciación (D
y F) a expensas de 1a disminución en ias subpobiaciones con mayor
capacidad proiiferativa pero sin afectar a 1a subpobiación de
céluias "stem".
C.3. Butirato gg ¿2312
A1 igual que e] DMSO,ei butirato de sodio ejerció un efecto
inhibitorio de] crecimiento que estuvo acompañado por cambios mor
foiógicos y aiteraciones en e] perfil de] gradiente de densidad de
Percoiï. Las céluias cuïtivadas en e] medio quimicamente definido
fueron más sensibïes a1 efecto de] butirato de sodio mientras que
ias céiuias en suspensión resuitaron ser 1as más resistentes.
G.4. 13-cis-retina1
A concentraciones de] orden de 10"8 - 10'7 M, este derivado
de 1a Vitamina A estimuió e] crecimiento de ias células cultivadas
en presencia o ausencia de suero.
Además, en este trabajo se describió un efecto novedoso de]
13-cis-retina1: 1a estimuiación de 1a sintesis y acumuiación de
proteinas nucieares en ias céïuias crónicamente tratadas. Las pro
teinas citopiasmáticas y liberadas a1 medio de cultivo se modifi
caron transiente y opuestamente. Las céiulas crónicamente tratadas
presentaron mayor eficiencia clonogénica en agar b1ando.
El 13-cis-retina1 actuó como moduiador negativo de 1a
diferenciación,- incrementando 1a contribución de ias subpobïaciones con mayor
capacidad proiiferativa a expensas de 1a disminución en e]
aporte de ias subpobiaciones más diferenciadas;
- retardando 1a obtención de ias subpobiaciones más diferenciadas
a partir de ias subpobiaciones A, B y E;
- protegiendo a 1as céluïas de] efecto inductor de 1a
ciación ejercido por e] butirato de sodio.
INTRODUCCION
1. Heterogeneidad tumoral
Desde 1977, diversos grupos de investigación han descripto la
existencia de distintas subpoblaciones celulares dentro de un
mismo tumor (Fidler y Kripke, 1977; Dexter y col., 1978; Mackillop
y Buick, 1981; Dexter y Calabresi, 1982; Woodruff, 1983; Heppner,
1984). Estas subpoblaciones se caracterizan por la expresión de
distintos marcadores de diferenciación (Podhajcer y col., 1986),
distinta velocidad de crecimiento, distinta capacidad de dar
metástasis (Puricelli y col., 1984) y distinta sensibilidad a los
agentes terapéuticos.Esta heterogeneidad celular también se ha descripto en lineas
celulares tumorales del sistema hemopoyético (Till y McCulloch,
1980) y en la linea celular de tumor de mama humano MCP-7 (Yang y
col., 1977; Barkley Buttler y col., 1986).
La heterogeneidad celular puede deberse a:
- la inestabilidad genética de las células tumorales, por la cual
se producen mutaciones puntuales en el ADN, rearreglos cromoso
males, pérdida de cromosomas o amplificación genética (Cifone y
Fidler, 1981; Isaacs y col., 1982);
- la existencia de subpoblaciones en distinto estadio de diferen
ciación originadas a partir de una célula "stem" (Bennett y
col., 1978; Hager y col., 1981; Rudland y col., 1982).
Los tumores pueden considerarse sistemas de “autorenovación”,
en los cuales una pequeña proporción de células (células “stem")
tienen la capacidad de autogenerarse y de originar células desti
lO
nadas a 1a diferenciación. Estas céiulas, denominadas céluias
transicionaies, tienen una capacidad proïiferativa limitada que
disminuye a medida que las células se van diferenciando (Mackilïop
y c01., 1983; Buick y Poiiak, 1984).
En 1a Fig. 1.1 se presenta un esquema de 1a jerarquía ceiular.
Las distintas subpoblaciones ceïuiares se comportan de manera
diferente cuando están aisladas que cuando crecen juntas e
interactúan entre sï (Heppner y c01., 1984). Las interacciones
entre 1as subpobiaciones afectan la veiocidad de crecimiento
(Mi11er y co]., 1980), 1a inmunogenicidad (Miiïer y Heppner,
1980), 1a sensibiiidad a drogas (Miller y c01., 1981) y la capaci
dad de dar metástasis (Hang y col., 1982). Esta interacción puede
estar mediada por factores difusibles o puede requerir e] contacto
ceiular (Miiier y c01., 1983). Aün no se ha descripto un mecanismo
genera] para expiicar ias interacciones entre ias distintas
subpobiaciones; dichas interacciones complican ei estudio
biológico y bioquïmico de ios tumores dado que 1as propiedades de
un tumor no pueden deducirse de 1a simpie adición de ias propieda
des de cada una de 1as subpobiaciones que 10 componen.
Por io tanto, para estudiar cómo evoiucionan estos sistemas es
necesario estudiar 1a bioïogïa ce1u1ar de cada subpobiación por
separado y de] conjunto.
2. Reguiación de] crecimiento ceiuiar
E1 estimulo para 1a regulación de] crecimiento en céiulas de
mamíferos proviene de] medio extraceiuiar, a través de ios fac
tores de crecimiento, que son moiécuias de naturaieza poii
ll
Fig. 1.1: Esguemagg l_ jerarquía celular, producto g_ la diferenciación de 1a céiuia “stem”.
A medida que se desciende en e] esquema, disminuye
progresivamente 1a capacidad proiiferativa y se
adquieren 1as caracteristicas propias .de céiuïas
diferenciadas (Buick y Poïlak, 1984).
AUTORENOVACIO./GO ,CELULA STEM
NO PROLIFERATIVA
EXPANSIONCLONAL
CELULASTRANSICIONALES
DIFERENCIACIONCRECIENTE
k
w
.PUTENCIALPROLIFERATIVOCRECIENTECELULAS TERMINALES]
12
peptïdica. La mayoria de estos compuestos actüan estimulando 1a
proiiferación celular aunque se conocen otros, como e] TGF-é o e]
interferón-( , que inhiben e] crecimiento.Los factores de crecimiento se diferencian de ias hormonas por
e] mecanismo de secreción invoiucrado. Mientras que ias hormonas
actüan a través de] sistema endócrino (es decir, son producidas en
una célula especifica y se transportan a través de] torrente
sanguïneo hasta su sitio de acción), para ios factores de creci
miento se han propuesto mecanismos de secreción paracrino o
autócrino. En e] primer caso, ei factor de crecimiento es produ
cido por una céiuia y iiega por difusión hasta las céiulas vecinas
sobre las que actüa (James y Bradshaw, 1984). E1 mecanismo
autÓCCino, descripto por Sporn y Todaro (1980) impiica que e] fac
tor de crecimiento es producido en 1a misma céluia en la que
ejerce su efecto.
En 1a Fig. 1.2 se presenta un esquema de ios tres mecanismos de
secreción.
Los factores de crecimiento actüan a través de 1a unión a
receptores especificos de aita afinidad presentes en 1a membrana
celular. Como consecuencia de esta unión, 1a seña] mitogénica
generada se transmite desde e] dominio extraceiuiar (sitio de
unión de] factor de crecimiento) a1 dominio intracitopiasmático
(donde reside 1a actividad de tirosina quinasa de] receptor;
Hunter y Cooper, 1985). Se activan señaies consideradas segundos
mensajeros (fosforiiación de proteinas, aumento de]
Ca2+intraceiuiar, formación de diaciigiiceroi, inositoï trifos
fato y AMPC)ias que a su vez, activan genes involucrados en 1a
13
Fig. 1.2: Diagrama gg los mecanismos gg secreción endócrina
gllzgaracrina SII! L autócrina {III}.Las regiones semicircuïares de 1a membrana ceiular
representan Ios sitios receptores (Sporn y Todaro,1980).
14
producción de mARNsy proteinas necesarias para 1a repiicación de]
ADN. Estos eventos permiten 1a transición de 1a fase GI a 1a fase
S de] cicio ceïular, pudiéndose discriminar entre eventos tempra
nos y tardïos (Pardee, 1987 a y b). Los eventos tempranos se re1a
cionan con 1a sintesis de mARNsy proteinas; ios eventos tardïos
están reIacionados con 1a sintesis de componentes especificos que
permiten 1a repiicación de] ADN, taies como 1as enzimas timidina
quinasa y timidinasintetasa. Una vez que la céïuïa ha entrado en
1a fase de sintesis de] ADN, los siguientes estadios de] cicio
ceiular dejan de estar regulados por factores externos.
Si ias condiciones de cultivo son adversas, ias céiuïas pueden
detener su crecimiento en 1a fase previa a 1a sintesis de ADNy
entrar en un estado de quiescencia denominado "Go" (Baserga. 1975)
(Fig. 1.3).
Aün no está resueito si ias céiuias en Go están fuera de] cicio
ceïular en un estado bioquímico distinto a1 de 61 (Baserga, 1976)
o bien si G0 corresponde a un estadio en ei cua] ias céluïas
cician en forma infinitamente 1enta (Smith y Martin, 1973).
Las condiciones que reversibiemente inducen ei estado de
quiescencia son:
- e] crecimiento a a1ta densidad ceiuiar (Todaro y c01., 1965;
Temin, 1971; Barthoiomew y c01., 1976; Robinson y Smith, 1976);
- 1a baja concentración de suero en e] medio de cultivo (Hoiiey y
Kiernan, 1974; Pardee, 1974; Martin y Stein, 1976);
- 1a baja concentración de aminoácidos y nutrientes esenciaïes
(fosfatos, gïucosa, biotina, vitaminas y iipidos).Las céïuias transformadas tienen una reguïación reiajada de]
15
Fig. 1.3: Ciclo ceiuïar regulado.
Las iïneas gruesas indican ias regiones dei cicio ceiu
iar en las Cuaies tienen lugar Ios eventos reguiatorios.
S: sintesis de ADN.
M: mitosis
R: punto de restricción
16
crecimiento debido a mutaciones o rearregios cromosomaies que
afectan 1a expresión de genes invoiucrados en e] control de 1a'
proliferación.E1 término "transformación" en reiación a céiuias animales en
cuitivo se asocia con propiedades taies como menor requerimiento
de suero, menor dependencia de] anciaje a un sustrato para e] cre
cimiento y mayor densidad ce1u1ar a 1a cua] se verifica 1a deten
ción del crecimiento (denominada densidad de saturación; Todaro y
co]., 1965; Duibecco, 1970).
Las 1ïneas ceiulares transformadas generalmente conservan 1a
reguïación de su crecimiento en 1a fase Gl del cicio ceiuiar aün
cuando requieren menor concentración de suero para proiiferar
(Hoiiey y co]., 1976; Moses y co]., 1978; Cherington y co]., 1979;
Dubrow y c01., 1979).
E1 menor requerimiento de suero probabiemente se deba a 1a
pérdida del requerimiento de aigün factor de crecimiento en par
tiCuiar. En 1978, Scher y co]. describieron 1a pérdida de]
requerimiento de PDGFen céluias transformadas.
Cherington y col. observaron, en 1979, céiuias transformadas
que habïan perdido el requerimiento de EGFmientras conservaban e]
de insuiina o somatomedinas.
3. Crecimiento autócrino en céluias transformadas
El menor requerimiento de factores de crecimiento en céluias
transformadas puede deberse a una activación autócrina de 1a
céiuia. En este caso, 1a céiuia sintetiza y libera a1 medio de
cultivo péptidos que mimetizan o son idénticos a hormonas o fac
17
tores de crecimiento y que utiïizan para su efecto 105 receptores
presentes en 1a membrana de 1a céïuia (Shieïds, 1978).
De Larco y Todaro (1978, 1980) deSCubrieron un factor de creci
miento (SGF) que es producido y secretado a1 medio de cultivo por
céiuïas transformadas con e] virus de] sarcoma murino o feiino.
Este factor tiene la propiedad de competir con e] EGF por 1a unión
a ios mismos receptores presentes en 1a membrana ce1u1ar; mimetiza
a] EGF en su efecto mitogénico pero 10 supera en 1a estimuïación
de] crecimiento. E1 SGF (factOr de crecimiento de sarcoma) permite
e] crecimiento en agar b1ando de fibroblastos normaies; es por
esta razón que se lo ha denominado TGF- b<dado que induce un feno
tipo transformado en céïulas normaies, caracterizado por 1a capa
cidad que adquieren estas céïuïas de crecer en forma independiente
de] ancïaje a un sustrato.
Existe otro factor de crecimiento con actividad transformante y
se ha denominado TGF-€>. Este factor es un homodïmero de 25.000
daitons de peso molecuiar que actüa a través de 1a unión a recep
tores especïficos (Froïik y c01., 1984; Tucker y c01., 1984;
Massagüe y Like, 1985). Moses y co]. (1985) y Roberts y co].
(1985) demostraron que e] TGF- Ü actüa como moduïador negativo de]crecimiento en céiuias epiteïiaïes. Sporn y Roberts (1985) postu
Iaron que su efecto se debe a que interviene en 1a reguiación de
1a proiiferación, evitando un crecimiento descontroïado.En 1a ïïnea celuïar de tumor de mama humano MCF-7 se ha
descripto 1a producción de factores de crecimiento semejantes a
PDGF, EGF e IGF-I (Bronzert y c01., 1987; Mori y c01., 1986; Huff
y co], 1986 y 1987), 10 que expiicarïa un crecimiento autócrino de
esta iïnea celuiar.
Existen otros mecanismos que expiican un menor requerimiento de
factores de crecimiento por parte de ias céiuias transformadas.E1105 son:
- sintesis g_ _n receptor aiterado para el factor gg crecimiento
_g Cuestión. Es e] caso de] oncogen virai erb-B (dei virus que
produce 1a eritroblastosis de ias aves) que codifica para e]
receptor truncado de] EGF. Este receptor carece de] dominio
extraceluiar para 1a unión del iigando y está constitutivamente
activado dado que genera la seña] mitogénica independientemente
de 1a unión de] EGF (Downward y c01., 1984);
- activación d ios mecanismos intraceiuiares gue tienen lugar
Iue o d 1 unión de] factor de crecimiento a ¿_ receptor. Los
trabajos de Mulcahy y co]. en 1985 demuestran que 1a proteina
p21 codificada por e] protooncogen ras está invoiucrada en 1a
transducción de 1a seña] mitogénica. La proteina p21 está ioca
iizada en la cara interna de 1a membrana piasmática y tiene
actividad GTPásica (Wiilingham y c01., 1980; Furth y c01., 1982;
McGrath y c01., 1984).
Varios grupos de investigación postuiaron que 1a proteina p21
actuarïa acopiando e] receptor de membrana con ia fosfoiipasa C,
que es 1a enzima que hidroiiza e] fosfatidi]
inosito]-4,5-difosfato (Cockeroft y Gomperts, 1985; Litosch y
c01., 1985; Fleischman y c01., 1986; Preiss y c01., 1986;
Marshaii, 1987; Noifman y Macara, 1987). Sin embargo, Ios trabajos
de] grupo iiderado por Stacey (1988) demuestran que no es asi;
estos autores postulan que e] metaboiismo de fosfoinosïtidos ante
19
cede a la acción de 1a proteina p21 en ia cadena de eventos nece
sarios para 1a transducción de 1a seña] mitogénica a1 nücieo.
E1 gen ras activado presente en muchos tumores tiene una muta
ción que Io estabiïiza en la configuración activa, permitiendo 1a
transducción de 1a seña] mitogénica independientemente de 1a pre
sencia de] factor de crecimiento; es otro ejempio de una activa
ción constitutiva de 1a céluïa (Berridge, 1987). Otros oncogenes
de Iocaiización nuciear están invoïucrados en 1a transducción de
señaies mitogénicas. E1105 son e] fos, myc y myb, cuya transcrip
ción aumenta por tratamiento de ias céiuias con PDGF (Keiiy y
coi., 1983; Cochran y c01., 1984; Greenberg y Ziff, 1984). La
expresión constitutiva de] oncogen myc aitera 1a sensibiiidad de
las céiulas a 10s factores de crecimiento. En presencia de EGF
estas céiuias son capaces de formar coionias en agar biando
mientras que eso no ocurre con las céiuïas normaies (Roberts y
c01., 1985).
4. Cultivo gg lineas ceiuiares tumoraies humanasA1 mantener céluias en cu1tivo se busca reconstruir e] microam
biente extraceiuiar que requieren 1as céiuïas en su iocaiización
de origen. Para eso, se consideran ios requerimientos hormonaies,
nutricionaies y de] estrOma, éstos üitimos reiacionados con 1a
matriz extraceiular y ios fenómenos de adhesión.
Durante mucho tiempo, e] medio de eiección para e] Cuitivo de
céiuias fue ei suero, que contiene una mezcia compieja e indefi
nida de sustancias, cuyas concentraciones pueden variar de iote en
iote de suero.
20
El suero contribuye al crecimiento y sobrevida celular apor
tando componentes de la membrana basal como fibronectina que pro
mueve la adhesión celular y el estiramiento de las células sobre
el sustrato de cultivo (Yamada y Olden, 1978). El suero humano
presenta una crioglobulina semejante a la fibronectina plasmática
mientras que en el suero fetal bovino, la principal proteina pro
motora de la adhesión es la vitronectina (Haymany col., 1985). El
suero también aporta nutrientes de bajo peso molecular
(aminoácidos, lïpidos, vitaminas, trazas minerales), factores de
crecimiento, hormonas y proteinas transportadoras de iones y meta
les (transferrina y albúmina).
La transferrina actüa comoproteina detoxificante para la eli
minación de trazas de metales tóxicos presentes en el medio. Tiene
la capacidad de ligar hierro y transportarlo dentro de la célula.
Las células transformadas requieren transferrina durante todo el
ciclo celular, por lo tanto no actüa c0mofactor regulatorio del
crecimiento sino como nutriente (Cherington y col., 1979; Youngy
col., 1979).
Otra proteina transportadora es la albúmina, que transporta
hormonas esteroideas y vitaminas. El suero fetal bovino contiene
fetuina (Ham y McKeehan, 1979) que tiene la capacidad de unir
sustancias tóxicas o lábiles y actüa comobuffer.
A partir de 1980, Barnes y Sato promueven el reemplazo de suero
como suplemento de los medios de cultivo por una mezcla conocida
de nutrientes. A partir de entonces, empezaron a aparecer en la
literatura numerosostrabajos en los cuales se diseñaban distintos
medios libres de suero para el Cultivo de diversas lineas celu
21
1ares. En muchos de ellos se ha utiiizado e] medio F-12 diseñado
por Ham en 1965 como supiemento de] medio Duibecco (Hayashi y
Sato, 1976; Bottenstein y co]., 1979).
Los trabajos de Barnes y Sato en 1979 y de Jozan y co]. en 1982
concuerdan en que 1a insuiina es e] componente más importante e
indispensabie de] medio químicamente definido que mantiene e] cre
cimiento de 1a linea ce1u1ar de tumor de mama humano MCF-7.
La utilización de medios quimicamente definidos permite estu
dios de reguiación de] crecimiento, de] metaboiismo y de 1a
diferenciación ce1u1ar, a 1a vez que permite conocer los ver
daderos requerimientos de ias células en cuanto a hormonas y fac
tores de crecimiento.
5. Factores gg crecimiento
Muchos factores de crecimiento están presentes en e] suero
(iiberándose de ias piaquetas durante e] proceso de coaguiación
sanguínea) o bien se encuentran en e] piasma pobre en piaquetas.
Aïgunos factores actüan sinérgicamente en 1a estimulación de 1a
sintesis de ADN, indicando mecanismos de acción distintos pero
compiementarios.Otras combinaciones de factores de crecimiento resuitan en
efectos aditivos, indicando que estimuian los mismos eventos
intraceiulares que conducen finaimente a 1a sintesis de ADN.Los factores de crecimiento actüan en distintas fases de] cicio
ce1u1ar, pudiendo definirse tres tipos de factores:
- Factores tipo l: factores gg competencia.
Actüan sobre células quiescentes (detenidas en 1a fase G1/60 de]
22
ciclo celular) induciendo un estado de competencia, en el Cual
las células son sensibles al efecto de otros factores de creci
miento.
Ejemplo de factor de c0mpetencia: PDGF(factor de crecimiento
derivado de plaquetas).
Factores tipo ll: factores gg progresión.Actüan sobre células c0mpetentes permitiendo la entrada a la
fase S del ciclo celular.
Ejemplo de factores de progresión: insulina,
somatomedina C.
Los factores mencionados están contenidos en el plasma pobre en
plaquetas.
- Factores 1122 lll.
Son factores que actüan sinergisticamente con la insulina en la
estimulación de la sintesis del ADN.
El hecho de haber sido agrupados en la misma sección no implica
que actüen por el mismo mecanismo, disparando las mismas señales
que conducen finalmente a la sintesis de ADN.Por el contrario, el
hecho de que puedan actuar sinergïsticamente unos con otros
sugiere mecanismos cooperativos de acción que transcurren por
distintas vias. Se han considerado juntos para su discusión debido
a que su mecanismo de acción en relación al crecimiento no se
conoce tanto como el del PDGFo el de la insulina.
Estos factores son: EGF(factor de crecimiento epidérmico).Trombina.
Prostaglandina F2¡X
23
Otras proteasas: tripsina, pronasa.
Giucocorticoides, como 1a dexametasona.
Vasopresina.
En este trabajo se anaiizarán los primeros tres factores mencionados.
5.1. Factores ¿122 l
ngf: E1 factor de crecimiento derivado de piaquetas ha sido
purificado a homogeneidad por e] grupo de investigación de
Antoniades, en 1979. Tiene 31.000 daïtons de peso moïecular y está
compuesto por dos cadenas (A y B), unidas entre sï por puentes
disuifuro. La cadena B presenta homoiogïa de secuencia con 1a pro
teina p28, producto de] oncogen sis de] virus que produce e] sar
coma en Ios simios (Devare y c01., 1983; Doolittie y co], 1983;
Naterfield y col., 1983).
Las céiulas quiescentes expuestas a PDGFadquieren un estado
de "c0mpetencia" en e] cua] son sensibies a otros factores de cre
cimiento que estimuian 1a sintesis de ADN (por ejemplo, 1a
insuïina).Varios investigadores han estudiado e] efecto mitogénico de
PDGFsobre fibroblastos (Piedger y co]., 1977; Antoniades y co].,
1979; O'Keefe y Piedger, 1983). La unión de] PDGF a su receptor
provoca una disminución de 1a densidad de] receptor en 1a membrana
ce1u1ar debido a una internaïización de] compiejo receptor-PDGF
por endocitosis (James y Bradshaw, 1984). Se activa 1a tirosina
quinasa de] receptor que provoca 1a fosforiiación de] mismo y de
otras proteinas (Ek y Heldin, 1982; Nishimura y c01., 1982;
24
Frackelton y co]., 1984).
E1 PDGFactiva 1a fosfolipasa C provocando 1a hidróiisis dei
fosfatidi] inosit01—4,5-difosfato, con formación de
1,2-diaci191icero] e inosito]-1,4,5-trifosfato (Habenichty c01.,1981). E1 inosito] trifosfato induce moviiización de ca1cio de Ios
depósitos de] retïcuïo endoplásmico provocando un incremento de]
Ca2+ intraceluiar (Streb y c01., 1983; Berridge e Irvine, 1984;
Moolenaar y co]., 1984a). E1 diacilgïiceroi en presencia de
Ca2+ activa 1a proteïnaquinasa C (Nishizuka, 1984; Rodriguez-Peña
y Rozengurt, 1985). Esta induce fosforiiación de 1a proteina que
interviene en e] transporte de Na+/H+, determinando un efiujo de
H+ y un infïujo de Na+. Se produce asï una a1caïinizaci6n de]
citopiasma (Casseï, 1983; L'A11emain y col., 1984) que cumpie un
ro] permisivo de 1a mitogénesis dado que ias céiuias no se dividen
si e] pH de] citoplasma es ácido (Poysségur y c01., 1984).
Por otro Ïado, e] diaciïgiiceroï en presencia de 1a fos
fo1ipasa A2 se hidroiiza dando ácido araquidónico, que es e] pre
cursor de ias prostaglandinas (Habenicht y c01., 1981). Se produce
principaïmente prostagIandina E que es un potente mitógeno y que
induce a 1a adenil ciclasa con acumuïación de AMPC(Rozengurt y
col., 1983).
Asimismo, e] PDGF induce reorganización de] citoesqueleto
provocando a1teraciones en la distribución de vinCuiina y actina
(Herman y Piedger, 1985).
E1 tratamiento de fibrobïastos con PDGF provoca a los 45
minutos un incremento en ios nive1es de ARNmde] gen c-fos
(Greenberg y Ziff, 1983; Cochran y c01., 1984; Kruijer y c01.,
25
1984; Müiier y co]., 1984); a las 2 horas, se induce e] gen c-myc
(Keliy y c01.. 1983) y mucho más tarde, se inducen ios ARNrnde
é -interferón y de 2', 5'-o]igoadeni1atocic1asa que actüan comomecanismo de contro] de 1a proiiferación, evitando un crecimiento
excesivo.
Los fibrobiastos estimuiados con PDGF presentan un aumento
transiente en ios niveïes de ARNmcorrespondientes a Ïa cadena A
de] PDGF, con sintesis de] homodïmero de cadena A. Esto quiere
decir que e] mismo factor de crecimiento induce 1a transcripción
de genes invoiucrados en su sintesis, desencadenando un mecanismo
de retroaiimentación positiva en 1a mitogénesis (Pauisson y c01.,
1987).
En 1987, Bronzert y c01., demuestran que ias céiuias de tumor
de mamahumano MCP-7secretan un factor de crecimiento biológica e
inmunoiógicamente semejante a1 PDGF. E1 medio condicionado por
estas céiuias es capaz de inducir un estado de competencia en las
células Swiss 3T3 quiescentes, que se manifiesta por un incremento
en 1a incorporación de (3H)-timidina. La secreción de este factor
estaría hormonalmente regulada dado que ei tratamiento de ias
céiuias MCF-7con 17(5-estradi01 aumenta 1a secreción de] factor.Peres y co]. (1987) demuestran también que 1as céiulas MCF-7
producen y secretan un factor de crecimiento semejante a1 PDGF,
siendo esta Iïnea celular 1a más aita productora en relación a
otras 1ïneas ce1u1ares de tumor de mama humano estudiadas. Estos
autores observan que estas céluias presentan a1tas cantidades de
ARNrncorrespondientes a ias cadenas A y B de] PDGF, con aita pro
ducción de] homodïmero de cadena A que se secreta a1 medio de
26
cultivo. Dado que no se verifica una unión especifica de
(1251)-PDGF a las células MCF-7, estos autores deducen que estas
células no presentarïan receptores para este factor de creci
miento, por lo cual descartan que el factor secretado al medio de
cultivo intervenga en el crecimiento autócrino de estas células.
5.2. Factores ¿122 ¿l
Son los factores que actuando sobre células competentes per
miten la progresión de la fase 61 a la fase S del ciclo celular.Dentro de estos factores tenemos la familia de las somatome
dinas, presentes en el suero y en la fracción del plasma pobre en
plaquetas. Son la somatomedina C (IGF-I) y la somatomedina A
(IGF-II) (Rinderknecht y Humbel, 1978 a y b). Estos péptidos son
factores de crecimiento semejantes a insulina y presentan con
siderable homologïa de secuencia entre sï y con la proinsulina.
"In vivo", las somatomedinas coordinan el crecimiento y
desarrollo de los tejidos; "in vitro", tienen efecto mitogénico
sobre células en cultivo, siendo más potente la somatomedina C
(Schoenle y col., 1982).
Para ejercer sus efectos deben unirse a receptores específi
cos de membrana. Se han identificado dos receptores fisicoquïmica
mente distintos:
- el receptor tipo I es un heterotetrámero compuesto por dos gru
pos de subunidades distintas unidas entre sï por puentes
disulfuro. Su peso molecular es de 330 kilodaltons (Kasuga y
col., 1981; Massague y Czech, 1982; Stuart y col., 1984). Es
estructuralmente semejante al receptor de insulina y podrian
27
estar evolutivamente reiacionados (Roth y co]., 1983). Este
receptor presenta mayor afinidad por IGF-I que por IGF-II. La
insulina se une a é] 5610 a aitas concentraciones.
- E1 receptor tipo II es una cadena poiipeptïdica de 220 kilo
daitons de peso moiecuiar. Presenta mayor afinidad por IGF-II
que por IGF-I pero no iiga insuiina ni aün a aïtas con
centraciones.
Las céiuias MCP-7 de tumor de mama humano presentan recep
tores tipo I para somatomedinas (Furianetto y Di Cario, 1984). La
somatomedina C tiene efecto mitogénico sobre estas céiuias; se
requieren concentraciones de 10 a 100 veces mayores de insuiina
para iograr e] mismo efecto debido a que 1a potencia con que 1a
insuiina se une a1 receptor tipo I es 1/10 a 1/100 que 1a que pre
senta la somatomedina C. Esta observación ya habia sido descripta
por otros investigadores que estudiaron e] efecto de insuïina y
somatomedina C sobre fibrobiastos (Stiies y coi., 1979; Cherington
y Pardee, 1980). Esta teoria se opone a 1a de Osborne (1976) que
dice que 1a in5u1ina interactüa con receptores eSpecïficos de alta
afinidad y no con Ios receptores de 50matomedinas.
Las células MCF-7 responden a 1a insuiina con un incremento
en 1a sintesis de ARNy proteinas. Estas respuestas tempranas se
acompañan de cambios en e1 fiujo de iones,aumento en ios niveies
de fosforiiación y estimuiación de] transporte de aminoácidos. La
progresión de 1a fase Gl a 1a fase S de] cicio ceiuiar requiere
sintesis de nuevos ARNm(tai como fue descripto por Shipiey y co].
en 1984) y cuimina en 1a división y crecimiento ce1u1ar. A
diferencia de 10 que ocurre en fibrobiastos, 1a insuiina induce
síntesis de ADNen lineas celulares de tumor de mama humano sin
que se requieran otros componentes séricos. Su mecanismo de acción
involucra el metabolismo de fosfolïpidos; aumenta la síntesis "de
novo" de fosfoinosïtidos con un incremento en los niveles de
1,2-diacilglicerol, fosfatidil inositol-4,5-difosfato y ácido fosfatïdico (Farese y col., 1986). Asimismoestimula la actividad de
la proteïnaquinasa C (pK C) provocando una translocación de la
enzima del citosol a la fracción particulada. Este efecto se mani
fiesta sólo en células quiescentes y es mayor para las células
MCF-7 que para la otra lïnea celular estudiada, T-47 D (Gómez y
col., 1988).
D'Ercolle y col. postularon en 1984 que la estimulación del
crecimiento en estas células ocurre por un mecanismo autócrino o
paracrino. Sus resultados concuerdan con los trabajos de Clemmons
y col. (1981) y Adamsy col. (1983) que describen la sïntesis de
IGF-I en células humanasy en fibroblastos de rata en cultivo.
Más recientemente, los trabajos de Huff y col. en 1986 y 1987
demuestran que las lïneas celulares de tumor de mama humano son
capaces de secretar IGF-I al medio de cultivo. Dicha producción
está estimulada por el tratamiento de las células con
17€)-estradiol .
5.3. Factores tigo III
Son los factores que actüan sinergïsticamente con la insu
lina, aumentando aün más la sintesis de ADNen las células sobre
las que ejercen su efecto.
29
5.3.1. EEE: El factor de crecimiento epidérmico es un péptido de
6045 daitons de peso molecuïar, aisïado de gïánduïa Submaxiiar de
ratón (Cohen, 1962) y de orina humana, de 1a cua1 se obtiene como
urogastrona (Cohen y Carpenter, 1975).
Actüa estimuïando 1a sintesis de ADNen céïuïas BaIb/c 3T3
sobre 1as que ha actuado previamente el PDGF para inducir el
estado de competencia (Leof y col., 1983).
Se ha estudiado su efecto sinérgico con insuiina en 1a
estimuïación de] crecimiento, observándose que e] EGFse requiere
durante 1a fase temprana de 1a progresión (las primeras 8 horas)
mientras que 1a insulina se requiere durante toda 1a progresión
(Rose y c01., 1975; Leof y c01., 1983; Shipïey y c01., 1984).
E1 EGF tiene efecto mitogénico sobre céïuïas derivadas de
ectodermo, mesodermo y endodermo (Osborne y c01., 1980). Se ha
postuïado una estimuiación de] crecimiento inducida por EGF en
céiulas epiteiiaies de mamatanto normaïes como ma1ignas, de ratón
o humano.
E1 EGF a dosis de 10 ng/m] estimuïa e] crecimiento de las
céluias MCP-7cultivadas en un medio 1ibre de suero, provocando un
aumento en 1a incorporación de timidina, uridina y 1eucina a
macromoiécuias y aumentando e] contenido de ADNy e1 crecimiento
ce1u1ar (Fitzpatrick y co]., 1984). Induce 1a transcripción de Ios
genes de P .y Ïf -actina (Eider y co1., 1984) y dei gen c-fos
(Marsha11, 1987).
Su mecanismo de acción no invoïucra e] metaboïismo de
fosfoinosïtidos; provoca un aumento de] Ca2+ intraceïuïar como
30
consecuencia de un efecto directo sobre los canales de calcio de
la membranacelular (Moolenaar y col., 1986).
El tratamiento de las células con EGF induce autofos
forilación de los residuos tirosina del receptor a la vez que se
fosforilan los residuos serina y treonina (Hunter y Cooper, 1981;
Cochet y col., 1984; Davis y Czech, 1984; Iwashita y Fox, 1984).
Esta reacción está catalizada por la proteina quinasa C siendo la
treonina 654 el principal sitio de fosforilación (Hunter y col.,
1984; Davis y Czech, 1985a; King y C00per, 1986). La fosforilación
del receptor mediada por la proteina quinasa C tiene por lo menos
tres efectos:
- inhibe la actividad de tirosina quinasa (Cochet y col., 1984;
Friedman y col., 1984; Iwashita y Fox, 1984; Downwardy col.,
1985; Chinkers y Garbers, 1986);
disminuye la afinidad de unión del receptor por EGF (Lee y
Weinstein, 1979; Shoyab y col., 1979; Davis y Czech, 1986);
provoca internalización del receptor (Beguinot y col., 1985;
Fearn y King, 1985; Chinkers y Garbers, 1986).
Factores c0mo el PDGFque activan a la proteina quinasa C,
actüan regulando la expresión del receptor de EGF (Brown y col.,
1984; Davis y Czech, 1985b; Rozengurt, 1986). Fabbro y col. en
1986 postulan que de esta manera se regula el crecimiento de
células de tumor de mama humano.
Mori y col. demostraron en 1986 que las células MCF-7sin
tetizan y secretan al medio de Cultivo un polipéptido inmunológi
camente relacionado con EGF humano.
Dickson y col. (1986) demostrarOn que la producción de este
31
poiipéptido se induce por tratamiento de 1as céïuias MCP-7con 17
G>-estradi01; este factor estaria invoiucrado en e] crecimientoautócrino de estas céiuias.
5.3.2. Trombina. Es una proteasa serïnica a1tamente especifica que
juega un ro] importante en 1a cascada de 1a coaguiación sanguínea.
Varios grupos de investigación han estudiado su efecto
sobre cuitivos primarios y 1ïneas ceiuiares de origen mesodérmico,
observando que estimuia la sintesis de ADNy la proiiferación
ceiuïar tanto en presencia de suero como en medios químicamente
definidos (Chen y Buchanan, 1975; Zetter y c01., 1977; Carney y
Cunningham, 1978; Cherington y Pardee, 1980).
Trombina tiene efecto mitogénico por si misma sobre
fibrobiastos de embrión de p0110 quiescentes pero además potencia
e] efecto de otros mitógenos, como 1a prostagiandina Faq, insuiina
y EGF (Zetter y co]., 1977; Carney y Cunningham, 1978;
Gospodarowicz y c01., 1978).
E1 agregado de trombina junto con PgF2°( y EGF aumenta 1a
densidad celuiar fina] que a1canzan Ios cuitivos. Hoiley y
Kiernan han sugerido que 1a densidad ceiuiar fina] a1canzada por
un cultivo se re1aciona con 1a capacidad de ias céiulas para acu
muïar nutrientes aportados por e] medio de cultivo. En consecuen
cia, este efecto de tr0mbina podria relacionarse con un incremento
de] transporte de nutrientes a través de 1a membrana ceiuiar o
bien, trombina podria actuar indirectamente, superando 1a barrera
de difusión de nutrientes (Stoker, 1973). Los trabajos de Carney y
Cunningham (1978) y de Baker y co]. (1979) postuian que trombina
32
ejerce sus efectos a través de 1a unión a receptores especificos
de membrana. Ni EGF ni insuiina ni protrombina pueden competir con
trombina por la unión a1 receptor. Sin embargo, Low y co].
demostraron en 1985 que 1a unión a1 receptor no es necesaria para
e] efecto estimulatorio de trombina sobre 1a división ceiuiar,
mientras que es imprescindibie para dicho efecto 1a actividad pro
teoiïtica de trombina, ta] como habian observado Gienn y col. en
1980.
Para expiicar e] mecanismo por e] cua] trombina potencia e]
efecto de otros mitógenos se han postuiado aiteraciones en la
membrana ceiular con modificaciones en 1as proteinas de Superficie
(Biumberg y Robbins, 1975; Baker y co]., 1979) que se traducen en
una sensibilización de las céiuias a ios demás factores de creci
miento, por una mayor exposición de los corresp0ndientes recep
tores de membrana.
Goidstein y co]. en 1979 postularon para e] caso de EGF e
insu1ina que trombina aumentaría 1a vida media dei compïejo factor
de crecimiento-receptor, disminuyendo 1a degradación por endocitocis.
Cherington y Pardee observaron en 1980 que trombina puede
reempiazar a1 EGFen su actividad. Describieron céiuias transfor
madas que habïan perdido simuitáneamente los requerimientos de
ambos factores de crecimiento y postuiaron que ios mecanismos
invoïucrados en 1a estimuiación de] crecimiento celuiar por parte
de EGFy trombina estarian reiacionados. Sin embargo, trabajos más
recientes demuestran que e] efecto mitogénico de trombina se rela
ci0na con una activación de] metaboiismo de fosfoiïpidos. Carney y
33
co]. (1985) y L'A11emain y co]. (1986) observaron que trombina
ejerce un efecto dosis dependiente en 1a activación de 1a fos
foiipasa C en fibroblastos de hamster.
Ruggiero y Lapetina demostraron en 1985 que trombina activa
1a proteina quinasa C en plaquetas.
Se requiere una proteina con actividad GTPásica para 1a
transducción de 1a seña] mitogénica generada por trombina, dado
que cuando se bioquea 1a proteína G con 1a toxina de pertussis, se
bloquea también e] efecto mitogénico de trombina (Paris y
Pouysségur, 1986).
A pesar de] considerabie progreso alcanzado en e] estudio
de] mecanismo de acción de trombina en células de origen mesodér
mico, poco es 10 que se conoce sobre su efecto en cé1u1as epite
liaïes. En 1987, Medrano y co]. describen por primera vez su
efecto mitogénico sobre una iïnea ce1u1ar de tumor de mamahumano,
T-47D, de origen epiteïiai. Observan que trombina estimuïa 1a
sintesis de ADNen céiuïas quiescentes por ayuno de suero, ejer
ciendo un efecto mitogénico por sï misma pero potenciando también
los efectos de EGF. C0mprueban que trombina puede c0mpensar en
parte los requerimientos de EGF pero no 105 de insuïina. Además,
trombina provoca una activación de 1a proteina quinasa C con
transiocación de 1a enzima de] citosoI a 1a membrana (Gómez y
c01., 1988).
34
5.3.3. Prostagl andina ¿2 cx
Las prostaglandinas constituyen un grupo de moléculas
lipïdicas sintetizadas a partir del ácido araquidónico. Pueden
modificar la velocidad de proliferación y diferenciación de una
gran variedad de células en cultivo. En particular, la Pg
F2c( tiene efecto mitogénico sobre fibroblastos (Jiménez de Asüa y
col., 1975), cultivos de células "stem" hem0poyéticas (Feher y
Giraldi, 1974) y sobre explantos de glándula mamaria de ratón
(Rillema, 1975).
La Pg F29(a dosis bajas (300 ng/ml) estimula una serie de
eventos que preceden a la sintesis de ADNy a la división celular
en cultivos confluentes de células Swiss 3T3 detenidas en la fase
Gl/Go del ciclo celular (Jiménez de Asüa y col., 1975 y 1979;
O'Farrell y col., 1979). Entre los cambios bioquïmicos observados
se verifica una estimulación del metabolismo de fosfoinositidos
con un incremento del contenido celular de 1,2-diacilglicerol
(Macphee y col., 1984) y movilización de calcio de los depósitos
con un incremento del Ca2+ intracelular, como consecuencia de la
formación de inositol-1,4,5-trifosfato (Moolenaar y col., 1984a;
Hesketh y col., 1985). El diacilglicerol formado interviene en la
activación de la proteina quinasa C y en la producción de
prostaglandinas a través de la formación de ácido araquidónico.
35
6. Efectores g moduladores de] crecimiento ceiuiar
Son moléculas de bajo peso molecular (menor de 500 daitons) que
controian 1a proliferación y diferenciación ceiuiar.
Dentro de estos compuestos se inciuyen: e] dimetiisuifóxido
(DMSO),
e] butirato de so
dio,
los derivados de 1a
vitamina A.
6.1. Dimetiisuifóxido
En 1971, Friend y co]. demostraron que ei dimetiisuifóxido
estimuiaba 1a diferenciación eritroide en céluias de ieucemia de
mono infectadas c0n virus. A partir de entonces, se utiiizó ei
DMSOcomo inductor de 1a diferenciación en céiuias leucémicas y
principaimente en dos iïneas ceiuiares: 1a eritroieucemia murina
de Friend y la ieucemia pr0mielocïtica HL-60 (Coiiins y c01.,
1978).
E1 tratamiento de ias céiuias de 1a eritroieucemia murina de
Friend con DMSO induce 1a aparición de marcadores de
diferenciación: sintesis de hemo, hemogiobina y espectrina y
aparición de antígenos de membrana (Ross y c01., 1972).
En 1a iïnea ce1u1ar HL-60, e] DMSOinduce diferenciación ter
mina] con aparición de granuiocitos maduros con poder fagocïtico.
Distintas teorias se han formulado para expiicar su mecanismo
de acción. Debido a su utiiización en 1a criopreservación de ias
36
céiuïas, se ha propuesto que su mecanismo de acción invoiucra
alteraciones en 1a membrana (Lyman y co]., 1976). Otra teoria
indica que e] DMSOactuarïa en e] nücïeo, a1terando 1a confor
mación de] complejo ADN-cromatina, permitiendo 1a iniciación de 1a
transcripción de Ios genes involucrados en 1a diferenciación
(Tanaka y co]., 1975).
E1 hecho de que el DMSOinduzca diferenciación en céiuïas
humanas y murinas hace pensar que pueda actuar a través de meca
nismos comunes en una gran variedad de céiulas animales.
6.2. Butirato de sodio
Es un agente inductor de 1a diferenciación, más potente que
e] DMSO(Leder y Leder, 1975).
Tsao demostró en 1982 que e] butirato de sodio inhibe e] cre
cimiento de céïuias epiteïiales de mamïfero y aumenta e] contenido
de antïgeno carcinoembrionario (CEA) en adenocarcinomas de coion
humano.
Se estudió su efecto también sobre ias células HL-60 y sobre
1a eritroleucemia murina de Friend.
Abe y Kufe (1984a) comprueban que e] butirato de sodio inhibe
1a proiiferación de 1as céluïas MCF-7 de tumor de mama humano y
aumenta 1a expresión de] CEA. Este efecto es dosis dependiente y
se manifiesta a partir de una concentración de 1 mM; e] máximo
efecto se logra con una concentración de 4 mM. Observan también
a1teraciones morfoiógicas con un agrandamiento de] citoplasma.
Estos autores buscaron 1a aparición de otros marcadores de
diferenciación en células MCF-7que fueran más especificos que e]
37
CEA para obtener una mejor correiación entre e] tratamiento con
butirato de sodio y 1a aparición de un fenotipo diferenciado.
Desarroiiaron un antiCUerpo monocïonai en ratón (DF3) que reac
ciona con un antïgeno presente en los bordes apicaies de ias
céluias de epiteiio de mama más diferenciadas y con capacidad
secretoria; este antïgeno también está presente en 1a ieche
humana, por lo tanto 10 usan como marcador bioquímico especifico
de 1a diferenciación. Luego de] tratamiento de las céluias MCF-7
con butirato de sodio, estos autores observaron un aumento en 1a
producción de este antígeno, pudiendo correiacionar e] efecto de]
butirato de sodio con 1a inducción de un fenotipo diferenciado en
estas céluias (Abe y Kufe, 1984b).
Los trabajos de Bryant en 1986 demuestran que e] butirato de
sodio reduce 1a expresión de receptores para laminina presentes en
ias células MCF-7. La 1aminina es una giicoproteïna iocaiizada en
1a membrana basa] e involucrada en e1 crecimiento ce1u1ar,
diferenciación, morfogénesis, migración, adhesión ce1u1ar y
metástasis. E1 butirato de sodio, en consecuencia, interferirïacon estos fenómenos.
En 1984, Stevens habïa descripto que e] tratamiento de 1as
céluias de tumor de mamahumano con butirato de sodio resuitaba en
una menor expresión de receptores estrogénicos y de progesterona
por parte de estas céluias.
Se ha postulado que e] butirato de sodio afecta proteinas
nucïeares y que induce hipermetiiación del ADN(de Haan y c01.,
1986).
Más recientemente, Giancotti y coi. (1988) demuestran que e]
38
butirato de sodio provoca inhibición de las deacetilasas con la
consiguiente aparición de histonas hiperacetiladas y cambios en la
conformación del ADN. Como resultado de la hiperacetilación, el
ADNse vuelve más sensible a la acción de la DNAsa I.
6.3. ggmpuestos retinoideos: derivados gg la vitamina AInvolucran a una familia de moléculas de origen natural o
sintético, análogas a la vitamina A.
Durante de más de 60 años, estas molÉCulas demostraron ser
potentes agentes de control de la diferenciación y proliferacióncelular.
En 1925, Holbach y Howedescribieron efectos diferentes en la
diferenciación y proliferación celular de epitelio de ratas defi
cientes en vitamina A. Observaron una excesiva proliferación celu
lar en el epitelio acompañada de una altïsima acumulación de
queratina (producto de la diferenciación de los queratinocitos).
No pudieron dilucidar los mecanismos moleculares involucrados y
aün hoy no se ha logrado una explicación satisfactoria.
Se ha propuesto su uso como agentes en la prevención del
cáncer a partir de que inhiben o retardan el crecimiento de
tumores murinos y humanos. Sin embargo, los re5ultados obtenidos
en el tratamiento de pacientes con tumor de mama no han sido
auspiciosos, para lo Cual se esgrimen razones de tipo far
macológico (Gold y col., 1981; Goodmany col., 1982; Kerr y col.,
1982; Clamon y col., 1985).
El empleo de lineas celulares sigue arrojando resultados
contradictorios, en los cuales influyen la susceptibilidad de las
39
células, el medio de cultivo empleado para su crecimiento y la
dosis administrada. En 1979, Lotan describe la distinta suscep
tibilidad que presentan diferentes lineas de tumor de mamay de
melanoma humanos al tratamiento con compuestos derivados de la
vitamina A.
En 1983, Hiragun y col. observan estimulación de la proli
feración celular por efecto de ácido retinoico en células Balb/c
3T3 transformadas por los virus que producen el sarcoma de Moloney
y de Kirsten. Esta estimulación se manifiesta sólo cuando las
células se cultivan en un medio libre de suero y es dosis
dependiente; el pico de máxima estimulación se observa con dosis
de 10'8 a 10'7 M. Concentraciones por encima de 10"6 M resultan
tóxicas para las células, provocando una disminución de la viabi
lidad celular. En 1980, Lotan ya habia mencionado la influencia de
la dosis administrada sobre explantos cutáneos humanosy cultivos
primarios de epidermis de rata, ratón o humano. En este caso, la
administración de bajas dosis de vitamina A (tanto "in vivo“ como
aportada al medio de cultivo) provocaba un aumento del indice
mitótico, de la división celular y de la velocidad de sintesis del
ADN. Estos efectos desaparecïan al administrar altas dosis de
vitamina A.
Jetten y col. observaron en 1985 que el ácido retinoico
inhibïa el crecimiento independiente del anclaje en células de
hamster que expresaban el oncogen v-src mientras que se eviden
ciaba un efecto estimulatorio cuando la mismalinea celular expre
saba el oncogen v-Ha-ras.
Los derivados de la vitamina A a altas dosis (10‘6 M) han
60
sido utiiizados como agentes inductores de 1a diferenciación en
células de teratocarcinoma murino F9 (Strickiand y Mahdavi, 1978)
y en la linea ceiular de ieucemia promieiocïtica HL-60 (Breitman y
c01., 1981).
41
OBJETIVOS E ESTA TESIS
E1 concepto de heterogeneidad tumora], segün fue introducido
por Heppner en 1984, impiica 1a presencia de distintas sub
pobiaciones dentro de un mismo tumor. Buick y Poïiak (1984)
postularon 1a existencia de 1a jerarquïa ce1u1ar, con 1a célula
"stem" capaz de autogenerarse y de originar céiuias con distinto
grado de diferenciación.
E1 presente trabajo de tesis considera de crucia] importancia
investigar 1a naturaieza de 1a céiuia "stem", su crecimiento
autócrino y su reguiación por hormonas y factores de crecimiento
exógenos.
E1 objetivo de esta tesis comprende:
- obtener en forma purificada 1as diferentes subpobiaciones que
componen 1a iïnea ceiuiar de tumor de mama humano MCP-7. Dicha
purificación impiica 1a puesta a punto de 1a técnica de separa
ción de subpobiaciones celuiares mediante centrifugación en gra
dientes de densidad de Percoli;
estudiar e] efecto de factores de crecimiento tales como insu
iina, trombina, PDGF, EGF y PgF2(¿ sobre ias subpobiaciones
aisiadas. Anaiizar los posibies mecanismos bioquímicos impiica
dos en la reguiación del crecimiento ce1u1ar.
estudiar e1 efecto de agentes moduiadores de 1a diferenciación
ce1u1ar, taies como e] 13-cis retina], e] DMSOy e] butirato de
sodio.
- analizar 1a posibiiidad de secreción de factores proteicos
autócrinos que moduian e] crecimiento ceiular.
42
MATERIALES l METODOS
1. Céiuïas
Se utilizó 1a Iïnea ce1u1ar de tumor de mama humano MCF-7 obte
nida en la Michigan Cancer F0undation, Detroit, MI., USA, a partir
de una efusión p1eura1 de una paciente con tumor diseminado (Scuïe
y col., 1973). La iïnea utiiizada en e] 1aboratorio no ha sido
clonada.
2. Medios gg cuitivo
2.1. Duibecco/F-12: mezc1a de Duibecco/F-IZ (1:1) supiementada
con 4 mMde gïutamina, 50 U/ml de peniciïina, 50 ug/m] de
estreptOmicina y 10 ug/m] de in5u1ina (Sigma Chemicaïs
Co., St. Louis, M0., USA).
2.2. Duïbecco/F-12/FBS: mezcla de Duibecco/F-12 supiementada
también con 10% de suero feta] bovino (Laboratorios
Gibco).
2.3. Duibecco/F-IZ/BSA: mezcïa supïementada de Duïbecco/F-IZ en
1a cual e] agregado de suero feta] bovino se reempiaza por
1 mg/m] de seroalbümina bovina fracción V (Sigma Chemicais
Co., St. Louis, M0,, USA).
3. Mediosgg cuitivo 1ibres gg metionina
3.1. Dulbecco ¿ln M33: Duibecco iibre de metionina supiementado
con 4 mMde gïutamina, 50 U/m1 de penicilina, 50 ug/m] de
estreptomicina y 10 ug/m] de insuïina.
3.2. Duibecco sin Met/FBS: medio Du1becco sin metionina Supie
3.3.
43
mentado además con 0,5% de suero fetal bovino.
Dulbecco sin Met/BSA: medio Dulbecco sin metionina suple
mentado además con 35 ug/ml de seroalbümina bovina frac
ción V.
Factores de crecimiento4.1. Insulina: provista por Collaborative Research, Natham,
MA., USA. Se ensayaron distintas concentraciones a partir
de una solución madre de 10 ug/ml, conservada a -20°C.
EGF: provisto por Collaborative Research, Hatham, MA.,
USA. Se ensayaron distintas concentraciones a partir de
una solución madre de 10 ug/ml, conservada a -20°C.
Trombina: minimo 3.000 unidades NIH/mg (Sigma Chemitals
Co, St. Louis, M0., USA). Se prepararon distintas dilu
ciones a partir de una solución madre de 250 U/ml, conser
vada a -20°C.
PDGF: obtenido por gentileza del Dr. Charles Stiles, del
Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA., USA. Se ensayo
a una concentración de 1 ug/ml preparada a partir de una
solución madre de 200 ug/ml, conservada a -20°C.
¿a 52o(: prostaglandina provista por Sigma Chemicals Co.,
St. Louis, MO., USA. Se prepararon distintas diluciones a
partir de una solución madre de 20 ug/ml, conservada a
-20°C.
44
5. Moduiadores de 1a diferenciación celuiar
5.1. 13-cis-retina1: derivado 2-cis de la Vitamina A, tipo XV
(Sigma Chemicais Co., St. L0uis, M0., USA). Se prepararon
distintas diluciones en dimetilsuifóxido a partir de una
solución madre 10'2 M, conservada a -70°C. Todas ias mani
puiaciones se efectuaron en 1a oscuridad.
5.2. Estradio]: (Sigma Chemicais Co., St. Louis, M0., USA). Se
ensayaron distintas diiuciones preparadas a partir de una
soïución madre 10'5 M, conservada a -20°C.
5.3. Butirato de ¿2312: (Sigma Chemicais Co., St. Louis, M0.,
USA). Se ensayaron distintas diluciones preparadas a par
tir de una soiución madre 100 mM.
5.4. Dimeti] suifóxido: (Merck, Aiemania Occidentaï).
OS o Cuitivo ceiuiar
Las células MCF-7 (no cionadas) se cuitivaron en medio
Duibecco/F-12/FBS a 37°C en atmósfera humidificada conteniendo 5%
de C02. E1 medio de cuitivo se cambió cada 3 dias.
7. Curvas gg crecimiento celuiar
Las células MCF-7 se sembraron en piacas de piástico de 35 mm
con medio de cuitivo supiementado con 10% de suero fetai bovino.
Cuatro horas después, ias céiulas se pasaron a ios distintos
medios de cultivo, segün io indicado. E1 nümero de céluias se
determinó por dup1icado 1uego de tripsinizar las céluias con
tripsina-EDTA (2,5 g/i; 0,2 g/1; Laboratorios Gibco) a 37°C. E1
45
recuento celular se efectuó en hemocitómetro; la viabilidad de las
células se determinó por el ensayo de exclusión del colorante azul
tripán.
8. Marcación gg proteinas con L3SSQ-metionina
Las células se marcaron durante 3 horas con 100 uCi de
(35S)-metionina (1.000 Ci/nmol, New England Nuclear, Boston, MA.,
USA) por cada placa de plástico de 35 mm, en medio libre de
metionina.
8.1. Determinación de las groteïnas marcadas con
L35S1-metionina secretadas al medio gg cultivo. Al cabo de
la incubación con el material radiactivo, el medio de
cultivo de las células fue aspirado con pipeta Pasteur. Se
centrifugó para remover las células flotantes y se preci
pitó con 10% de TCA en hielo. Las proteinas precipitadas
se lavaron 2 veces con acetona frïa (Merck) para remover
el TCAy se resuspendieron en 50 ul de buffer muestra (2%
de SDS, 20% de glicerol, 0,125 M de Tris HCl pH 6,8; 2,5%
de e 4nercapto etanol y 0,1% de azul de bromofenol). Se
contó una alícuota usando Tolueno Omnifluor como solución
de centelleo. Las muestras se conservaron a -70°C hasta el
momentode correrlas en una electroforesis monodimensional
en geles de poliacrile 'a (segün Laemmli, 1970), usando
10% de acrilamida. Las muestras se hirvieron durante 2
minutos antes de ser sembradas. Los geles se revelaron
usando la técnica descripta por Bonner y Laskey, 1974;
46
Laskey y Mills, 1977.
8.2.1. Determinación ¿L_ las proteinas intracelulares marcadas
con L3SSz-metionina. Luego de la incubación con el
material radiactivo, se removió el medio de Cultivo y
las células se lavaron 2 veces con PBS-Ca2+/Mg2+frïo.
Se agregaron 40 ul de SDS 0,3% hirviendo y luego, 10 ul
de DNAsa/RNAsaen hielo. Los extractos obtenidos se pre
cipitaron con 10% de TCAen hielo. Se contó una alïcuota
utilizando Tolueno Omnifluor comosolución de centelleo.
-70°C hasta elLas muestras se conservaron a momento de
correrlas en una electroforesis bidimensional en geles
de poliacrilamida. La primera dimensión fue un
isoelectroenfoque, efectuado segün O'Farrell (1975),
para lo cual se utilizó una solución de anfolitos al 2%,
de pH 3,5 a 10. La segunda dimensión se corrió segün
Laemmli (1970), usando 10%de acrilamida.
Determinación de las groteïnas intracelulares (nucleares
l citoplasmáticas) marcadas con L3SSl-metionina. Luegode la incubación con el material radiactivo, se removió
el medio de cultivo y las células se lavaron 2 veces con
PBS-Ca2+/Mg2+frio. Luego se cosecharon raspándolas con
escobilla de goma y se centrifugaron durante 2 minutos
en una centrífuga Eppendorf. Las células se resuspen
dieron en 50 ul de buffer TNN (50 mM de Tris pH 8; 250
mM de NaCl; 0,5% de NP-40; 1 mM de PMSF) y se agitaron
en un aparato Vortex varias veces durante los 4 minutos
47
de tratamiento con e] buffer. Las muestras se pasaron 10
veces por un homogeneizador Dounce y se centrifugaron
durante 2 minutos en centrífuga Eppendorf para separar
1a fracción nuciear de la citopiasmática. Las proteinas
citopiasmáticas y nucïeares se precipitaron con 10% de
TCA en hielo y se soïubiiizaron con 0,1 N de NaOH. Se
contó una a1ïcuota usando Bray como soiución de cen
teileo.
9. Determinación de proteinas
Se efectuó sobre céiuias MCF-7plaqueadas en piacas de piástico
de 35 mm. Se determinó el contenido tota] de proteinas y se
discriminó entre la fracción nuclear y 1a citoplasmática.
Se utilizó e] método descripto por Lowry y co]. en 1951.
10. Medición gg transporte
Las células MCP-7cuitivadas en placas de piástico de 35 mmse
marcaron con 100 uCi de (355)-metionina (1.000 Ci/nmo]; New
Engiand Nuciear, Boston, MA., USA) a distintos tiempos, segün 10
indicado, para hacer una cinética de 1a reacción.
A] cabo de cada incubación, ias células se 1avaron 3 veces
rápidamente con PBS-Ca2+/Mg2+frio; 1as proteinas se precipitaron
con 10% de TCA en hieio durante 20 minutos y se recogió 1a frac
ción soiubie en TCA.Las proteinas precipitadas se disoivieron con
0,5 mi de SDS 0,3% durante 30 minutos a 37°C. Se contó una
aiïcuota de cada fracción (solubie y precipitabie en TCA)usando
Bray como soiución de centeïieo.
48
11. Determinación de queratinas
11.1. _g efectuó por análisis gg Westerngig;
Luego de marcar las proteinas ceiuiares con (3SS)-metionina,
se obtuvieron ios extractos celuiares (tai como fue descripto en
1a sección 8.2.1.) y se corrieron en una eiectroforesis monodimen
sionai en geles de poiiacriiamida en presencia de SDS, usando
12,5% de acriiamida. Posteriormente, las proteinas se trans
firieron eiectroforéticamente a nitroceiuiosa (Schieicher y
Schuli, BA 85, tamaño de] poro: 0,45 u). Las citoqueratinas se
revelaron por 1a técnica de 1a inmunoperoxidasa, utiiizando anti
cuerpos obtenidos en conejo y dirigidos contra queratinas humanas
(Neai Burnette, 1981). Se procedió de 1a siguiente manera: iuego
de bioquear 1a peroxidasa endógena y los sitios inespecïficos de
reacción, se inCubó con ei anticuerpo antiqueratinas humanas
diiuido 1/100 durante 2 horas 30‘ a temperatura ambiente. Luego de
iavar con PBS, se incubó con e] segundo anticuerpo (IgG de cabra
anti IgG de conejo) diiuido 1/450 durante 60‘ a temperatura
ambiente. Luego de 1avar con PBS, se incubó con e] complejo PAP
(peroxidasa compiejada con IgG de cabra anti IgG de conejo)
durante 30' a temperatura ambiente. E1 reveiado se efectuó por e]
método de 1a diaminobencidina/agua oxigenada durante 7 minutos en
la oscuridad.
49
11.2. _g efectuó pg; la técnica inmunocitoquïmica
Las céiuias cultivadas en piacas de pïástico de 35 mm se
fijaron en etano] absoluto durante 10 minutos. Se conservaron a
-20°C hasta su uso. En e] momento de ser usadas, se rehidrataron
con PBS y se procedió tai como se describió en 1a sección 11.1.
Luego dei revelado con diaminobencidina/agua oxigenada, ios
nücleos de ias céiuïas se tiñeron con hematoxilina de Harris
durante 20 segundos. E1 coiorante viró con agua caliente. Las
céiuias se iavaron y se montaron con giiceroï para su observación
microscópica.
12. Marcación gg proteinas con L32Pl-ortofosfatoLas céluïas se marcaron durante 3 horas con 150 uCi de
(32P)-ortofosfato por cada piaca de piástico de 35 mm, en medio
1ibre de fosfato. Para 1as céiulas cuitivadas en presencia de
suero feta] bovino, se utiïizó suero diaiizado durante 1a mar
cación.
12.1. Determinación de las proteinas marcadas con
L32El-ortofosfato secretadas gl_ mgglg_gg cuitivo. Se
procedió tai como fue descripto en 1a sección 8.1. para
ias proteinas marcadas con (355)-metionina.
12.2. Determinación gg las proteinas ceiuiares marcadas con
132Pi-ortofosfat . Se procedió siguiendo e] mismoproto
colo descripto en 1a sección 8.2.1. para las proteinas
marcadas con (355)-metionina.
50
13. Separación de las céïuïas gg¿¿1 en subpobiaciones
Las céïulas MCF-7se separaron en subpoblaciones usando gra
dientes de densidad de un poïïnero de coïoide de sïlica (Percoïi,
ABPharmacia, Uppsala, Suecia).
Se prepararon 7 soluciones :e densidades 1,035; 1,040; 1,050;
1,060; 1,065; 1,070 y 1,080 ;/1 en 2,5 M de sacarosa y se
sembraron 2 m1 de cada soïución. Las céiuias en crecimiento expo
nencial se tripsinizaron y se sembraron encima de] gradiente
(3.106 céiuias en 1 m1 de PBS-C22+/Mgz+). E1 gradiente se centri
fugó a 800 g durante 45 minutos a temperatura ambiente en una
centrífuga de ánguïo móvil.
Se coiectaron fracciones cada 0,5 m1 comenzando desde e]
extremo superior dei gradiente y se 1avaron 2 veces con 5 voiüme
nes de PBS-Ca2+/Mgz+. Se efectuó e] reCuento de] nümero de células
en cada fracción, determinando 1a viabiiidad ceïular por ei ensayo
de exclusión de] azu] tripán. Se obtuvieron 6 subpoblaciones (A a
F) que corresponden a 1as siguientes fracciones: A (fracción 1 a
fracción 15); B (fracción 16 a fracción 19); C (fracciones 20 y
21); D (fracción 22); E (fracción 23) y F (fracción 24 a fracción
30 = precipitado).
Estas subpobiaciones aisiadas fueron piaqueadas separadamente
y utiIizadas para su estudio.
51
14. Ensaïos clonogénicos en agar blando
Se preparó un agar base (0,5% de concentración final en 1 ml
por placa de plástico de 35 mm; BioRad, Richmond, CA., USA) con
medio Dulbecco/F-12 suplementado con 10%de suero fetal bovino o 1
mg/ml de seroalbümina bovina fracción V (de Cohn). Encima se
sembraron 104 células por placa en 1 ml de medio de cultivo con
teniendo los factores en ensayo y agar (0,4% de concentración
final). Al cabo de 10 dias, se agregaron 0,5 ml de una solución
estéril de cloruro de
2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (0,5 mg/mlen agua)
y las placas se incubaron en la oscuridad durante 24 horas. Se
efectuó el recuento de colonias viables (teñidas con el colorante)
bajo el microscopio. Las colonias se fotografiaron usando pelicula
Polaroid.
15. Determinación del efecto de factores de crecimiento sobre
células guiescentes
Las células se plaquearon en presencia de 10% de suero fetal
bovino. Cuatro horas después, se lavaron exhaustivamente con
PBS-Ca2+/Mg2+ y se pasaron a medio Dulbecco/F-lZ/BSA pero sin el
aporte de insulina para inducir la entrada de las células al
estado de quiescencia. Luego de 48 horas, se agregaron los fac
tores de crecimiento en estudio por 24 horas, al cabo de las
cuales se efectuó una marcación con metil-(3H)-timidina, 1 uCi/ml
(actividad especifica = 1 uCi/ul) durante 2 horas a 37°C. Al cabo
de la incubación se aspiró el medio de cultivo. Las células se
52
lavaron con PBS-Caz+/Mg2+frio; se precipitaron 1as proteinas con
10% de TCA en hielo y se disoivieron con 0,3% de SDS durante 30
minutos a 37°C. Se contó una aIÏCuota usando Bray como solución de
centeiieo.
16. Determinación de] "TLI": porcentaie gg nücleos mitóticos mar
cados con metil-(afll-timidina
Las céiulas se marcaron con 10 uCi/mi de metiI-(3H)-timidina
(actividad especifica=1uCi/u1) durante 2 horas a 37°C. Las céiuias
se 1avaron 2 veces con PBS-Ca2+/Mg2+ frio y se fijaron con
metanoizácido acético (2:1) durante 25 minutos a temperatura
ambiente. Se lavaron 2 veces con metano] y se cubrieron con
emuisión NTB-2 Kodak Nuciear Track Emulsion. Se expusieron durante
7 dïas a -70°C en 1a oscuridad dentro de un desecador y se reve
1aron con revelador 019 de Kodak. Los nücïeos se tiñeron con hema
toxiiina .y se determinó e] porcentaje de nücieos marcados en un
nümero de céluïas Superior a 500.
17. Determinación de receptores estrogénicos ¿ggl gg; inmunocito
guïmica
Se utilizó el kit de] Laboratorio Abbott ER-ICAque contiene
e] anticuerpo monocionai obtenido en rata y dirigido contra e]
receptor estrogénico humano.
Las céluias Cuitivadas en placas de piástico de 35 mm se
fijaron durante 12 minutos en paraformaïdehido a1 3,7% en PBS a
temperatura ambiente; 4 minutos en metano] enfriado a -20°C y 2
minutos en una mezcia de metanolzacetona (1:1) a -20°C. Las piacas
se guardaron a -20°C hasta e] momento de ser usadas, en presencia
de una soïución conservadora (4,3 g/l de sacarosa y 0,33 g/1 de
cioruro de magnesio anhidro en una mezica de PBS:g]iceroi (1:1)).
En e] momento de ser usadas, ias céiuias se rehidrataron por
sucesivos pasajes por PBS. Se bioqueó 1a peroxidasa endógena con
metano] y 0,6% de H202 100 voïümenes, durante 30 minutos a tem
peratura ambiente y en 1a OSCuridad. Se bloquearon 105 sitios
inespecïficos de reacción incubando ias céiulas con suero de cabra
a1 10% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente y en
cámara hümeda. Se inCUbó con e] anticuerpo monocionai obtenido en
rata y dirigido c0ntra e] receptor estrogénico humano, durante
toda 1a noche a 4°C en cámara hümeda. Las células se 1avaron 3
veces con PBS y se incubó con e1 segundo antiCUerpo (Ig G de cabra
antiIgG de rata) durante 30 minutos. Luego de iavar ias céiuïas,
se incubó con el compïejo PAP (peroxidasa compiejada con Ig G de
cabra anti Ig G de rata) durante 30 minutos. E1 revelado se efec
tuó por e] método de 1a diaminobencidina/agua oxigenada utilizando
ios reactivos provistos por e] Laboratorio Abbott, durante 6 minu
tos en 1a oscuridad. Los nücleos de ias células se tiñeron con
hematoxiiina de Harris a1 10% durante 5 segundos. E1 coiorante
viró con agua caiiente; 1as céiuïas se iavaron y se montó con gii
cero] para 1a observación microscópica. Se determinó e] porcentaje
de céluias con nücieos teñidos con 1a diaminobencidina. Dado que
se observaron distintas intensidades de tinción nuciear, se deter
minaron 2 grados de positividad: tinción intensa y tinción débil.
54
18. Determinación de antígeno carcinoembrionario SCEA)por inmune;
citoguïmica
Se utilizó el anticuerpo dirigido contra CEA provisto por
Dakopats, Copenhaguen, y la técnica de] compiejo avidina-biotina
(Vectastin ABC, Laboratorios Vector, Buriingame, CA., USA).
Las células cultivadas en piacas de piástico de 35 mm se
fijaron con etano] absoluto durante 10 minutos. Se conservaron
hasta su uso a -20°C. En e] momento de ser usadas, las céluïas se
rehidrataron con PBS; se bioquearon 1a peroxidasa endógena y Ios
sitios inespecïficos de reacción segün fue descripto para 1a
determinación de receptores estrogénicos.
Se incubó con e] anticuerpo antiCEA di1uido 1/500 durante 1
hora a temperatura ambiente en cámara hümeda. Luego de 1avar con
PBS, se incubó con el segundo antiCUerpo biotini1ado durante 30
minutos. En este momento se preparó 1a di1ución de] tercer anti
cuerpo (reactivo ABC)para que se estabiïizara durante 30 minutos.
Finaimente, se incubó con e] reactivo ABC durante 60 minutos a
temperatura ambiente y en cámara hümeda.
E1 reveïado se efectuó por e] método de 1a
diaminobencidina/agua oxigenada 30 volúmenes, tal como fue
descripto para la determinación de receptores estrogénicos. Luego
de teñir los nücleos ceïulares con hematoxilina de Harris, las
células se montaron con gïiceroï para su observación microscópica.
55
19. Determinación de 1a proteina 921 codificada por el oncogen ras
utilizando la técnica inmunocitoquïmica
Se utilizó el antiCuerpo monocionai Y13-259, gentiimente
cedido por el Dr. Furth (Furth y c01., 1982).
Las células p1aqueadas en p1acas de pïástico de 35 mm se
fijaron ta] c0mo fue descripto para la determinación de receptores
estrogénicos. Luego de rehidratar ias céluias con PBS y de bio
quear 1a peroxidasa endógena, se bloquearon los sitios
inespecificos de reacción incubando Ias céïuïas con suero de
conejo a1 10% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se
lavaron las céïuïas con PBS y se incubó con e] anticuerpo monocïo
na] Y13-259 (a una concentración fina] de 5 ug/mi) durante 45
minutos a 37°C en cámara hümeda. Luego de 1avar con PBS, se
incubó con e] compïejo PAP (peroxidasa conjugada a Ig G de conejo
anti Ig G de rata), (Dako Immunogïobuïin, Copenhaguen) diïuido
1/50, durante 45 minutos a 37°C en cámara hümeda.
E1 reveïado se efectuó ta] como fue descripto para 1a deter
minación de receptores estrogénicos. Los nücÍeos ce1u1ares se
tiñeron con hematoxilina, 1uego de 1o cua] se montaron ias células
con gïiceroi para 1a observación microscópica.
20. Tinción gg iïpidos ¿gg 1911 ¿gg Q:
Las céluïas cuïtivadas en p1acas de pïástico de 35 mm se
tiñeron durante 10 minutos con una soiución de oi] red 0 0,5% P/V
en isopropano]. Se 1avaron 1as células y se tiñeron ios nücïeos
durante 15 segundos con hematoxiïina de Harris. Las gotas de
56
lïpidos se observaron como manchas de color rojo brillante, en
contraste con los nücleos de tinción azulada.
21. Obtención d os medios condicionados
Los medios condicionados por las células MCF-7se centrifu
garon para eliminar restos celulares y se filtraron por membrana
de 0,22 u (Millex, Millipore Corp., Bedford, MA., USA). Se conser
varon congelados a -20°C en presencia de 0,2% V/V de aprotinina
(Sigma Chemicals Co., St. Louis, M0., USA) hasta el momento de ser
usados.
22. Microscopía electrónica
La preparación de las muestras para la microscopía electrónica
fue efectuada por Silvana Ragone, perteneciente a la Comisión
Nacional de Energia Atómica.
Las células MCP-7 se fijaron "in situ“ con 2,5% de glu
taraldehïdo en 0,1 M de buffer cacodilato pH 7,4 a temperatura
ambiente durante 10 minutos y 2,5% de glutaraldehïdo: 2% de
tetróxido de osmio (1:2) en buffer cacodilato a 4°C durante 15
minutos. Posteriormente, se tiñeron con una solución acuosa de
acetato de uranilo. Luego de deshidratar con concentraciones cre
cientes de etanol, se agregó óxido de propileno para despegar la
monocapa de células, la cual fue concentrada en pequeños precipi
tados y embebida en Maraglas. Secciones ultrafinas se contrastaron
con una solución de acetato de uranilo y se fotografiaron en un
microscopio electrónico Phillips 300.
57
23. Análisis citogenético
Este estudio fue efectuado por 1as Dras. Irene Larripa e Irma
Sïavutsky pertenecientes a 1a Academia Naciona] de Medicina.
Las céluias MCF-7en crecimiento exponencia] y 1a Subpobiación
E (en este caso, menos de 24 horas iuego de haber sido obtenida)
se expusieron durante 1 hora a 0,1 ug/m] de c01cemid. E1 medio de
cuitivo se removió y 1as céluias se despegaron por tratamiento con
0,25% de tripsina-0,2% EDTA. Luego se centrifugaron a 1.000 rpm
durante 5 minutos y e] precipitado se resuspendió en una soiución
hipotónica 0,075 M de CIK durante 15 minutos. Las céluïas se
fijaron con metanolzacético giacial (3:1) y se prepararon Ios
extendidos. Los cromosomas se tiñeron con Giemsa y se bandearon
con tripsina-Giemsa, segün Seabright (1971). Los cromosomas se
identificaron segün ei Sistema Internaciona] de Nomencïatura
Citogenética Humana (ISCN, 1978).
58
RESULTADOS
ESTUDIO gg ¿A LINEA CELULAR MCF-7
A. Análisis gg la heterogeneidad celular
A.1. Distribución g_ las células gg gradientes de densidad
Luego de semeter las células MCF-7cultivadas en presencia
de suero fetal bovino a una centrifugación en gradientes de den
sidad en coloide de sïlica (Percoll), se obtuvieron 6 sub
poblaciones. La Fig. 1 muestra la distribución de las células a
partir de un Cultivo en crecimiento exponencial. La subpoblación C
resultó ser la más abundante mientras que la D y la E fueron las
minoritarias. El porcentaje de la subpoblación E se mantuvo
constante en todas las determinaciones efectuadas y fue del
(5,810,2)%. La contribución de las demás subpoblaciones sufrió
variaciones dentro de un rango más amplio; asï por ejemplo, la
subpoblación A contribuyó con el 14-20% y la subpoblación C, con
el 28-35% segün los cálCulos correspondientes a más de 60 experi
mentos distintos. En la Fig. 1, la densidad aumenta desde la sub
población A ( á: 1,035-1,050) hasta la subpoblación F (Á :
1,070-1,080).
Para demostrar que la heterogeneidad observada en las células
MCF-7no era un artefacto de la técnica utilizada, se sometieron
las células de tumor de mama humano T-47D clon 11 (receptor
estrogénico-positivas) a una centrifugación en gradientes de den
sidad de Percoll. En este caso, se obtuvo un solo pico, como se
observa en el inserto de la Fig. 1, tal como habïan obtenido
S9
Fig. l: Distribución de ias céluias MCF-7l T-47D ginserto} engra ientes fis den51aad_ïg Percoll. ’
Se sometieron 3.106 céiuias en crecimiento exponencial auna centrifugación en gradientes de densidad, tal como se describeen 1a sección materiaies y métodos. Los resuitados obtenidos paralas células MCF-7 corresponden a1 promedio de 60 experimentosdistintos; ios vaiores correspondientes a las céiuias T-47D provienen de 3 experimentos distintos.
(°/o)
NUMERODECELULAS
A B C D E F
SU BPOBLAClON CELULAR
DENSIDAD Q (1.0359rml"-1.0809rm|")
60
Podhajcer y co]. en 1986 utiiizando gradientes de seroaibümina
bovina.
A.2. Análisis de las distintas subpoblacionesLas 6 Subpobïaciones aisladas fueron sometidas a diversos
ensayos tendientes a su caracterización.
A.2.1. Capacidad gg generar otras subpoblaciones
Una de 1as propiedades de 1a céluia "stem" es la capacidad
de generar todos Ios comp0nentes de 1a jerarquía ce1u1ar dado que
es 1a ünica célula de] sistema que puede originarse a sï misma y
generar céiuïas destinadas a 1a diferenciación. Por 10 tanto, si
las 6 subpoblaciones aisiadas correspondieran a distintos estadïos
de 1a jerarquía ceIular, sólo las céluias "stem" serïan capaces de
generar todas las otras subpobïaciones.
Para determinar cuá] era 1a subpobiación que contenïa las
céluïas “stem”, las distintas subpobïaciones aisïadas fueron sub
cultivadas en presencia de suero y sometidas a distintos tiempos a
una centrifugación en gradientes de densidad. Un ejempio tïpico de
Ios resuitados obtenidos se observa en 1a Fig. 2.
Las céïuïas de 1a subpobïación E fueron las únicas capaces
de generar todas las demás subpobïaciones. A partir de] dïa 14, la
contribución de cada subpobiación a 1a población total fue 1a
misma que en 1a iïnea celuïar.
La subpobiación A fue capaz de originar las subpoblaciones
B, C, D y F pero no 1a E; 1a B generó C, D y F; 1a C originó D y
F; la D dio F y 1a F quedó como tal, habiéndose subcultivado
durante 30 dïas (estos resultados no se muestran).
61
Fig. g: Distinta capacidad de las subpoblaciones g l A para darori en a todas 1as subpobiaci nes gue componenla 1ïnea parental.
Las subpobiaciones E y A se aisïaron a partir de 1a pob1ación total de céluias MEF-7y se subcuitivaron durante distintostiempos, a] cabo de ios Cua1es fueron sometidas nuevamente a unacentrifugación en gradientes de densidad de Percoi]. Los gráficospresentados corresponden a experimentos efectuados por triplicado.
SUBPOBLACION E
100] DIA o 100
80“ 80
60- 60
40- 4o
20- ,20
SUBPOBLACION A
LL.
E
U)<A n
3 l DIA3
8 40LuD
20OCZLU
5 DIA7
DIAM
20 20
A BCDEF ABCDEFSUBPOBLACION CELULAR
62
La Fig. 2 permite deducir la siguiente secuencia de apari
ción de las subpobiaciones: E -b A -+ B —+C -9 D -9 F. Asimismo,
puede suponerse que 1a Subpoblación E está enriquecida en céiulas
"stem" dado que fue 1a ünica capaz de generar todas ias Sub
pobiaciones, ninguna de elias 1a originó y además contribuye con
una pequeña pero constante proporción a 1a pobiación tota].
A.2.2. Capacidad proliferativa
Las distintas Subpobiaciones fueron subcuitivadas en pre
sencia de suero durante 8 dias, obteniéndose ias curvas de creci
miento que se presentan en 1a Fig. 3.
La subpobiación E resultó ser 1a de mayor veiocidad de
crecimiento; al dia 8 de cuitivo, e] nümero de céiuias aumentó 16
veces con respecto al nümero inicia]. La subpobiación F fue 1a de
menor capacidad proiiferativa; no Iiegó a dupiicarse en 8 dias decultivo.
E1 anáiisis de ias veiocidades de crecimiento se compïe
mentó con un detaiiado estudio de 1a capacidad de sintesis de ADN
de ias distintas subpobiaciones durante ios primeros 3 dïas de
cuitivo. Se eligió este intervaio porque a tiempos más proiongados
ias subpobiaciones comienzan a ser heterogéneas.
A las 24 horas de cu1tivo, e] "TLI" (indice de marcación
con timidina) en 1as 6 subpobiaciones fue de] 30%, como se observa
en 1a Fig. 4. En todas las Subpobiaciones, a excepción de 1a E, el
“TLI” decayó a medida que transcurrieron ios dïas de cultivo. A1
tercer dïa de cuitivo, 1a reïación entre e] "TLI" de 1a sub
población E (1a de mayor capacidad proliferativa) y el de 1a sub
63
Fig. g: Curvasde crecimiento de ias distintas subpobïaciones.
Las subpobiaciones si aisiaron a partir de 1a 1ïnea celuiar MCF-7. Se sembraron 8.10 céiuias/piaca de cuitivo de 35 mmyse subcuïtivaron durante varios dïas. A los tiempos indicados seefectuó e] recuento celuiar. Los nümeros colocados entre paréntesis indican e] incremento observado en e] nümero de céluïas a1cabo de 8 dias de cultivo con respecto a1 nümero inicia]. Losvaiores obtenidos corresponden a1 promedio de 18 experimentosdistintos.
OE(16x)
A (7x)A B (6.8x)/°c (6.21)Ü
I F(1.1x)NUMERODECELULAS
m.
TIEMPO (días)
64
Fig. _í: Indice 'dg marcación con timidina STLIQ x_ ex resión _d_diversos marcadores: proteina 921, producto de] gen ras {921 5 ,receptores estrogénicos {RE}l antigeno carc1noembr10nario CEen ias distintas subpobiac1ones, medidosal cabo gg l l g dias d_cíitivo.
Las Subpobiaciones se aislaron a partir de ias célulasMCF-7por centrifugación en gradientes de densidad de Percoii. A]cabo de 1 y 3 dias de cultivo, se anaiizaron varios parámetros enlas subpobiaciones aisiadas, ta] como se describe en 1a secciónmateriaies y métodos. En e] histograma correspondiente a 1a determinación de RE, ias barras bianCas simboiizan e] porcentaje totaide céluias RE-positivas mientras que ias barras negras representane] porcentaje de células RE-positivas que dan una tinción intensa.Los resultados corresponden a experimentos efectuados en triplicado.
1 D'A 3 DIAS
2! ras
E
o<e>¡Z 4
8Q_ 2É:
FÉÍABCDEF ABCDEF
SUBPOBLACION CELULAR
65
pobiación F (la de menor veiocidad de crecimiento) fue de 8. Debo
aciarar que en 1a eiaboración de esta figura no se ha considerado
que en 1a autoradiografïa de 1a subpobïación F habia menos granos
de plata depositados por nücieo marcado.
Estos resuïtados fueron confirmados marcando ias céiulas
con (3H)-timidina durante 2 horas y determinando ia radioactividad
Iuego de precipitar el ADN. A ias 24 horas de cultivo, 1a incor
poración de precursor radiactivo normaiizada por e] nümero de
células en 1a subpoblación E fue 1,8 veces mayor que el vaior
correspondiente a 1a subpoblación F. Para ias subpoblaciones A, B,
C, D y F, la incorporación de (3H)-timidina medida fue práctica
mente 1a misma (9.000 - 10.000 cpm/105 células).
A] cabo de 3 dïas de cuïtivo, 1a relación entre 1a incor
poración de (3H)-timidina en 1a subpoblación E con respecto a 1a F
ascendió a 12 veces. En orden decreciente siguieron ias sub
pobiaciones A, B, C, D y F.
En 1a Fig. 5.1 se muestra 1a autoradiografïa correspon
diente a 1a subpoblación D marcada con (3H)-timidina, iuego de 24
horas de cultivo.
A.2.3. Crecimiento independiente de] ancïaje
Las subpobiaciones obtenidas 1uego de someter la iïnea
ceiuiar a una centrifugación en gradientes de densidad fueron
cuïtivadas en un medio semisólido (agar biando) en presencia de
suero durante 10 dias. En ese momento se determinó e] indice c10
nogénico de cada subpoblación, ta] como se presenta en 1a Tabla I.
Las subpobiaciones no sólo difirieron en su capacidad de
66
Fig. g: Determinación de] indice gg marcación con timidina SI} lexpresión de diversos marcadores: proteina 921z codificada Eor e]gen ras (ITT, receptores estrogénicos LIII) l ’antigenocarcinoembrionario 51V}en ias subpobïaciones aisiadas.
il) Sub obiación D, dia de cuitivo.II) Su pobiación C, dia 1 de cultivo.(III) Subpobiación C, dia 1 de cuitivo.Las fiechas indican células intensamente (S) y débilmente
(N) teñidas.( IV) Subpobiación A, dïa 1 de cultivo (x 360).
67
Tabla l. Crecimiento independiente del anclage e 1as subpobiaciones aisladas
Sub- Indicepobiación cionogénico
A ' i,67;1,25
B o,39¿ó,17
C 0
D 0,05410,034
E 6,621148
F o
Las subpobiaciones aisiadas se cultivaron durante 10 dïas en un medio semisóiido(agar biando), tai como se describió en materiaies y métodos.Los resultados se expresan comoe] porcentaje de formación de coionias (vaiormedio;D.S.) y corresponden a1 promedio de 3 experimentos distintos, cada uno delos cuaies se efectuó por tripiicado.Las diferencias son estadísticamente significativas; 1a reiación E a A da p
(0,005; 1a reiación E a B da p(0,005.
68
generar colonias sino también en el tamaño de las mismas. Así, por
ejemplo, para las subpoblaciones A, B y E se obtuvieron colonias
grandes de más de 3.000 células/colonia al décimo dia de cultivo
mientras que la Subpoblación D originó en ese mismo tiempo colo
nias pequeñas conteniendo aproximadamente 30 células.
En la Tabla II se presentan los resultados obtenidos al
variar las condiciones de cultivo de la subpoblación E. La efi
ciencia clonogénica se mantuvo en aproximadamente un 7%en presen
cia de suero completo tratado o no con carbón activado para
depletarlo de estrógenos pero ascendió al 9% al cultivar las
células en un medio libre de suero. El tamaño de las colonias no
varió significativamente en las tres condiciones de cultivo.
A.2.4. Expresión gg distintos marcadores celulares
A.2.4.1. Expresión gg la proteina 2g; codificada por gl oncogen
Las
Se analizó la expresión de la proteina de 21.000 daltons
de peso molecular codificada por el oncogen ras debido a que los
trabajos de De Bortoli y col. en 1985 y Ohuchi y col. en 1986
describieron alteraciones en la expresión de la proteina p21 en
tumores de mama humano. Por otro lado, Graham y col. demostraron
en 1985 una amplificación del gen N-ras en las células MCF-7.
La Fig. 4 muestra los resultados obtenidos luego de
determinar la expresión de la proteina p21 por la técnica inmuno
citoquïmica en las distintas subpoblaciones a las 24 y 72 horas de
cultivo en presencia de suero.
Si bien todas las subpoblaciones expresaron la proteina
69
Tabïa I. Crecimiento independiente de] anclaje gg la subpoblación
g: infiuencia de] suero l de] aporte hormona]
Nümero de coionias
Condicionesde Pequeñas Grandes Totaïes
cuitivo (4.30 céiuïas) (> 30 céiulas) (pequeñas+grandes)
En presencia 653 116 769de suero comp1eto(Duibecco/F-lZ/FBS)
En presencia 610 165 775de suero depletado de estrógenos(Duibecco/F-12/FBS charcoïizado)
En ausencia 761 174 935de suero y estrógenos _(Duibecco/F-lZ/BSA)
La subpobïación E se cuitivó durante 10 dïas en agar b1ando, ta]como se describió en materiaïes y métodos. Se evaïuó e1 efecto de]suero y de1 aporte estrogénico sobre 1a eficiencia cionogénica de dicha subpobiación. Los resuitados que se presentan en esta tabiacorresponden a dos experimentos efectuados por tripiicado.
70
p21, el mayor porcentaje de céiuias positivas y con 1a mayor
intensidad de tinción se verificó en 1a subpoblación C.
En 1a Fig. 5 II se muestra 1a autoradiografïa correspon
diente a 1a subpoblación C a ias 24 horas de cuïtivo. Puede apre
ciarse que 1a proteina p21 se Iocaliza preferentemente en e]
citoplasma.
A.2.4.2. Determinación del contenido gg receptor estrogónico LEE)
La determinación se efectuó por e] método inmunocito
quimico en lugar de empiear e] método bioquímico para poder detec
tar variaciones entre ias céiulas, aün de 1a misma subpobiación y
porque segün e] trabajo de Thorpe en 1987, este método es e1 más
sensibie.
Se determinó e] contenido de RE en cada una de las sub
pobiaciones a1 primer y tercer dïa de cuitivo en presencia de
suero.
E1 nümero tota] de células positivas no varió significa
tivamente en ias distintas subpobiaciones; se observó 1a tendencia
a aumentar e] contenido de RE a medida que transcurrïan ios dïas
de cultivo.
Se distinguieron 2 niveies de positividad: intenso (s) y
débil (w), como puede apreciarse en 1a Fig. 5 III para la sub
pobiación C.
En 1a Fig. 4 se muestra e] porcentaje de cóiulas positi
vas totales (intensas y débiles) indicado con barras biancas
mientras que e] porcentaje de células que dan tinción intensa se
indica con barras negras.
71
A las 24 horas de cultivo, 1as subpoblaciones C y F
fueron ias que presentaron mayor contenido de receptor estrogénico
(evaiuado a través de] porcentaje de céiuias positivas totaies),
siendo las céiuïas de 1a subpoblación C las de tinción más
intensa.
A ios 3 dïas de cuitivo, e] mayor porcentaje de células
positivas correspondió a 1a subpoblación F. E1 porcentaje de
céluïas intensamente teñidas no varió significativamente entre 1as
subpobiaciones C y F.
A.2.4.3. Expresión d antígeno carcinoemgrionario LQEA)
Los trabajos de Naiker en 1980 y de Bravo y co]. en 1985
demostraron que 1a producción de CEA varïa segün e] grado de
diferenciación en tumores coiorectaies y de mamahumanos.
Se decidió, entonces, anaiizar 1a expresión de CEAen ias
subpob1aciones aisiadas para 10 Cuaï se utilizó e] método inmuno
citoquïmico.
En 1a Fig. 4 se observa que e] contenido de CEA en las
Subpobïaciones fue mayor a ias 24 horas que a Ios 3 dïas de
cuitivo. En ese momento, 1a subpobiación F habia perdido práctica
mente todo su contenido de CEA.
En 1a Fig. 5 IV se observa 1a autoradiografïa obtenida
para la subpobiación A a1 primer dïa de cu1tivo.
72
A.2.4.4. Contenido gg Iïpidos
Para evaiuar ei contenido de iïpidos se sometieron ias
subpobiaciones aisiadas a una tinción con e] coiorante oil red 0.
A las 24 horas de cuitivo en presencia de suero, la sub
población F resultó ser 1a que presentaba mayor contenido de
Iïpidos, como se aprecia en 1a Fig. 6a. La subpobiación B tuvo un
bajo contenido Iipïdico y no se tiñeron ias céluias de 1a sub
pobiación E. En esta subpobiación se detectó aproximadamente un 8%
de núcleos mitóticos por campo observado (Fig. 6b). La tinción se
repitió a1 sexto dïa de cuitivo de 1as subpobiaciones; 1a coiora
ción fue intensa en 1a subpoblación B debido a que esta sub
población habia generado células con mayor grado de
diferenciación. La subpoblación E se positivizó a1 cabo de 6 dïas
de cuitivo y 1a coloración fue más intensa luego de 14 dïas de
cuitivo (Fig. 6c), cuando ya se habian generado todas ias demás
subpobiaciones, ta] como se aprecia en la Fig. 2.
A.2.5. Respuesta 3 distintos factores gg crecimiento
La técnica de separación de 1as céiuias MCF-7 en 6 sub
pobiaciones permitió estudiar los requerimientos de diversos fac
tores de crecimiento en cada subpobiación.
A.2.5.1. Efecto gg diversos factores gg crecimiento sobre as sub
pobiaciones quiescentes
Las subpobiaciones aisladas fueron piaqueadas a baja den
sidad ceiuiar (20.000 céiuias/hoyo en una placa de 24 hoyos) en
Se procedió ta] como se describe en 1ay métodos.
(A) Subpoblación F, dia 1 de cuitivo.(B) Subpoblación E, dïa 1 de cultivo.(C) Subpobiación E, dïa 14 de cuitivo.
sección materiales
74
presencia de suero. A1 cabo de 4 horas, se lavaron 2 veces con
PBS-Ca2+/Mg2+ y se agregó medio Du1becco/F-12 (1:1) con 1 mg/m] de
seroaibümina bovina fracción V sin e] aporte de factores de creci
miento. Luego de 2-3 dias se agregaron 10s distintos factores de
crecimiento en estudio, ensayándose varias concentraciones de cada
uno de eilos. A1 cabo de 24 horas, se efectuó una marcación con
(3H)-timidina durante 2 horas.
Se evaïuó: (I) si todas 1as subpobiaciones detenïan su
sintesis de ADNen ausencia de factores de
crecimiento, entrando en un estado de
quiescencia.(II) cuáies de los factores de crecimiento
ensayados eran capaces de inducir 1a sintesis
de ADNen las céiuias quiescentes.
En e] caso (I), la medición de 1a incorporación de
(3H)-timidina en las céiuias contro} de cada subpobiación, Cuiti
vadas durante 3-4 dïas en ausencia de factores de crecimiento,
demostró que ias subpobiaciones son heterogéneas en cuanto a sus
requerimientos para 1a sintesis de ADN.
Las subpoblaciones D y F detuvieron 1a sintesis de ADNen
ausencia de factores de crecimiento y entraron en un estado de
quiescencia. La incorporación de precursor radiactivo fue de 860 y
450 Cpm/IO5 céiuias, respectivamente. En ias subpobiaciones A, B y
E no se logró detener 1a sintesis de ADNen ausencia de factores
de crecimiento; 1a incorporación de (3H)-timidina fue de 6.000 a
10.000 cpm/105 céiuias. Para 1a Subpobiación C, 1a incorporación
de precursor radiactivo medida fue de 3.300 cpm/105 céiuias.
75
En e1 caso (II), para evaiuar si ios factores de creci
miento eran capaces de inducir 1a sintesis de ADNen ias células
quiescentes, se comparó 1a incorporación de (3H)-timidina en ias
células tratadas con ios factores con respecto a 1a incorporación
medida en ias céiuias contro].
Los resuïtados obtenidos se presentan en 1a Tab1a III y
se analizan a continuación:
A.2.5.1.1. Efecto gg insulina
E1 agregado de insuiina indujo un notabie incremento en
la sintesis de ADNen ias subpoblaciones D y F pero no afectó a
las subpobiaciones A, B y E. Esto podria deberse a que estas tres
subpobiaciones no detuvieron su crecimiento en ausencia de insu
lina. Una probabie expiicación serïa que estas céiuias produzcan y
secreten a] medio un factor de crecimiento semejante a insuiina,
como ya fue descripto por Huff y co]. (1986, 1987) para esta Iïnea
ceiuiar.
La subpobiación C tripïicó la incorporación de
(3H)-timidina en presencia de insuiina. Este requerimiento se
manifestó 5610 cuando 1as céluias se piaquearon a baja densidad y
desapareció a1 aumentar e] nümero de céluïas a 50.000
células/hoyo.
A.2.5.1.2. Efecto gg trombina
La proteasa serïnica trombina estimuló la sïntesis de
ADNen ias subpobiaciones D y F. En 1a subpobïación D aumentó 10
veces 1a incorporación de (3H)-timidina con 1a menor concentración
z‘oïs‘vI‘oït‘zz‘oïg‘oI‘OÏ9‘Is‘zïo‘ozo‘eïo‘ezI‘ZÏO‘6Ez‘oïo‘tI‘oïo‘IJI‘OÏL‘OI‘oïo‘tso‘oïss‘oI‘oïz‘oz‘oïo‘sI‘oïo‘zz‘oïz‘zI‘oïs‘tI‘oïo‘t3I‘OÏ6‘ZI‘oït‘tI‘0Ï9L‘0I‘oïv‘ts‘zïo‘uv‘tïo‘etz‘sïo‘eïO‘EÏO‘VII‘Iïo‘OIc1I‘OÏS‘EI‘oTL‘II‘oïg‘tI'oïz‘tz‘oÏL‘I1‘01'9‘1I‘OÏS‘II‘oïe‘oI‘oïs‘o3I‘oïv‘zz‘oïs‘zI‘oïz‘oI‘OÏI‘II‘oïz‘oI‘oïo‘tI‘oïz‘tI‘oïs‘oI‘OÏG‘OaI‘oïz‘oI‘oïz‘oI‘oïs‘oI‘oïz‘oI‘oïz‘oI‘oÏL‘oI‘oïa‘ov‘oïa‘oz‘oïa‘oV
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____________________ 74
I‘o+z‘1I‘o+z‘II‘0+8‘II‘o+¿‘oI‘0+I‘I€‘O+t7‘Iz‘o+v‘II‘0+9‘I17‘0+¿‘II‘0+9‘I8s‘oïo‘tI‘o'IL‘oI‘oïI‘Iz‘oïz‘t‘o‘oïe‘tI‘oïo‘tI‘OÏO‘II‘oïo‘tJ I‘oïo‘II‘oïo‘tV
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'IIIPIQPL
77
de trombina ensayada (0,25 U/ml). Para la Subpoblación F se
requirió una dosis de 1 U/m] para lograr el efecto máximo.
A.2.5.1.3. Efecto gg 33 fi2c4
Este factor estimuïó la sintesis de ADNen las Sub
pobïaciones C y D.
A.2.5.1.4. Efecto gg estradio]La respuesta a esta hormona demostró una vez más 1a
heterogeneidad de las céiuias MCP-7.
E1 estradio] indujo una estimuïación en 1a síntesis de
ADNen 1a subpoblación C. No afectó a 1as subpoblaciones A, B, D y
E mientras que inhibió en un 50%1a incorporación de (3H)-timidina
en 1a subpobiación F. Por lo tanto, 1as subpobïaciones C y F a
pesar de responder de distinta manera, fueron 1as ünicas sensibïes
a1 efecto de estradio] Cuando se encontraron en un estado de
quiescencia. Curiosamente, fueron éstas ias Subpoblaciones que
presentaron mayor contenido de receptor estrogénico, ta] como se
demostró en 1a Fig. 4.
A.2.5.1.5. Efecto g_ EQQ[¿¿EL l una combinación de amoo;
Como ya se expiicó en 1a introducción, e] PDGF actüa
sobre ias células quiescentes induciendo un estado de c0mpetencia
en e] cual las céluïas son sensibïes a1 efecto de otros factores,
conocidos como factores de progresión (EGF, por ejemplo) que per
miten que 1a serie de eventos desencadenados Cuimine en la sïnte
sis de ADN.
78
Se ensayo el efecto de PDGF, EGF y una combinación de
ambos sobre las distintas subpoblaciones.
Las subpoblaciones A y E no se estimularon en presencia
de PDGF, EGF o la combinación de ambos.
La subpoblación B respondió al EGF y la combinación de
PDGFcon EGF potenció el efecto.
La subpoblación C no respondió a una dosis de 50 ngr/ml
de EGF pero sin embargo, la combinación con PDGF indujo un incre
mento de más de 3 veces en la sintesis de ADN.
La combinación de PDGFcon EGF potenció la estimulación
de la síntesis de ADNinducida por EGF en las subpoblaciones D y
F.
A.2.5.2. Efecto gg diversos factores gg crecimiento sobre las sub
poblaciones en activa proliferaciónLas subpoblaciones aisladas se plaquearon a baja densidad
celular en presencia de suero. Al cabo de 4 horas, se lavaron 2
veces con PBS-Ca2+/Mg2+ y se agregó el medio de cultivo
quïmicamente definido conteniendo los distintos factores de crecimiento en estudio. Se evaluó durante 5 dïas el efecto de los fac
tores de crecimiento a través de Curvas de crecimiento celular.
A.2.5.2.1. Efecto gg trombinaEsta proteasa no modificó las velocidades de creci
miento de las subpoblaciones A, B, C y E.
Al cabo de 5 dias, el agregado de 2 U/ml de trombina
duplicó el nümero de células en la subpoblación D y cuadruplicó el
79
de 1a subpobiación F, en reiación a los respectivos controies,
cultivados en presencia de insuiina como único factor de creci
miento reguiatorio. Este efecto fue mayor cuando ias céiulas se
cuitivaron en un medio iibre de insuiina; en estas condiciones,
trombina indujo un incremento de 4 veces para 1a subpobiación D y
de 6 veces para 1a subpobïación F, ta] como se observa en 1a Fig.
7 (a y b). Estos resuitados se obtuvieron habiendo agregado trom
bina después de 4 horas de haber plaqueado ias céiuias y también
al segundo dïa de cuïtivo. Sin embargo, cuando se agregó trombina
cada 24 horas, se verificó un incremento de] 30% en cada uno de
ios casos anteriormente descriptos. Este resuitado induce a pensar
que ias subpobiaciones estarian iiberando proteasas a1 medio que
inactivarïan a 1a trombina.
A.2.5.2.2. Efecto gg Bflïzc(
Se ensayó ei efecto de una dosis de 300 ngr/m] de Pg
cmg sobre ias subpobiaciones cu1tivadas en presencia de insulina.
E] agregado de Pg F2.4 no modificó ias velocidades de
crecimiento de ias subpobiaciones A, E y F.
El crecimiento de 1a subpobïación B resultó inhibido en
presencia de 1a Pg F2e(; a1 cabo de 5 dïas de tratamiento, e]
nümero de céiulas correspondió al 11%de] c0ntr01.
La Pg F2=4 estimuló e] crecimiento de ias sub
pobiaciones C y D, siendo mayor su efecto sobre 1a subpobiación C.
Luego de 5 dïas de cultivo, e] incremento fue de] 60% para 1a sub
pobiación C y de] 42% para 1a D.
Las correspondientes curvas de crecimiento ce1u1ar se
80
Fig. l: Efecto gg diversos factores gg crecimiento (trombinal EGF1 PDGF sobre 1as subpobiaciones aisiadas.
Las subpobiaciones se obtuvieron en forma aisïada a artirde 1a lïnea celuiar MCP-7. Se subcultivaron durante varios dias enpresencia de factores de crecimiento, ta] como se describe enmateriaies y métodos.
(A) Curvas de crecimiento para 1a subpobiación D.(B) Curvas de crecimiento para 1a subpobiación F.
31‘105 A ESA ° PDGF v EGF
3 ESA 9 EGF
A BSA o Th!
C
A
ACELULAS
NUMERODl'
UI2 3 4
TIEMPO (DIAS)
5B 10 r BSA‘Thr
/ BSAOPDGFOEGFAW BSA‘EGF/Elm<a l.3 4xmuaU
¡uOo /o BSAm L Om 2x10IDz
10" l l l l l
I 2 3 lo 5
TIEMPO (DIAS)
81
presentan en ia Fig. 8.
A.2.5.2.3. Efecto gg É_E
El agregado de 100 ngr/m1 de EGF no afectó ias veioci
dades de crecimiento de ias Subpobiaciones A, B, C y E.
A] cabo de 5 dïas de cultivo en presencia de insuiina,
el agregado de EGF logró dupiicar e] nümero de céiuias de 1a sub
pobiación D con respecto a] control no tratado. E1 incremento fue
de casi 5 veces Cuando ias céiuias se cuitivaron en ausencia de
insuiina (Fig. 7a).
Cuando 1a subpobiación F se cuitivó durante 5 dïas en
presencia de insuiina y EGF 1a estimuiación de] crecimiento fue
superior a 3 veces e] de] contro]; ei efecto fue más acentuado
cuando e] EGF se agregó en ausencia de insulina. (Fig. 7b).
A.2.5.2.4. Efecto gg la combinación PDGF/EGF
La combinación de PDGF con EGF (l ngr/mi: 50 ngr/mi) no
aiteró e] crecimiento de las subpobiaciones A, B y E.
La subpoblación C incrementó en un 50% Su veiocidad de
crecimiento a ias 24 horas pero dicho efecto desapareció a1
segundo dia de cultivo.
La combinación de PDGF con EGF estimuió e] crecimiento
de 1a subpobiación D aün más que por agregado de EGF soiamente. La
potenciación de] efecto se manifestó hasta 1as 48 horas de cuitivo
de 1as céiulas en ausencia de insulina pero a1 cabo de 5 dïas se
alcanzó la misma densidad de saturación (Fig. 7a). Para 1a sub
pobiación F, 1a potenciación de] efecto estimulatorio iograda por
82
Fig. g: Efecto de PgF23¿ sobre el crecimiento gg 1as subgoblacion_e_sL 2 x 2.
Las subpoblaciones aisladas se sembraron a razón de2.104 céluïas/pïaca de cuïtivo de 35 mm. Se cu1tivaron en un medioIibre de Suero y se ensayo el efecto de PgFg°< (300 ngr/m1) sobree] crecimiento ceïuïar durante 5 dïas.
o: subpobiación B; A: subpoblación C; D: subpobïación D.Los simboios cerrados corresponden a 1as subpobïaciones tratadascon PngN ; los sïmbo1os abiertos corresponden a 1os contro1es.
5.105
m<d:a
d sU IO uno /c:uz
2.10"
l l l l l
... N u 5 0|
TIEMPO (dias)
83
la combinación de PDGF con EGF se manifestó a las 24 horas de
cultivo en presencia o ausencia de insulina. Al quinto dïa, se
alcanzó la misma densidad de saturación con EGF sólo o combinado
con PDGF (Fig. 7b).
A.2.5.3. Efecto de factores gg crecimiento ¿3253 la supervivencia
gg las subpoblaciones cultivadas en un medio 11253 de ¿23:2
Si bien la población total de células MCF-7tiene un cre
cimiento óptimo en presencia de insulina comoúnico factor regula
torio (como se verá en el capitulo B), las subpoblaciones aisladas
Cultivadas en un medio libre de suero sólo son capaces de crecer
por 10 dias. A partir de entonces, su crecimiento se detiene y
sobreviene la muerte celular.
En base a los resultados obtenidos y anteriormente
descriptos, se decidió agregar distintos factores de crecimiento
para ver si alguno de ellos era capaz de evitar dicha muerte celular.
A.2.5.3.1. Rescate ¿gg trombina
El agregado de 2 U/ml de trombina logró estimular el
crecimiento de las subpoblaciones D y F. El efecto sobre la sub
población F fue limitado dado que al cabo de 2 duplicaciones, las
células detuvieron su crecimiento y dejaron de ser sensibles al
efecto de trombina.
Al cabo de 5 dïas de tratamiento, las células de la
subpoblación D se semetieron a una centrifugación en gradientes de
densidad de Percoll. En la Fig. 9 se observan los perfiles
84
L2. g: Distribución de las células gg la subpoblación g tratadason PgF2<xl de la subpoblación D tratadas con trombina durante áias, _g_írad1entes de densidad de Percoll.
fl
Las SubpoblaciOnes C y D se obtuvieron en forma aisladaluego de someter las células MCF-7 a una centrifugación en gradientes de densidad de Percoll (barras blancas). Las subpoblaciones se suDCultivaron en el medio quïmicamente definido cono sin el aporte de 300 ngr/ml de PgF2a\ (para la Subpoblación C) o2 U/ml de trombina (para la subpoblación D). Las células se subcultivaron en estas coniciones durante 5 dias, al cabo de loscuales se sometieron nuevamente a una centrifugación en gradientesde densidad.
(a) Células no tratadas con los factores de crecimiento.(b) Células tratadas con los factores de crecimiento.Los resultados obtenidos corresponden al promedio de
experimentos efectuados por duplicado.
SUBPOBLACION C
b
eo
4o.
Lx:
52 20
5'Ej A B c o E F A e c o E FLJ
Lu SUBPOBLACION Do 10% L—J
gg BJ- bIUE::3 60 60z:
40- 4o»
20 20
SUBPOBLACIONES CELULARES
85
obtenidos a partir de las células tratadas y del control. Se puede
apreciar que en presencia de trombina fue menor la progresión de
la subpoblación D a la F. El agregado de trombina no sólo estimuló
el crecimiento de la subpoblación D, disminuyendo la generación de
la subpoblación F, sino que permitió la supervivencia de las
células en el medio libre de suero. Esta subpoblación lleva más de
2 meses de crecimiento en estas condiciones.
A.2.5.3.2. Rescate ¿gn gg Ez‘í
Se ensayó el efecto de una dosis de 300 ngr/ml de Pg
cmx sólo sobre la subpoblación C cultivada en un medio libre de
suero.
Al cabo de 5 dias de tratamiento, las células fueron
sometidas a una centrifugación en gradientes de densidad, obte
niéndose el perfil que se muestra en la Fig. 9.
El agregado de Pg thx disminuyó la generación de Sub
poblaciones con mayor grado de diferenciación a partir de la sub
población C y permitió además, la supervivencia de la subpoblación
C en el medio libre de suero, en el cual ya ha superado los 2
meses de cultivo.
A.2.5.3.3. Rescate con estradiolEl agregado de 10'10 M de estradiol indujo una rápida
diferenciación y posterior muerte de las subpoblaciones A, B, C, D
y F cultivadas durante 10 dias en ausencia de suero y permitió que
la subpoblación E fuera capaz de sobrevivir en dicho medio de
Cultivo bajo la forma de agregados multicelulares en suspensión.
86
Este fenómeno se expiica detaïïadamente en e] capïtuio dedicado a
1as céiuias MCF-7 en suspensión; aquï se comentó como un ejempïo
más de factores de crecimiento u hormonas capaces de inducir 1a
supervivencia celular.
A.2.6. Fosforilación gg las proteinas presentes gn las ¿gg
poblaciones cultivadas gn presencia g ausencia gg sueroTeniendo en cuenta los trabajos de Heidin y Nestermark
(1984) acerca de 1a correïación entre fosforiiación de proteinas
específicas y 1a morfoiogïa y proiiferación ceiuiar, se iniciaron
experimentos para determinar 1a capacidad de incorporación de
32P-ortofosfato a proteinas en ias subpobiaciones aisiadas.
Las subpobiaciones aisïadas se plaquearon a baja densidad
ceiuiar en presencia de suero. Se efectuaron dos ensayos de fos
foriïación por dupiicado y cuïtivando ias células en presencia o
ausencia de Suero. En este óïtimo caso, luego de que las céluias
se adhirieron a1 sustrato de 1as placas de cuitivo, se iavaron 2
veces con PBS-Ca2+/Mg2+ y se agregó e] medio iibre de suero. A1
cabo de 3 dïas de cuitivo, se efectuó 1a marcación con
(32P)-ortofosfato, ta] comose describió en materiales y métodos.
En 1a Tabla IV se presentan 105 resuitados obtenidos.
Como puede observarse, 1a incorporación de precursor
radiactivo fue siempre mayor cuando ias subpobïaciones se cuitivaron en ausencia de suero.
La incorporación de (32P)-ortofosfato medida en 1a sub
pobiación E fue 4 veces mayor que 1a correspOndiente a 1a sub
pobiación F cuando ias céiuïas se cuitivaron en presencia de
87
Tabla IV. Fosforilación de 1as subpobiaciones cuïtivadas en presencia
g ausencia gg suero
Incorporación de (32P)_0rt0fosfatoa proteïnas ce1u1ares(10 cpm/10 céïuïas)
Subpoblaciones En ausencia de suero En presencia de suero
A 1,55:0,11 5,20:0,15
B 1,43:0,06 3,9810,“
C 1,25:0,13 3,30i0,23
D 0,91:0,18 1,50:0,18
E 1,8610,12 5,75:0,10
F o,42¿o,o4 0,84i0,18
Las subpobiaciones aisladas se cu1tivaron durante 3 dïas en presenciao ausencia de suero. La fosforiiaciónbió en materiales y métodos.En la tabla se presentan las incorporaciones de
se efectuó ta] como se descri
precursor radiactivomedidas en los extractos ce1u1ares obtenidos en dos experimentos distintos, cada uno de Ios cuaïes se efectuó por dupïicado.
88
suero. Dicha diferencia aumentó a casi 7 veces Cuando los culti
vos se efectuarOn en ausencia de Suero.
El orden decreciente de incorporación de (32P)-ortofosfato
se mantuvo en presencia o ausencia de suero y fue E>A>B>C>D>F.
Numerosos inconvenientes surgidos luego de correr los
extractos celulares en geles de poliacrilamida impidieron efectuar
un análisis de las proteínas especificamente fosforiladas en cada
una de las subpoblaciones.
A.3. Análisis citogenético d_ l_ subpoblación g l d_ l_a Mparental
Para demostrar que la subpoblación E diferïa del resto de las
subpoblaciones en su estadio de diferenciación pero no en su ori
gen clonal, se decidió efectuar un análisis citogenético de la
subpoblación E y de la linea celular MCF-7completa. Dicho estudio
fue realizado por las Dras. Irma Slavutsky e Irene Larripa, per
tenecientes a la Academia Nacional de Medicina, y arrojó los
siguientes resultados:
- en ambas poblaciones celulares se obtuvo el mismo nümero de cro
mosomas con un rango de 79 a 81;
en ambas muestras se observaron los mismos marcadores: 5p+, 7p+,
10p+, 14q+, 15p+, 16q+, 17q+, 18q+, 20p+, 22p+, Xq+, M1_y M2, la
mayoria de los cuales ya habïan sido descriptos en estas células
por Nhang-Peng y col. en 1983;
- en ambas muestras se observó la translocación 14; 20;
- en ambas poblaciones se observaron monosomïas de los cromosomas
19 y 20.
89
Estos resuitados demuestran que 1a subpobiación E tiene 1a
misma composición genética que 1a linea ceiuiar parenta],
descartándose asï 1a posibiiidad de que dicha Subpobiación
correspondiera a un cion de mayor capacidad proiiferativa obtenidoen forma aisiada.
A.4. Interacciones entre las subpobiaciones
A.4.1. Contribución gg 13_ subpobiación g__¿1 crecimiento gg laiïnea ceïular MCF-7
A partir de ias subpobiaciones aisladas y considerando la
contribución de cada una de eilas a 1a iïnea parentai, se
reconstituyó 1a población total de céiuias MCF-7, a ias cuales se
._¡denominó MCF-7"reconstituidas". Por otro iado, se reconstituyó a
pobiación de céiulas MCF-7omitiendo e] aporte de 1a subpobiación
E. Esta pobiación ceiular se denominó “MCF-7(-E)". Se plaquearon
8.104 céiuias MCF-7 parentaies, "MCF-7 reconstituidas“ y
"MCF-7(-E)" en piacas de piástico de Cuitivo de 35 mmy se comparó
su crecimiento durante 6 dias en presencia de suero.
Las curvas de crecimiento ce1u1ar obtenidas para cada una
de las pobiaciones se presentan en 1a Fig. 10.
Ta] como se esperaba, e1 crecimiento fue iguai para 1a
pobiación parentai y para las céiulas "MCF-7reconstituidas“.
A las 48 horas, e] crecimiento de ias céiuias "MCF-7(-E)"
correspondió al 60% de] contro] y a1 cabo de 6 dias de cuitivo fue
de apenas e] 20%. El crecimiento de estas células se recuperó al
agregar a1 tercer dia de cuitivo medio condicionado de 1a sub
pobiación E con medio fresco (1:1).
90
Fig. 10: Curvas de crecimiento d las céiuïas MCF-7parentaies,"MCF- reconstituïïas“ l “MCF-7g-E)".
Las células "MCF-7reconstituidas" se obtuvieron porrecomposición de ia pobiación ce1u1ar tota] a partir de ias subpobiaciones aisiadas. La contribución de cada Subpobiación fue 1amiSma que 1a correspondiente a 1a pobiación parentai.Las células “MCP-7(-E)" se obtuvieron a1 reconstituir la pobiación tota] a partir de las subpobiaciones aisiadas pero omitiendoe] aporte de 1a subpobiación E.
e sembraron 8.10 células MCF-7 parentaies, “MCF-7reconstituidas" y "MCP-7(-E)" y se cuitivaron durante 6 dïas enpresencia de suero. A los tiempos indicados, se efectuó e1recuento ce1u1ar por tripiicado. La flecha indica e] momento apartir de] cuai se agregó e1 medio condicionado por 1a Subpobiación E.
o: MCF-7parentaies; A: “MCF-7reconstituidas"; I: “MCP-7(-E)"; D: "MCF-7 (-E)" + medio condicionado de (E).
2.io‘
10°—
W<_| Ü3¡u 5
1.10 u ILIJO
g NHJzD 5z 10v
aio‘
4 l 1 l l 1 é4 1° 1 2 3 l. 5 6
TIEMPO (días)
91
A1 dïa 16 de Cultivo, las céiuias "MCF-7(-E)" se sometieron
a una centrifugación en gradientes de densidad de Percoll y pudo
comprobarse que más de] 85% de ias células correspondía a Ias sub
pobiaciones D y F.
E1 cuitivo de 1a pobiación "MCF-7(-E)" mantuvo su viabiïi
dad durante 28 dïas.
A.4.2. Efecto d los medios condicionados
A.4.2.1. Efecto d Ios medios condicionados sobre la proliferaciónce1u1ar
A.4.2.1.l. Efecto d ios medios condicionados sobre la prolifera
ción de la subpobiación E
Se colectaron ios medios condicionados por ias distin
tas subpobiaciones Cultivadas en presencia de suero y se ensayó su
efecto sobre e1 crecimiento de 1a subpoblación E.
La subpobiación E se piaqueó a baja densidad ceiuiar en
presencia de suero. Se ensayaron ios distintos medios con
dicionados diluidos a1 50%con medio de cuitivo fresco. Las curvas
de crecimiento obtenidas en cada caso se presentan en 1a Fig. 11.
E1 crecimiento de 1a subpoblación E resuitó inhibido en
presencia de ios medios condicionados por las distintas sub
poblaciones, siendo e] medio condicionado por 1a subpoblación F e]
de mayor efecto inhibitorio.
Cuando se agregó el medio condicionado por 1a pobiación
"MCF-7(-E)“, e] nümero de céiuias a1 cabo de 3 dias de cuitivo
correspondió a1 65% de] controi. E1 medio condicionado por 1a
población tota] de céiulas MCF-7no modificó el crecimiento de 1a
92
Fig. ¿iz Efecto d los medios condicionados Eor 1as distintas su pobïaciones sobre-gl crecimiento gg lg subgobiación É.
La subpobïación E se sembró a razón de 2.104céluïas/pïaca de cultivo de 35 mm. Los medios condicionados porlas subpobïaciones aisiadas se ensayaron a una concentración de]50%, dado que se diiuyeron 1:1 con medio de cu1tivo fresco. Losresultados obtenidos correSponden a 2 experimentos distintos, cadauno de ios cuaïes se efectuó por dupïicado.
o: (E) + medio condicionado de (A); o: (E) + MC (B); Ü:(E) + MC (C); I: (E) + MC (D);A: (E) + MC (E);A: (E) + MC (F);
: (E) + D/F12/FBS; e: (E) + MC (MCF-7 totaies); o; (E) + MC(MCP-7 (-E)).
‘25' ÍI._¡ _u 510 /U ALu /CI
oEl
É= 2.104z
1 2 3
HEMPO(dhm
93
subpoblación E.
A.4.2.1.2. Efecto d los medios condicionados sobre la proïifera
ción gg la subpobiación í
Se ensayo el efecto de los medios condicionados por las
distintas Subpobiaciones cuïtivadas en presencia de suero sobre el
crecimiento de 1a subpobiación F. Se procedió tal como se descri
bió anteriormente para 1a subpobïación E. Las correspondientes
curvas de crecimiento se presentan en 1a Fig. 12.
El medio condicionado por 1a subpoblación A incrementó
en un 26%e] crecimiento de la subpoblación F. E1 efecto estimuïa
torio fue mayor (más de] 60% a las 48 horas) en presencia de]
medio condicionado por 1a pobiación tota]. Cuando se agregó e]
medio condicionado por 1a subpobiación E, las céiuias de 1a sub
pobïación F casi triplicaron su crecimiento.
Los medios condicionados por las subpobiaciones B, C y
D no modificaron significativamente e] crecimiento de 1a sub
pobïación F.
A.4.2.2. Efecto de ios medios condicionados sobre el crecimiento
independiente del ancïaje
A.4.2.2.1. Efecto del Egglg condicionado pg: l_ subpoblación f
sobre el crecimiento independiente del anciaje de la subpobïación
E
La subpobiación E se cuïtivó en un medio semisólido
(agar biando) en presencia o ausencia de] medio condicionado por
1a subpoblación F, cuya concentración fina] fue del 25%. A1 cabo
9a
Fig. ¿3: Efecto de Ios medios condicionados por 1as distintas subspoblaciones aislada sobre el crecimiento g_ l_ subpoblación j.
La subpoblación F se sembró a razón de 2.104 céïulas/pïaca de euïtivo de 35 mm. Los medios condiciOnados se ensayarondi1uidos a1 50% con medio de cuïtivo fresco. A Ios tiempos indicados, se procedió a efectuar e] recuento ce1u1ar. Los resuïtadosobtenidos corresponden a1 promedio de 2 experimentos distintos,cada uno de 1os Cuaies se efectuó por dupiicado.
o: (F) + medio condicionado de (A); o: (F) + MC (B); Ü:(F) + MC (C ;I. (F) + MC (D);A: (F) + Mc (E); A: (F) + MC (F);Q' (F) + MC(MCF-7 totaies);1ka (F) + D/F-12/FBS.
105
W
Í:3 Smok.¡
EiHJ _—' oeO
ñg 2.10" >43z
l l __.l1 2 3
TIEMPO (días)
95
de 10 dias de cultivo se efectuó el recuento del nümero y tamaño
de las colonias. La eficiencia clonogénica de la subpoblación E
fue de aproximadamente el 7% aün en presencia del medio con
dicionado por la subpoblación F. No se modificó el tamaño de las
colonias, con más de 3.000 células/colonia. Las colonias presen
taron la misma morfologïa en presencia o ausencia de dicho medio
condicionado (foto que acompaña a la Tabla I).
A.4.2.2.2. Efecto del medio condicionado por l subpoblación g
sobre el crecimiento independiente del ancla'e gg la ¿ugpgglaglón
f.
Se procedió tal como se describió anteriormente para la
subpoblación E; estos ensayos se efectuaron por triplicado.
El medio condicionado por la subpoblación E, en una
concentración final del 25%, logró que las células de la sub
población F generaran colonias en agar blando con una eficiencia
clonogénica del 1% determinada al cabo de 14 dias de cultivo. El
tamaño promedio fue de 800 células/colonia, tal como se aprecia en
la Fig. 13 II.
No obstante, el crecimiento de las colonias fue limi
tado ya que se detuvo al dia 19.
Las células de la subpoblación F cultivadas en presen
cia de suero pero sin el aporte del medio condicionado por la sub
población E crecieron hasta formar muy escasas colonias de 8-10
células que perdieron rápidamente su viabilidad (Fig. 13 I).
Dado que el agregado de EGF también logró estimular el
crecimiento en agar blando de la subpoblación F (estos datos no se
96
Fig. ¿3: Efecto de] medio condicionado Eor 1a subpoblación g sobregl crecimiento independiente de] anclaje gg l_ subgobïación í.
La subgoblación F se sembró a razón de 104 céluïas/placade cultivo de 3 mmen medio de cuïtivo conteniendo 0,4% de agar,ta] como se describe en 1a sección materiaies y métodos. Losensayos se efectuaron por triplicado.
(I): Subpobïación F (control).(II): Subpobiación F en presencia de] medio condicionado
por 1a subpoblación E (concentración fina]: 25%).
muestran), podrïa considerarse 1a posibilidad de que el factor
responsabie de 1a estimulación de] crecimiento presente en el
medio condicionado por 1a subpobiación E fuera e] TGF-d.
98
B. CRECIMIENTO EE LAS CELULAS MCF-7 E! EL MEDIO LIBRE QE SUERO
B.1. Requerimiento gg factores de crecimiento
Las células de mama humana y de ratón requieren EGF e insu
lina para su óptimo crecimiento, tal como fue descripto por
Osborne y col. en 1981, Imagawa y col. en 1982 e Imai y col. en
1982. Sin embargo, cuando se ensayo el efecto de diversos factores
de crecimiento sobre las células MCF-7 cultivadas en un medio
libre de suero, se observó que el requerimiento de dichos factores
dependïa de la densidad celular.
8.1.1. Requerimiento gg factores gg crecimiento manifestado ¡al
plaguear las células a bala densidadSe ensayo el efecto de diversos factores de crecimiento
(insulina, EGF, trombina y transferrina) sobre las células MCF-7
plaqueadas a baja densidad celular (6.104 células por placa de
cultivo de 35 mm).
Las células se plaquearon durante 4 horas en presencia de
suero, se lavaron 2 veces con PBS y se cultivaron durante 3 dias
en el medio quïmicamente definido (con el aporte de insulina como
ünico factor regulatorio y necesario para la supervivencia de las
células, como se verá más adelante) antes del agregado de los fac
tores de crecimiento.
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla V.
Puede observarse que el crecimiento de las células durante
los primeros 3 dias fue mayor en el medio quïmicamente definido
que en presencia de suero. Dicha estimulación desapareció al
quinto dïa de cultivo.
99
Tabïa 1. Requerimiento gg factores gg crecimiento d_ las céluïas
MCF-7cuando ¿g pïaquean a baja densidad ce1u1ar
Tiempo transcurrido Iuego de] agregado de losfactores de crecimiento
Factores decrecimiento
agregados a] 3 dias 5 diasmedio quïmica- _mente definido _
(M00) N° de células x105 1, N° de celulasx105 1
M00 1,35:0,18 100,0 4,46:0,12 100,0(Du1becco/F-12(1:+ 1 mg/m] BSA+ 10 ug/m] insu
lina)M00+ trombina 2,38¿0,27 176,3 4,45:0,11 99,7
(2 U/m1)
MQD+ EGF 1,99:0,13 147,4 4,4610,35 100,0(100 ngr/mï)
MOD+ EGF+ trom 2,6510,22 196,3 4,7010,17 105,4bina
(100 ugr/m1+ 2 U/m1)
M00+ transfe- 1,20:0,15 88,8 4,50:0,11 100,1rrina(5 ugr/mi)
Duibecco/F-IZ 0,98:0,11 72,6 4,3910,11 98,4(1:1)+ 10% FBS+ 10 ug/m] insuIina
Las céluias MCF-7 se p1aquearon a razón de 6x104 céluias/pïaca decuitivo de 35 mm. Los reSultados corresponden a 3 experimentos
cada uno de los cuales seResultados similares se obtuvieroncuales las células se piaquearon ade Cultivo de 35 mm.
distintos, efectuó por tripïicado.en otros experimentos,
razón de 2-2,5x10en ios
céluïas/piaca
100
Por otro lado, e] agregado de trombina iogró estimuiar el
crecimiento de ias céluias cuitivadas en e] medio químicamente
definido pero dicho efecto desapareció a1 quinto dïa de cuitivo,
a] alcanzar las céiulas una aita densidad.
E1 agregado de EGF estimuió en un 50% e] crecimiento ceiu
lar y su efecto se potenció con e] agregado de trombina.
Las céiulas no manifestaron el requerimiento de trans
ferrina ni aün a baja densidad ceiular; probabiemente se deba a
que ias céluias produzcan y secreten a] medio aïgün factor con
actividad de sideroforo que pueda reempiazar a 1a transferrina.
8.1.2. Reguerimiento gg factores ¡gg crecimiento manifestado ¿l
piaguear las células g ¿133 densidad ceiularEn 1a Fig. 14 se presentan los reSuItados obtenidos a]
ensayar e] efecto de diversos factores de crecimiento (inSuiina,
EGFy trombina) sobre las células MCF-7plaqueadas a aita densidad
ceiuiar (105 céiuias/piaca de cuitivo de 35 mm).
Los simbolos cerrados correspOnden a ias céiuias que se
plaquearon durante 4 horas en presencia de suero para permitir 1a
adherencia a] sustrato de ias p1acas de cuitivo; se iavaron 2
veces con PBS y se agregó e] medio de cuitivo Iibre de suero
supiementado con los distintos factores de crecimiento. En este
caso, ias céiulas crecieron rápidamente en presencia de insuiina
como ünico factor de crecimiento regulatorio; no se manifestó ei
requerimiento de EGF o trombina.
Por otro iado se repitió e] experimento p1aqueando ias
céluias directamente sobre ias piacas de cu1tivo previamente recu
101
Fig. ¿1: Curvas gg crecimiento gg 1as céluïas MCF-7cultivadas enpresencia gg suero 2 gg el medio quimicamente definido.
Simboïos cerrados: Las células se sembraron a razón de105 céiuïas/placa de cuÍtivo de 35 mmen presencia de 10% de suerofetal bovino y 10 ug/m] de insu1ina. A! cabo de 4 horas, 1ascélulas se lavaron 3 veces con PBS -Ca +/Mg2+ y se agregarondistintos factores de crecimiento para supiementar e] medioDu1becco/F-12 (1:1):*: 101, FBS + 1o ug/mi insulina; o: 10 ug/m1insuïina; A: 10 ug/m] insulina + 50 ngr/m] EGF; l: 10 ug/m] insu1ina + 2 U/m] trombina; Q: 10 ug/m] insuiina + 50 ngr/m] EGF + 2U/m] trombina.
Simboïos abiertos: Luego de despegar 1as céiulas de]pïástico de 1a boteiïa de cuitivo, 1a acción de 1a tripsina sedetuvo con inhibidor de tripsina de soja. Las céïuias se 1avaroncuidadosamente con PBS, se resuspendieron en Ios distintos mediosde cuitivo supïementados con Ios factores de crecimiento y sesembraron a razón de 105 células/placa de cu1tivo de 35 mm, previamente recubierta con coïágeno. Los simboios corresponden a 1asmismas condiciones de cuitivo expïicitadas en e] párrafo anterior.Los recuentos celuïares corresponden a 3 experimentos distintos,efectuados cada uno de eilos por tripïicado. El medio de cultivose renovó cada 3 dias.
-<
3;A 30a\‘ 20‘
LnO
x 10m4<.JI:>_:LL]LJ
unc:
C)o:un2'.:>:z
l l l l l
2 4 6 8 D
TIEMPO (días)
102
biertas con colágeno. En este caso, las células no estuvieron en
contacto con el suero dado que el efecto de la tripsina se detuvo
con inhibidor de tripsina de soja. En estas condiciones, las
células crecieron más lentamente pero mantuvieron el requerimiento
de insulina sin ser estimuladas por el agregado de EGFo trombina,
tal como puede apreciarse en la Fig. 14 (símbolos abiertos).
Shibata y Taylor-Papadimitriou describieron en 1981 que las
células cultivadas en presencia de suero se adhieren con menor
cohesión a las placas de cultivo. En nuestro caso, Cuando las
células MCF-7alcanzaron una alta densidad celular en presencia de
suero comenzaron a despegarse de la placa de cultivo a partir del
quinto día, tal como se observa en la Fig. 14. Es por esta razón
que las células cultivadas en presencia de suero deben trip
sinizarse y replaquearse freCuentemente.
Las células Cultivadas en el medio químicamente definido
siguieron creciendo aün a alta densidad. Su adhesión a las placas
de cultivo fue mucho más firme y en el caso de las células pla
queadas en presencia de colágeno se requirió una mezcla de trip
sina y colagenasa (1:1) para poder despegarlas.
8.2. Ultraestructura d as células MCF-7cultivadas en l medio
químicamente definido
Al cabo de 16-20 horas de Cultivo en el medio químicamente
definido, las células cambiaron su morfología epitelioide
adquiriendo un aspecto “ahusado” de célula menos diferenciada, tal
como puede apreciarse en la Fig. 15b. Este cambio morfológico se
revirtió rápidamente en presencia de suero (Fig. 15a).
103
Fig. ¿2: Morfología gg ias céïulas MCF-7cuïtivadas gg gresencia 2ausen 1a gg suero.
A: en presencia de 10% de suero fetal bovino; B: en e]medio químicamente definido, con e] aporte de insulina como ünicofactor de crecimiento reguiatorio.
104
Se analizó el origen epitelial de las células MCP-7cultiva
das en presencia de suero y en el medio químicamente definido.
3.2.1. Microscopía electrónica d las células MCF-7cultivadas en
presencia g ausencia gg suero
Este análisis fue efectuado gracias a la valiosa colabora
ción de Silvana Ragone y de la Dra. Beatriz Molinari pertenecien
tes a la C0misión Nacional de Energía Atómica.
El análisis de la ultraestructura de las células cultivadas
en presencia o ausencia de suero reveló la existencia de uniones
estrechas, desmosomasy tonofilamentos. Sin embargo, las células
cultivadas en el medio químicamente definido se caracterizarOn por
la existencia de un complejo de Golgi muy desarrollado con la pre
sencia de sáculos distendidos distribuidos en los polos y alrede
dor del nücleo celular (Fig. 16A). Por el contrario, las células
cultivadas en presencia de suero no presentaron complejo de Golgi
desarrollado; se detectaron escasos tonofilamentos y numerosas
microvellosidades (Fig. 168).
En ciertas regiones de las células cultivadas en el medio
químicamente definido se detectaron "coated pits" y "vesíCulas
recubiertas", indicando un probable rol en la función secretoria
de estas células (Fig. 16€).
8.2.2. Determinación gg queratinasEn base a los cambios morfológicos experimentados por las
células en el medio químicamente definido, se decidió analizar la
expresión de citoqueratinas.
Luego de separar las proteínas celulares en un gel al 12,5%
105
¡Fig. 16: Microscopía eiectrónica gg ias céiuias MCF-7.
(A) Céiuïas cuitivadas en e] medio químicamente definido.Estas céïuias están caracterizadas por 1a presencia de un
compïejo de Goïgi aitamente desarroliado que ocupa una zona polar(ei compiejo de Golgi se indica con una fiecha). Es notabie 1a‘presencia de dictiOSOmas distendidos y vesicuias que conforman 1región de] Goigi.
(B) Céiulas cultivadas en presencia de Suero. En estacondición de cultivo es evidente 1a ausencia de complejo de Goïgi,escasos tonofiiamentos y abundantes microveliosidades. Barra: 1 u.
(C) Células cuitivadas en ei medio quimicamente definido.La membrana piasmática presenta microfiïamentos y “coated pits“,indicados con 1a fiecha. Barra: 0,25 u.
-.’ a . I,3%" . ’ . 2En ut \ ’k'n
106
de acriiamida en presencia de SDS, se transfirieron a un filtro de
nitroceluiosa. Las queratinas se identificaron por 1a técnica de
1a inmunoperoxidasa, utiiizando un antiCuerpo poiiclonai de conejo
antiqueratinas humanas. E1 reveiado de] Western biot no permitió
detectar diferencias en ias queratinas de ias céiuias cultivadas
en presencia o ausencia de suero (Fig. 17.1).
Cuando 1a técnica inmunocitoquïmica se empleó sobre las
células fijadas, si bien se obtuvo una reacción intensa tanto para
1as céluias cultivadas en presencia de suero como en e] medio
químicamente definido, 1a distribución topoiógica de ias cito
queratinas fue distinta. En la Fig. 17.11 se puede apreciar que
1as céluias cuitivadas en e] medio químicamente definido presen
taron un aniiio perinuciear mientras que 1a distribución en ias
céiuias cuitivadas en presencia de suero asemeja a una red
fibriiiar.
B.3. Análisis de las proteinas marcadas¿gg 13552-metionina
8.3.1. Anáiisis gg las proteinas ceiuiaresE1 análisis de ias proteinas ceiuiares marcadas con
(355)-metionina corridas en una eiectroforesis de geies bidimen
sionaies permitió observar ias siguientes diferencias: a) cuando
se compararon las proteinas celulares de ias céiuias cultivadas en
presencia o ausencia de suero, se detectaron cambios en ias inten
sidades de ias manchas inducidas en 1a piaca fotográfica debidos a
variaciones en 1a radioactividad incorporada a proteinas. Estas
diferencias se indican en 1a Fig. 18A y B, con ios simbolos
abiertos; b) aparición de manchas que se manifestaron en una de
107
Fig. 17: Citoqueratinas reveladas Eor_lg técnica de la inmunoeroxiïasa con anticuergos gg coneJo dirigiaos confra gueratinas
Eumanas. '
Los qetalles experimentales se describen en la secciónmateriales y metodos.
I. Revelado gel Western blot.II. Revelado gg la tecnica inmunocitoquïmica.(A) Celulas cultivadas en presencia de suero. (B) Células cultivadas en el medio químicamente definido.
108
Fig. 18: Electroforesis en geïes bidimensionaies de groteïnas—- -—-—-—--—--3 -— . . ——ce1u1ares marcadas con L 5S)-metionina.
Los detailes experimentales se expiicitan en 1a secciónmateriales y métodos.
(A) Céiuias cuitivadas en presencia de suero.(B) Céluias cuitivadas en e] medio químicamente definido.
109
las dos condiciones de cultivo; se indican con simbolos cerrados
en la Fig. 18A y B.
8.3.2. Análisis de las proteinas liberadas al mediode cultivoLas células cultivadas durante 3 dias en el medio quimica
mente definido incrementaron en un 50-60% la incorporación de
(3SS)-metionina a las proteinas liberadas al medio de Cultivo, tal
como se observa en la Tabla VI.
Las proteinas secretadas al medio de cultivo se corrieron
en un gel de acrilamida al 10% en presencia de SDS. El análisis de
la autóradiografïa reveló la existencia de una proteina de 56.000
daltons presente sólo en el medio químicamente definido (Fig. 19).
8.4. Análisis d os medios condicionados obtenidos a partir de
as células cultivadas gg presencia d suero g gn el medio
químicamente definido
Se ensayo el efecto de dichos medios condicionados sobre lalïnea celular CHEF/18 de fibroblastos diploides de embrión de
hamster que presentan la caracteristica de poder ser diferenciados
"in vitro" a preadipocitos, adipocitos, mioblastos y condrocitos,
tal como fue descripto por Sager y Kovak en 1982. Las diferencias
Cuali y cuantitativas observadas en las proteinas liberadas al
medio por las células cultivadas en presencia o ausencia de suero
se reflejaron al agregar los medios condicionados a cultivos de
células CHEF/18en crecimiento exponencial.
El medio condicionado de las células MCF-7cultivadas en pre
sencia de suero estimuló el crecimiento de las células CHEF/18
110
Tabia El. Síntesis gg proteinas en as céiuias MCF-7 cultivadas 32
presencia gg suero g en 1 medio químicamente definido du
rante ; dïas
Incorporación deIncorporación de ( S)-metionina(355)-metionina a 1as proteinas
Condiciones a proteinas intra liberadas a1 mediode cuitivo ceiulares (A) de cuitivo (B)
cpmx10'3/105 céiuias cpmx10'3/105 céiuias %B/A
En presenciade suero 1,86 1,74 0,94(Dulbecco/F-12/FBS)
Medio quïmicamente definido 1,68 2,29 1,36(Duibecco/F-12/BSA)
Las células se marcaron con (355)-metionina (100 uCi/mi) durante 3horas. La incorporación de materia] radiactivo medida se normaiizópor e] nümero de céiuias presentes en cada piaca de cuitivo. Losresu1tados corresponden a] promedio de 2 experimentos, cada uno deios cuaies se efectuó por tripiicado.
111
Fig. 19: Autorradiografïa _d_e_1_ge_1_monodime iona] de Eroteïnassecret’a‘ïias _a__me io _g cu tivo marcadas ¿En ggÉSj-met'ïïíïiina.
Se sembró igual cantidad de proteinas radiactivas en las2 condiciones anah’zadas. E1 ge] s‘e expuso durante 5 dias. Laflecha indica 1a posición de 1a proteina de 56.000 daitons, presente 5610 cuando se cultivan las céiuias en e] medio quïmicamentedefinido.
Aunun
4
¡37.4Im>.
112
durante las primeras 48 horas (Tabla VII) pero luego indujo la
aparición de lipidos que se tiñeron con el colorante oil red 0; el
crecimiento se detuvo antes de que las células alcanzaran
confluencia. Al cabo de 20 dias de cultivo en presencia de dicho
medio condicionado, las células se diferenciaron a adipocitos, tal
como se observa en la Fig. 208.
El medio condicionado de las células MCF-7cultivadas en el
medio quïmicamente definido inhibió, al cabo de 4 dias de cultivo,
un 50% el crecimiento de las células CHEF/18 (Tabla VII) pero no
indujo la aparición de lïpidos (Fig. 20C). Esta observación coin
cide con la descripta por Sager y Kovak quienes demostraron en
1982 que el agregado de insulina como ünico factor no es capaz de
inducir la diferenciación terminal de las células CHEF/18.
8.5. Crecimiento independiente del anclaje
Las células MCF-7cultivadas en presencia de suero o en el
medio químicamente definido se sometieron a un ensayo clonogénico
en agar blando.
En la Tabla VIII se presentan los resultados obtenidos.
Las células cultivadas durante 20 dïas en el medio quimica
mente definido presentaron una eficiencia clonogénica del 16 al
20%. Estas células originaron colonias conteniendo aproximadamente
8.000 células al cabo de 10 dias de cultivo (Fig. 21A y B).
Las células cultivadas en presencia de suero detuvieron su
crecimiento luego de 2-3 divisiones y dieron colonias de menos de
10 células que al décimo dïa de cultivo perdieron su viabilidad
(Fig. 21, inserto C). En cuanto a las células cultivadas durante
113
Tabia II. Efecto de os medios condicionados d las céluïas MCF-7
cuitivadas gg presencia g ausencia gg suero sobre el crecimiento d 1 iïnea ce1u1ar CHEF/18
Tiempo transcurrido 1uego de] agregadoCondiciones de ios medios condicionados (horas)
48 96
5%FBS (2,87¿0,13)x104 (2,35¿o,17)x105
2,5% FBS (2,50¿o,21)x104 ‘ (1,80¿O,31)x105
5% FBS + MQD(1:1) (2,67¿0,14)x104 (2,29¿o,07)x105
5% FBS + MC (FBS) (3,70:0,32)x104 (7,87_+¿0,35)x104
5% FBS + MC (MOD) (2,3410,26)x104 (1,2210,09)x105
Las céïuïas CHEF/18 se piaguearon a razón de_104 céiuias/pïaca gecultivo de 35 mm. E] medio con icionado se ensayo a una concentracionde] 50% (Duïbecco + 10% FBS + MC(1:1)). Los resuitados presentadoscorresponden a dos experimentos distintos, cada uno de Ios cuaïes seefectuó por tripiicado.
114
Fig. gg: Diferenciación gg 1as céïulas CHEF/18 mediada por 1medio condicionado gg 1as céïulas MCF-7cultivadas en presencia dsuero. f'D
(A) Céluïas CHEF/18 con morfoïogïa de preadipocitos,Iuego de 3 dias de cultivo en presencia de] medio condicionado porlas células MCF-7en presencia de suero.
(B) Céluïas CHEF/18 con morfoïogïa de adipocitos, 1uegode 20 dias de cultivo en presencia de] medio condicionado por lascélulas MCP-7en presencia de suero.
(C) Céïuias CHEF/18 tratadas durante 15 dias con e] mediocondicionado por las céiuïas MCF-7 en ausencia de suero. Lascéïulas presentan distinta morfologïa que ias células no tratadas(controles, no presentados aqui) a pesar de que no se detectancaracteristicas de diferenciación.
\
115
recimiento independiente del ancïaje de as céiulasC
MCF-7Cultivadas en 1 medio 1ibre gg suero
Condiciones de cuitivo Nümero de coionias/placa de cu1tivo de 35 mm
10 céiuias 30 céiuias 300 céluias
En presencia de suero 2
MQD(10 dïas) - 250
MQD(>20 dïas) - 825 786
Se sembraron 104 céïuias en medio de cuïtivo conteniendo agar, a unaconcentración fina] de 0,4%. Las coionias se contaron a1 cabo de 10dïas de cuitivo, procediéndose ta] como se describió en materiaies ymétodos. Los vaiores corresponden a1 promedio de 3 experimentos, cadauno de los cuaïes se efectuó por triplicado. En e] caso de] medioquímicamente definido (MOD), 10 y >20 dias corresponden a Ios dïas decuitivo de ias céluias en e] medio iibre de suero antes de someterlas a] ensayo cionogénico.
116
Fig. 21: Crecimiento independiente del anclaje .gg las célulasCF'703
Las células MCF-7 se cultivaron durante 20 dïas en elmedio químicamente definido antes de someterlas al ensayo clonogénico en agar blando. Los detalles experimentales se explicitanen la sección materiales y métodos.
j (A) Crecimiento en el medio quimicamente definido (40x O
- (B) Tamaño comparativo de una colonia creciendo en elmedio quimicamente- definido en relación al de una colonia creciendo en presencia de suero (inserto C).
) (C) Tamaño_de una colonia creciendo en presencia de suero(100 X .
117
10 dïas en e] medio químicamente definido, su eficiencia clo
nogénica fue de (2,5510,06)%. Dado que a Ios 10 dïas de cultivo en
ausencia de Suero 1as céïulas manifestaron Su requerimiento hor
mona] (tai como se expiica en 1a sección 0.2.1.), se decidió efec
10 M estradioï. Entuar e] ensayo clonogénico en presencia de 10'
estas condiciones se verificó un incremento de] 80%en 1a capaci
dad de generar coïonias en agar blando (eficiencia cionogénica =
(4,6310,11)%) pero no se modificó e] tamaño de las coïonias (S30
céïuias/colonia).
B.6. Distribución de las células en gradientes de densidad ggPercoil
Se sometieron las céluias cuitivadas en presencia de Suero o
en e] medio químicamente definido a una centrifugación en gradien
tes de densidad de Perc011. La distribución de Ias céluïas en e]
gradiente se presenta en 1a Tabla IX.
En e] medio quïmicamente definido se verificó un incremento
en 1a contribución de 1as subpobiaciones A y B a expensas de una
disminución en e] aporte de ias subpobiaciones D y F mientras que
no se modificaron ias subpobiaciones C y E. Los cambios descriptos
se acentuaron a medida que transcurrieron 105 dïas de cuitivo en
el medio químicamente definido.
B.7. Expresión de marcadores ce1u1ares
8.7.1. Egpresión de antígeno carcinoemgrionario CEA
Se utilizó 1a técnica inmunocitoquïmica para analizar 1a
expresión y distribución de] antígeno carcinoembrionario en 1as
118
Tabla IX. Distribución d ias céluias MCF-7gn gradientes gg densidadgg Percoii
Condiciones de Cultivo
En presencia En ei medio químicamente definidode suero (dias)
Subpobiaciones 3 7 10 191 (1») (1») (7€) (Z)
A 17,0 19,3 20,8 20,0 24,6
B 21,7 24,5 25,2 26,8 28,8
C 30,0 29,0 29,2 33,0 30,3
D 4,5 4,2 3,9 3,3 3,4
E 5,8 5,7 5,3 5,5 5,4
F 21,0 17,3 15,6 11,4 7,5
Las células MCF-7en crecimiento exponencia] se sembraron en un gradiente de densidad de Percoii a razón de 3x106 céiuias/tubo, ta] comose describe en materiaies y métodos.Los resuitados obtenidos corresponden a1 promedio de 2 experimentos.
119
céluïas cu1tivadas en presencia o ausencia de suero.
Se ensayo sobre céluias en crecimiento exponencial y pia
queadas a 1a misma densidad dado que Kufe y col. demostraron en
1983 que 1a expresión de] CEA en células MCF-7 depende de] cicio
ce1u1ar.
En 1a Fig. 22 puede apreciarse que 1a distribución de] CEA
fue difusa cuando ias céïuias se cuitivaron en presencia de suero.
En cambio, en las céïuias cultivadas en e] medio químicamente
definido, el CEA se concentró en un "casquete" próximo a1 nücieo
celular.
8.7.2. Expresión de la proteina 231 codificada por gl oncogenLas
En 1a Fig. 23 (A y B) se presentan ios resuïtados obtenidos
1uego de determinar 1a expresión de 1a proteina p21 por 1a técnica
inmunocitoquïmica.
Las céiuias cuïtivadas en presencia de suero dieron una
reacción intensa; las céiuïas Cuitivadas en el medio químicamente
definido, por e] contrario, presentaron un bajo grado de positivi
dad, con una distribución difusa de 1a proteina p21.
8.7.3. Expresión gg receptores estrogénicos SRE!
Los resuïtados correspondientes a 1a determinación de] con
tenido de receptores estrogénicos por 1a técnica immunocitoquimica
se presentan en 1a Figura 23 (C y D). Se detectaron 2 niveïes de
positividad: intenso (s) y débii (w).E1 contenido de RE se incrementó en 1as céiuïas cuïtivadas
durante 10 dias en ausencia de suero, principalmente a expensas de
120
Fig. gg: Exgresión gg antïgeno carcinoembrionario, revelado Eor lgtécnica inmunocitoquïmica.
Se procedió taiy métodos.
2A; Céluias cultivadas en presencia de suero.B Céluias cuitivadas en e]
comose describe en la sección materiaies
medio quïmícamente definido(X 560).
121
Fi . gg: Determinación gg lg Eroteina 921z codificada Eor gl genras LA1 El L receptores estrogénicos ¿g l El gg células MEF-7.
A y C: céluïas cuitivadas en presencia de suero.B y D: células cuitivadas en e] medio químicamente defi
nido durante 10 dias.Las fiechas indican células intensamente (S) y débiimente
(W) teñidas (X 360).
122
1as céïulas que daban una tinción intensa (Tabïa X). Dicho incre
mento fue transiente dado que desapareció a] cultivar 1as céluïas
durante un tiempo mayor o menor a 10 dïas en e] medio químicamente
definido; en estos casos, el contenido de RE se mantuvo como en
las células cuïtivadas en presencia de suero.
123
Tabia Á. Expresión gg receptores estrogénicos en céiulas MCP-7cuïti
vadas en presencia 2 ausencia gg suero
en medio química% de células RE-positivas en presencia de suero mente definido
débiimente teñidas (H) 27 56
intensamente teñidas (S) 5 22
w + S 32 78
Los vaïores obtenidos corresponden a] promedio de 2 experimentosdistintos, cada uno de los cuaies se efectuó por dupiicado.Las céiuias MCF-7se cuitivaron durante 10 dias en e] medio 1ibre desuero antes de someterlas a este anáiisis.
124
C. Efecto de moduladoresg_ l_ diferenciación
Se ensayó el efecto de moduladores de la diferenciación (13-cis
retinal, dimetilsulfóxido y butirato de sodio) sobre las células
MCF-7cultivadas en presencia o ausencia de suero.
C.1. 13-cis retinal
C.1.1. Efecto del 13-cis retinal sobre la proliferación celularSe ensayó el efecto de este derivado de la vitamina A sobre
la proliferación de células cultivadas en presencia de suero o en
el medio químicamente definido. Las curvas de crecimiento celular
en presencia de distintas dosis de 13-cis retinal se muestran en
la Fig. 24 (A y B). Paralelamente, se hizo un control cultivando
las células en presencia de dimetilsulfóxido para descartar que el
efecto del retinal se debiera en parte al DMSOusado como
diluyente. Los resultados obtenidos demostraron que 0,1% DMSOno
ejerce ningün efecto sobre el crecimiento celular. La mayor esti
mulación del crecimiento celular se verificó a concentraciones
10'8-10’7 M de 13-cis retinal y se manifestó a partir de las 24
horas de cultivo. Cuando la concentración empleada fue del orden
de 10'6 M, hubo una inhibición del crecimiento celular que se
manifestó hasta el tercer dïa de cultivo; a partir de entonces, y
a pesar del agregado de 10'6 M de 13-cis retinal en cada cambio de
medio de cultivo (efectuado cada 3 dias), las células se recu
peraron y crecieron con la misma velocidad que los controles.
Concentraciones de 13-cis retinal mayores de 10'6 M
resultaron ser tóxicas en todas las experiencias efectuadas.
Cuando se utilizó el ácido retinoico en lugar del 13-cis
125
U'IFig. gg: Efecto de] 13-cis retina] sobre gl crecimiento d_ lacéïuïas MCF-7.
Las células se sembraron a razón de 8.104 céïuias/pïacade cultivo de 35 mm. Se ensayaron distintas concentraciones de13-cis retina] durante 10 dias. Los resuïtados obtenidoscorresponden a1 promedio de 6 experimentos distintos, cada uno deios cuales se efectuó por tripiicado.
(A) Céïuïas cuïtivadas en presencia de 10%de suero fetalbovino.
(B) Células cultivadas en el medio químicamente definido.o: controles; A: , M ; - 10'6 retina]; l;
5x10'7 M retina]; o: 10-7 M retina1;A: 10'8 Mretina].
E 100 100
5 ao g aofi 60 3 60'á uw 40 ° 40:5 30 ‘2- 305 2g 20 í 20b Íun “9
IO ü
v3) 8 u)3 — 3u.) 6. 3 6u ' ¡u
g 4' ° 43'- ls' 3h
8 o
¡gl 2h El 2z 2
1 1 1 l 1 1 l 1 1 l
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
126
retina] se obtuvieron ios mismos resuïtados.
Se ensayó e] efecto de] 13-cis retina] en otras 1ïneas
ceiulares de tumor de mama humano, como T-47D cion 11 (de origen
metastásico, obtenida por Keydar y c01. en 1979 y también como
MCP-7, sensible a estrógenos) y Hs-578 T, estrógeno-independiente
(derivada de un carcinosarc0ma mamario y obtenida por Hackett y
co]. en 1977), habiéndose obtenido simi1ares resuitados.
También se reprodujeron los resultados obtenidos Cuando e]
13-cis retina1 se preparó diiuido en etanoi. Las céiuias tratadas
con 0,1% etano] no variaron su veïocidad de crecimiento con
respecto a1 contro].
Debo agregar también que e1 reempiazo de suero fetal bovino
por suero de cabailo no modificó e] efecto inducido por e] 13-cis
retina] en las iïneas ceiuiares estudiadas.
0.1.2. Efecto del 13-cis retina] ¿gbgg la sintesis de proteinasceiuiares l liberadas al medio gg CuÏtÍVO
En 1a Tabla XI se muestra e] efecto de] 13-cis retina]
sobre la incorporación de (355)-Met a proteinas y sobre e] cón
tenido proteico de céïulas cuïtivadas en presencia de 10%de suero
fetal bovino.
E1 tratamiento de 1as células con 10'8 M de 13-cis retina]
durante 3 dias produjo una ieve inhibición de 1a incorporación de
(355)-metionina a las proteínas ce1u1ares y a las proteinas
liberadas a1 medio de cuitivo. Luego de 15 dïas de tratamiento se
verificó un incremento de] 50-60% tanto en 1a incorporación de
precursor radioactivo comoen e] contenido de proteinas intraceiu
Tab1a_¿1.Efectode]l3-cisretina]sobrelasintesis1_acumu1aci6nggproteinasgn_célu1as
MCF-7
Proteinas ceïulares
tota1es
Proteinas nucïeares
Proteínas
cit0p1asmáticas
Proteinas
1iberadas
mediodecu1tivo
a1
Cuantificaciónpor1atécnica deLowry
Incororaciónde(3S)-Met.
Cuantificaciónpor1atécnica deLowry
Cuantificaciónpor1atécnica deLowry
Incororación
Incorporaciónde(35S)-Met.
Incooracde(SgS)-M
ión et.
cmx10-/1o5 céïulasZ
Dïasde
tratamiento
cpmx10-5/105 céïuïas1
cpmx10-5/105
pgr/célula%pgr/célula1céïulas%pgr/célula%
Cpmx10'3/105 céïulas
100 (18)
100 (18)
Controïes1,86573100
(7)
1,24384100
(7)
0,62100189100
(7
1,74
100
1,4778
(4)
N.Do
1,54
89 (4)
15dïas2,92157
(8
860150
(2
150
(8
550143
(2)
1,00162
(8)
310164
(2
1,34
77 (8)
60dïas1649511661,30105409
3(7(3
106,5
(7)
1,80292
(3
542287
(7
2,40
138
(3
110-120
dïas
244(2)
203(3)
1.4002,52640167
(2)
2,58419
(3)
720381
(2
1,41
81 (3
._. Lascélulassecuïtivaronenpresenciade13-cisretinaïdurante1ostiemposqueseindican.Losnúmerosentre canelnümerodeexperimentosdistintosreaïizados,cadauno_de1oscuaïesseefectuópordup1icado.Losdetaïïesexperimentaiesseespec1f1canenmateria1esymetodos.N.D.:Nodeterminado.
paréntesis
1nd1
128
lares (de localización citoplasmática y nuclear). Las proteinas
liberadas al medio de cultivo sufrieron una leve inhibición.
El tratamiento crónico de las células durante 60 dïas
mostró una diferencia notable: el contenido proteico de la frac
ción soluble fue similar al del control pero fue en la fracción
nuclear donde se produjeron los cambios más importantes, con un
incremento de casi 3 veces en el contenido de proteinas y en la
incorporación de precursor radioactivo. En Cuanto a las proteinas
liberadas al medio de Cultivo, se produjo un incremento del 40%.
Estos efectos se modificaron más dramáticamente luego de 4
meses de tratamiento de las células; se duplicó la incorporación
de (35S)-metionina a la fracción soluble y se cuadruplicó en la
fracción nuclear; estos cambios se acompañaron de un incremento de
la masa proteica (167% para la fracción soluble; 381% para la
nuclear).Para descartar que el efecto del 13-cis-retinal sobre la
incorporación de (355)-metionina a proteinas se debiera a una
alteración en el transporte de precursor radioactivo, se efectuó
una cinética para medir la incorporación de radiactividad al
material soluble en presencia de TCA. Los resultados obtenidos se
graficaron y se presentan en la Fig. 25. En esta figura se
demuestra que el incremento en la incorporación de (3SS)-metionina
a fracciones insolubles en presencia de TCA observado en las
células tratadas con 13-cis retinal, no se debió a un aumento del
transporte del aminoácido marcado. Por el contrario, luego de una
inCubación de 60 minutos, fue mayor la radiactividad en la frac
ción soluble en presencia de TCA medida en los controles con
129
¿13; 32: ¿gggggggggián gg L3ssg-metionina a] materia] soïuble engresencia de IEA en céluïas - con roïïï l cronicamenfe ELE:tadas ¿gg Ïïïcis retinal.
Las céluïas se sembraron en piacas de cuitivo de 35 mm,tai como se describió para 1a determinación de 1a sintesis deproteinas. La incorporación de precursor radioactivo a1 materia]soïubie en presencia de TCA se efectuó ta] como fue descripto en1a sección materiaIes y métodos. _
Los valores graficados corresponden a 6 experimentosdistintos, cada uno de Ios cuaïes se efectuó por tripiicado.
o: controïes; I: céluïas crónicamente tratadas con 13-cisretina] 10-8 M(durante 110-120 dïas).
E 6E.9 ..'Ü m2:.9l D
1? '22 4¿.mg.2 6‘3 53 28 E. a.'< .8¿e
l l l
0 60 120 180
flEMPO(mkwb9
130
respecto a las células crónicamente tratadas con 13-cis retina].
E1 anáiisis de ios geies no reve16 cambios cuaiitativos en
las células tratadas con 13-cis retinai. Sólo cuando se corrieron
ias proteinas nucieares de ias céluias tratadas durante 15 dias
con retina] se observó 1a aparición de una proteina de 32.000
daitons de peso moiecular que no se encontró en 1as céluias no
tratadas. No se continuó con el análisis de esta proteina ya que
no siempre ios geies dieron resuitados reproducibies respecto a su
presencia.
C.1.3. Efecto de] 13-cis retina] sobre el crecimiento indepen
diente dei anciageCuando ias céiuias crónicamente tratadas con 13-cis retina]
se cuitivaron en un medio semisólido (agar biando) en presencia de
suero feta] bovino, aproximadamente un 20-30% de ias céiuias fue
capaz de dar macrocoionias de céluïas, viabies aün después de 14
dias de cultivo en esas condiciones. Los controies de céiuias no
tratadas, por e] contrario, fueron incapaces de dar coionias en
ese medio, comoya se describió anteriormente.
En 1a Fig. 26 se muestra un ejemplo de] tipo de coïonias
que indujo e] 13-cis retina] en agar b1ando.
C.1.4. Efecto de] 13-cis retina] sobre 1a distribución de las
células en gradientes de densidadE1 tratamiento de ias céluïas con 10'8 M de 13-cis retina]
en presencia de suero feta] bovino indujo modificaciones en 1a
contribución de 1as distintas subpobiaciones, ta] como se muestra
131
Fig. 26: Crecimiento independiente de] anclaje de céïuïas MCF-7croniï’hente tratadas con ló-c1s retinal. _' __—_“—‘."-’
Las céiuïas MCF-7 se trataron con 13-cis retina]10"8 M durante 60 dias antes de someterias a1 ensayo cionogénicoen agar blando, ta] como se describe en 1a sección materiales ymétodos.
100) La fotografia muestra una colonia de más de 0,5 mm2 (X
132
en la Tabla XII.
Ya a Ios 4 dïas de cu1tivo, se observó una disminución en
e] porcentaje de 1as subpobiaciones C y F, a expensas de un incre
mento en ias subpoblaciones con menor grado de diferenciación (A y
B). Este efecto se acentuó a medida que transcurría el tratamiento
con 13-cis retina] y fue máximo a Ios 120 dias. En ese momento, se
aicanzó 1a mayor contribución de ias subpoblaciones A y B a expen
sas de ia disminución de las subpobiaciones C, D y F. La contribu
ción de 1a subpobiación de céiulas "stem" (E) permaneció
invariabie.
C.1.5. Efecto del 13-cis retina] sobre las subpobiaciones aisiadas
Para comprobar que e] 13-cis retina] actuaba como moduiador
negativo de 1a diferenciación, se decidió probar su efecto sobre
ias Subpobiaciones con menor grado de diferenciación (A,B,E).
En 1a Fig. 27 (a y b) se observan ios perfiies de ios gra
dientes obtenidos 1uego de 7 dïas de cuitivo de 1a Subpobiación A
en ausencia o en presencia de 10"8 M de 13-cis retina].
A1 cabo de 7 dias, 91 13-cis retina] detuvo 1a diferen
ciación de 1a subpobiación A; e] 65% de ias céluïas quedó c0mo A,
e] 28% como B y ei porcentaje restante se distribuyó entre C, D y
F. Para e] contro] no tratado, sólo e] 17% se conservó cemo A.
Cuando e] tratamiento de ias céiuias se prolongó durante 47
dïas, aproximadamente el 70% de 1as céiulas quedó como A mientras
que ias céiuias no tratadas terminaron en 1a subpobiación F.
Resuitados similares se obtuvieron para ias Subpobiaciones
B y E. En e] primer caso, e] tratamiento de las céluias durante 7
133
Tabïa II. Efecto de] 13-cis retina] sobre la distribución gg
1as células MCF-7gg gradientes gg densidad
Dïas de tratamientoSubpoblación
(1a)0 4 26 68 120
A 16,0 20,0 20,0 24,0 20,0
B 23,0 24,7 25,4 28,9 35,0
C 33,5 30,0 31,6 27,8 32,0
D 4,5 4,5 4,7 3,4 2,5
E 5,8 5,8 5,9 5,7 6,0
F 17,2 15,0 12,4 10,2 4,5
Las céïulas fueron tratadas con 10'8 Mde 13-cis retina] durantedistintos tiempos. Segün se indica, fueron 50metidas a una centrifugación en gradientes de densidad, ta] c0mose describe en materiaïesy métodos.
131o
Las subpobiaciones A y B se trataron con 13-cis retina]10'8 M durante 7 dias y se sometieron a una centrifygación en gradientes de densidad de Percoii. Para 1a subpob1ac1on E, e] tratamiento con 13-cis retina] 10’8 M se proion 6 durante 47 dias.
(a),(c),(e): Céiuïas no tratadas ïcontroies .(b),(d),(f): Céiuias tratadas con 13-cis retina] 10"8 M.
SUBPOBLACION A
¡00 ¡oo80 (a) 80 (b)60 50
4° 4o
20 20
A B C D E F A B C D E F
Lx: SUBPOBLACION By 100 100m (C) (d)< 80 ao3 60a 60U 40 40uJ 20 20o
g A B C D E F A B C D E Fu:2, SUBPOBLACION Ez ¡oo (e) ¡oo (f)
80 8060 50
1.0 ¿o
20 20
A B C D E F A B C D E F
SUBPOBLACIONES CELULARES
135
dïas detuvo la generación de subpoblaciones con mayor grado de
diferenciación, quedando el 84% de las células como B. El control
no tratado generó C, D y F y sólo el 16% de las células permaneció
como B (Fig. 27 c y d).
El tratamiento de la subpoblación E durante 47 dias provocó
un notable incremento en la contribución de las subpoblaciones A y
B al total (78% versus 38% en el control) a expensas de la dismi
nución del aporte de las subpoblaciones C, D y F (14% verSus 56%
en el control). En las células tratadas con retinal hubo un 8% de
E mientras que en el control disminuyó al 5,8% (Fig. 27 e y f).
Estos resultados demuestran que 10'8 M de 13-cis retinal
actüa en estas células como modulador negativo de la diferen
ciación.
G.2. Dimetilsulfóxido
C.2.1. Efecto del dimetilsulfóxido sobre la proliferación celularSe ensayó el efecto de distintas dosis de DMSOsobre la
proliferación de las células cultivadas en presencia de suero.
Las correspondientes curvas de crecimiento celular se
muestran en la Fig. 28. Se puede apreciar que 0,1% DMSOno ejerció
ningün efecto sobre el crecimiento, tal c0mo se habïa comprobado
anteriormente cuando se utilizó esta dosis como control en las
curvas del 13-cis retinal (Fig. 24A).
Una concentración del 0,5% produjo una inhibición del 50%
del crecimiento celular que se manifestó ya a las 24 horas de tra
tamiento.
Cuando la dosis ensayada fue del 2%, hubo una inhibición
136
Fig. gg: Efecto de] DMSOsobre ¿L crecimiento _d_e_1a5céiuias MCF-7.
Las céiuïas MCP-7se sembraron a razón de 8.104 células/placa de cultivo de 35 mmy se cuitivaron durante 4 dias en presencia de distintas concentraciones de DMSO. Cada 24 horas seefectuó e] recuento ce1u1ar por triplicado.
‘o: contro]; A: 0,1% DMSO; l: 0,5% DMSO; o: 2% DMSO.En e] inserto de 1a figura se observa 1a morfoïogïa que
adquirieron ias céluias Iuego de 48 hs de tratamiento con 0,5% de
.//¡w Ir... - a "h %33Q2fl4:f&;.u’ñïsáéfa - rx¿r ug? tag: 4, 'a 1.‘ ’. ¡- o v h.
NUMERODECELULAS
TIEMPO (días)
137
del 50% del crecimiento celular durante las primeras 48 horas; a
partir de entonces se detuvo el crecimiento.
En el inserto de la Fig. 28 puede observarse la morfologïa
que presentaron las células tratadas con 0,5% DMSOdurante 48
horas. Las células se redondearon y adquirieron un aspecto más
pequeño y más oscuro que las células no tratadas.
Estos cambios morfológicos fueron irreversibles; las célu
las perdieron su viabilidad y se colorearon con el colorante azul
tripán.A partir de las Curvas de crecimiento obtenidas, se decidió
elegir la concentración de 0,5% DMSOpara los sucesivos experimen
tOS.
Para comprobar que el DMSOactuaba como inductor de la
diferenciación en estas células, se sometieron las células trata
das durante 4 dias con 0,5% DMSOa una centrifugación en gradien
tes de densidad de Percoll. La Tabla XIII muestra los resultados
obtenidos para las células tratadas y para un control de células
MCF-7, sin tratar.
El efecto del tratamiento con 0,5% DMSOdurante 4 dias fue
notable: la distribución de las células en el gradiente sufrió
alteraciones, con un importante enriquecimiento en las sub
poblaciones más diferenciadas (D y F) a expensas de la disminución
de las subpoblaciones con mayor capacidad proliferativa. La sub
población de células “stemn (E) no resultó afectada por este tratamiento.
Tabla XIII. Efec
las
to
138
de] dimetiisuïfóxido
céluias MCF-7
sobre la diferenciación d
CéiuiasSubpobïación
(%)Control Tratadas
A 15,5 4,4
B 23,0 9,0
C 33,5 14,0
D 4,2 17,0
E 5,8 5,5
F 18,0 50,1
Las céïuias cuïtivadas en presencia de suero fueron tratadas durante4 dïas con 0,5% DMSO.tes de densidad, tal
Se sometieron a una centrifugación en gradiencomo se describe en materiaies y metodos.
139
Estos resultados demuestran que e] DMSOejerce un efecto
inductor de 1a diferenciación en 1as células MCF-7.
G.3. Butirato gg sodio
C.3.1. Efecto de] butirato gg sodio sobre la proiiferación celular
Se ensayó e] efecto de distintas concentraciones de
butirato de sodio sobre 1a proïiferación de ias céiuïas cuitivadas
en presencia de 10% de suero feta] bovino o en e] medio quimica
mente definido. Las correspondientes curvas de crecimiento ce1u1ar
se presentan en 1a Fig. 29 (a y b).
En presencia de suero, concentraciones de butirato de sodio
de 1 y 2 mMresuitaron inhibitorias de] crecimiento ceiuïar (65%y
73%, respectivamente, a1 3° dia de cu1tivo) mientras que con
centraciones de 3 y 4 mMtuvieron efectos tóxicos; quedaron el 18
y 11%, respectivamente, de 1as céïulas presentes en e] contro] a]
cabo de 3 dïas de cuitivo.
En el medio químicamente definido, ias céluias fueron más
sensibies a1 efecto de] butirato de sodio. Concentraciones de 1 y
2 mMre5u1taron ser tóxicas; a partir de ias 24 hs se detuvo e]
crecimiento celuiar cuando 1a concentración empïeada fue 1 mM.
Concentraciones de 3 y 4 mMtuvieron un importante efecto tóxico.
A1 cabo de 3 dias de cu1tivo y en presencia de butirato de sodio 4
mM, e] nümero de céluïas fue de apenas el 5% de] contro].
E1 butirato de sodio indujo cambios morfoïógicos en las
céïuïas, que se manifestaron a 1as 36 horas cuando 1a dosis
empieada fue 1 mM; ios cambios morfológicos observados fueron
simiiares a Ios descriptos anteriormente para e] DMSO.
140
Fig. 29: Efecto del butirato de sodio sobre el crecimiento de lascélulas MCF-7.
Las células se sembraron a razón de 5.104 células/placade Cultivo de 35 mmy se cultivaron durante 3 dias en presencia dedistintas concentraciones de butirato de sodio. Cada 24 horas seefectuó el recuento celular por triplicado.
(a): Células cultivadas en presencia de Suero.(b): Células cultivadas en el medio químicamente defi
nido.o: control; o: 1 mM But; A: 2 mM But; I: 3 mM But; 4
mM But.
5
no5_ 2105
m _< 105 - IOsdD
d _.U /'.g &m¿ “‘-ú————4 sm‘2 \'\_ (¡-4-———¡3 \z \\\\'
210‘— 210‘
¡0L 1 1 Q ¡0‘..__.I._l___¡1 2 33
TIEMPO (días)
141
C.3.2. Efecto del butirato gg ¿2212 sobre .13 diferenciaciónce1u1ar
Las céiulas MCF-7cultivadas durante 2 dias en presencia de
suero y 1 mMde butirato de sodio fueron sometidas a una centrifu
gación en gradientes de densidad. E1 perfi] de] gradiente obtenido
a partir de ias céiulas tratadas y de] contro] se observa en 1a
Fig. 30.
E1 tratamiento de ias células durante 2 dïas fue suficiente
como para observar un cambio en 1a distribución de ias céluïas en
e] gradiente. Tai como fue descripto anteriormente para ei DMSO,
se incrementó 1a contribución de Ias subpobiaciones más diferen
ciadas (en este caso, ei incremento más importante se registró
para 1a subpoblación D) a expensas de 1a disminución de 1as sub
poblaciones A, B y C. No se aiteró e] porcentaje de ia sub
pobiación E, que contiene 1as céiulas "stem".
G.4. Combinación de moduiadores de 1a diferenciación
C.4.1. Efecto sobre la proiiferación ceiuiarSe decidió estudiar e] efecto producido por 1a combinación
de 13-cis retina] 10'8 Mcon butirato de sodio, a concentraciones
de 1 y 4 mM, sobre 1a proliferación de 1as céiuias cultivadas en
presencia de suero y en e] medio quïmicamente definido (en ambos
casos adheridas a las placas de cuitivo) y en células crecidas en
suspensión. En 1a Fig. 31 se graficaron 1as curvas de crecimiento
ce1u1ar, correspondientes a cada caso.
E1 anáiisis de esta figura permitió conciuir que:
NUMERODECELULAS(Vo)
142
Fig. _3_0_:Efecto de] butirato g_e_sodio sobre 1a distribución d asce uïas MLr-I ïfgracfientes _d_e_den51dad fi Percoll.
Las céluIas MCF-7se cultivaron durante 2 dïas en presencia de 1 mMbutírato de sodio. Posteriormente, se sometieron a unacentrifugación en gradientes de densidad de PercoH.
CELULAS CONÏROL +13 - ClS-RETINALUO'a M) +BUT|RATO DE SODIO(lmM)
B D ABCDEF
SU BPOBLACIONES CELULARES
Fig. 31: Efecto del 13- 's retinal l del butirato gg sodioo om
c1
‘agreqados por separado _ en c binación) sobre el crecimiento ggas ce u as MF- adherida g_ sustratoz gg presenc1a g ausenc1agg suerol l en suspen51o .
Las células MCF-7se sembraron a razón de 5.104 céluÉas/placa de cultivo de 35 mm. Se ensayo el efecto de retinal 10' M;butirato de sodio 1 mM y 4. mM agregados por separado o en combinación con l3-cis retinal 10' M sobre el crecimiento de lascélulas durante 4 dïas de cultivo.
Las células MCF-7adheridas al sustrato se sembraron enpresencia de suero. Al cabo de 4 horas, se lavaron conPBS-Ca2+/Mg2+y se agregó el medio químicamente definido.Las células MCF-7en suspensión se cultivaron directamente en elmedio químicamente definido; la acción de la tripsina se detuvocon inhibidor de tripsina de soja, tal como se describe en la sección materiales y métodos.
(a : Células cultivadas en presencia de suero.(b : Células cultivadas en el medio químicamente defi
nido, adheridas al sustrato.(c): Células en suspensión.o: c0ntroles; o: 10' M Ral; D: 10'8 M Ral + 1 mMBut; A:
10'8 M Ral + 4 mM But; I: 1 mM But; A: 4 mM But.Los resultados corresponden al promedio de 2 experimentos
efectuados por triplicado.
¿1110s
0
21105 \.
\o \NUMERODECELULAS
5
NUMERODECELULAS
6 \°\\
NUMERODECELULAS\21164 zno‘._—._
TIEMPO (DIAS)
N U N h N b
w.
e] 13-cis retina] estimuïó e] crecimiento de ias células que
crecïan adheridas a] suStrato de 1as pïacas de plástico de
cuitivo pero no iogró estimuïar el crecimiento de ias células
que crecïan en suspensión;
los efectos de] butirato de sodio fueron más dramáticos sobre
las céïulas que crecïan adheridas a1 Sustrato de ias piacas de
cultivo;resultó sumamente interesante e] efecto observado por 1a com
binación de ios dos moduladores ya que ei 13-cis retina] tuvo un
efecto protector sobre ias células, disminuyendo su sensibiiidada1 butirato de sodio.
145
D. Crecimiento gg l línea celular en suspensión
D.1. Obtenciónd_ la línea celular en suspensión
Las células MCF-7se sometieron a una centrifugación en gra
dientes de densidad. Las subpoblaciones aisladas se plaquearon en
presencia de suero durante 3 horas para permitir la adherencia a
las placas de cultivo y luego de aspirar el medio, se lavaron 2
veces con PBS y se agregó medio libre de suero. En estas con
diciones las subpoblaciones crecieron muy poco y sobrevivieron
durante 8-10 días. El agregado de 10'10-10'9 M estradiol aceleró
la muerte de las Subpoblaciones A, B, C, D y F al inducir una
rápida diferenciación de las células, con aparición de la misma
morfología provocada por tratamiento con DMSOo butirato de sodio.
En la Fig. 32 se observa la morfología que presentaron las células
de la Subpoblación B luego de 24 horas de tratamiento con 10'10 M
estradiol. La subpoblación B se muestra a modo de ejemplo de lo
que ocurrió también c0n las subpoblaciones A, C, D y F.
Con respecto a la subpoblación E, el agregado de 10'lo M
estradiol al día 10 indujo un nuevo fenómeno: esta hormona per
mitió la supervivencia de las células luego de 3 días de trata
miento (es decir, al día 13 después de haber sido plaqueadas) pero
con la aparición de un nuevo fenotipo debido a que las células se
desprendieron espontáneamente de la placa de cultivo, creciendo en
forma de agregados multicelulares en suspensión.
Este fenómeno no fue un hecho aislado sino que se reprodujo
en todas las oportunidades ensayadas (6 veces), siempre que las
subpoblaciones aisladas se cultivaran en el medio químicamente
definido e independientemente de que la población total hubiera
146
F19. gg: Morfología gue presenta lg subpoblación g g_ as cé1u1asMCF-7luego de] tratamiento con estradio] g DMSO.
Las células MCF-7se sometieron a una centrífugación engradientes de densidad para aisïar las subpob1aciones A a F.
La subpobïación B se muestra en esta figura como ejempïode 10 que ocurrió con e] resto de 1as subpoblaciones, a excepciónde 1a subpobïación E.
las no tratadas (controï).ulas tratadas durante 24 horas con 10"10 M estra
dio].III: Céïuïas_tratadas donante 72 horas con 0,5% DMSO.Las fotograflas se obtuv1eron con una camara Poïaroid (X
100).
167
crecido en presencia o ausencia de suero. Hasta e] momento, las
células 11evan más de 2 años creciendo en suspensión.
A partir de] momento en que las céïuïas adquirieron la capa
cidad de crecer en forma independiente de] anciaje, dejaron de
requerir estradiol para su crecimiento o supervivencia.
D.2. Anáïisis d las céiulas
0.2.1. Curvasg_ crecimiento celuïar
En 1a Fig. 33 se graficaron ias curvas de crecimiento para
ias céiuias en suspensión y para e] contro], cuitivado en presen
cia de suero. Se puede apreciar que ias céiulas en suspensión
tienen una mayor velocidad de crecimiento que e] control. En e]
inserto de 1a Fig. 33 se observan los agregados multiceiuiares
creciendo en suspensión.
0.2.2. Distribución gg las céiulas en gradientes de densidadCuando ias céiuias que crecen en suspensión se sometieron a
una centrifugación en gradientes de densidad de Percoi], se
observó que 1a población total estaba enriquecida en ias sub
pobiaciones A y B (juntas sumaron e] 86% de ias céïulas) a expen
sas de 1a disminución de 1as subpoblaciones D y F, cuya
contribución fue de] 4%. Por e] contrario, en presencia de Suero,
las subpoblaciones A y B c0nstituyeron e] 38% de] tota] mientras
que las subpobïaciones D y F aportaron e] 22%. Esta a1teraci6n en
1a distribución de 1as céiuïas en e] gradiente expïicarïa 1a mayor
velocidad de crecimiento observada en 1as céiuïas en suspensión
con respecto a las céiuias cuitivadas en presencia de suero. Por
148
Fig. gg: Curvas gg crecimiento g_ as cé1u1as MCF-7gg suspensiónl g_ presencia gg suero.
Las céluïas se sembraron a razón de 2,5.104 céluïas/pïacade cuïtivo de 35 mm. Las céluïas MCF-7 adheridas a1 sustrato secu1tivaron en medio Dulbecco/F-IZ/FBS (o). Las céluïas MEF-7 ensuspensión se cuïtivaron en medio Duïbecco/F-IZ (1:1) sin supïementar (A). Los resuïtados obtenidos corresponden a1 promedio de 2experimentos distintos, cada un uno de los cua1es se efectuó pordupïícado.
E1 inserto de 1a fi ura muestra 1as células MCF-7 creciendo como agregados muïtice uïares en suspensión. La fotografía
{ue tomada con una cámara Po1aroid asociada a] microscopio Wiïd (X
5x105
I
decelulas Ou Í
Inumero
4u6?
2xw4 A - - '
Tiempo (días)
169
la misma razón se expïicarïa la mayor veiocidad de crecimiento de
estas células con respecto a las que crecen en e] medio quimica
mente definido pero adheridas a1 sustrato de 1as pïacas de
plástico de cuitivo.
0.2.3. Crecimiento independiente de] ancïage
Obviamente, por su capacidad de crecer en suspensión, estas
céïuias dieron fácilmente coïonias en un medio semisólido de
cultivo como e] agar bIando. A] cabo de 7 dias de cuitivo en estas
condiciones, ias coïonias fueron grandes con más de
105 céluias/coionia mientras que ias céiuïas cuitivadas en e]
medio químicamente definido adheridas a ias placas de cuïtivo
generaron coïonias en agar biando con un tamaño promedio de 4.000
células/coïonia medido a1 séptimo dïa de cuitivo.
D.2.4. Contenido gg receptores estrogénicos
Se determinó e] contenido de receptores estrogénicos por e1
método inmunocitoquïmico.
A los 3 dïas de cultivo en e] medio quimicamente definido,
e] RE se detectó en e] 33% de ias céiuias. A1 dia 10, e] 80% de
las céiuïas dieron reacción positiva para e] RE; esto se correia
cionó con e] requerimiento de estradio] que manifestaron 1as
céïuïas. A1 dïa 13, cuando las céïuias ya crecïan en suspensión,
e] RE se detectó sólo en e] 10%de las células y coincidió con una
falta de requerimiento de estrógeno por parte de ias mismas. No
sólo se modificó e] porcentaje de céiuias RE-positivas sino tam
bién 1a intensidad de 1a tinción. A1 dïa 3, e] 19% de] tota] de
150
las células RE-positivas dieron una tinción intensa; al dïa 10, el
porcentaje ascendió al 30%mientras que al dïa 13 disminuyó al 8%.
D.2.5. Respuesta a factores gg crecimientoSe ensayó el efecto de diversos factOres de crecimiento
sobre estas células. Ninguno de ellos (PDGF, EGF, trombina, trans
ferrina e insulina) logró modificar la velocidad de crecimiento de
estas células, que demostraron tener un crecimiento autócrino.
Incluso se ha logrado cultivar las células en un medio
Dulbecco/F-IZ (1:1) sin el aporte de albümina, insulina y estradiol.
0.2.6. Efecto de moduladoresde la diferenciación celularD.2.6.1. Efecto del 13-cis retinal
Tal como puede apreciarse en la Fig. 31€, el 13-cis reti
nal no logró estimular el crecimiento de estas células.
0.2.6.2. Efecto del butirato de sodioEn base a los resultados obtenidos y presentados en la
Fig. 31C, se deduce que las células en suspensión resultaron ser
más resistentes a la inhibición del crecimiento inducida por elbutirato de sodio.
151
DISCUSION
1. Heterogeneidad celular
La linea celular MCF-7utilizada en este trabajo no ha sido
previamente clonada y conserva las caracteristicas que fueron
descriptas en el momento de Su obtención por Scule y col. en 1973.
Varios investigadores han descripto su heterogeneidad celular
(Yang y col, 1977; Barkley Butler y col., 1986) pero la han atri
buido a la coexistencia de distintas sublïneas, cada una de las
cuales presenta diferentes propiedades. La pregunta crucial era
dilucidar si cada una de las subpoblaciones obtenidas luego de
someter la linea celular a una centrifugación en gradientes de
densidad correspondía a distintos clones o sublineas o bien si
todas ellas se originaban a partir de una misma subpoblación de
células “stem” y por lo tanto correspondïan a distintos estadios
de diferenciación. Este trabajo apoya la segunda hipótesis dado
que:
- cuando las subpoblaciones se cultivan en forma aislada, dan ori
gen a otras subpoblaciones, a excepción de la subpoblación F que
queda como tal;
- las subpoblaciones con mayor capacidad proliferativa originan
subpoblaciones con menor velocidad de crecimiento. Este
resultado es justamente el opuesto al que se podria esperar si
coexistieran 2 subpoblaciones no relacionadas con distinta capa
cidad proliferativa.
La subpoblación E cumple con los requisitos indispensables para
ser considerada una subpoblación enriquecida en células “stem”:
152
- contribuye con un pequeño pero constante porcentaje (5,810,2)%a la pobiación tota];
- es 1a.}ubpob1ación de mayor capacidad proliferativa, determinadapor ias curvas de crecimiento celuïar y 1a capacidad de sintesis
de ADN;
- es 1a subpobïación con mayor eficiencia cionogénica en agar
blando;
tiene 1a capacidad de autorenovarse y de originar a 1as demás
subpoblaciones sin que ninguna de e11as pueda generaria.
E1 hecho de que posea la misma composición genética y los
mismos marcadores cromosomaies que 1a linea ce1u1ar parentai con
firma que su distinta capacidad proliferativa se debe a su con
tenido de céïulas "stem" y descarta la posibiiidad de que
corresponda a un cion de mayor veiocidad de crecimiento obtenido
en forma aisiada.
Por otro iado, cabe agregar que si bien ias iïneas ce1u1ares
tumoraies tienen cierta tendencia a sufrir variaciones genéticas
espontáneas en cuitivo, los resuitados citogenéticos obtenidos
para 1a iinea ceiuiar MCF-7de nuestro iaboratorio coinciden con
los descriptos por Souie y co]. (1973) y Nhang-Peng y co]. (1983).
Las subpoblaciones A, B, C y D Unencionadas en orden decre
ciente de capacidad proiiferativa) constituyen 1as céiuias tran
sicionaies, dentro de 1a jerarquïa ce1u1ar propuesta por Buick y
Poiiak en 1984.
La subpobiación F contiene las células más diferenciadas dado
que 1a misma no aicanza a dupiicar su nümero de céiuias a1 cabo de
8 dias de cuitivo; tiene bajo indice de marcación con timidina
153
tritiada; es incapaz de generar otras Subpoblaciones; corresponde
a la subpoblación de mayor densidad (1,070-1,080 gr/ml) y es la
que presenta mayor producción de lïpidos, teñidos con el colorante
oil red 0. Estas caracteristicas descriptas para la Subpoblación F
coinciden con las observadas por Mackillop y Buick (1981) en
células diferenciadas de carcinoma de ovario humano. Estos autores
caracterizaron a las células diferenciadas por su baja incor
poración de timidina tritiada, por ser células densas y por su
contenido de lípidos, revelados comogotas de color rojo brillante
en el citoplasma de células teñidas con oil red 0. Asimismo, estas
células son incapaces de generar colonias en medio semisólido.
La expresión de marcadores tan diversos como la proteina p21
codificada por el gen ras, receptores estrogénicos y el antïgeno
carcinoembrionario no permite establecer una relación precisa
entre la expresión de los mismos y el estadio de diferenciación.
La proteïna p21 se expresa principalmente en la subpoblación C,
siendo menor su expresión en la subpoblación E que corresponde a
la de mayor capacidad proliferativa. Por lo tanto, estos resulta
dos contradicen la hipótesis formulada por el grupo de investiga
ción liderado por Schlom (Horan-Hand y col., 1984; Thor y col.,
1984; Viola y col., 1985 y 1986) acerca de la correlación
existente entre altos niveles de expresión de esta proteina y alta
capacidad proliferativa. Más recientemente, Garin Chesa y col.
(1987) demostraron en tumores humanos que la expresión de la pro
teïna p21 se correlaciona con la diferenciación celular y no con
la capacidad proliferativa. Estos autores analizaron tumores con
teniendo células en distintos estadios de diferenciación y
154
encontraron que las células más diferenciadas correspondían a las
de reacción inmunocitoquïmica más intensa. Correlacionaron estas
observaciones con las anteriormente descriptas por Cotton y Brugge
(1983) y Brugge y col. (1985) para la expresión de una proteina
codificada por otro oncogen; en este caso, los mayores niveles de
expresión de la proteina pp60 codificada por el gen src se detec
taron en las células diferenciadas.
Clair y col. (1987) demostraron en tumores humanos hor
monodependientes la existencia de una correlación entre mayores
niveles de expresión de receptores estrogénicos y mayor expresión
de la proteina p21. Los resultados presentados en este trabajo
coinciden con dichas observaciones por cuanto la subpoblación C es
la que presenta mayor contenido de receptores estrogénicos y mayor
expresión de la proteina p21.
De Bortoli y col. (1985) y Ohuchi y col. (1986) demostraron en
carcinomas de mama humanos una expresión aumentada de la proteina
p21, con localización citoplasmática. Correlacionaron la mayor
expresión de este marcador con propiedades biológicas, tales como
la capacidad invasiva y el crecimiento in vivo". Al respecto,
podria mencionar que resultados preliminares indican que la Sub
población C, con mayor expresión de la proteina p21, seria la de
mayor tumorigenicidad en ratones atïmicos. Dicho estudio se
efectüa en presencia de aporte estrogénico y coincidentemente,
dicha subpoblación es la de mayor respuesta al estimulo hormonal.
La subpoblación E, enriquecida en células “stem” y la de mayor
crecimiento independiente del anclaje, curiosamente no reSultó la
más tumorigénica en estos ensayos preliminares. Estas obser
155
vaciones probablemente puedan explicarse a partir del trabajo de
Nicolson y col. (1988) en el cual los autores demuestran que la
eficiencia clonogénica en agar blando es un parámetro que no
correlaciona con la tumorigenicidad "in vivo". Por otro lado, el
ensayo en los ratones atïmicos requiere del aporte hormonal y como
se mencionó anteriormente, la subpoblación E es la de menor con
tenido de receptores estrogénicos y responde a dicho estimulo “in
vitro" sólo en condiciones muy particulares (c0mo se explica más
adelante, en la sección 3.3).
Con respecto al contenido de receptores estrogénicos en las
distintas subpoblaciones, en el presente trabajo se observa una
mayor expresión de este marcador en las subpoblaciones C y F.
Podhajcer y col. describieron en 1986 que el contenido de recep
tores estrogénicos en tumores primarios de mamahumanos se debia a
la expresión de este marcador exclusivamente en las células más
diferenciadas. Sin embargo, SUS resultados contradicen a los de
Huseby y col. (1984) y Osborne y col. (1984) por cuanto descartan
la expresión de receptores estrogénicos en células proliferativas,
oponiéndose al efecto directo de los estrógenos sobre la proli
feración celular en lineas celulares tumorales humanas RE-positivas. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio coinciden con
los de Podhajcer y col. (1986) en cuanto a la expresión en las
células más diferenciadas (en nuestro caso, la subpoblación F)
pero también coinciden con los trabajos de Huseby y col. (1984) y
Osborne y col. (1984) en cuanto al contenido de receptores
estrogénicos en células proliferativas (como son las células de la
subpoblación C). La discrepancia observada en los distintos traba
156
jos probabiemente se deba a que las Iïneas ce1u1ares tumoraïes
humanas no representen fielmente 10 que sucede en los tumores "in
vivo".
Los cambios tan drásticos que se manifiestan en e] indice de
marcación con timidina ("TLI") cuando ias subpobiaciones se culti
van en forma aisiada sugieren que cuando están juntas, en 1a
pobiación tota] de céiuias MCP-7, interactúan entre si. Dichas
interacciones enmascaran e] rea] comportamiento que presenta cada
subpoblación por separado. Cuando se originan todas 1as sub
pobiaciones a partir de ias céiuias “stem”, se reestabiecen 1as
interacciones entre las distintas subpobiaciones y se pierden 1as
caracteristicas de cada una de eiïas, comportándose como1a iïnea
ceiuiar parenta]. Esto se manifiesta a partir del dia 14 de
cuitivo de 1a subpoblación E (Fig. 2). Los resuitados presentados
en dicha figura sugieren un proceso de diferenciación unidirec
ciona] en las céiulas MCF-7, siguiendo este orden: E-+ A-+ B-á C
—>D-+ F. La tinción de iïpidos con oi] red 0 reSuItó un método
va1ioso para e] seguimiento de este proceso. A las 24 horas de
cuitivo de 1a subpoblación E, no se detectaron iïpidos pero en
cambio se observó aproximadamente un 8% de nücieos mitóticos por
campo anaiizado (Fig. 6b). Cuando 1a tinción se repitió a1 cabo de
14 dïas de cultivo, 1a coioración fue intensa y correiacionó con
la aparición de 1as Subpobiaciones diferenciadas (Figs. 2 y 6 c).
E1 estudio de ias interacciones entre 1as distintas sub
pobiaciones aportó información sumamente interesante. Comocabia
esperar por Su condición de célula "stem", e] aporte de 1a sub
pobiación E resultó imprescindible para e] óptimo crecimiento de
157
1as céiulas MCF-7. En ausencia de dicha subpobiación, e] creci
miento observado a los 6 dïas fue de apenas ei 20% de] contro]
pero se recuperó a1 agregar e] medio condicionado por 1as céiulas
"stem" (Fig. 10). Dicho medio condicionado, ensayado a una con
centración fina] del 50%, fue capaz de tripiicar e] crecimiento de
1a subpoblación F. Más impactante aün fue su efecto sobre ei cre
cimiento en agar b1ando dado que a una c0ncentraci6n fina] de]
25%, logró que las células de 1a subpoblación F generaran coionias
con una eficiencia de] 1%(Fig. 13 II). Este efecto podria deberse
a] contenido de TGF-0< en e] medio condicionado dado que mimetiza
e] efecto inducido por ei EGFen estas céiulas. Actuaimente, en e]
1aboratorio se está trabajando en 1a purificación de TGF-R a par
tir de] medio condicionado de 1as céiulas "stem". Por ei
contrario, e] medio condicionado por 1a subpobiación F probable
mente contenga TGF-fi dado que tiene efecto inhibitorio sobre el
crecimiento de 1a subpoblación E (Fig. 11) pero no afecta su efi
ciencia cionogénica en agar blando. Estos resuitados e hipótesis
concuerdan con Ios trabajos de Saiomon y coi. (1984) y Knabbe y
col. (1987) por ios cuaies demuestran 1a presencia de TGF- Ü en e]medio condicionado de ias céiuias MCF-7. Estos autores indican
además que 1a 1ïnea ce1u1ar MCF-7 es heterogénea, ta] como se
demuestra en e] presente trabajo, y postuian que dicha heteroge
neidad se manifestarïa también en 1a distinta producción de TGF-nX
o G) por parte de ias céiuias.Por otra parte, 1a diferente producción de estos factores por
parte de ias células de 1as subpoblaciones E y F explicaría su
distinta capacidad de generar coionias en un medio semisóiido. Por
158
lo tanto, 1a a1ta eficiencia cionogénica que presenta 1a sub
pobiación E se expiicarïa por 1a presunta existencia de TGF-d-en
Su medio condicionado; dicho factor actuarïa como moduiador posi
tivo de] crecimiento autócrino. Asimismo, la incapacidad de ias
céluias de 1a subpobiación F para crecer en forma independiente
dei anciaje coreïacionarïa con 1a producción de TGF-fi por partede estas céiuias. La mayor contribución de ias céluias F con
respecto a ias céiulas "stem" en 1a población tota] cuitivada en
presencia de suero explicaría 1a bajïsima eficiencia cionogénica
de 1as células MCP-7, debido a que predominarïa e] efecto inhibi
torio sobre e] crecimiento ejercido por e] TGF-é . Knabbe y col.
(1987) postuiaron que dicho factor actuarïa como moduiador nega
tivo de] crecimiento autócrino y paracrino de ias céluias MCF-7.
2. Crecimientode las céluias en el mediolibre de suero
2.1. Requerimientogg factores de crecimientoUna vez considerada 1a va1idez de] modeio de ias céiuias
MCF-7y sus subpoblaciones aisladas, 1a siguiente pregunta que
debia ser contestada era averiguar qué factores de crecimiento
estaban verdaderamente invoiucrados en 1a reguiación de 1a proii
feración de estas células de tumor de mama humano.
Barnes y Sato describieron en 1979 un medio 1ibre de suero
para e] crecimiento de ias céiulas MCF-7 que inciufa además de
nutrientes e insu1ina, otros factores de crecimiento como EGF,
transferrina y Pngq . En e] presente trabajo, se describen 1as
modificaciones fenotïpicas que experimentan 1as céiuias MCP-7
cuando se cuitivan en un medio químicamente definido, con e]
159
aporte de insulina comoünico factor regulatorio. La morfología de
las células cultivadas en ete medio minimo de cultivo es muy seme
jante a la que presentaban las células descriptas por Barnes y
Sato en 1979. Sin embargo, ciertas deficiencias se hacen evidentes
cuando se siembran las células a baja densidad. Los factores de
adhesión provistos por el suero fetal bovino serian una de las
deficiencias criticas del medio quimicamente definido empleado.
Las células MCP-7 se adhirieron al Sustrato de las placas de
cultivo previamente tratadas con colágeno pero Su crecimiento fue
más lento que el observado al sembrar las células en presencia de
suero durante 4 horas antes de transferirlas al medio químicamente
definido. Al respecto, Karey y Sirbasku (1988) c0mentan que si
luego de plaquear las células en presencia de suero, se hacen
lavados con buffers de pH neutro no se consigue eliminar el efecto
residual del suero en cuanto a su aporte de hormonas y factores de
crecimiento. Para lograr que las células pierdan la "memoria" del
suero, se requieren lavados con buffers de pH ácido. Esta obser
vación explicaría la menor velocidad de crecimiento observada al
sembrar las células sobre placas recubiertas con colágeno y pro
bablemente se deba a que las células requieran otras glicopro
teïnas involucradas en la adhesión celular y que serian
normalmente provistas por el suero. En ausencia de suero, las
células deberian sintetizar dichos factores, retardando asï suvelocidad de crecimiento.
El uso del medio libre de suero permite analizar los requeri
mientos de factores de crecimiento y el rol que cumplen los mismos
en esta lïnea celular. Las células MCF-7no experimentan requeri
160
miento alguno de transferrina, considerada un nutriente esencia]
para 1a mayoria de las céiulas. Esta falta de requerimiento pro
bablemente se deba a que ias céiuias sinteticen y Iiberen a1 medio
de cuitivo un factor con actividad de sideroforo, ta] c0modescri
bieron Kitada y Hays (1985) en 2 iïneas ceiuiares que no mani
fiestan requerimiento de transferrina. Por otro iado, Lee y co].
(1987) describieron que 1a transferrina es una proteina mayori
taria de 1a Ieche de ratón, siendo producida por céluïas epite
iiaies de mama. Sin embargo, no se detectó producción de ARNmde
transferrina en las céiuias MCF-7(Zakin y Medrano, resuitados no
pubiicados).Con respecto a1 requerimiento de factores de crecimiento,
varios grupos de investigación (Osborne y co]., 1981; Imagawa y
c01., 1982; Imai y c01., 1982) describieron que EGF ejerce un
efecto estimuiatorio de] crecimiento en las céluïas MCF-7. En
nuestro caso, este efecto se manifiesta sólo cuando ias céluias se
siembran a baja densidad (Tabla V). La faita de requerimiento de
EGFcuando ias céiulas se encuentran a alta densidad ceiuiar pro
babiemente se correïacione con 1a capacidad que presentan estas
células para producir TGF-tx o EGF, tai como fue descripto por
Saiomon y coi. (1984) y Mori y col. (1986).
A baja densidad, las céluïas también requieren tr0mbina para
su óptimo crecimiento. Dicho requerimiento desaparece cuando Ios
cu1tivos aicanzan una aita densidad celular y probabiemente se
deba a que ias céiuias liberen inhibidores de proteasas a1 medio
de cultivo, ta] como fue descripto por Gendier y co]. (1982) y
Morisett y co]. (1986).
161
Zetter y col. (1977) y Gospodarowicz y col. (1978) observaron
que trombina tiene la capacidad general de potenciar el efecto de
otros factores de crecimiento. En este trabajo, se observó que
trombina potencia el efecto de EGF sólo cuando las células se
encuentran a baja densidad. Uno de los mecanismos posibles para
explicar la potenciación del efecto postula que trombina induce
modificaciones a nivel de membrana celular, aumentando la sen
sibilidad de las células al efecto de otros factores de creci
miento. Blumberg y Robbins (1975) y Baker y col. (1979)
demostraron que trombina induce modificaciones en proteinas de
membrana y Su acción a nivel de membrana es suficiente para esti
mular la sintesis de ADNy el crecimiento celular (Carney y
Cunningham, 1978a). Dichos efectos consisten en una mayor exposi
ción de receptores presentes en la membranacelular especificos
para otros factores de crecimiento.
El otro mecanismo de potenciación propuesto se basa en que
trombina aumentaría la vida media del complejo factor de
crecimiento-receptor, disminuyendo la endocitosis mediada por
receptor (Goldstein, 1979) o la degradación intracelular de fac
tores de crecimiento tales como insulina y EGF.
Por otro lado, Medrano y col. (1987) observaron que tr0mbina
puede reemplazar casi completamente al EGF en otra linea celular
de tumor de mama humano, T-47D. Sin embargo, la relación entre
estos dos factores de crecimiento no se daria a nivel de membrana
dado que para cada uno de ellos existen receptores especificos y
por ende, estos factores de crecimiento no se unirïan al mismo
receptor (Carney y Cunningham, 1978b). En consecuencia, es posible
162
que estimuien un segundo mensajero en comün que conduzca a 1a
síntesis de ADN.
E1 agregado de trombina a ias céluïas MCF-7 resuita en una
rápida estimuiación de 1a proteïnaquinasa C, aunque su efecto es
menor que e] inducido por insu1ina (Gómez y c01., 1988).
En fibrobiastos de hamster chino IIC 9, trombina estimuia 1a
iiberación de ácido araquidónico y 1a sintesis de fos
fatidiiinositoi (Raben y co]., 1987). L'Aliemain y co].
demostraron en 1986 que trombina induce formación de inositoi fos
fato en fibrobiastos de pulmón de hamster. Carney y co]. (1985)
habian descripto, anteriormente, que trombina estimuiaba 1a incor
poración de 32Pi a fosfatidi] inosit01-4-fosfato en fibrobiastosde hamster.
Determinados los requerimientos de factores de crecimiento en
1a iïnea ceiuiar MCF-7, e] paso siguiente consistió en ana1izar
ios requerimientos manifestados por cada Subpobiación en particuiar.
En ausencia de insuiina, ias subpob1aciones más diferenciadas
(D y F) detuvieron su crecimiento y entraron en un estado de
quiescencia. Las subpoblaciones A, B y E, por e] contrario, con
tinuaron proiiferando probabïemente debido a que estas céiulas
produzcan aïgün factor semejante a 1a insu1ina. En este sentido,
Huff y co]. (1986 y 1987) describieron 1a producción de factores
que pueden reemplazar a 1a insuïina en céiuias MCF-7.
En cuanto a 1a subpobiación C, estas células manifiestan e]
requerimiento de insuiina sólo cuando se encuentran a baja
densidad; e] mismo desaparece cuando 105 cu1tivos superan una den
163
sidad de 5 x 104 células/placa de cultivo de 35 mm.
El agregado de 10 ug/ml de insulina, que es la concentración
empleada para mantener los cultivos madres de células MCF-7, esti
muló dramáticamente la incorporación de timidina tritiada en las
subpoblaciones D y F quiescentes. Rechler y col. (1980)
demostraron que a estas concentraciones, insulina ejerce su efecto
mitogénico a través de la unión a los receptores de IGF-I.
Trombina indujo un notable incremento en la incorporación de
timidina tritiada en las subpoblaciones más diferenciadas (D y F)
cuando se encontraban en estado de quiescencia. Cuando las células
estaban en activa proliferación, trombina estimuló el crecimiento
de ambas subpoblaciones, siendo mayor su efecto en ausencia de
insulina. Sin embargo, el efecto sobre la subpoblación F fue limi
tado dado que se detuvo al cabo de 2 duplicaciones. Sobre la sub
población D, por el contrario, trombina indujo la supervivencia de
las células en el medio químicamente definido durante más de 2
meses, demorandola diferenciación celular. Este efecto es notable
dado que en ausencia de trombina, las células no sobrevivieron más
de 8-10 dias.
La prostaglandina qufestimuló la sintesis de ADNde las sub
poblaciones C y D quiescentes y en cultivo. No ejerció efecto
alguno sobre las células de la subpoblación B quiescentes; sin
embargo, tuvo un efecto inhibitorio del crecimiento cuando las
células de la Subpoblación B se encontraban en activa prolifera
ción (Fig. 8).
El tratamiento de las células de la subpoblación C con
Pngo/ permitió la supervivencia de las mismas en el medio libre\
164
de suero durante más de 2 meses. Ta] como se describió anterior
mente para 1a subpobïación D tratada con trombina, en este caso
también e] factor de crecimiento detuvo 1a diferenciación celuïar.
Las células controïes no tratadas no pudieron sobrevivir en esas
condiciones por más de 10 dïas.
Varios grupos de investigación (Macphee y c01., 1984; Davis y
c01., 1987) demostraron que 1a Pngq actüa estimuïando e] metabo
lismo de fosfoinosïtidos. Sin embargo, aunque trombina y
PgF2L<actüen a través de] mismo segundo mensajero, 1a reguiación
debe ser distinta en las subpobïaciones C, D y F dado que 1a Sub
pobiación F sólo es sensibie a trombina; la Subpoblación C sóïo
responde a PgFZLKmientras que 1a subpoblación D es estimuiada por
ambos factores. En este trabajo no se ha estudiado e] metaboiismo
de fosfoinosïtidos ni se ha identificado e] mecanismo de acción de
estos mitógenos como para poder di1ucidar por qué aigunas sub
poblaciones ce1u1ares manifiestan e] requerimiento de un deter
minado factor de crecimiento mientras que otras prescinden de]
aporte exógeno de] mismo factor.
Las subpobiaciones celuiares también resuitaron heterogéneas
en cuanto a1 requerimiento de PDGFy EGF. Las subpobiaciones A y E
no manifestaron requerimiento aiguno de factores de crecimiento.
La subpobïación B respondió a] EGF sólo cuando se Cuitivaba en
ausencia de insulina. La subpobiación C respondió a 1a combinación
de PDGF/EGPcuando se encontraba en estado de quiescencia y 5610
durante 24 horas en activa proliferación.
Las subpoblaciones D y F respondieron a1 efecto de EGF, d
cua] se potenció en combinación con PDGFtanto sobre las cé1u1as
165
quiescentes comoen activa proliferación.
La falta de requerimiento de EGF por parte de las Sub
poblaciones A y E probablemente se correlacione con la producción
endógena de TGF-t(. Los resultados presentados-permiten establecer
una correlación entre diferenciación y mayor requerimiento de fac
tores de crecimiento aportados al medio de cultivo. Las células
con mayor capacidad proliferativa, por el contrario, son las que
presentan un crecimiento autócrino.
2.2. Ultraestructura gg las célulasPor microscopía electrónica se observa que las células culti
vadas en el medio libre de suero, con el aporte de insulina como
ünico factor regulatorio, presentan una ultraestructura tïpica de
célula secretora caracterizada por un aparato de Golgi muy grande
y distendido y por la presencia de vesiculas con cubierta en la
membrana plasmática. Franke y col. (1976) describieron a estas
vesïculas como vehïCUlos para la eliminación de lactosa, iones
inorgánicos y agua en células de epitelio mamario de rata. Estas
vesículas también se relacionan con el transporte selectivo de
proteïnas solubles y de membranay con la endocitosis mediada por
receptor.La morfología secretoria de las células cultivadas en ausen
cia de suero se correlaciona con una mayor liberación de productos
de naturaleza proteica al medio de cultivo y con la aparición de
una proteina de 56 kDa (Fig. 19). Asimismo, este hecho podria
explicar también un menor requerimiento de factores de crecimiento
y una mayor capacidad de originar colonias en agar blando que pre
166
sentan estas céiulas en reiación a ias cultivadas en presencia de
suero. En este sentido, este trabajo concuerda con los de otros
autores (Chaibos y co]., 1982; Zwiebe] y c01., 1982; Ikeda y
c01., 1984; Saiomon y c01., 1984; Hiragun y co]., 1985; Mori y
c01., 1986) acerca de que varias proteinas contribuirïan a1 cre
cimiento autócrino de 1as células de tumor de mama.
Los geles bidimensionaies de ias proteinas intraceiuiares
reveian cambios cuaiitativos pero queda por establecer e] origen
subceiular de esas proteinas.
El análisis de ias citoqueratinas por 1a técnica de “Western
blot“ demuestra que ias citoqueratinas son idénticas en ambas con
diciones de cuitivo aün cuando 1a distribución topoiógica sea
diferente. Lo mismo ocurre con 1a expresión de] CEA: es difusa en
1as céluias cuitivadas en presencia de suero mientras que se pre
senta como un aniilo perinuciear en ias céiuïas cuitivadas en e]
medio químicamente definido (Fig. 22). Resta diiucidar si existe
alguna reiación entre 1a expresión dei CEAy 1a estructura de]
Golgi en ambas condiciones de cultivo.
La mayor actividad secretoria de 1as céluias cuitivadas en e]
medio Iibre de suero no correiaciona con 1a expresión de un feno
tipo más diferenciado por parte de 1as céïuias, dado que las
células cuitivadas en e] medio quïmicamente definido están enri
quecidas en las subpobiaciones con menor grado de diferenciación y
mayor veiocidad de crecimiento (Tabia IX). Más aün, el medio con
dicionado de Ias céiuias cuitivadas en presencia de Suero es e]
que induce diferenciación de ias céiuias CHEF/18mientras que no
se Iogra ese efecto cuando se agrega e] medio condicionado de ias
167
células cultivadas en ausencia de suero. Por otro lado, las
células cultivadas en presencia de suero presentan una intensa
reacción inmunocitoquimica para la proteina p21, siendo menor la
positividad de la reacción cuando las células se cultivan en el
medio químicamente definido (Fig. 23). Tal como se comentó
anteriormente, haciendo referencia a los trabajos de Garin Chesa y
col. (1987), existe correlación entre la expresión de este mar
cador y el grado de diferenciación.
Katzenellenbogen y col. (1987) describieron un incremento de
3 veces en el contenido de receptores estrogénicos en células
MCF-7 cultivadas durante perïodos prolongados en ausencia de
estrógenos. Sin embargo, el medio quimicamente definido empleado
en este trabajo contiene rojo fenol que ejerce efecto estrogénico,
segün fue descripto por Berthois y col. (1986).
De los resultados obtenidos puede concluirse que el suero es
una mezcla compleja de sustancias entre las cuales se cuentan hor
monas, factores estimulatorios e inhibitorios del crecimiento que
pueden atenuar el metabolismo de las células MCF-7y/o el efecto
que ejerce la insulina sobre esta linea celular.
Estos resultados coinciden con los de Hammondy col. (1984)
acerca del efecto inhibitorio que ejerce el suero sobre las
células epiteliales de mamahumana. El suero enmascararïa el feno
tipo agresivo de las células MCP-7.En ese sentido resulta intere
sante comentar los resultados presentados en la Tabla VIII donde
se observa la alta eficiencia clonogénica que presentan las célu
las cultivadas durante más de 20 dias en el medio químicamente
definido.
168
El requerimiento hormonal que presentan las células al 10°
dïa de cultivo en el medio libre de suero coincide con el incre
mento transiente en la expresión de receptores estrogénicos. El
agregado de estradiol incrementa en un 80% la eficiencia clo
nogénica de estas células. Cabe mencionar que Stampfer y col.
describieron en 1980 un medio de cultivo para epitelio de mama
normal, en el cual la reducción de 10% a 1% de suero permitia una
mayor proliferación.
3. Moduladoresgg la diferenciación celular
3.1. Efectos de l3-cis retinal
Los resultados presentados en la Fig. 24 demuestran que el
13-cis retinal estimula la proliferación de las células MCF-7
independientemente del medio de cultivo empleado, obteniéndose
resultados similares tanto en presencia comoen ausencia de suero.
Estos resultados no se restringen a esta linea celular sino que se
reprodujeron en las células T-47D de origen metastásico (obtenida
por Keydar y col. en 1979) y en la linea celular Hs-578T derivada
de un carcinosarcoma mamario (obtenida por Hackett y col., 1977).
En este trabajo se describe un efecto novedoso del 13-cis
retinal: la acumulación de proteinas nucleares en las células
crónicamente tratadas. Dicho efecto podria deberse a un incremento
en la sintesis y/o transporte de proteinas nucleares o a una mayor
estabilidad de estas proteinas. En este sentido, el efecto del
13-cis retinal se asemeja a la estimulación de proteinas intra
nucleares inducida por el PDGFsobre fibroblastos 3T3 quiescen
tes, tal como fue descripto por Kellermayer y col. (1984). Por
169
otro lado, el 13-cis retinal ejerce un efecto transiente y opuesto
sobre las proteinas de la fracción soluble y las proteinas libera
das al medio de cultivo. Estas variaciones podrian relacionarse
con la distinta capacidad que tienen las células crónicamente tra
tadas con retinal para dar origen a macrocolonias en agar blando.
Luego de 4 meses de tratamiento, el tamaño de las colonias en agar
disminuye con respecto al tamaño que presentan las macrocolonias a
los 60 dïas de tratamiento. Este hecho probablemente refleje
variaciones en la concentración y calidad de las proteínas liberadas al medio de cultivo.
La estimulación del crecimiento observada como consecuencia
del tratamiento de las células con 13-cis retinal se debe a un
enriquecimiento en subpoblaciones con menor grado de diferen
ciación y mayor capacidad proliferatia, a expensas de la disminu
ción en la contribución de las subpoblaciones más diferenciadas (D
y F). Estos efectos se acentúan a medida que transcurre el trata
miento (Tabla XII).
Los resultados presentados en la Fig. 27 demuestran que el
13-cis retinal actüa comomodulador negativo de la diferenciación,
retardando la generación de subpoblaciones diferenciadas a partir
de las que presentan mayor capacidad proliferativa (E, A y B). A
pesar de los trabajos publicados acerca de los efectos de los
derivados de la Vitamina A sobre la diferenciación, los resultados
obtenidos en nuestro laboratorio demuestran que deben efectuarse
ensayos bioquïmicos y celulares, incluyendo tratamientos prolonga
dos, antes de poder considerar a los c0mpuestos retinoideos como
agentes en la prevención del cáncer. Al respecto cabe agregar que
170
el uso de estos derivados de la Vitamina A en el tratamiento de
pacientes con tumores avanzados no ha resultado auspicioso, tal
como comentan Goodman y col., 1982; Kerr y col., 1982 y Clamon y
col., 1985.
3.2. Efecto de agentes inductores de la diferenciación: DMSOl
butirato gg sodioEstos agentes inhiben el crecimiento de las células MCF-7,
induciendo cambios morfológicos irreversibles en las células, las
cuales adquieren un aspecto más pequeño y oscuro. “Disparan” la
diferenciación terminal de forma tal que las células dejan de
dividirse y en caso de ser tripsinizadas, pierden la capacidad de
adherirse al plástico de las placas de cultivo. Su efecto inductor
de la diferenciación se manifiesta porque incrementan la c0ntribu
ción de subpoblaciones más diferenciadas (D y F) a expensas de la
disminución en el aporte de las subpoblaciones A y B. Dado que la
población de células “stem” no se ve afectada por este trata
miento, cuando se remueven estos compuestos se recupera en parte
el crecimiento. La inducción de la diferenciación va ac0mpañada de
un mayor contenido de lïpidos, teñidos con el colorante oil red 0.
Estos resultados coinciden con los descriptos por Abe y Kufe
(1984a y b; 1986) para la misma linea celular y con los resultados
presentados por Grahamy Buick (1988) en otras lineas celulares de
tumores de mama humanos. Estos autores, además, describen la
expresión de marcadores de diferenciación relacionados con el
glóbulo de grasa de la leche, como el antïgeno DF3, luego del tra
tamiento de las células con butirato de sodio.
171
Varios son Ios efectos que induce e] butirato de sodio a
nive] de] ADN.Giancotti y col. (1988) describieron que el trata
miento de fibrobiastos con butirato de sodio resuita en una inhi
bición de ias deacetiiasas con aparición de histonas hiperacetiia
das que resuitan más sensibies a la acción de 1a DNAsaI.
De Haan y coi. (1986) describieron que ei tratamiento de
fibrobiastos de puimón humano NI-38 con este agente inductor de
1a diferenciación induce hipermetiiación de] ADN.El sitio ciave
("hot spot“) de metiiación de] ADNse encuentra en e] cromosoma
11. Utilizando una sonda de calcitonina, que mapea en dicho cromo
soma, de Brestos y coi. (1988) detectaron cambios en ios niveles
de metilación de] ADNcomo consecuencia de] tratamiento de ias
céiuias con butirato de sodio. En este momento, en nuestro iabora
torio se están efectuando los mismos experimentos con ei fin de
diiucidar si este mecanismo de acción de] butirato de sodio tam
bién ocurre en las céiuias MCF-7.
El tratamiento combinado de butirato de sodio con 13-cis
retina] resultó particuiarmente interesante dado que el derivado
de 1a Vitamina A ejerció un efecto protector sobre ias céiuias,
disminuyendo su sensibiiidad a1 butirato de sodio. Bryant y co].
(1986) describieron que e] butirato de sodio interferïa con ios
fenómenos de adhesión ceiuiar por reducción en ei nümero de recep
tores de 1aminina.
Kato y De Luca (1987) demostraron que ios derivados de 1a
Vitamina A incrementan la adhesión ceiuiar de fibrobiastos NIH
3T3, favoreciendo 1a sintesis de ias glicoproteïnas invoiucradas
en 1a interacción con 1a matriz extracelular. Estos autores obser
172
van un incremento en la adhesión celular mediada por laminina y
colágeno de tipo IV. Considerando que las células MCP-7requieren
laminina para su adhesión e interacción con la matriz extracelu
lar, puede pensarse que el efecto protector del 13-cis retinal
probablemente se deba a que neutraliza los efectos del butirato de
sodio a ese nivel. Por otro lado, los efectos inhibitorios del
crecimiento inducidos por el butirato de sodio son más dramáticos
sobre las células que crecen adheridas a las placas de plástico de
cultivo que sobre las células que crecen comoagregados multicelu
lares en suspensión (Fig. 31 a, b y c). En consecuencia, es fac
tible que su acción a nivel de los receptores de laminina sea
importante para desencadenar la inhibición del crecimiento.
Abe y Kufe (1986) demostraron que el ácido retinoico dismi
nuye la expresión de antïgeno DF3 en células diferenciadas por
efecto del butirato de sodio. Estos experimentos conjuntamente con
los resultados presentados en este trabajo permiten concluir que
mientras agentes como el DMSOo el butirato de sodio son induc
tores de la diferenciación, los derivados de la Vitamina A no
pueden considerarse agentes protectores contra el cáncer en estas
células dado que todos sus efectos están dirigidos a pr0mover la
proliferación y neutralizar la diferenciación celular.
3.3. Efectos del estradiol
A una dosis de 10'10 M, el estradiol indujo un rápido efecto
inductor de la diferenciación en las subpoblaciones A, B, C, D y F
cultivadas durante 10 dias en el medio químicamente definido.
Cuando se ensayó el efecto de esta hormona sobre las sub
173
poblaciones quiescentes, sólo las células de las subpoblaciones C
y F, con mayor contenido de receptores estrogénicos, respondieron
al estimulo estrogénico. Pero si bien estas 2 subpoblaciones celu
lares fueron las ünicas sensibles al efecto del estradiol, la
regulación hormonal ocurrirïa por distintos mecanismos en cada una
de ellas dado que la subpoblación C resultó estimulada mientras
que en la subpoblación F se inhibió la síntesis de ADN.
El efecto del estradiol sobre la subpoblación E resultó
sorprendente dado que no sólo permitió la sobrevida de las células
en el medio químicamente definido sino que le confirió a las
células la capacidad de despegarse del sustrato de las placas de
cultivo y crecer como agregados multicelulares en Suspensión. El
requerimiento hormonal es transiente y se manifiesta al 109 dïa de
cultivo de las células en el medio libre de Suero.
Coincidentemente, en ese momento es máxima la expresión de recep
tores estrogénicos. Al dïa 13 de cultivo, cuando las células se
despegaron de las placas de cultivo, deja de manifestarse el
requerimiento estrogénico y concomitantemente, la expresión de
receptores-estrogénicos decae hasta alcanzar el nivel basal. Con
respecto a estos fenómenos, no he encontrado datos semejantes en
la bibliografia.Estas células llevan más de 3 años de cultivo y presentan un
crecimiento mucho más agresivo que la linea celular parental.
Tienen un crecimiento autócrino dado que no requieren el aporte
exógeno de ningün factor de crecimiento y se han cultivado,
incluso, en un medio mïnimo libre de albümina, insulina y
estrógenos. La mayor velocidad de crecimiento se correlaciona con
174
un incremento en e] porcentaje de Subpoblaciones con a1ta capaci
dad proliferativa a expensas de 1a disminución en e] aporte de las
subpobïaciones D y F.
Esta nueva ïïnea ceiuiar es mucho más resistente a1 efecto
de] DMSOo de] butirato de sodio en re1ación a 1as células que
crecen en ausencia de suero pero adheridas al Sustrato. E1 trata
miento de 1as céluias “stem” con estradio] permitió 1a obtención
de una pob1ación ceïular con un crecimiento más agresivo y asi
mismo Ie dio 1a posibiiidad a1 1aboratorio de contar con otro
modeïo para e] estudio de 1a reguïación de] crecimiento y 1a
diferenciación de las céïuïas "stem" de tumor de mamahumano.
175
CONCLUSIONES GENERALES
E1 presente trabajo de tesis aporta un sistema experimenta] que
permite obtener en forma aislada y purificada a la céluïa "stem"
y a las diferentes subpobïaciones ce1u1ares que componen 1a
jerarquía ceiular de un tumor o de una Iïnea ceïular, propuesta
por Buick y Poïïak en 1984. Este modeio posibiïitó e] estudio
de 1as caracteristicas bioïógicas y bioquímicas de cada una de
las subpobiaciones y permitió anaiizar 1as modificaciones en 1a
expresión de diversos marcadores de naturaïeza proteica y
iipïdica que acompañanal proceso de diferenciación ceïular. Se
determinó 1a secuencia de aparición de 1as subpobïaciones y se
planteó un proceso de diferenciación unidirecciona]. Se anaïi
zaron 1as interacciones existentes entre 1as Subpobïaciones,
responsabïes de que el comportamiento de 1a iïnea ceïular no
resulte de 1a simp1e adición de 1as caracteristicas que presenta
cada subpobiación por separado. Se definió e] requerimiento hor
mona] y de factores de crecimiento ‘que manifiesta cada sub
pobiación cuando se cu1tiva en forma aisïada.
En este trabajo se propone un medio de cuitivo iibre de suero,
con e] aporte de insulina comoünico factor de crecimiento regu
latorio. Se describe e] crecimiento de 1a iïnea ce1u1ar en dicho
medio químicamente definido y se comprueba que e1 emp1eo de
suero como supiemento en e1 medio de cuitivo enmascara e] feno
tipo agresivo de estas céïuïas. Este hecho probabiemente se debasuero esa que el una mezcla compieja de hormonas y factores
promotores e inhibidores de] crecimiento que pueden atenuar e]
metaboiismo de 1as céïulas y/o 1a actividad que ejerce 1a insu
1ina sobre esta Iinea ce1u1ar.
176
- Se describe un efecto novedoso para el 13-cis retinal, derivado
de la Vitamina A. Dicho efecto consiste en un notable incremento
en la sintesis y acumulación de proteinas nucleares en células
crónicamente tratadas. A pesar de que algunos grupos de investi
gación consideran el uso de compuestos retinoideos en la preven
ción del cáncer, los reSultados presentados en este trabajo
alertan sobre los peligros de Su uso prolongado. Se comprueba
además que el 13-cis retinal actüa como modulador negativo de la
diferenciación en esta lïnea celular ya que retarda la aparición
de subpoblaciones más diferenciadas a partir de las de mayor
capacidad proliferativa y protege a las células del efectoinductor de la diferenciación ejercido por el butirato de sodio.
Se describe también un efecto novedoso para el estradiol sobre
la subpoblación de células "stem" cultivadas durante 10 dias en
el medio químicamente definido. El aporte hormonal dio origen a
la linea celular en suspensión, caracterizada por un crecimiento
mucho más agresivo y autócrino, dado que es independiente del
aporte exógeno de factores de crecimiento.
El presente trabajo apoya la hipótesis acerca de que varias pro
teïnas contribuyen al crecimiento autócrino de las células.
Actualmente, en el laboratorio se está investigando la presencia
de TGF- 0( en el medio de cultivo condicionado por la célula
"stem".
177
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