herramientas y flujos de i jornadas de foodómica tbj ... · la importancia del metaboloma ... en...

Herramientas y Flujos de T b j M t b ló i

I Jornadas de FoodómicaCIAL (I tit t d I ti ióTrabajo en Metabolómica

y Análisis Comparativos E t t í d

CIAL (Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación),

Campus Cantoblanco, Madrid

por Espectrometría de Masas.

Organizan: Virginia García-Cañas, Carolina Simó y Alejandro Cifuentes. Laboratorio de Foodómica(CIAL, CSIC).C l b P CONSOLIDER CSD2007 00063Colaboran: Programa CONSOLIDER, CSD2007-00063 FUN-C-FOOD y Agilent Technologies.

Isidro MasanaEspecialista Producto LC-CE/MS

Agilent TechnologiesDi i ió d Bi i i A áli i Q í iDivisión de Biociencia y Análisis Químico

Herramientas y Flujos de Trabajo en

Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos

1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.

2 Herramientas para Análisisp


2.- Herramientas para Análisis Comparativos de Muestras.

- Cromatografía/ Espectrometria de Masas.

3.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.

4 C l i4.- Conclusiones.

5 -INFORMACION5.-INFORMACION SUPLEMENTARIA

Página 2

INFORMACION• Ejemplos Resultados:

1 Optimización Proceso de ExtracciónINFORMACIONSUPLEMENTARIANo impartida en Seminario Foodómica.

1.- Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos.2.-Estudio Metabolómico Infección

Ver final de este documento pg>40 Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales.3.-Clasificación de Muestras. Autentificación de Vinos4.-Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosEstudios Metabolómicos5.- Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales:

I f ió V i• Información Varia:1.- Proceso Deconvolución 3D: MFE+AMDIS

2.- Descubrimiento de Biomarcadores en2. Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica.3.-Aspectos Clave en Estudios Metabolómicos :Metabolómicos :

Página 3









4 C l i4.- Conclusiones.

5 -INFORMACION5.-INFORMACION SUPLEMENTARIA

Página 4

La Importancia del Metaboloma

RNA GENÓMICA

Metabolómica: es el estudio i t áti d l ñ

DNA

RNA GENÓMICA

sistemático de las pequeñas moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico

CH OH

TRANSCRIPTÓMICA

p gCH2OH

Proteinas

PROTEÓMICA

METABOLÓMICA

Metabolitos

Metaboloma ~ Expresión final de las “-omicas”

Página 5

La Importancia del Metaboloma

Genoma

Metaboloma

Proteoma

El t di d biEl estudio de cambios en rutas metabólicas generados por agentes internos/externos

• Conocer mejor la biología• Conocer mejor la biología del organismo

• Prevenir futuras enfermedades.

P f t i d d /d d• Preveer efectos indeseados /deseados en fármacos

• Mejorar la salud.

•…..

Página 6

Objetivos de la Investigación Biomédica ActualActual

- Identificación de nuevos BIOMARCADORESpara diagnóstico precoz de enfermedades, clasificación pacientes

E l i M di i di ó ti ti- Evolucionar Medicina diagnóstico-curativa (basada en el tratamiento de la enfermedad)

Medicina que promueva la salud (evite la enfermedad)

- Requiere el desarrollo de una Medicina:

Predictiva, Preventiva, Personalizada, Participativa

R i d t ll d i i t d l bi ló i /- Requiere un detallado conocimiento de los procesos biológicos/ bioquímicos que tienen lugar en el organismo y como éstos están influenciados por:

- el desarrollo de una enfermedad

- la ingesta de un fármaco

- la alimentación/ dieta seguidasla alimentación/ dieta seguidas

- Se deberá estudiar el impacto de estos factores en el perfil del genoma, proteoma y metaboloma del organismo.

• ……

Página 7

Foodómica

RNA GENÓMICA

DNA

TRANSCRIPTÓMICA

CH2OH

P t i

PROTEÓMICA

Ó

Metabolitos

Proteinas METABOLÓMICA

Metabolitos

Objetivo final:Objetivo final:

• Mejorar la salud.

• Prevenir futuras enfermedades.

Página 8 5-30m









4.- Conclusiones.

Página 9 6-29m

Fundamentos del Análisis Comparativo de Muestras y Descubrimiento Biomarcadores en Metabolómicay Descubrimiento Biomarcadores en Metabolómica

• Se basa en la obtención de perfiles de concentración de miles de compuestos mayoritariamente desconocidos en unas decenas decompuestos mayoritariamente desconocidos, en unas decenas de muestras de diversas poblaciones.

• Utiliza el análisis estadístico multivariante• Utiliza el análisis estadístico multivariantepara correlacionar:- variaciones en la concentración de

tcompuestos. - con distintas propiedades de 2 o más grupos de muestras comparadas.

¿Cuales son las diferencias en su composición química que se

correlacionan con las

• En Metabolómica se compararán los perfiles masivos de metabolitos (pequeñas moléculas orgánicas) presentes en un sistema biológico (organismo órgano correlacionan con las

diferencias observadas?presentes en un sistema biológico (organismo, órgano, tejido, célula, fluido,…).

• En Genómica se compararán los perfiles masivos de expresión génica.

Página 10

Herramientas: Hardware y Software Bioinformáticopara -Ómicaspara Ómicas

para Descubrimiento y Seguimiento de Biomarcadores

1.- Genoma- aCGH ArraysChIP on Chip

2.-Transcriptoma- Gene Expression Arrays; Splicing-Arrays RNA ChIP on Chip

Arrays - GS Genotyping

CGH AnalyticsChIP Analytics

Arrays- GeneSpring GXResolver

DNA

RNA

y

CH2OHProteínas

3.- ProteomaTécnica análisis:

LC/MS Metabolitos 4.- MetabolomaLC/MS Spectrum Mill,

Mass Profiler Pro(GeneSpring MS)

Metabolitos

Metabolómica comparte:Instrumentación LC/MS con Proteómica

4. MetabolomaTécnica análisis:

LC/MS & GC/MS RMN

Mass Profiler ProBioinformát: GeneSpring & MPP con Prot. & Genóm. (GeneSpring MS)

Página 11

Portfolio de Instrumentos para Metabolomica: desde zeptomoles hasta exactitudes de masa de 250ppb’sp pp

5975C5975CGC/MSGC/MS

7000B7000BGC/QQQGC/QQQ

GC/MS7000B7000B

GC/QTOFGC/QTOFGC/QTOFGC/QTOFúnico

QQ--TOFTOF6500 series6500 seriesHiHi--DEF QDEF Q--TOFTOF

QqQ-6490

6500 series6500 series6500 series6500 series 6490-QqQ

100 atogramos verapapmil

CECEZeptomoles !! zmol 10-21

CE/MS

QQQQQQ6400 Series6400 Series

TOFTOF6200 series6200 series

Infinity Infinity 1290 1290

UHPLCUHPLC

CE/MS

LC/MS

RMN

Página 12 10-25m

CromatografíaEjemplo Instrumentación MS: LC/MS-Q-TOF

HPLC: todo tipo analitos GC: analitos volatilizables

CE: analitos iónicos

Para poder ser detectadasen MS las moléculas

necesitan ser ionizadas HPLC MS: QTOF

GCMS

necesitan ser ionizadas HPLC MS: QTOF

JUAN

13Página 13

Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis Comparativos de MuestrasAnálisis Comparativos de Muestras

Aplicando las mismas estrategias y herramientas analíticas

• Descubrimiento y Validación de Proteínas como Biomarcadores.

• Identificar los compuestos responsables de episodios de contaminación medio ambiental o alimentaria.

• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos anómalos de un lote de productos, con su origen, con tratamientos a que han sido sometidos,……

E t di l i ilit d dif i d i ió t• Estudiar las similitudes y diferencias de composición entre sus productos y otros semejantes en el mercado.

• Estudiar el impacto del tratamiento de un alimento en su composición.

• Optimizar condiciones de procesos de Extracción / Síntesis (temperatura, pH, presión,….) para maximizar su eficiencia

• A partir de muestras de referencia poder clasificar/AUTENTIFICAR• A partir de muestras de referencia, poder clasificar/AUTENTIFICAR muestras desconocidas, materias primas, según su origen, tipo, tratamientos a que han sido sometidas, detectar fraudes,….

Página 14

• ….









4.- Conclusiones.

Página 15 13-22m

2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y EspecíficosEspecíficos

LC/MS-QTOFGC/MS-QTOF

LC/MS-QqQGC/MS-QqQ

Comparación de Comparación de Perfiles Específicosp

Perfiles Genéricos del Metaboloma

(metabolitos conocidos

Perfiles Específicos(metabolitos concretos)

S t b j á MS(metabolitos conocidos + desconocidos)

Se trabajará con MS

Se trabajará con MS (QTOF/QqQ) en modo

MS/MS o en MS en modo selectivoj

(TOF/QTOF) en modo espectral con masa exacta

Tí i

modo selectivo

Típico para Validación de Biomarcadores

Típico para Descubrimiento de

Nuevos BiomarcadoresCambios en ciclos

concretos del metabolismo

Página 16

metabolismo

15-20m

¿Cómo Obtener Perfiles Específicos y Caracterizar Miles de Metabolitos Desconocidos?

PERFILADO: la clave es una masa exacta robusta. Ésta permite obtener perfiles específicos de centenares/miles de Metabolitos:obtener perfiles específicos de centenares/miles de Metabolitos:

• Imprescindible LC/MS.

• Imprescindible GC/MS con Ionización Química 3 5e54.0e54.5e55.0e55.4e5

+TOF MS: 5.672 to 5.833 min lowhigh03.d Agilent277.087

279.084

ClenbuterolC12H18Cl2N2O p

(CI, NCI, APCI ).

• Recomendable en GC/MS con EI(Ionización por impacto electrónico).

1.0e51.5e52.0e52.5e53.0e53.5e5

100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290

279.084[M+H]+=277.0874

(Ionización por impacto electrónico).

CARACTERIZACIÓN de metabolitos/comp. a comparar:

• Tiempo de retención

• LC/MS y GC/MS (CI,NCI,APCI): por su masa exacta

• GC/MS (EI): por su espectro de EI deconvolucionado y/o su masa exacta. .

Página 17

Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativade Cromatogramas de Iones con Masa Exacta.

Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 DaClenbuterol S/N = 14

Exactitud Masa (ppm)

Nº posibles fórmulas empíricas

Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP10 13 Clenbuterol S/N = 1410ppm 135 ppm 72 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

Rango extracción típico Cuadrupolo

LC/MS-TOF Agilent 6210

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm S/N = 102

Página 18

Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)

S ft D l ió MFE

GC/MSD PCA

Extraer automáticamente la información para cuantificar

relativamente MILES de t d id

Soft. Deconvolución: MFE

compuestos desconocidos

Página 19 18-17m

Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la p pMasa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la Muestra Espectros Deconvolucionados

Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF

TICIC’s0

Página 20


Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales

Intensidad, Tr, Masa exacta

GC/MSDPCA

Página 21 20-15m

Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras

Análisis Estadístico

Admite Experimentos:

• Estudios simples (A vs. B)

• Estudios en función del tiempo, de condicionesEstudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….

• Clasificación (/ Autentificación) de muestras

P i M P t t H i tProporciona Muy Potentes HerramientasEstadísticas y de Visualización Comparación:• Filtrado simple (test de frecuencia)

• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)( )

• Análisis de Componentes Principales (PCA)

• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),

• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)

• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)

• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……

• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)

• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q TOF’s de Agilentmetabolitos de interés con Q-TOF s de Agilent.

Página 22

Mass Profiler Professional: Interfase de Usuario

Un proyecto puede contener varios tipos de experimentos (p.e.combinar GC / MS y LC / MS)!!!y )

Navegador con flujo de trabajo para facilidad uso

Perfecto para inexpertos en bioestadística !!!en bioestadística !!!

Página 23

Mass Profiler ProfessionalMPP Flujo de Trabajo Recursivo

Un nuevo fichero de intercambio (.cef) permite la extracción recursiva de “features” (/compuestos).

MFERaw feature lists

.cef.cef f1111

MPP Flujo de Trabajo Recursivo

GC/MS MassHunterQ l (MFE).d

Raw feature lists.cef1

.CEF.CEFcefRefined33

33 FBI (Find by Ion)

LC/MS Qual (MFE)Mass Profiler Professional

cef

Combined binned List

22

Pathway Analysis

CASID

.CEF.cefRefinedfeature lists

.cef 2MassHunterID Browser

.cefDifferential features

44

• Permite flujos de trabajo RECURSIVOS para mejorar el análisis estadístico

.cef 55Annotated

compounds

diferencial.• Permite anotar los compuestos identificados con sus ID y espectros de MS/MS.

• Admite el mapeado a rutas metabólicas, y la extracción de los metabolitos involucrados en éstas.

• Flujo de trabajo con elevado nivel de automatización y eficiencia en el análisis diferencial/comparativo de muestras.

Página 24

“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA

Proporciona una mucha j dif i ió

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta

ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

mejor diferenciación de clases

7-INF 6-RES

2

3-INF7-INF

6-RES

2

3-INF5

5

3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1 4

Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra

12

3-INF

45

6-RES7-INF mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

i f N t d A li ió M t b l i P fili f B t i l L f Bli ht i Ri 5989 6234EN+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN

Página 25 25-10m


Interpretación p

Resultados

GC/MSDPCA

Identificación metabolitos relevantes

Página 26 26-9m

Fase Identificación de Metabolitos+24.000

metabolitos • LC/MS: búsqueda en Bases de datos deendógenos &

exógenos

LC/MS: búsqueda en Bases de datos de Metabolitos con Masa Exacta

• METLIN Personal DB:

• Instalada en PC

• 24.678 metabolitos (~8.000 lípidos)

Incluye ~670 RT’s

• Búsquedas en lotes o individuales

• Query basado en masa exacta monoisotópica.

• Editable: adicionar compuestos, tiemposde retención crear sub-bibliotecasde retención, crear sub-bibliotecas,…

• METLIN Personal DL: Bibliotecas con Espectros MS/MS-QTOF de ~2.286 metabolitos (8712 espectros)

• GC/MS: búsqueda en Bibliotecas de Espectros de Metabolitos por GC/MS con EI

• Biblioteca Fiehn de Metabolitos (GC/MS con EI):

• 665 metabolitos (1051 espectros MS)• Incluye: aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos,….• Incluye índice de retención basados en FAMES • Método con RTL (Congelación Tiempos de Retención)

• Bibliotecas genéricas: Wiley (+600K comp) , NIST (+200K comp)

Página 27

Niveles de Fiabilidad en la Identificación de Compuestos por LC/MS*Compuestos por LC/MS . Los compuestos pueden ser identificados mediante:

1.Concordancia con Base Datos (DB) de masa exacta.

2.DB+Concordancia con Perfil Isotópico teórico.

Fiab

i

3. DB+perfil isotop.+ concordancia con tiempo retención.

4 d i bibli t

ilidad

4. …+ concordancia con biblioteca espectros MS/MS.

5 concordancia con biblioteca Citric acid pathway map5. concordancia con biblioteca MS/MS y tiempo retención.

Citric acid pathway map

*En GC/MS se utilizarán bibliotecas de Impacto Electrónico (EI), e idealmente confirmación con

la masa exacta y perfil isotópico del compuesto

Página 28

la masa exacta y perfil isotópico del compuesto.

Mass Profiler Profesional: Importación y Visualizaciónde Rutas Metabólicas

Una vez identificados los metabolitos relevantes:

Página 29

Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por M l i

A i i

Malaria.

Ciclo de la UreaArgininaOrnitinaCitrulina

Ver en que rutas metabolicas están involucrados los

metabolitos

Ciclo de la Urea

metabolitos relevantes del

estudio diferencial

Células sangreInfectada

L-Arg

1500

2000

2500

Citrul.Ornit.

0

500

1000

No infectados

Página 30

2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos yEspecíficosEspecíficos

LC/MS-QTOF

LC/MS-QqQ

Comparación de Comparación de Perfiles Específicosp

Perfiles Genéricos del Metaboloma

(metabolitos conocidos

Perfiles Específicos(metabolitos concretos)

Se trabajará con QqQ/QTOF en modo(metabolitos conocidos

+ desconocidos)

Se trabajará con MS

QqQ/QTOF en modo MS/MS o en MS

(QTOF/TOF) en modo selectivo (masa exacta)

j(TOF/QTOF) en modo

espectral con masa exacta

Tí i

Típico para Validación* de Biomarcadores

Cambios en ciclos Típico para

Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores

concretos del metabolismo

*Se corroborarán los resultados de PCAcon perfiles específicos de un elevado

Página 31

con perfiles específicos de un elevado nº de individuos.

30-5m

Fase Validación de Biomarcadores. Requisitos en LC/MS: Sensibilidad Reproducibilidad y RapidezLC/MS: Sensibilidad, Reproducibilidad y Rapidez

Cuadrupolo “3” (Q3)Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión354.4

Triple Cuadrupolo modo MRM: el LC/MS más sensible y robusto para cuantificar

Cuadrupolo 3 (Q3)Cuadrupolo 1 (Q1) Celda ColisiónEspectro MS

35

374.7

452.3 472 6

374.7ALELFR2+ 564.3

ELFR1+

Ión Precursor Ión Producto

472.6278.5

Ión Precursor Ión Producto

Transición 374 7 564 3

Espectro MS/MS

Muy elevada sensibilidad metabolitos/péptidos minoritarias

Transición 374.7 564.3

Buena reproducibilidad

Reducidos tiempos de análisis elevado nº muestras (Validación Biomarcadores)

Página 32

Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)

LC-QqQ

GC-QqQ

Página 33

“Pathway to Database Tool”

C i t l i f ió d l t b lit i l d l t l i dConvierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS):

• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés.• Elimina metabolitos redundantes.• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:

CAS ID N b IUPAC E t t• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura

Página 34

Cuantificación Relativa de Metabolitos Involucrados en Rutas Metabólicas de Interés

Cambios de expresión del metaboloma inesperados pueden revelar p p ptoxicidad o efectos indeseados en el tratamiento con un fármaco, dieta,…

Página 35









4.- Conclusiones.

Página 36 13-22m

Conclusiones

• El estudio de cambios en el metaboloma permite evaluar el impacto sobre un organismo, tanto de factores internos(genoma/proteoma/enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio(genoma/proteoma/enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio ambiente/…).

• El metaboloma es una excelente fuente de biomarcadores para diagnóstico y seguimiento de enfermedades, clasificación de pacientes,….

• La espectrometria de masas acoplada a cromatografía (LC/MS y GC/MS) tit h dí l h i t líti á t t lGC/MS) constituyen hoy en día la herramienta analítica más potente para el análisis del metaboloma proporcionando perfiles de cientos/miles de metabolitos.

• Hoy es día ya están disponibles comercialmente en el mercado:

– Cromatógrafos, Espectrómetros de Masas y Software para pasar: g p y p pde IONES a RUTAS METABOLICAS.

– Instrumentos y Software bioinformático para abordar con una visión global la “Biologia de los Sistemas”.

Página 37

www.metabolomics-lab.com

38

MuchasMuchas Gracias

www.metabolomics-lab.com

www.proteomics-lab.comEstamos a su disposición en:

http://www.chem.agilent.com/[email protected]

Tel 901 11 6890Tel. 901.11.6890

Isidro Masana

Mass Spec/tacularIsidro Masana Especialista de Productos LC-CE/MS AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90 [email protected]

INFORMACION• Ejemplos Resultados:

1 Optimización Proceso de ExtracciónINFORMACIONSUPLEMENTARIA (No impartida en Seminario Foodómica)

1.- Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos.2.-Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales.3.-Clasificación de Muestras. Autentificación de Vinos4.-Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosEstudios Metabolómicos5.- Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales:

I f ió V i• Información Varia:1.- Proceso Deconvolución 3D: MFE+AMDIS

2.- Descubrimiento de Biomarcadores en2. Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica.3.-Aspectos Clave en Estudios Metabolómicos :Metabolómicos :

Página 40

Ejemplo Aplicación 1º: Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos deProceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos

PARÁMETROS INFLUENCIAN RENDIMIENTO EXTRACCIONES LÍQUIDO/LÍQUIDO:

pH fase acuosa (parámetro estudiado en este ejemplo)

P i f / á iProporciones fase acuosa/orgánica

Adición de sales / modificadores orgánicos fase acuosa

TemperaturaTemperatura

...PREPARACIÓN MUESTRA:

1.- Centrifugar sangre (con citrato como anticoagulante) y eliminación del sobrenadante.

2.- Lavado con PBS (solución salina de tampón fosfato) para eliminar los metabolitos del exterior de los glóbulos.

3.- “Quenching” y lisado de la membrana de los glóbulos para liberar los metabolitos de su interior.

4 Adición modificador fase acuosa (metanol)4.- Adición modificador fase acuosa (metanol).

5.- Adición fase orgánica (cloroformo).

6.- Extracción líquido-líquido a diferentes pH’s fase acuosa.

7.- Evaporación a vacío y reconstitución fase acuosa.

Página 41

Influencia pH en nº Metabolitos ExtraídosDistribución 1211 metabolitos distintos identificadosDistribución 1211 metabolitos distintos identificados en MetLin DB por su masa exacta con <10ppm error

(LC/MS-TOF)

Incluye compuestos no identificados en MetLin DB

+ inf. en nota aplicación: Maximizing Metabolite Extraction for p gComprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN

Página 42

Ejemplo 2º: Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales

• TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje

• TP309-Xa21 arroz transgénico resistente a la

PX099 PX099 RaxST -Bacteria salvaje Bacteria transgénica

TransgenicSalvajeCondition

2 Tipos de Arroz (TP...)

Resistente a la plaga

2 tipos bacterias

TP309 Xa21 arroz transgénico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada genéticamente: PXO99 (RaxST-).

• PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa

Péptido AvrXa21+6 (C)6 (A)PXo99

g

TP309-Xa21

Salvaje

TP309

Condition

(Class)

ria

(PX

…)

(A) (B) (C) (D)

raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa capaz de generar el péptido AvrXa21.

• PXO99 RaxST- : bacteria modificada genéticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el péptido AvrXa21

Blanco control tratado

6

6

6

6

deb

acte

r

Blanco control permite generar el péptido AvrXa21.

• Péptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genéticamente (TP309-Xa21)

PXo99

RaxST-6 (D)

6

NA(B)

6

2 ti

pos

d control SIN tratar

TP309 TP309-Xa212 tipos arroz (TP…)p ( )

Los replicados de muestras de la población son importantes

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)

Página 4330-15m

Mass Profiler Professional: ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados mediante “Tukey Post-hoc Test”. M d I P itiModo Iones Positivos

Azul: estadísticamente equivalentes

----- Arroz Salvaje ------7 Condiciones Biológicas Comparadas

----- Arroz Transgénico ------

. act.

lv

aje

Bac

t.

alva

je

equivalentes

Rojo: estadísticamente diferentes

Bac

t. M

od

if.

Gen

.

Ba

Sal B Sa

lóg

icas

s

ArrocesResisten.

zT

ran

gén

ico

on

es B

iol

mp

arad

asA

rro

z

Bact. Modif. Gen.

Bact. Salvaje Resisten.

7 C

on

dic

ioC

om

Infección

zS

alva

je Arroces

7

Arr

o

Bact. Salvaje Infección

LCMS ESI 1900 t / t ANOVA li d 564 t dí ti t fi blLCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

Página 44

“Mass Profiler Profesional”: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-vía con Datosde Venn de ANOVA de 1 vía con Datos de Arroz Filtrados La comparación mediante ANOVA de 1-

Diagrama de Venn ComparandoArroz Infectado Vs Resistentep

vía se realizó para encontrar “molecular features” (/compuestos) de interés biológico.

Arroz Infectado Vs. Resistente

• Se evaluan 7 condiciones biológicas. De la comparación de resultados se concluye:

– Immunity features: (42) – metabolitos relacionados con la resistancia

– Infected features (22) – metabolitos l i d l i f iórelacionados con la infección

– Bacterial features (25) – metabolitos producidos por las bacterias

– Rice line features (170) – metabolitos relacionados con diferencias en las líneas de arroz

Página 45

“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA

Proporciona una mucha j dif i ió

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta

ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

mejor diferenciación de clases

7-INF 6-RES

2

3-INF7-INF

6-RES

2

3-INF5

5

3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1 4

Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra

12

3-INF

45

6-RES7-INF mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

i f N t d A li ió M t b l i P fili f B t i l L f Bli ht i Ri 5989 6234EN+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN

Página 46

Ejemplo Aplicación 3º: Clasificación de Muestras.Autentificación de Vinos

• 45 Vinos Tintos (para modelizar)

• 3 Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)

• 11 países de origen: República Checa, Eslovaquia, Francia, Italia, Macedonia, Bulgaria, Hungría, Australia, Chile,

Alemania, EE.UU.

• Cosechas: 2004 – 2008

CONJUNTO DE MUESTRAS MUY VARIADO

Página 47 35-10m

Instrumentación Utilizada

?Jet Stream ESI source

?Jet Stream ESI source

Multimode ion source

Software de AnálisisAnálisis

Estadístico Multivariante

Agilent Technologies

/

Agilent Technologies

1200 RRLC

Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)

Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb

6530 Accurate‐Mass Q‐TOF LC/MS1200 RRLC system

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

Página 48

Procesado de Datos: ejemplo T.I.C.

TIC of wine and LC blank, LC-(ESI+) QTOFMS

?

?? ?

????

?

?

?

??

?

??

??

?? ? ?

???

??

?

???

???

??

?

??

??

?? 6x10

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3+ESI Scan (6.248-6.387 min, 13 scans) Frag=125.0V ESI+_PN…

* 210.1133

Los espectros corresponden a

múltiples compuestos ? ?

BLANKWINE

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

493.1350

200 400 600 800 1000

pcoeluyentes

• Datos muy complejos.

• Compuestos minoritarios enmascarados.

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000

6x10

1.2

1.4

1.6

1.8+ESI Scan (3.888-3.981 min, 9 scans) Frag=125.0V ESI+_PN_…

Se requiere software que extraiga y caracterice todos los compuestos

ionizados.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

358.1719

571.3074

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000

Página 49

Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”

M F E extrae 20 506 “features” delM.F.E. extrae 20.506 “features” del conjunto de todas las muestras (en

las condiciones utilizadas)

Find compound by Molecular Feature Extractor

Página 50

Procesado de Datos mediante Agilent Mass Profiler Profesional: Filtración de Entradas por Frecuencia (Incidencia en las Clases)p ( )

Filtro por omisión: la existencia del “feature” en el 100%* de las muestras de al menos en un grupoy 100%* de las muestras de al menos en un grupo.

inte

nsi

tyA

vera

ge

A

663 “features” de 20.506

* Filtrando con el 50%el nº de “features”

En conjuntos de muestras muy variadas, algunos compuestos importantes podrían ser filtrados ...

e de eatu esaumenta de 663 a 3600

co ju tos de uest as uy a adas, a gu os co puestos po ta tes pod a se t ados

Página 51

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante Filtrado por Frecuencia y Análisis de Componentes

PCA de las “Molecular PCA de las “Molecular Features”

Principales (PCA)

Features” iniciales (20506) filtradas por frecuencia ≥50% (3600)

FILTRATION

CABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR

FILTRATION

PINOT NOIR

Página 52

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)

PCA de las “Molecular Features”

filtradas con ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26

y p p ( )

(p ) ( )

Un adecuadoUn adecuado filtrado de los

datos es esencial para

FILTRACIÓNesencial para

una buena clasificación

CABERNET SAUVIGNONCABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR

Página 53

Validación del Modelo de Predicción de ClasesClases

Número de muestras utilizadas en la validación: 45

• Durante la validación del modelo, 2 MERLOT fueron mal clasificados.

• Todos los Cabernet Sauvignon y Pinot Noir se clasificaron correctamente.correctamente.

• La fiabilidad de predicción del modelo resuelto ser del 95.6%*

El modelo clasificó correctamente las 5 muestras adicionales evaluadas (2 CS, 1M, 2 PN).* ANOVA utilizó para filtrar un p≤0.05.

Página 54 40-5m

Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosMetabolómicos

• LC/MS-TOF: Biomarcadores de bajo peso molecular de Cáncer Pancreático

Poster ASMS: Mayo Proteomics Research Center, …Mayo Clinic

- La fracción de bajo peso molecular del plasma es una fuente viable de potenciales biomarcadores de cáncer pancreático yviable de potenciales biomarcadores de cáncer pancreático y

mediante unos 20 metabolitos permiten discriminarlo en pacientes diabéticos vs. no diabéticos

• LC/MS-QTOF & QqQ: “Changes in phopholipase expression in the CNS of SIV-q g p p p pinfected macaques”.

• Gary Siuzdak & others. The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 118 Number 7 July 2008

• CE/MS-TOF: “Ophthalmic Acid as an Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption”

• Tomoyoshi Soga & others. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 24, pp. 16768–16776, June 16, 2006, , pp , ,

Página 55

Típicos Análisis de Metabolopatías mediante MS

• Típicos compuestos a seguir

- Aminoácidos

- Acyl carnitinas

Á- Ácidos orgánicos

- Ácidos grasos

- ……

F il t i (PKU) t l l l ió d PHE / T d d

LC/MS-QQQ

• Fenilcetonuria (PKU): se controla con la relación de PHE / Tyr, donde Tirosina es el producto natural del metabolismo de la fenilalanina. Niveles elevados de Phe en relación con Tyr indica problemas en la conversión natural de este metabolito. PKU es una enfermedad que se puede tratar (sólo por el control de la dieta) y es importante tratarla lo antes posible, ya que puede conducir a daño cerebral y retraso mental.q p y

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Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales: Using Mass Profiler Pro to Analyze Large Batch of SamplesMass Profiler Pro to Analyze Large Batch of Samples PCA plot of different mAb’s oxidation conditions

•Principal component analysis Controles

(PCA) is a clustering tool often applied to reduce the dimensionality of complex data sets

Controles

sets.

•The result for the oxidation samples demonstrates correct

Tratadas con >0.3% t-BHP

grouping of the technical replicates and clear separation between different concentrations of t‐BHP treatedconcentrations of t BHP treated mAbs.

•It is clearly observed that Tratadas con

control (cyan) and 0.1% (red) are well separated as compared with other oxidized samples.

Tratadas con 0.1% t-BHP

Deconvolución 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass HunterMolecular Feature Extractor”(LC/MS)

TICPicos deconvolucionados y espectrosTIC & Espectro

En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo

TIC (suma de los 3)

Componente 1

y p

Componente 1TIC & Espectro

[M+H]+

Componente 2

Componente 3 Componente 2

[M+Na]+

“Deconvolución”

p[M+H]+

[M+Na]+ [2M+H]+

E.C.C.: Suma de intensidades de sus

iones específicos

Componente 3

[M Na]

[M+H]+

Ejemplo con espectros de LC/MS

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jAPI-LC/MS apenas produce fragmentación

Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica: Flujo de Trabajo “Metabolómico”

Identificación de Proteínas con estrategia “Metabolómica” & MFE: considerará TODOS los péptidos ionizados, incluso cuando coeluyen con

otros mucho más concentrados.

Selected Peptides by MFE & GS-MSTOF o QTOF

en modo MS

Targeted MS/MS by TRAP or QTOF

Identificar Proteínas por “DB MS/MS search”

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Aspectos Clave en Estudios Metabolómicos

• Buen diseño experimental • Adecuada selección de las distintos individuos que componen cada una

de las poblaciones sujetas a estudio.• Adecuada valoración del impacto de la diversidad dentro de cada una de las

poblaciones (sexo, raza, actividad física y estilo de vida, dieta, factores ambientales,…).

• Adecuado nº de individuos dentro de cada población para valorar la variabilidad natural dentro de cada grupo (~20-30 en descubrimiento // cientos-miles para validación).

• …

• Adecuada Extracción y Conservación de la muestra:• La muestra extraída (biofluidos, tejidos, cultivos celulares,…) debe ser representativa del objeto

del estudio.• Extraer los compuestos de interés con una elevada y reproducible recuperación (o en

d f t tili b t i t d f i )su defecto utilizar buenos patrones internos de referencia).• …..

• Adecuados Instrumentos y Procesos Analíticos• Potentes Herramientas de Análisis Estadístico Multivariante

• Deben permitir correlacionar cambios multivariantes en el perfil masivo del metaboloma (sin hipótesis previas – aproximación holística) con las diferencias entre las distintas

bl i dpoblaciones comparadas.

Página 60

herramientas y flujos de i jornadas de foodómica tbj ... · la importancia del metaboloma ... en...

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